CN107012162A - 农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，首次采用吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。本方法具有操作简单、转化周期短的优点。利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。

Description

农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法
技术领域
本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体地说，涉及一种农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法。
背景技术
棉花是重要的经济作物，自1987年Umbec等首次报道将外源基因成功导入陆地棉以来，目前棉花转基因技术主要采用基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法因转化效率低，设备成本较高，且转基因拷贝数偏高，不利于进行商业化育种。王振怡等通过基因枪介导棉花转化，得到1.6％的转化效率。农杆菌介导法进行转基因棉花实验，受体材料的种类较多，可以利用棉花下胚轴、子叶、萌发数天的茎尖为侵染材料。下胚轴及子叶可通过愈伤组织诱导途径诱导胚状体的形成，是目前较常用的方法。但该方法转化周期长，体细胞无性系变异严重，转化效率低，且对品种的依赖性很高。易于转化的品种例如，YZ1等转化周期长达6个月。李燕娥等用农杆菌转化棉花品系9422的下胚轴，耗时4-5个月才获得转基因植株。常规的农杆菌侵染茎尖的方法，需将棉花先进行萌发，取幼苗的茎尖作为外植体材料，其缺点包括形成抗性芽少，易形成嵌合体，转化效率低等。
因此，开发适合商业化生产的棉花品种的高效稳定的转基因方法，对于加快棉花的遗传育种进程意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于工业化规模的向棉花中导入外源基因的高效转基因方法，即农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，包括以下步骤：
(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀， 然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；
(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；
(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；
(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；
(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；
(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株。
所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0-5.2g/L+维生素B5培养基0.8-1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0-1.5g/L。其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L。MS基本培养基见表1。
表1 MS基本培养基的配方
所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES(2-吗啉乙磺酸)3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B6 0.1mg/L+维生素B1 0.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L。
所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸。
所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。
前述的方法，步骤(1)中棉花种子去绒灭菌的具体方法为：将棉花种子用95％浓硫酸浸泡脱去表面短绒，然后用清水冲洗，晾干；将种子用75％乙醇浸泡10-15分钟，弃掉乙醇，然后浸泡于20％过氧化氢中，在100rpm摇床上室温震荡1-2小时，最后用无菌水冲洗3-5次。
前述的方法，步骤(2)中使用农杆菌EHA105，所述农杆菌菌液的OD660值0.1-1.0，优选OD660值0.9。
前述的方法，步骤(2)将胚尖浸入农杆菌菌液中，用10-150瓦超声波处理1-10分钟(优选100瓦超声波处理2分钟)，然后转入23℃，100rpm摇床中侵染2小时。
前述的方法，步骤(3)将侵染后的胚尖移至FM培养基上共培养，于23℃，16小时光照/8小时黑暗共培养2-4天(优选3天)。
前述的方法，步骤(4)中培养条件为：36℃，16小时光照/8小时黑暗，培养3天，然后于25℃光照培养室内培养4天。
前述的方法，步骤(2)中所述质粒为pZZ00090，该质粒含有壮观霉素抗性基因aadA以及编码绿色荧光蛋白的报告基因GFP，质粒结构示意图见图1，其全序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述共培养培养基的组成如下：FM+半胱氨酸0.1-400mg/L+琼脂4g/L；所述恢复培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+琼脂4g/L；所述筛选培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1-2mg/L+萘乙酸0.01-0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+壮观霉素100mg/L+琼脂4g/L；所述生根培养基的组成如下：MSB+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L。
本发明进一步提供用于培育转基因棉花的培养基组合，包括共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基和生根培养基。
其中，所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L(优选200mg/L)的半胱氨酸；所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸，优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。
本发明中涉及的棉花品种包括但不限于Coker312、鄂棉24。
本发明采用由农杆菌介导的棉花转化方法，首次将吸胀但未萌发的胚尖作为外植体材料，经农杆菌侵染、共培养、筛选、生根、移栽等步骤，获得转基因棉花植株。本方法具有操作简单、转化周期短的优点。利用本方法在4个月即可获得转化植株，而常规棉花转化周期一般为5个月以上，本方法大大缩短了转基因棉花的获取周期，提高了转化效率。另外，利用本方法进行转化不受棉花基因型限制，为实现大规模转基因棉花生产、育种提供了可能。
附图说明
图1为本发明实施例1中质粒pZZ00090的结构示意图。
图2为本发明实施例1中棉花胚尖示意图。
图3为本发明实施例1中农杆菌介导棉花胚尖转化的流程图；其中，A为棉花种子；B为去绒消毒后的棉花种子；C为浸种后的棉花种子，D为去掉种皮子叶的棉花胚尖；E为棉花胚尖与农杆菌共培养；F 为胚尖诱导筛选产生抗性芽；G为抗性芽伸长并生根；H为移入温室的棉花转基因幼苗。
图4为本发明实施例4中棉花幼苗GFP瞬时表达图；其中，A为Coker312转基因幼苗在白光下的影像；B为Coker312转基因幼苗在荧光下的影像；C为鄂棉24转基因幼苗在白光下的影像；D为鄂棉24转基因幼苗在荧光下的影像。
图5为本发明实施例4中转基因植株的PCR检测图；其中，M为2kb分子量标准；1-15为转基因棉花编号；-为阴性对照；+为阳性对照。
图6为本发明实施例4中转基因植株的Southern-blot检测结果；其中，1-4为单个转基因事件，5为WT对照，6为蛋白Marker。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1转基因Coker312棉花的制备
1、含目的基因的根癌农杆菌的制备
本实施例采用的农杆菌菌株为EHA105，质粒为pZZ00090(由中国种子集团有限公司提供)，该质粒含有壮观霉素抗性基因aadA以及编码绿色荧光蛋白的报告基因GFP，质粒结构示意图见图1，其全序列如SEQ ID NO:1所示。
将保存于甘油中的农杆菌取出后，在LB(10g/L氯化钠、5g/L酵母浸膏、10g/L蛋白胨和15g/L琼脂粉)固体培养基平板上划线；28℃，黑暗培养2天后，挑取单克隆划平板；28℃，黑暗培养1天后，挑取农杆菌用FM培养基悬浮，放入摇床，23℃，在100rpm转速下培养2-5小时，待OD660值为0.9后备用。
2、侵染受体材料的制备
将Coker312棉花种子(由河北省农林科学院棉花研究所提供)用95％浓硫酸浸泡以脱去表面短绒，然后用清水冲洗表面残留的硫酸，阴凉处晾干。在超净工作台上，将种子先用75％乙醇充分浸泡消毒15分钟，倒去乙醇，再加入适量20％过氧化氢，在100rpm摇床上室温摇动2小时灭菌，然后用无菌水冲洗3次。
将无菌的种子浸入MSB液体培养基中，28℃，黑暗浸泡16-24小时，种子吸胀后备用。
3、侵染与共培养
将吸胀后的种子种皮及子叶去掉，裸露胚尖(图2)，取出50-100个带裸露胚尖的种胚加入盛有5ml FM培养基的50ml离心管中。吸除FM培养基，加入上述制备好的农杆菌5ml。将离心管放入超声波清洗仪(新芝SB-3200DTD)中，100w超声处理2分钟，然后转入23℃，100rpm摇床中侵染2小时，弃去菌液。
将种胚分散置于垫有无菌滤纸的，添加有5ml共培养培养基的培养皿中，于23℃光照(16小时光照/8小时黑暗)培养箱中共培养3天。
4、筛选、生根培养及移栽
共培养结束后，将外植体放入未加筛选剂的恢复培养基中，在高温36℃下光照(16小时光照/8小时黑暗)培养3天，然后于25℃光照培养室内培养4天，再移至筛选培养基中诱导抗性芽的形成。每隔2周用新鲜筛选培养基继代1次。
将筛选8周左右的抗性芽转入生根培养基中，使其伸长及生根，每隔2周换新培养基，培养4-8周完成生根。
将生根的幼苗从培养盒中取出，洗净根部的残留培养基，移栽至穴盘置温室中，待长出新叶后移栽到盆钵中栽培。
得到转基因Coker312棉花的整个转化过程耗时仅4个月。
转化过程中所用培养基的配方如下：
MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.33g/L+维生素B5培养 基1mg/L+葡萄糖酸钙1.29g/L。其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L。MS基本培养基见表1。
FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES(2-吗啉乙磺酸)3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B6 0.1mg/L+维生素B1 0.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L。
共培养培养基的组成如下：FM+半胱氨酸0.1-400mg/L+琼脂4g/L。
恢复培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+琼脂4g/L。
筛选培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1-2mg/L+萘乙酸0.01-0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+壮观霉素100mg/L+琼脂4g/L。
生根培养基的组成如下：MSB+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L。
上述农杆菌介导棉花胚尖转化的流程图见图3。
实施例2转基因鄂棉24棉花的制备
鄂棉24成熟棉花种子去绒消毒、吸胀、获得胚尖、农杆菌菌液侵染胚尖，共培养、恢复培养、筛选、生根和移栽等操作方法均同实施例1的描述。最终获得含目标基因的转基因鄂棉24棉花。获得转基因鄂棉24棉花的整个转化过程耗时仅4个月。
实施例3影响外植体存活率和转化效率的各项技术参数研究
1、不同激素配比对棉花胚尖丛生芽诱导的影响
以MSB为基本培养基设计9种6-BA与NAA不同组合下胚尖丛生 芽诱导能力的比较实验，实验设计方案如表2所示。
表2 棉花胚尖丛生芽诱导培养基激素配比设计
注：B1-B9为含有不同浓度激素配比的培养基编号
诱导6周后，统计丛生芽诱导率，比较结果如表3和表4所示。
表3 棉花胚尖丛生芽诱导比率(％)
表4 棉花胚尖丛生芽诱导比率(％)
注：丛生芽诱导率＝诱导出丛生芽的胚尖数/诱导培养的胚尖数*100％
从以上结果可以看出，利用含有B3、B5和B6激素组合的诱导培养基诱导胚尖，75％以上的胚尖可诱导得到丛生芽。在实施例1和2中，优选使用B5激素组合(MSB+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L)的诱导培养基培养胚尖，成功获得了转基因阳性植株。由于这一步的研究结果 突破了获得高效率丛生芽的技术瓶颈，为转化中抗性芽的生成提供了保障，是棉花胚尖成功转化的重要前提。
2、超声波处理强度对棉花胚尖转化的影响
侵染前，将吸胀后的种子种皮及子叶去掉，暴露胚尖，取出50-100个种胚加入盛有5ml FM培养基的50ml离心管中。待种胚收集完吸除FM培养基，加入上述制备好的农杆菌5ml。将离心管放入超声波清洗仪中，调整超声波强度，处理2分钟后再行侵染。以无超声波处理的胚尖侵染实验作对照。每个处理50棵外植体左右，共培养之后，观察GFP瞬时表达情况，结果见表5。
表5 超声处理对胚尖GFP瞬时表达率(％)的影响
结果表明，在棉花胚尖侵染前，超声波处理可明显提高胚尖GFP瞬时表达率。且经强度为50W-150W的超声波处理后，棉花胚尖GFP的瞬时表达率比对照提高2-3倍，其中以100W为最佳。
3、共培养基中添加半胱氨酸对转化的影响
将经过侵染的胚尖转到添加不同浓度半胱氨酸的共培养培养基上，半胱氨酸浓度分别为0、200mg/L和400mg/L，每个处理50棵外植体。共培养结束后，观察外植体带GFP信号胚尖比率情况，结果如表6所示。
表6 共培养基中半胱氨酸对GFP瞬时表达比率(％)的影响
从以上结果可以看出，在共培养阶段，与对照相比，添加200mg/L半胱氨酸可使胚尖GFP瞬时表达率提高近一倍。
4、共培养阶段光照条件的设置
在共培养阶段，光照条件设置是每天光照培养16小时和暗培养8小时交替进行与常规的全黑暗培养对比。共培养完成后，观察外植体GFP瞬时表达情况；恢复培养完成后，统计胚尖存活率，结果如表7、表8所示。
表7 不同光照条件下带GFP信号胚尖比率(％)
表8 不同光照条件下胚尖存活率(％)
从以上结果可以看出，共培养阶段光照和黑暗交替培养，或黑暗培养对外植体GFP瞬时表达率影响不大，但光照和黑暗交替培养可提高胚尖存活率，有助于后期得到转化植株。
5、高温培养对棉花胚尖转化的影响
共培养后，对外植体进行高温培养处理，测试其对转化的影响。 以无高温处理，即室温25℃条件下进行恢复培养7天，作为对照；以36℃恢复培养3天，25℃恢复培养4天作为处理条件。统计诱导筛选6周后的抗性丛生芽的数量，结果如表9所示。
表9 36℃高温培养获得抗性芽的比率(％)
从以上结果可以看出，三次重复实验，无高温处理抗性芽平均比率为0.37％，经高温处理后抗性芽平均比率提高10倍以上，达到5.14％。表明经过侵染了的棉花胚尖，在恢复培养阶段设置36℃高温处理，有利于转化细胞形成幼芽，可能是由于高温处理有利于细胞分裂，从而提高转化细胞的存活率。
实施例4转基因棉花的鉴定
1、转基因植株中外源基因(GFP)在组织中的表达
取实施例1和实施例2制得的转基因棉花植株抗性芽进行外源基因(GFP)在组织中的表达观察，在荧光下抗性组织呈绿色，说明外源基因成功表达，否则为阴性材料，结果见图4。
2、转化植株的PCR检测
以质粒DNA为阳性对照，水为阴性对照，在GFP基因编码区域设计引物F:5′-ACAAGTTCAGCGTGTCC-3′；R:5′-GGTGTTCTGCTGGTAGTG-3′，对抗性植株DNA样品进行PCR扩增。检测结果表明，阳性对照和绝大多数转化植株能够扩增出预期大小的485bp DNA片段，而阴性对照没有扩增带(图5)。PCR检测结果表明，外源基因片段已经整合到棉花基因组中。PCR共检测转基因棉花62株，其中PCR阳性50株。
3、转化植株的Southern-blot检测
选取若干样品，进行Southern杂交。Southern杂交探针标记及杂交与显影采用Roche公司的地高辛产品，具体操作见说明书。本实施例选择目的基因GFP，设计探针Primer F:5′-AGCAGCACGACTTCTTCA-3′；Primer R:5′-CGAACTCCAGCAGGACCAT-3′，扩增长度434bp，选取高活性内切酶HindIII处理植物基因组。结果如图6所示，检测样品1-4为单个转基因事件，5为WT对照，6为蛋白Marker。说明目的基因GFP已经成功插入基因组。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
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Claims (10)

1.农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将棉花种子去绒灭菌后，浸泡于MSB培养基中，使其吸胀，然后在无菌条件下剥去吸胀的种皮，除去两片子叶，使胚尖裸露，放入含有FM培养基的离心管中，准备侵染；
(2)将胚尖浸入携带外源目的基因和标记基因质粒的农杆菌菌液中侵染，辅以超声波处理；
(3)将胚尖移至共培养培养基上进行共培养；
(4)将胚尖移至恢复培养基上培养；
(5)将胚尖移至筛选培养基上培养，诱导抗性芽的形成；
(6)抗性芽在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因棉花植株；
所述MSB培养基的组成如下：MS基本培养基4.0-5.2g/L+维生素B5培养基0.8-1.2mg/L+葡萄糖酸钙1.0-1.5g/L；其中，维生素B5培养基的组成如下：肌醇100mg/L+盐酸硫胺素10mg/L+盐酸吡哆素1mg/L+烟酸1mg/L；
所述FM培养基的组成如下：硫酸镁0.1g/L+硝酸钾1g/L+硫酸铵53.6mg/L+磷酸氢钠52.2mg/L+氯化钙60mg/L+硼酸0.3mg/L+硫酸锰1mg/L+硫酸锌0.2mg/L+碘化钾0.075mg/L+钼酸钠0.025mg/L+氯化钴2.5μg/L+硫酸铜1.6μg/L+Na2·EDTA 2.8mg/L+葡萄糖30g/L+MES3.9g/L+肌醇10mg/L+烟酸0.1mg/L+维生素B60.1mg/L+维生素B10.1mg/L+乙酰丁香酮292.4mg/L；
所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸；
所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中棉花种子去绒灭菌的具体方法为：将棉花种子用95％浓硫酸浸泡脱去表面短绒，然后用清水冲洗，晾干；将种子用75％乙醇浸泡10-15分钟，弃掉乙醇，然后浸泡于20％过氧化氢中，在100rpm摇床上室温震荡1-2小时，最后用无菌水冲洗3-5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用农杆菌EHA105，所述农杆菌菌液的OD660值0.1-1.0，优选OD660值0.9。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)将胚尖浸入农杆菌菌液中，用10-150瓦超声波处理1-10分钟，然后转入23℃，100rpm摇床中侵染2小时；优选地，用100瓦超声波处理2分钟。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)将侵染后的胚尖移至FM培养基上共培养，于23℃，16小时光照/8小时黑暗共培养2-4天。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中培养条件为：36℃，16小时光照/8小时黑暗，培养3天，然后于25℃光照培养室内培养4天。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述棉花品种包括Coker312、鄂棉24。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述质粒为pZZ00090，其全序列如SEQ ID NO:1所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述共培养培养基的组成如下：FM+半胱氨酸0.1-400mg/L+琼脂4g/L；
所述恢复培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+琼脂4g/L；
所述筛选培养基的组成如下：MSB+6-苄氨基嘌呤1-2mg/L+萘乙酸0.01-0.1mg/L+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L+壮观霉素100mg/L+琼脂4g/L；
所述生根培养基的组成如下：MSB+羧苄青霉素100mg/L+头孢霉素100mg/L。
10.用于培育转基因棉花的培养基组合，其特征在于，包括共培养培养基、恢复培养基、筛选培养基和生根培养基；
所述共培养培养基中含有终浓度为0.1-400mg/L的半胱氨酸；优选含有终浓度为200mg/L的半胱氨酸；
所述筛选培养基中含有终浓度分别为1-2mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.1mg/L的萘乙酸；优选含有终浓度分别为1mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸。
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