CN102876712B - 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法 - Google Patents

一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102876712B
CN102876712B CN201210300322.9A CN201210300322A CN102876712B CN 102876712 B CN102876712 B CN 102876712B CN 201210300322 A CN201210300322 A CN 201210300322A CN 102876712 B CN102876712 B CN 102876712B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seed
brush
plant
wicresoft
seedling
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201210300322.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102876712A (zh
Inventor
王海波
董福双
吕孟雨
张艳敏
任志恒
杨帆
梁新潮
左文博
石学萍
张欢欢
高义平
赵和
徐显
孙果忠
柴建芳
刘永伟
朱金永
韩秋芬
张强
马辉杰
王占武
关军锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Original Assignee
INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES filed Critical INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Priority to CN201210300322.9A priority Critical patent/CN102876712B/zh
Priority to PCT/CN2012/001265 priority patent/WO2014029044A1/zh
Priority to US14/422,661 priority patent/US20150344897A1/en
Publication of CN102876712A publication Critical patent/CN102876712A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102876712B publication Critical patent/CN102876712B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers

Abstract

本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。其技术要点是：将种子萌发1～2d，芽伸长至0.2～2cm时，去除胚芽鞘暴露生长点；用刷毛单根直径4～20μm、露出长度0.5～3mm、根数100～5000根的微创刷蘸农杆菌介导转化液，对生长点实施刺刷，进行较充分的微创转化；完成共培养后进一步发育成苗，促进穗、粒发育，分株收获；T1代进行鉴定。本发明的优点是不需要组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、操作简便、易规模化，适用于所有结种子的单子叶植物。利用本发明涉及的方法，在小麦、水稻、玉米的遗传转化上，分别获得了转化率为49%、66.3%、100%的转化效果。

Description

一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
技术领域
本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，适用于所有结种子的单子叶植物。
背景技术
在诸多植物转基因方法中，农杆菌介导法最被普遍认可。它具有获得的转基因植株育性较高、外源基因多以单拷贝或低拷贝在受体中整合、可转移大片段DNA等优点。但是，目前所有以农杆菌介导为基础的转基因技术，大都离不开组织培养，故存在着受基因型限制、操作复杂、需借助抗性标记筛选、周期长、转化效率低、转化结果不稳定等突出问题。尤其以小麦、水稻、玉米等为代表的单子叶植物的转基因，受基因型限制问题十分突出，严重影响了技术的发展与应用。
植物种子芽生长点是形成生殖器官和地上大部分营养体的原始细胞群。萌发后的单子叶植物种子芽生长点，具有很强的再生能力和发育补偿能力，去掉芽鞘和已分化的微型幼叶后，乃至受到较强的创伤后，仍能发育成正常植株，是实施转基因的理想受体。
有报道和专利虽也注意到了用种子芽生长点做受体的优势，但对生长点的特点研究不够，未形成稳定、简易、高效的技术方案和技术体系，存在较多问题，如：实施转化处理的时间较晚，导致对生长点的转化覆盖度低；对生长点不做任何创伤处理，或创伤方法不佳，造成的生物伤害过重，而转化所需要的创伤却不够，导致转化效果较差；抗性筛选策略使用不当，容易淘汰“被有效转化”了的嵌合体；当代鉴定不合理，假阳性率高，等等。
中国专利《一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法》（专利号：200410075773.2），所述主要步骤包括：1）种子萌发后再4℃春化20-30d；2）含有目的基因农杆菌的活化与重悬；3）对适宜大小的幼苗进行切割，暴露或损伤生长点部位；4）将含有目的基因的农杆菌菌液滴至幼苗切口处；5）幼苗恢复生长以及移至土中培养和抗生素筛选获得转基因植株及子代；6）转基因植株及子代的鉴定。所述适宜大小的幼苗是指2-4cm长的幼苗。
上述专利的主要问题如下：
（1）春化后进行转化，转化时机过晚，减少了转化的有效覆盖度，在创伤方面为农杆菌介导转化提供的条件不充分，且生物伤害重。
（2）操作难度大、分寸不易把握、工作效率不高。
有些报道，用各种针刺伤转化对象生长点，但所用针的直径普遍较粗【African Journal for Biotechnology,2011,10(5):740-750】，有的甚至达710μm【Journal of bioscience and bioengineering, 2005，100(4): 391-397；2006，102(3):162-170】，对生长点造成的生物伤害重，而对转化所需的创伤则造成得不够。有些报道，则是用手术刀片划几下，造成的转化所需的创伤不充分，转化效果不佳；还有不少报道不做任何创伤处理，就用农杆菌进行转化，转化效果难以保障。
总之，很多以生长点为转化对象的专利或报道，仍然未离开“离体培养”环节，而且使用的抗性筛选的策略不够科学。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种不依赖组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、转化效率高、转化效果稳定、操作简易方便、实用性强、易于规模化、耗费成本低的充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。
本发明采用如下技术方案：
一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于：
（1）受体及侵染液的准备
挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗，25℃下浸泡7～10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28℃暗培养发芽1～2d；所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；
划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm暗培养至菌液OD600=0.5～0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5～1/2所述LB液体培养基的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS的盐、10g/L葡萄糖、40g/L麦芽糖，pH 5.6；
（2）芽生长点暴露与微创转化
①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到0.2～2cm时，对于籽粒较大的植物芽伸长到0.3～1cm时，实施转化处理；
所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉米；
②暴露生长点的方法
对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶；
③用微创转基因刷转化
用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷2～3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有2层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置10～40粒种子；
（3）共培养
往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为0.5～3ml，盖上皿盖，置于25℃暗培养3d；
（4）苗培养
将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器，25℃、光照12h/d培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养7d就移栽于温室，或完成共培养后就直接移播于温室，罩上塑料薄膜，7～10d后揭膜；
对于需春化处理的冬小麦，则先25℃、光照12 h/d培养7d，然后转到8℃的春化箱内春化处理20～30d，具体天数因品种而定；
（5）幼苗移栽
苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田；
（6）苗及植株管理
采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；
（7）分子检测与鉴定
在T0代不进行检测，以免结果不真实；将T0代植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在T1代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料，进行Southern blot检测予以确证。
所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4～20μm，每刷的刷毛根数为100～5000根，刷毛露出长度为0.5～3mm。
所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8～18μm，每刷的刷毛根数为大于100根、小于等于2000根，刷毛露出长度为1～2mm。
所述“刺刷”为即刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。
所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、黍子和高粱。
本发明的技术原理如下：
申请人研究发现：（1）萌发后的小麦、玉米、水稻种子去掉芽鞘后即可实施遗传转化处理，对于谷子、黍子、高粱等也如此。据此申请人确定了转化种子芽生长点的最早适宜时期。（2）水稻种子芽生长点细胞的直径约25μm、小麦种子芽生长点细胞的直径约60μm、玉米种子芽生长点细胞的直径约50μm。要获得好的转化效果，必须对生长点进行充分的微创伤。为此，申请人发明了由若干根（100～5000根）微米级刚性纤维（即不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维，单根直径4～20μm）组成的可对生长点细胞实施较充分微创伤的转基因工具——微创转基因刷，简称“微创刷”或“转基因刷”。用这种微创刷蘸农杆菌介导转化液对生长点细胞实施较充分的微创转化，可获得很好的转化效果。（3）适当控制转化处理后种子芽生长点的水势，可保护受微创的细胞不胀破、促进农杆菌与受创细胞的结合，进而提升转基因的效果。（4）微创转化处理后的种子芽生长点，可以基本不受影响地发育成正常植株并开花结实，比一般的转化技术耗时少。（5）将转化处理后长成的植株（T0）所结的种子分株收获，再将种子萌发成苗（T1）进行鉴定，不必抗性筛选，结果具体而准确。
在此基础上，申请人还建立了评价这种转基因技术的专门指标：
损伤率与成苗率：用“微创刷”刺刷生长点时，有些种子的芽生长点难免会因受伤过重而不能成苗。这类种子所占的百分率，即为“损伤率”；与之对应的便是“成苗率”。
Figure 2012103003229100002DEST_PATH_IMAGE001
转化率：转化处理后，所有长成植株中“有转化种子的植株”所占的百分率。
Figure 2012103003229100002DEST_PATH_IMAGE002
转化度：单株种子总粒数中，“转化种子”所占的百分率。此指标反映的是生长点被转化的程度。
Figure 2012103003229100002DEST_PATH_IMAGE003
本发明的有益效果是使农杆菌介导的单子叶植物转基因方法具备了不再依赖组织培养、不再受基因型限制、不再必须抗性筛选，具有操作简易方便、转化效率高、转化效果稳定、实用性强、易于规模化、耗费成本低等诸多优点，适用于所有结种子的单子叶植物。
附图说明
图1为微创刷的结构示意图。图中，A：刷毛材质为不锈钢纤维的微创刷，B：刷毛材质为玻璃纤维的微创刷，C：刷毛材质为碳硅纤维的微创刷，a：刷毛单根直径为8μm、刷毛根数为4000根（不锈钢纤维）的微创刷，b：刷毛单根直径为4μm、刷毛根数为200根（不锈钢纤维）的微创刷，c：刷毛单根直径为16μm、刷毛根数为200根（不锈钢纤维）的微创刷。
图2为重要禾本科植物芽生长点纵切显微观察图片。图中，A为小麦芽生长点纵切显微观察图片，B为水稻芽生长点纵切显微观察图片，C为玉米芽生长点纵切显微观察图片。
图3为典型单子叶植物—小麦生长点微创转化关键图片集锦。图中，a为掰芽暴露生长点图片，b为生长点放大观察图（圆圈所框部分即生长点的位置），c为微创转基因刷（局部），d为用微创刷转化生长点的实况图，e为转化后的种子，f为转化后的芽发育情况，g为T0代苗，h为T0代植株，i为T0代植株结的种子（T1的始点），j为T1代幼苗的抗性鉴定（白化的为非抗性株，未白化的为抗性株，抗性株叶子被剪用于分子鉴定），k为PCR检测结果图。
图4为所有参试单子叶植物生长点微创转化当代及后代植株图片集锦。图中，a为转基因防护温室，b为转基因小麦T1代幼苗，c为转基因水稻T2代植株（结实），d为转基因玉米T2代植株，e为转基因谷子T0代植株，f为转基因高粱T0代植株。
图5为小麦T1植株的GUS基因PCR检测。图中，1～21为被检测样品，22为空白对照，23为阴性对照，24为阳性对照，25为DL2000 marker。
图6为小麦GUS基因 PCR–Southern检测。图中，CK为阳性对照，1为空白对照，2为阴性对照，3～11为检测样品。
图7为小麦基因组Southern blot结果。图中，1～6为检测样品，7为空白对照，8为阳性对照，M为marker。
图8为水稻T1植株的BAR基因PCR检测结果。图中，1为DL2000 mark，2为阳性对照，3为空白对照，4为阴性对照，5～25为被测样品。
图9为玉米T1植株BAR基因 PCR检测结果。图中，M为DL2000 mark，CK+为阳性对照，CK－为阴性对照，1～16为被测样品。
图10为玉米T1植株基因组Southern检测结果。图中，M为mark，1～6为被测样品，7为空白对照，8为阴性对照，9为质粒，10为PCR产物。
图11为玉米第26批转化实验T2植株基因组的Southern blot分析结果。图中，BADH基因表现了双拷贝遗传。
具体实施方式
实施例1：利用微创刷转化冬小麦种子芽生长点的实验
（1）材料与方法
小麦品种：“石4185”。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：gus + npt-II，构建于pCAMBIA2201质粒中。
挑取单菌落，接到50ml含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基中，于28℃、220rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/2所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400/L MES，1/10 MS盐，10g/L葡萄糖，40g/L麦芽糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
选取饱满整齐的种子90粒，25℃浸泡7h后，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜28℃暗培养1d；86粒正常萌芽，胚芽鞘长度达到0.2～0.5cm，用摄子掰芽暴露生长点，用微创转基因刷（规格：刷毛单根直径为12μm、每刷刷毛根数为5000根、刷毛露出长度为3mm）蘸取农杆菌介导转化液对准芽生长点刺刷2～3次，然后按芽生长点向上的方向摆放于灭过菌的加有2层滤纸、0.5ml无菌水的直径90mm的玻璃皿中，每皿中放置40粒种子，盖上皿盖，置于25℃暗培养3d。完成共培养后，将被转化的种子转入装有蛭石的培养钵内，浇水浸润蛭石，于25℃、光照12h/d培养恢复生长7d，转入8℃的春化箱内春化20d。完成春化后移栽于按转基因要求进行防控的温室，成熟后分株收获。
将单株收获的种子，按T0株号分组浸泡于75mg/L的卡那霉素水溶液里（按平均每粒种子1mL加液），浸种至露白（25℃、1d），然后播种于装有蛭石的营养钵，将蛭石用水浸润，于25℃、光照12h/d培养7d，统计绿苗率和出现绿苗的T0代株数。将绿苗逐株剪取部分叶片后，置于8℃、光照12h/d条件下春化25d。
将剪取的叶片分别提取DNA，用GUS基因的引物（上游：5′- CAA CGA ACT GAA CTG GCA G -3′；下游：5′- CAT CAC CAC GCT TGG GTG -3′）进行PCR检测。根据单株籽粒苗（T1）出现PCR阳性结果的情况测算转化度；根据T0代株是否出现PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。随机选取PCR阳性株重新提取基因组DNA，进行PCR-Southern blot。根据PCR-Southern blot结果再进行总基因组Southern blot检测确证（委托美博莱公司完成）。
（2）实验结果
90粒种子中86粒正常萌芽，对所有正常萌芽的种子进行转化，62株成苗并移栽成活，损伤率28%。其中，53株正常结实，9株因管理不善种子干瘪。分别收取53个T0株上的种子进行卡那霉素抗性鉴定，43个株系出现抗性绿苗，T0抗性率达81.1%（43÷53×100%）。对来自43个T0株系的373株绿苗进行PCR检测（图5），有111株为PCR阳性，来自于26个T0株系。以53个T0株为基数进行推算，转化率达49%（26÷53×100%）。26个结阳性后代的T0株中，转化度最高的为37.1%（23÷62×100%，即单株结实为62粒，萌苗后经PCR检测23株为阳性）；转化度最低的为2.6%（1÷39×100%，单株结实39粒，萌苗后1株PCR阳性）。随机选取9个PCR阳性株进行PCR-southern blot检测，全部杂交出与阳性质粒相同的条带（图6），进行Southern blot鉴定，也获得了阳性结果（图7），证明外源基因整合到了小麦基因组中。
实施例2：利用微创刷转化不同基因型小麦种子芽生长点的实验
（1）材料与方法
小麦品种：“金禾9123”、“中国春”、“Bobwhite”。
农杆菌株：C58C1
外源基因：gus + npt-II，构建于pCAMBIA2201质粒中。
挑取单菌落，接到50ml含50mg/l卡那霉素+40mg/l利福平的LB液体培养基中，于28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.5，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400/L MES，1/10MS盐，10g/L葡萄糖，40g/L麦芽糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
分别选取3个小麦基因型的合格种子，25℃下浸泡10h后，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28℃暗培养1d；芽伸长到0.2～0.4cm，用镊子掰芽暴露生长点，用微创转基因刷（规格：刷毛单根直径为18μm、刷毛根数为100根、刷毛露出长度为3mm）蘸取农杆菌介导转化液对准生长点刺刷2～3次，然后按芽生长点向上的方向摆放于灭过菌的加有2层滤纸、0.5ml无菌水的直径90 mm的玻璃皿中，盖上皿盖，置于25℃暗培养3d。完成共培养后，将被转化的种子转至装有蛭石的钵器，浇水浸润蛭石，于25℃、光照12h/d培养恢复生长7d。此后，对于春性品种直接移栽于按转基因要求进行防控的温室；对于冬性品种转入8℃的春化箱内春化30d，然后再移栽于温室。成熟后分株收获种子。
将单株收获的种子，按T0代株号分组浸泡于75mg/L的卡那霉素水溶液里（按平均每粒种子1mL加液），浸种至露白（25℃、1.5d），然后播种于装有蛭石的营养钵，将蛭石浇水浸润，于25℃、光照12h/d培养7d，统计绿苗率和出现绿苗的T0代株数。将绿苗逐株剪取部分叶片后，冬性品种置于8℃、12h/d光照条件下春化30d；春性品种直接移栽于温室。
将剪取的叶片分别提取DNA，用GUS基因引物（上游：5′- CAA CGA ACT GAA CTG GCA G -3′；下游：5′- CAT CAC CAC GCT TGG GTG -3′）进行PCR。根据单株籽粒苗（T1）中出现PCR阳性的结果情况测算转化度；根据T0代植株是否出现PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。
（2）实验结果
用微创刷转化“金禾9123”、“中国春”、“Bobwhit”3个基因型的种子芽生长点均获成功，表明利用微创转基因刷转化小麦芽生长点可适应于多个基因型。
①“金禾9123”：对60粒正常萌芽种子的生长点实施转化，有50粒发育成株并正常结实。其中，有29个株系出现抗性绿苗，绿苗总数达181株。对所有的绿苗（T1）进行PCR检测，有77株为PCR阳性，分别来自于17个T0株，转化率为34.0%（17÷50×100%）。
②“中国春”：对30粒正常萌芽的种子实施转化，有15株正常结实。其中，有7个株系出现了抗性绿苗，共59株。对所有绿苗进行PCR检测，有29株为PCR阳性，分别来自于5个T0株，转化率为33.3%（5÷15×100%）。
③“Bobwhit”：对30粒正常萌芽的种子实施转化，有21株发育至正常结实。其中，有8个株系出现了抗性绿苗，共 47株。对所有绿苗进行PCR检测，有23株为PCR阳性，分别来自于6个T0株，转化率为28.6%（6÷21×100%）。
实施例3：利用微创刷转化水稻种子芽生长点的实验
（1）材料与方法
水稻品种：“龙稻10”。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：gus + bar，构建于pCAMBIA3301质粒中。
挑取单菌落，接到50ml含50mg/l卡那霉素、40mg/l利福平的LB液体培养基中，于28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于1/2所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES，1/10 MS盐，10g/L葡萄糖，40g/L麦芽糖，pH 5.6）摇匀制备成转化液。
选取饱满整齐的种子120粒，去除种壳，消毒后摆放在经过高温灭菌带有2层滤纸并加有8ml无菌水的直径90mm培养皿中，28℃萌发1.5d，117粒正常萌芽，芽长度达到0.2cm左右。用镊子掰芽暴露生长点，用微创转基因刷（规格：刷毛单根直径为8μm，刷毛根数为200根，刷毛露出长度为0.5mm）蘸取转化液对准生长点刺刷2～3次，摆放于滴加1mL无菌水、灭过菌的含2层滤纸、直径90 mm的无菌培养皿中，置于25℃暗培养3d。共培养结束后，移播于按要求防护的温室，上面铺盖草苫，每天喷水2次，温度控制在25℃，7d后揭去草苫，正常管理至成熟。成熟后单株收获，并将每株的主穗与分孽穗分开保存。
将单株收获的种子，按T0代植株分组从每个主穗上均匀选取10粒种子，进行萌发后播种于温室中（若选取的10粒种子经检测均为阴性，则把该T0代株主穗其余的种子全部萌发后播种成苗检测），当其长至1叶1心时，剪取的部分叶片分别提取DNA，用BAR基因引物（上游：5′- TCA AAT CTC GGT GAC GGG CA -3′；下游：5′- GGT CTG CAC CAT CGT CAA CC -3′）进行PCR。根据单株籽粒苗（T1）出现PCR阳性的结果情况测算转化度；根据T0株是否出现PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。
（2）实验结果
120粒种子中，有117粒正常萌发。对正常萌芽种子实施转化后，77株成苗并移栽成活，损伤率34.2%，其中71株结实、6株因管理不善未能结实。分别收取71个T0株上的种子，按T0株分组从每个主穗上均匀选取10粒种子进行萌发后播种。长至1叶1心时，提取基因组DNA进行PCR检测（图8），结果表明：被检测的786株中，有153株为PCR阳性，来自于47个T0代株系。由此推算，转化率达66.3%（47÷71×100%）。47个阳性T0代株的“参考转化度”（因未全部对所结种子进行检测而这样表述）最高的为：100%，即检测10株，10株全部为阳性；最低转化度为4.8%，检测21株，1株为阳性。
实施例4：利用微创刷转化水稻种子芽生长点导入BADH基因的实验
（1）材料与方法
水稻品种：“中花11”。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：badh + npt-Ⅱ，构建于pBIN438质粒中。
挑取单菌落，接到50ml含50mg/l卡那霉素、40mg/l利福平的LB液体培养基中，于28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.5，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES，1/10 MS盐，10g/L葡萄糖，40g/L麦芽糖，pH 5.6）摇匀制备成转化液。
选取饱满整齐的种子10粒，去除种壳，消毒后摆放在经过高压灭菌带有2层滤纸并加有8ml无菌水的直径90mm培养皿中，28℃条件下萌发1.5d，26粒正常萌芽，芽长度达到0.2cm左右，用镊子掰芽，用微创转基因刷（规格：单根直径为8μm、每刷根数为300根，刷毛露出长度为1mm）蘸取转化液对准生长点部位刺刷2～3次，摆放于滴加1mL无菌水、灭过菌的含2层滤纸、直径90 mm的无菌培养皿中，置于25℃暗培养3d。共培养结束后，移播于温室，上面罩盖塑料薄膜。10d后揭去薄膜，正常管理至成熟。成熟后按单株收获，并分别保存。将收获的种子，按T0株分组分别萌发后播种于温室，当长至1叶1心时，分别剪取部分叶片提取DNA，用BADH基因的引物（上游：5′- ATT GGC ATC TGT GAC TT -3′；下游：5′-CAC TCG CTT GAC TCC TTC -3′）进行PCR。根据每个T0单株籽粒苗（T1）出现PCR阳性的情况测算转化度；根据T0株是否出现PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。
（2）实验结果
所选10粒种子均正常萌芽，对其实施转化后，7株成苗并移栽成活，有4株结实。分别收取4个T0株系上的种子，按T0株分组萌发播种所有的种子，得91株苗。长至1叶1心时，提取基因组DNA进行PCR检测，有9株为PCR阳性，来自于2个T0株系。由此推算，转化率达50%（2÷4×100%）。其中：株系3，PCR检测12株，有6株为阳性，转化度为50%（6÷12×100%）；株系4，PCR检测也是12株，有3株为阳性，转化度为25%（3÷12×100%）。
实施例5：利用微创刷转化玉米种子芽生长点的实验
（1）材料与方法
转化对像：玉米自交系HY489。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：bar+bt+pta，构建于pCAMBIA3300。
挑取单菌落，接种到50ml含有50mg/L卡那霉素+40mg/L利福平的LB液体培养基中，于28℃、220 rpm培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于1/2所述LB液体培养基体积的侵染基液（100μmol/L AS、100mg/L F68、400 mg/L MES，1/10MS盐，10g/L葡萄糖，40g/L麦芽糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
选取饱满整齐无霉变的种子20粒，于2%的次氯酸钠溶液（20ml）中消毒20min，无菌水洗5遍，放入灭过菌、加有2层滤纸的直径90 mm玻璃培养皿中，加13ml无菌水，盖上皿盖，28℃暗培养2d，胚芽鞘长度达0.3～0.6cm。
将萌发的种子去除胚芽鞘，暴露出茎生长点，用刷毛单根直径为20微米、刷毛根数为2000根、刷毛露出长度为3mm的微创转基因刷，蘸取转化液对准茎生长点刺刷2～3次，摆放于灭过菌的、含2层滤纸的直径90mm的玻璃培养皿中，加3ml无菌水，盖上皿盖，25℃暗培养3d。完成共培养后，将被转化的种子转入装有蛭石的培养钵，用水湿润蛭石，于25℃、自然光照下培养恢复生长7d，移栽到按标准防护的温室，待植株长至抽雄抽丝期，适时套袋防护，并自交。
按T0代株分组将收获的种子萌发，在T1代提取叶片DNA进行PCR检测，根据检测结果计算转化率和转化度。对PCR检测阳性的部分植株送交北京美莱博医学科技有限公司进行Southern blot检测鉴定。
（2）实验结果
所选的20粒玉米种子中，15粒发芽良好，对其种子芽生长点实施转化处理后，有9个发育成株，其中3株因管理不善夭亡、6株结实。取这6个植株所结的部分种子（每株20粒）萌苗（T1）提取DNA进行PCR鉴定（图9），测得39株为阳性，来自于5个T0株。其中，第3号株一开始没检测到阳性，后又从3号株所结种子中取36粒再次萌苗检测，有7株为阳性。由此测得，6个T0株均有阳性后代产生，转化率达了100%，参考转化度为5%～70%（见汇总表）。Southern blot结果显示，外源基因以单拷贝的形式整合到了玉米基因组（图10）。
玉米生长点为创转化的参考转化度汇总表
T0株号 1 2 3 4 5 6
检测株数（T1） 20 20 20+36 20 20 20
阳性株数（T1） 14 1 7 5 10 9
参考转化度（%） 70 5 12．5 25 50 45
另外，在对第26批玉米转化实验后代（T2）的基因组Southern blot测验中，获得了目标基因双拷贝遗传的结果（图11）。
实施例6：利用微创刷转化谷子、黍子、高粱芽生长点的实验
（1）材料与方法
转化对象：黄谷、红谷；红黍、白黍；高粱。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：gus + npt-II，构建于pCAMBIA2201质粒中。
挑取单菌落，接到50ml含50mg/l卡那霉素、40mg/l利福平的LB液体培养基中，于28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，重新悬浮于1/3所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68，1/10MS盐，400mg/L MES，10g/L葡萄糖，40g/L麦芽糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
选取黄谷、红谷、红黍、白黍、高粱饱满整齐的种子，分别去除种壳、消毒后摆放在经过高压灭菌带有2层滤纸并加有8ml无菌水的直径90mm培养皿中，28℃条件下萌发1.5d，此时芽伸长至0.1～2cm(此时三类作物的地中茎长度均已伸长，谷子＞黍子＞高粱)，在紧靠地中茎和生长点结合部形成的折光带的上方切去叶鞘及伸长的小叶片暴露生长点，用微创转基因刷（黄谷、红谷所用微创转基因刷规格：刷毛单根直径为4μm，每刷根数为90根，刷毛露出长度为0.5mm；红黍、白黍所用微创转基因刷规格：刷毛单根直径为8μm，每刷根数为100根，刷毛露出长度为1.0mm；高粱所用微创转基因刷规格：刷毛单根直径为10μm，每刷根数为300根，刷毛露出长度为1.5mm）蘸取转化液对准生长点刺刷2～3次，摆放于滴加1mL无菌水、灭过菌的含2层滤纸、直径90 mm的无菌培养皿中，置于25℃暗培养3d。共培养结束后，移播于温室，上面罩盖塑料薄膜。10d后揭膜，正常管理至成熟。
单株收获每个结实株的种子，并将穗子顶部1/10的籽粒做进一步分收，分别从顶部籽粒中选取10种子，按T0代株号分组萌发播种于温室，待长至2叶1心时，剪取部分叶片分别提取DNA，用gus的引物（下游：5′- CAA CGA ACT GAA CTG GCA G -3′；下游：5′- CAT CAC CAC GCT TGG GTG -3′）进行PCR。根据T0单株是否出现PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。
（2）实验结果
三种作物5个品种经对种子芽生长点微创转化后，均获得转基因株，证明了利用微创刷进行转化的广泛适应性。详细情况如下：
①黄谷：对17粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有13粒发育成株并正常结实，对各T0株系的T1幼苗进行PCR检测，有5个株系出现PCR阳性苗，转化率达38.5%（19÷40×100%）。
②红谷：对31粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有29粒发育成株并正常结实，对各T0株系的T1幼苗进行PCR检测，有15个株系出现PCR阳性苗，转化率达51.7%（15÷29×100%）。
③红黍：对22粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有20粒发育成株并正常结实，对各T0株系的T1幼苗进行PCR检测，有13个株系出现PCR阳性苗，转化率达65.0%（13÷20×100%）。
④白黍：对42粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有40粒发育成株并正常结实，对各T0株系的T1幼苗进行PCR检测，有19个株系出现PCR阳性苗，转化率达47.5%（19÷40×100%）。
⑤高粱：对17粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有15粒发育成株并正常结实，对各T0株系的T1幼苗进行PCR检测，有11个株系出现PCR阳性苗，转化率达73.3%（11÷15×100%）。

Claims (4)

1.一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于：
（1）受体及侵染液的准备
挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗，25℃下浸泡7 ～ 10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2 层滤纸、直径为90mm 的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28℃暗培养发芽1 ～ 2d ；所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；
划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L 卡那霉素、40mg/L 利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm 暗培养至菌液OD600=0.5 ～ 0.6，4000rpm、5min 离心收集菌体，弃上清液加入1/5 ～ 1/2 所述LB 液体培养基体积的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS 的盐、10g/L 葡萄糖、40g/L 麦芽糖，pH 5.6 ；
（2）芽生长点暴露与微创转化
①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到0.2 ～ 2cm 时，对于籽粒较大的植物芽伸长到0.3 ～ 1cm 时，实施转化处理；
所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉
米；
②暴露生长点的方法
对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶；
③用微创转基因刷转化
用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷2 ～ 3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有2 层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置10 ～ 40 粒种子；
（3）共培养
往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为0.5 ～ 3ml，盖上皿盖，置于25℃暗培养3d ；
（4）苗培养
将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器，25℃、光照12h/d 培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养7d 就移栽于温室，或完成共培养后就直接移播于温室，覆罩上塑料薄膜，7 ～ 10d 后揭膜；
对于需春花处理的冬小麦，则先25℃、光照12 h/d 培养7d，然后转到8℃的春化箱内春化处理20 ～ 30d，具体天数因品种而定；
（5）幼苗移栽
苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田；
（6）苗及植株管理
采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；
（7）分子检测与鉴定
在T0 代不进行检测，以免结果不真实；将T0 植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在T1 代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR 检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR 检测；对经PCR 鉴定为阳性的材料，进行Southern blot 检测予以确证；
所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4 ～ 20μm，每刷的刷毛根数为100 ～ 5000 根，刷毛露出长度为0.5 ～ 3mm。
2.根据权利要求1 所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8 ～ 18μm，每刷的刷毛根数为大于100 根、小于等于2000 根，刷毛露出长度为1 ～ 2mm。
3.根据权利要求1 或2所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述“刺刷”为即刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。
4.根据权利要求3 所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、黍子和高粱。
CN201210300322.9A 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法 Expired - Fee Related CN102876712B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210300322.9A CN102876712B (zh) 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
PCT/CN2012/001265 WO2014029044A1 (zh) 2012-08-22 2012-09-14 充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
US14/422,661 US20150344897A1 (en) 2012-08-22 2012-09-14 Monocotyledon transgenic method for invading growing points of seed buds minimally and fully

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210300322.9A CN102876712B (zh) 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102876712A CN102876712A (zh) 2013-01-16
CN102876712B true CN102876712B (zh) 2014-01-29

Family

ID=47478227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210300322.9A Expired - Fee Related CN102876712B (zh) 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20150344897A1 (zh)
CN (1) CN102876712B (zh)
WO (1) WO2014029044A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074367A (zh) * 2013-01-27 2013-05-01 安徽科技学院 一种苏丹草胚接种转基因技术
CN103497970B (zh) * 2013-09-04 2015-06-24 吉林省农业科学院 以玉米胚珠为受体的转基因方法
CN103451230A (zh) * 2013-09-23 2013-12-18 江苏省农业科学院 一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法
EP3115456A4 (en) 2014-03-06 2017-10-25 Riken Plant transformation method
CN105002210A (zh) * 2015-08-31 2015-10-28 四川农业大学 一种高效对结缕草进行转基因的方法
BR112019018059A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, método para produzir um polipeptídeo, método de controle de ervas daninhas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
BR112019018175A2 (pt) 2017-03-07 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
CN107022565B (zh) * 2017-04-07 2019-11-05 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种玉米种子芽生长点转基因方法
CN109652438A (zh) * 2018-12-25 2019-04-19 河南农业大学 一种基于小麦种胚注射农杆菌的小麦遗传转化方法
CN110607323A (zh) * 2019-09-24 2019-12-24 四川育良生物科技有限公司 一种农杆菌介导水稻遗传转化方法
CN111235176B (zh) * 2020-01-17 2020-12-01 北京农学院 一种遗传转化体系
CN112375778A (zh) * 2020-09-03 2021-02-19 潍坊学院 一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法
CN113348806A (zh) * 2021-07-01 2021-09-07 浙江省农业科学院 一种促进兰花假鳞茎侧芽提前萌发的方法
CN113604497B (zh) * 2021-07-28 2023-03-24 浙江大学 一种禾本科植物的遗传转化方法
CN113481235A (zh) * 2021-08-17 2021-10-08 南京农业大学 一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法
CN114946653A (zh) * 2022-05-09 2022-08-30 鲁东大学 一种菠萝苗再生方法及腋芽生长点转化方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1277928C (zh) * 2004-12-30 2006-10-04 山东大学 一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法
CN201459148U (zh) * 2009-06-12 2010-05-12 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种植物芽生长点微创转基因刷
CN102021198A (zh) * 2009-09-11 2011-04-20 辽宁师范大学 利用萌发种子胚芽鞘转化外源基因的方法
US20110162111A1 (en) * 2009-12-31 2011-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for transforming somatic embryos
CN102321662A (zh) * 2011-07-14 2012-01-18 中国科学院植物研究所 植物茎尖转化方法及其专用工具

Also Published As

Publication number Publication date
CN102876712A (zh) 2013-01-16
WO2014029044A1 (zh) 2014-02-27
US20150344897A1 (en) 2015-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102876712B (zh) 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
CN104542299B (zh) 一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法
CN103966258B (zh) 一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法
CN104542256B (zh) 一种籼稻稻曲病抗性高效导入粳稻的育种方法
CN102864165B (zh) 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法
CN102660554B (zh) 大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST1及其应用
CN103205459A (zh) 一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法
CN104488694A (zh) 一种快速培育转基因玉米自交系的方法
CN102212552A (zh) 一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法
CN102676541B (zh) 大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2及其应用
CN102934607B (zh) 以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法
CN106718866A (zh) 一种芦笋全雄育种方法
CN109735538A (zh) 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
CN101736028B (zh) 一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法
CN105567730A (zh) 一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法
CN103340180B (zh) 一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法
CN111296278A (zh) 一种选育抗根肿病大白菜的方法
CN104620983B (zh) 一种稗草组织培养成苗的方法
CN106811482A (zh) 三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法
CN103173487A (zh) 一种周年大规模转化玉米的方法
CN107022565B (zh) 一种玉米种子芽生长点转基因方法
CN102021198A (zh) 利用萌发种子胚芽鞘转化外源基因的方法
CN111357642B (zh) 一种大白菜的育种方法
CN107646681A (zh) 一种提高大麦组培快速成苗的方法
CN103798125A (zh) 一种获得十字花科蔬菜新种质的方法及其应用方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140129

Termination date: 20190822

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee