CN107646681A - 一种提高大麦组培快速成苗的方法 - Google Patents

一种提高大麦组培快速成苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高大麦组培快速成苗的方法，步骤如下：1）选择直径大小为1‑3cm的大麦幼胚，分别用酒精和次氯酸钠表面消毒，降低杂菌污染率；2）准确分离幼胚胚芽鞘，对盾片进行二次处理，诱导愈伤组织快速发生；3）根据幼胚的大小调整预培养和农杆菌侵染的时间，预防菌液过量；4）采用弱光遮蔽法提高绿点分化率和成苗率；5）调整愈伤诱导培养基、分化培养基和生根培养基的抗生素配比和使用时间，诱导愈伤组织快速成苗。本发明为大麦幼胚的组培方法，愈伤发生快，胚性愈伤多，可操作性强，绿点分化和成苗率高，不限于材料基因型的限制；建立的大麦幼胚转化再生体系，可为探索大麦遗传改良和细胞工程育种研究提供技术支撑。

Description

一种提高大麦组培快速成苗的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种提高大麦组培快速成苗的方法。
背景技术
当前，国际大麦测序联盟组装完成了高质量的大麦参考基因组序列，为进一步拓宽栽培大麦基因库提供了应对策略(Mascher et al.,2017,Nature.544(7651):427-433)。作为二倍体禾本科小麦族作物，大麦是国际上公认的植物遗传研究理想的模式材料(Mayeret al.,2012,Nature.491(7426):711-716)。目前，大麦转基因技术普遍采用农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化方法，相比于基因枪法具有转化效率高、遗传稳定等优势；但该方法对材料的基因型依赖性强，转化成苗周期较长，目前仅限于欧洲栽培品种Golden Promise等少数栽培大麦品种(Wan and Lemaux,1994,Plant Physiol.104:37-48；Tingay et al.,1997,Plant J.11:1369-1376)，难以满足广泛的商业化应用和基础研究等的需求。在日益增长的基因功能研究和育种进程中，迫切需要一种更高效、更广泛、更快速的大麦组培转基因技术。
大麦幼胚仍是目前使用最广泛、最有效的遗传转化外植体，也有一些基于花药、成熟胚和叶基等作为转化材料的报道，但其可操作性和转化效率仍不如幼胚(Zhang et al.,2001,Plant J.28(4):431-441；Han et al.,2011,J Zhejiang Univ-Sci B.12(5):399-407；Yang et al.,2012,CN102577946A[P]；Liao et al.,2013,CN103421837A[P])。Bartlett等人(2008,Plant Methods.4:22)提出了一种农杆菌转化大麦幼胚的方法，通过在诱导培养基中添加Cu2+有效地促进了愈伤的增殖，并将Golden Promise的转化率提高到25％。但在应用实例中，受限于大麦幼胚的大小和状态，经常出现愈伤组织增长缓慢、农杆菌侵染过量难以抑制、在转移或分化培养基中绿点难以分化成苗等问题，实际成功转化一个基因所需的幼胚初始数量甚至可达上千(Zi,Hangzhou:Zhejiang University,2015)。此外，Golden Promise是上世纪六十年代培育的欧洲栽培大麦(Pakniyat et al.,1997,Plant Breeding.116:189-191)，其产量、品质和抗病等农艺性状表现远低于现有的各国主栽品种。因此，基于农杆菌介导的大麦遗传转化体系的构建需要加快愈伤增殖、提高成苗率和切实解决基因型依赖性等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高大麦组培快速成苗的方法，该方法是采用农杆菌介导的大麦幼胚转化的技术方法，能加快愈伤生成速率，缩短组培成苗所需时间，并可高效而普遍地应用于大麦不同基因型的遗传改良和基因功能研究。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
1)大麦幼胚材料的选择和灭菌：选择直径大小为1-3cm的大麦幼胚，分别用酒精和次氯酸钠表面消毒，降低杂菌污染率；
2)幼胚快速分离与愈伤增殖：准确分离幼胚和胚芽鞘，对盾片进行二次处理，诱导愈伤组织快速发生；
3)农杆菌侵染与筛选培养：根据幼胚的大小调整预培养和农杆菌侵染的时间，预防菌液过量；
4)愈伤的分化、成苗和炼苗：采用弱光遮蔽法进行培养，调整愈伤诱导培养基、分化培养基和生根培养基的抗生素配比和使用时间，诱导愈伤组织快速成苗。
本发明利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染大麦幼胚诱导产生胚性愈伤组织并获得转基因植株的遗传转化方法和相应的组织培养体系。
作为优选，该方法包括如下步骤：
(1)大麦幼胚材料的选择和灭菌：选择未成熟胚饱满、胚乳胶状，半透明、直径大小为1-3cm的大麦幼胚，摘除麦芒保持幼胚种皮完整，依次用酒精灭菌，再用现配的次氯酸钠溶液静置，灭菌水反复清洗，晾干；
(2)幼胚快速准确分离与愈伤诱导：
取步骤(1)中灭过菌的幼胚于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末段远离操作者；
利用双镊子尖端夹击法，左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住幼胚，右手镊子尖端撕扯下破损种皮，露出至少1/2幼胚；
找准胚芽鞘与盾片缝隙部位，右手镊子一侧尖端勾住胚芽鞘往里往下剥离，切断在盾片底部凸起部位；
在盾片中央用镊子尖端轻划几下造成伤口，取出完整盾片后将其正面轻抚接触诱导培养基，最后盾片正面朝上放入诱导培养基，每皿可放60-80个盾片；
如需经农杆菌侵染以获得转基因苗，则按步骤(3)操作；
如直接用于愈伤组织诱导，则23℃黑暗培养4-5周，每两周更换一次不含潮霉素和特泯菌的诱导培养基，而后转到步骤(4)；
(3)农杆菌侵染与筛选培养：
按盾片直径d大小依次放入若干诱导培养基，22℃黑暗环境，分别预培养0(d≥3mm)、1(3>d≥2)、2(2>d≥1mm)、3(d＜1mm)d；
使用100μL移液枪吸取农杆菌菌液(MG基本培养液，不含抗生素，OD600＝1.8～2.0)逐个滴加在盾片中央侵染愈伤，其后立即吸回多余菌液，将盾片换至新的诱导培养基；
共培养2-3d后，减少愈伤数目至每皿30-40个，更换两轮诱导筛选培养基，暗培养20-30d；
(4)愈伤的分化、成苗和炼苗：
自愈伤见光起，生根前的分化阶段全程用单层A4纸遮盖培养皿盖，每张A4纸可遮盖6个培养皿，营造弱光环境；
先取步骤(2)或(3)中淡黄致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块为宜，置于转移(筛选)培养基中培养两周；
再在转移至分化(筛选)培养基前，剔除颜色发白和褐化的部分，挑选有绿点分化的愈伤块转入分化(筛选)培养基中继续培养2-4周；
待绿点成苗后，长至2-3cm时，将其转移到含生根(筛选)培养基的12ml培养管(1/3培养基)中，培养2-4周后根系建成；
炼苗时即开盖，加灭菌水至高出液面1-2cm，在外界环境适应2-3d，洗净根周围的培养基，先在1/2大麦水培营养液中培养1周，再移至营养土中，在适宜条件下培养至收获种子；
若为转化后的愈伤分化与成苗，步骤如上所述，培养基则为转移筛选培养基、分化筛选培养基和生根筛选培养基。
作为优选，步骤(2-4)所述的各培养基组分如下(1L)，其中在农杆菌转化条件下在分化阶段逐渐减少抗生素的使用量，除植物凝胶高压灭菌，其余成分均过滤灭菌：
a.诱导培养基：4.3g MS基础培养基+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+350mg肌醇+690mg脯氨酸+1.0mg盐酸硫胺+1.25mg CuSO4·5H2O+2.5mg麦草畏+3.5g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
诱导筛选培养基：a中诱导培养基+50mg潮霉素+160mg特泯菌；
b.转移培养基：2.7g MS培养基(不含硝酸铵)+20g麦芽糖+165mg硝酸铵+750mg谷氨酰胺+100mg肌醇+0.4mg盐酸硫胺+1.25mg CuSO4·5H2O+2.5mg 2,4-D+0.1mg 6-BA+3.5g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
转移筛选培养基：b中转培养基+40mg潮霉素+120mg特泯菌；
c.分化培养基：MS微量元素(22.3mg MnSO4·H2O+8.6ZnSO4·7H2O+6.2mg H3BO3+0.25mg Na2MoO4·H2O+0.025mg CuSO4·5H2O+0.025mg CoCl2·6H2O+0.83mg KI)+N6大量元素(2.8g KNO3+0.46g(NH4)2SO4+0.4g K2H2PO4+185mg MgSO4·7H2O+165mg CaCl2·2H2O)+N6铁盐(37.3mg Na2·EDTA·2H2O+27.8mg FeSO4·7H2O)+B5有机成分(1.0mg维生素B1+0.5mg维生素B6+2mg甘氨酸+0.5mg烟酸)+30g麦芽糖+100mg肌醇+690mg脯氨酸+0.1mg 2,4-D+1.0mg 6-BA+3.5g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
分化筛选培养基：c中分化培养基+30mg潮霉素+80mg特泯菌；
d.生根培养基：4.3g MS基础培养基+25g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+350mg肌醇+690mg脯氨酸+1.0mg盐酸硫胺+3.2g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
生根筛选培养基：d中生根培养基+20mg潮霉素+40mg特泯菌。
作为优选，大麦幼胚材料的来源优先选择大田栽培植株，自然环境生长下的大麦幼胚生长规整，一般要比人工环境下的大麦材料更有再生活力。但南方地区大麦幼胚采收期通常雨水频繁，容易滋生杂菌，在摘芒时需确保种子表皮完整，并进行彻底灭菌。
作为优选，大麦盾片和胚芽鞘之间的缝隙常见于大麦背线和盾片交界处，在用镊子勾取胚轴时用力不能过猛，方向为沿缝隙处先往下再往上。胚轴去除80～90％即可，但盾片下端的凸起部分必须去除，以防止胚根的生成。在对盾片进行二次处理时，注意尽量不要划破盾片，只对其造成划痕伤口即可，有助于愈伤组织的快速形成和增殖。
作为优选，农杆菌的菌液浓度严格控制在OD600＝1.8～2.0，但不要求现摇现侵染，菌液存放在4℃环境下3d内的菌液仍保持在上述浓度均可重复使用，但务必确保菌液没有杂菌污染。往盾片中央添加菌液侵染时，注意不要滴太多，以免回吸时盾片上留有太多菌液造成后续菌液过量。
作为优选，潮霉素和特泯菌的使用量在愈伤诱导阶段保持初始用量，有利于阳性愈伤的筛选。但在分化阶段特别是生根阶段应逐渐减少用量，在确保阳性苗的基础上，有利于幼苗分化，缩短成苗和生根的时间。
本发明的有益效果是：
1.本发明通过改进大麦幼胚剥离方式，促进愈伤组织快速增殖，从而缩短了愈伤诱导到分化阶段的时间；
2.改良了分化培养基的成分配比，所选的分化培养基相较于转移培养基或生根培养基更有利于幼苗的快速生成，提高了成苗率；
3.在分化阶段全程采用弱光遮蔽法培养，有利于绿点的形成和出苗，并且有效地避免了愈伤组织褐化和幼苗黄化。
与现有的大麦组培体系相比，本发明提供的盾片二次处理提高愈伤组织快速增殖和全程弱光遮蔽等方法，不仅有助于高效快速获取转基因大麦植株，同时适用于除GoldenPromise(见实施例1)以外的其他栽培大麦品种，如浙大9号(见实施例2)。因此，本发明涉及的大麦组培体系可以高效而普遍地应用于大麦品种改良和基因功能等基础研究。
附图说明
图1是本发明的大麦幼胚剥离操作示意图，具体为：1左手镊子固定种子中部；2右手镊子撕扯种皮，露出1/2以上幼胚；3镊子一侧尖端找准盾片和胚芽鞘缝隙；4用镊子勾取整个胚轴；5在盾片中央轻划几下造成划痕；6取出完整盾片后将其正面轻抚接触诱导培养基，最后盾片正面朝上放入诱导培养基；
图2是本发明在愈伤组织分化阶段所采用的全程弱光遮蔽法示意图，用到的遮盖工具为A4纸，且一张A4纸可用于遮盖6个直径9cm的培养皿；
图3为实施例1中用检测PCR方法鉴定阳性苗的琼脂糖凝胶电泳图，引物扩增长度478bp，OE1-81代表转化获得的81株再生苗，检测到阳性条带的共有52株，阳性率超过64％。OE81之后第一条是阳性对照，即引物扩增载体pBract214-HvSTC1片段，揭示了目的条带位置和引物的特异性；第二条是DL2000marker标记，表明目的条带接近500bp指示位置；第三条是阴性对照，即在野生型DNA中进行扩增没有得到条带；
图4为实施例2中处在分化筛选阶段的浙大9号幼苗生长状态。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
相关试剂和药品出处为：MS基础培养基，购自美国Phyto Tech(M524)；MS培养基(不含硝酸铵)，购自荷兰Duchefa(Lot.P11215.01)；麦草畏，购自美国AccuStandard(Lot.001011LB)；潮霉素，购自美国Roche(Lot.18661899)；特泯菌，购自上海生工BBI(TB0950)；2,4-D，购自北京鼎国(Lot.35N10130)；6-BA，购自北京鼎国(Lot.SLBD2043V)；植物凝胶，购自Sigma(P8169)；其余所述药品和试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司。
农杆菌AGL1，购自上海唯地生物(Shanghai Weidi Biotech)有限公司。
实施例一：农杆菌介导大麦Golden Promise幼胚获得过表达转基因植株
(1)大麦幼胚的选取和灭菌：取来自大田栽培的大麦Golden Promise幼穗，选择种子形状饱满、胚乳胶状，半透明、直径大小为1-3cm的幼胚，摘除麦芒，收集种子置于灭过菌的50ml离心管，容积可达到刻度30ml处。在超净台上对上述种子进行灭菌，操作为：先加入40ml 70％酒精上下颠倒30s，用灭菌水清洗3次，再加入现配40ml 50％(v/v)次氯酸钠溶液静置4min，用灭菌水反复清洗5遍，置于垫有3层无菌滤纸的培养皿底座中晾干。
(2)幼胚的分离与愈伤诱导(分解见图1)：取上述步骤中的灭菌种子于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背朝上，麦芒末段远离操作者。左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住种子，右手镊子尖端撕扯下破损种皮，露出至少1/2幼胚。找准胚芽鞘与盾片缝隙部位，右手镊子一侧尖端勾住胚芽鞘往里往下剥离，切断在盾片底部凸起部位。在盾片中央用镊子尖端轻划几下造成伤口，取出完整盾片后将其正面轻抚接触诱导培养基，并最终正面朝上放入诱导培养基中，每皿放60个为宜。
(3)农杆菌侵染与筛选培养：按盾片直径(d)大小依次放入若干诱导培养基，22℃黑暗环境，分别预培养0(d≥3mm)、1(3>d≥2)、2(2>d≥1mm)、3(d＜1mm)d。提前准备好含目的质粒pBract214-HvSTC1的农杆菌菌液(MG基本培养液，不含抗生素，OD600＝1.8～2.0)，用100μL移液枪吸取农杆菌菌液逐个滴加在盾片中央侵染愈伤，其后立即吸回多余菌液，将盾片换至新的诱导培养基。共培养2-3d后，减少愈伤数目至每皿30个，更换两轮诱导筛选培养基，暗培养4周。
(4)愈伤的分化、成苗和炼苗：全程用单层A4纸遮盖培养皿盖，营造弱光环境(方法如图2所示)。取步骤(3)中淡黄致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块为宜，置于转移筛选培养基中培养两周；剔除颜色发白和褐化的部分，挑选有绿点分化的愈伤块转入分化筛选培养基中培养3周；待绿点成苗长至2-3cm时，将其转移到含生根筛选培养基的12ml培养管中，培养3周后根系建成。开盖，加灭菌水高出液面1cm，在外界环境适应2d，洗净根周围的培养基，先在1/5Hoagland大麦水培培养液中培养1周，此时提取叶片DNA进行PCR转基因阳性苗的鉴定。将阳性苗移至营养土中，培养3个月收获种子。
(5)根据步骤(2-4)所述需提前配制培养基，配制步骤为：
a)配制2×植物凝胶，121℃，20min，高压灭菌。
b)以2×浓度添加所述成分，用1M NaOH调节pH＝5.8，用0.22μm过滤器过滤灭菌。
c)将2×植物凝胶和2×培养基成分在70℃烘箱中保温30min。
d)在超净台上将激素和抗生素储存液(1000×)逐一添加到热的培养基成分中。
e)混合2×植物凝胶和2×培养基成分。
f)倒入9cm无菌培养皿。
g)如果是R培养基，则需倒入12ml摇菌管，每管倒4ml。
所需添加试剂和激素如下(1L)：
a.诱导培养基：4.3g MS基础培养基+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+350mg肌醇+690mg脯氨酸+1.0mg盐酸硫胺+1.25mg CuSO4·5H2O+2.5mg麦草畏+3.5g植物凝胶，若配制诱导筛选培养基还需在a的基础上添加50mg潮霉素+160mg特泯菌，1M NaOH调至pH＝5.8。
b.转移筛选培养基：2.7g MS培养基(不含硝酸铵)+20g麦芽糖+165mg硝酸铵+750mg谷氨酰胺+100mg肌醇+0.4mg盐酸硫胺+1.25mg CuSO4·5H2O+2.5mg 2,4-D+0.1mg 6-BA+3.5g植物凝胶+40mg潮霉素+120mg特泯菌，1M NaOH调至pH＝5.8。
c.分化筛选培养基：MS微量元素(22.3mg MnSO4·H2O+8.6ZnSO4·7H2O+6.2mgH3BO3+0.25mg Na2MoO4·H2O+0.025mg CuSO4·5H2O+0.025mg CoCl2·6H2O+0.83mg KI)+N6大量元素(2.8g KNO3+0.46g(NH4)2SO4+0.4g K2H2PO4+185mg MgSO4·7H2O+165mg CaCl2·2H2O)+N6铁盐(37.3mg Na2·EDTA·2H2O+27.8mg FeSO4·7H2O)+B5有机成分(1.0mg维生素B1+0.5mg维生素B6+2mg甘氨酸+0.5mg烟酸)+30g麦芽糖+100mg肌醇+690mg脯氨酸+0.1mg2,4-D+1.0mg 6-BA+3.5g植物凝胶+30mg潮霉素+80mg特泯菌，1M NaOH调至pH＝5.8。
d.生根筛选培养基：4.3g MS基础培养基+25g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+350mg肌醇+690mg脯氨酸+1.0mg盐酸硫胺+3.2g植物凝胶+20mg潮霉素+40mg特泯菌，1M NaOH调至pH＝5.8。
最初剥离大麦Golden Promise共485个盾片进行愈伤诱导，除去菌液过量、杂菌污染、愈伤致死等坏死盾片，至见光阶段留有411个完整愈伤，绿点分化率约为70％，最终获得再生转化植株81株，全部提取基因组DNA进行PCR鉴定，共检测到阳性植株52株，阳性率高达64％(见图3)。
如图3所示，其中，引物扩增长度478bp，OE1-81代表转化获得的81株再生苗，检测到阳性条带的共有52株，阳性率超过64％。OE81之后第一条是阳性对照，即引物扩增载体pBract214-HvSTC1片段，揭示了目的条带位置和引物的特异性；第二条是DL2000marker标记，表明目的条带接近500bp指示位置；第三条是阴性对照，即在野生型DNA中进行扩增没有得到条带。由此推算，获得10个阳性lines所需初始幼胚数量约为100个。
实施例二：浙大9号组培再生苗的获得
(1)大麦幼胚的选取和灭菌：取来自人工环境下栽培的大麦品种浙大9号的幼穗，选择种子形状饱满、胚乳胶状，半透明、直径大小为1-3cm的幼胚，摘除麦芒，收集幼胚置于50ml离心管刻度30ml处。在超净台上对种子进行灭菌，操作为：先加入40ml70％酒精上下颠倒30s，用灭菌水清洗3次，再加入现配40ml 50％(v/v)次氯酸钠溶液静置4min，用灭菌水反复清洗5遍，置于垫有3层无菌滤纸的培养皿底座中晾干。
(2)幼胚的分离与愈伤诱导：取上述步骤中的灭菌幼胚于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背朝上，麦芒末段远离操作者。利用双镊子尖端夹击法，左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住幼胚，右手镊子尖端撕扯下破损种皮，露出至少1/2幼胚。找准胚芽鞘与盾片缝隙部位，右手镊子一侧尖端勾住胚芽鞘往里往下剥离，切断在盾片底部凸起部位。在盾片中央用镊子尖端轻划几下造成伤口，取出完整盾片后将其正面轻抚接触诱导培养基，最后盾片正面朝上放入诱导培养基，每皿放60个盾片。23℃黑暗培养4周，每两周更换一次诱导培养基。
(3)愈伤的分化、成苗和炼苗：全程用单层A4纸遮盖培养皿盖，营造在分化阶段的弱光环境。取步骤(2)中淡黄致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块，置于转移培养基中培养两周；再在转移至分化培养基前，剔除颜色发白和褐化的部分，挑选有绿点分化的愈伤块转入分化培养基中继续培养3周；待绿点成苗长至2-3cm时，将其转移到含生根培养基的12ml培养管中，培养3周后根系建成。开盖，加灭菌水(高出液面1-2cm)，在外界环境适应2d，洗净根周围的培养基，先在1/5Hoagland大麦水培培养液中培养1周，再土培繁殖。
(4)培养基的配制见实例一中步骤(5)，但需除去潮霉素和特泯菌这两种抗生素。
浙大9号最初剥离210个盾片进行愈伤诱导，至见光阶段留有138个完整，绿点分化率约为50％(见图4)，最终成苗11株，成苗率约为8％，移至土中培养观察。由图4可知，浙大9号绿点分化率高。
由以上实验结果可知，本发明提供的这种大麦组培方法，简单实用，高效普适，可用于大麦遗传改良及基因功能研究。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种提高大麦组培快速成苗的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)大麦幼胚材料的选择和灭菌：选择直径大小为1-3cm的大麦幼胚，分别用酒精和次氯酸钠表面消毒，降低杂菌污染率；
2)幼胚快速分离与愈伤增殖：准确分离幼胚和胚芽鞘，对盾片进行二次处理，诱导愈伤组织快速发生；
3)农杆菌侵染与筛选培养：根据幼胚的大小调整预培养和农杆菌侵染的时间，预防菌液过量；
4)愈伤的分化、成苗和炼苗：采用弱光遮蔽法进行培养，调整愈伤诱导培养基、分化培养基和生根培养基的抗生素配比和使用时间，诱导愈伤组织快速成苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)大麦幼胚材料的选择和灭菌：选择未成熟胚饱满、胚乳胶状，半透明、直径大小为1-3cm的大麦幼胚，摘除麦芒保持幼胚种皮完整，依次用酒精灭菌，再用现配的次氯酸钠溶液静置，灭菌水反复清洗，晾干；
(2)幼胚快速准确分离与愈伤诱导：
取步骤(1)中灭过菌的幼胚于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末段远离操作者；
利用双镊子尖端夹击法，左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处并始终固定住幼胚，右手镊子尖端撕扯下破损种皮，露出至少1/2幼胚；
找准胚芽鞘与盾片缝隙部位，右手镊子一侧尖端勾住胚芽鞘往里往下剥离，切断在盾片底部凸起部位；
在盾片中央用镊子尖端轻划几下造成伤口，取出完整盾片后将其正面轻抚接触诱导培养基，最后盾片正面朝上放入诱导培养基，每皿可放60-80个盾片；
如需经农杆菌侵染以获得转基因苗，则按步骤(3)操作；
如直接用于愈伤组织诱导，则23℃黑暗培养4-5周，每两周更换一次不含潮霉素和特泯菌的诱导培养基，而后转到步骤(4)；
(3)农杆菌侵染与筛选培养：
按盾片直径d大小依次放入若干诱导培养基，22℃黑暗环境，分别预培养0(d≥3mm)、1(3>d≥2)、2(2>d≥1mm)、3(d＜1mm)d；
使用100μL移液枪吸取农杆菌菌液(MG基本培养液，不含抗生素，OD600＝1.8～2.0)逐个滴加在盾片中央侵染愈伤，其后立即吸回多余菌液，将盾片换至新的诱导培养基；
共培养2-3d后，减少愈伤数目至每皿30-40个，更换两轮诱导筛选培养基，暗培养20-30d；
(4)愈伤的分化、成苗和炼苗：
自愈伤见光起，生根前的分化阶段全程用单层A4纸遮盖培养皿盖，每张A4纸可遮盖6个培养皿，营造弱光环境；
先取步骤(2)或(3)中淡黄致密的愈伤块，每皿15个单独的愈伤块为宜，置于转移(筛选)培养基中培养两周；
再在转移至分化(筛选)培养基前，剔除颜色发白和褐化的部分，挑选有绿点分化的愈伤块转入分化(筛选)培养基中继续培养2-4周；
待绿点成苗后，长至2-3cm时，将其转移到含生根(筛选)培养基的12ml培养管(1/3培养基)中，培养2-4周后根系建成；
炼苗时即开盖，加灭菌水至高出液面1-2cm，在外界环境适应2-3d，洗净根周围的培养基，先在1/2大麦水培营养液中培养1周，再移至营养土中，在适宜条件下培养至收获种子；
若为转化后的愈伤分化与成苗，步骤如上所述，培养基则为转移筛选培养基、分化筛选培养基和生根筛选培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2-4)所述的各培养基组分如下(1L)，其中在农杆菌转化条件下在分化阶段逐渐减少抗生素的使用量，除植物凝胶高压灭菌，其余成分均过滤灭菌：
a.诱导培养基：4.3g MS基础培养基+30g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+350mg肌醇+690mg脯氨酸+1.0mg盐酸硫胺+1.25mg CuSO4·5H2O+2.5mg麦草畏+3.5g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
诱导筛选培养基：a中诱导培养基+50mg潮霉素+160mg特泯菌；
b.转移培养基：2.7g MS培养基(不含硝酸铵)+20g麦芽糖+165mg硝酸铵+750mg谷氨酰胺+100mg肌醇+0.4mg盐酸硫胺+1.25mg CuSO4·5H2O+2.5mg 2,4-D+0.1mg 6-BA+3.5g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
转移筛选培养基：b中转培养基+40mg潮霉素+120mg特泯菌；
c.分化培养基：MS微量元素(22.3mg MnSO4·H2O+8.6ZnSO4·7H2O+6.2mg H3BO3+0.25mgNa2MoO4·H2O+0.025mg CuSO4·5H2O+0.025mg CoCl2·6H2O+0.83mg KI)+N6大量元素(2.8gKNO3+0.46g(NH4)2SO4+0.4g K2H2PO4+185mg MgSO4·7H2O+165mg CaCl2·2H2O)+N6铁盐(37.3mg Na2·EDTA·2H2O+27.8mg FeSO4·7H2O)+B5有机成分(1.0mg维生素B1+0.5mg维生素B6+2mg甘氨酸+0.5mg烟酸)+30g麦芽糖+100mg肌醇+690mg脯氨酸+0.1mg 2,4-D+1.0mg6-BA+3.5g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
分化筛选培养基：c中分化培养基+30mg潮霉素+80mg特泯菌；
d.生根培养基：4.3g MS基础培养基+25g麦芽糖+1.0g干酪素水解物+350mg肌醇+690mg脯氨酸+1.0mg盐酸硫胺+3.2g植物凝胶，1M NaOH调至pH＝5.8；
生根筛选培养基：d中生根培养基+20mg潮霉素+40mg特泯菌。
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CN114027193A (zh) * 2021-11-15 2022-02-11 吉林省白城市农业科学院(吉林省向日葵研究所) 一种提高燕麦花药培养愈伤组织诱导率的培养基

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