CN103451230A - 一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运用根癌农杆菌介导的水稻转基因方法。不进行愈伤组织培养，将沾有外源基因的根癌农杆菌菌液的接种针直接侵染受体水稻种子的胚芽生长点，完成转基因操作。分别选用含转化质粒pBI121-GUS的农杆菌和pCDMARUBA-Hyg的农杆菌为转化载体菌株，以粳稻南粳45与南粳47和籼稻9311为转基因受体水稻品种验证了本发明。本方法与传统的农杆菌介导法不同的是，本方法不需诱导愈伤组织以及之后的一系列组织培养过程，节省了大量的人力和财力，且时间比较短；克服了在其它方法中籼稻品种难以转化的问题；转化载体可不必插入标记基因，具有简单、快速、高效、通用、安全的优点，是一种改良的水稻转基因新技术。

Description

一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法

技术领域

本发明涉及一种运用根癌农杆菌介导的简单、快速、高效的水稻转化方法的建立，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。

背景技术

人口、资源、环境一直是人类生存与发展所面临的主要问题。近年来，由于人口增长、气候变化等因素，出现了全球性的粮食短缺，主要农产品价格快速上涨，在世界范围内造成了粮食危机与恐慌。而水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，进一步提高水稻产量具有极其重要的意义。但是，可利用的耕地和淡水资源逐年减少，大量使用农药、化肥导致环境严重污染同时增加了农业生产成本和农民负担，农业生态系统遭受严重破坏，因此，确保粮食安全的根本途径在于提高作物单产。依靠惯有方法很难培育出在产量潜力上有大突破的新品种。近二十几年来，通过转基因技术培育转基因高产作物不断传出佳讯。转基因技术作为一种可持续发展的方式，可提高农作物产量和品质，具有良好的发展潜力和前景，将为世界农业发展注入新的动力^[1]。

目前，在水稻育种上相继开发研究的转基因技术有以农杆菌为主导的载体介导转基因技术；以基因枪、PEG等介导的基因直接导入技术和以花粉管通道转化、生殖细胞浸泡吸收为主的种质系统转化技术，尤以农杆菌介导技术、基因枪导入技术和花粉管通道技术的研究报道最多，其中农杆菌介导技术占64%^[2]。

以载体介导的转化，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，主要的方法就是农杆菌介导法。农杆菌细胞内的Ti质粒或Ri质粒具有一段T-DNA，可通过农杆菌侵染植物伤口进入细胞，并插入到植物基因组中。通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染，可实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株^[3]。自从1978年Chilton等^[4]第一次利用农杆菌的Ti质粒为载体将T-DNA上的胭脂碱基因转入烟草细胞以来，根癌农杆菌在双子叶植物转化中得到了广泛应用。1986年，Baba等^[5]通过PEG法将农杆菌原生质球与水稻原生质体融合，获得了能够合成胭脂碱的水稻转化组织。之后，科学界开始对农杆菌介导的水稻转化进行了广泛的研究，试图通过转基因技术来提高水稻产量、改良品质和增强抗性^[6-8]。但是，由于国内外各个实验室所使用的基因型、外植体的不同和培养环境条件的差异，造成了各个转化体系中的结果不尽相同，转化率也普遍不高。所以，近二十几年来，不同研究人员分别从Ti质粒的改造、转化载体的构建和组织培养方面入手，不断优化农杆菌介导的水稻转化方法，以期提高转化效率。一是选择最适农杆菌及优化载体。由于不同基因型水稻接受农杆菌菌株的亲和性不同，所以选取合适的农杆菌菌株和优良的质粒对转化来说非常重要。用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1。李双成等^[9]以3个籼稻品种和2个粳稻品种为对象，对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的因素进行了研究，发现菌株AGL1和EHA105按一定比例混合共转化，对抗性愈伤率有显著影响。现在水稻农杆菌介导应用最多的是EHA105菌株。

对天然Ti质粒的改造，最初只有共整合载体到现在的共整合载体、双T-DNA载体、双元载体、超级双元载体都可利用；在转化频率不断提高的同时，在去选择标记上也不断取得进步。1996年，Komari等^[10]构建了所谓的“超级双元载体”，以该载体转化农杆菌LBA4404菌株，阳性菌液侵染水稻愈伤组织，共转化率可达47%，转化植株自交后代中，约65%的植株只含报告基因而不含标记基因。2004年，殷丽青等^[11]运用农杆菌介导的双T-DNA法培育含反义蜡质基因的无选择标记水稻，获得了55.4%的共转化率，转化植株自交后代有29.2%的植株中只含有目的基因而不含选择标记基因。夏志辉^[12]利用DRB双元载体培育无选择标记的转基因水稻。2005年，朱祯、李旭刚发明了一种利用双T－DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法，单子叶植物表达载体中含两个独立T－DNA结构域且带MAR(matrixattachment region)序列，提高了获得稳定的无选择标记的转基因水稻的比率，并将该体系申请了专利^[13]。2007年，朱丽等^[14]尝试利用共转化和花药培养技术相结合，快速获得了纯合的无选择标记的三价转基因水稻。这种方法仅需要一代即可获得纯合的目的植株，大大加快了研究进程。

二是优化组织培养因素。1996年，Rashid等^[15]利用Hiei等^[16]的转化体系得到了较多的转基因水稻植株。Aldemita等^[17]报道，利用农杆菌介导转化籼稻品种IR72和TCS10，稳定转化率为1%～5%。1999年，Khanna等^[18]利用农杆菌介导转化水稻，来源于根尖、芽尖、幼苗以及成熟胚盾片的愈伤组织都表现出较高的稳定转化频率。2001年，陈秀花等^[19]以GUS基因的瞬时表达为依据，研究了农杆菌介导转化水稻的影响因素，指出预培养4～5天的幼胚是较为理想的转化受体材料；在共培养基中添加较高浓度的乙酰丁香酮可提高GUS基因的瞬间表达频率，按此条件进行双菌共转化，抗性愈伤组织的转化率最高可达70%。2004年，夏志辉^[12]利用DRB双元载体培育无选择标记的转基因水稻，并对转化效率的影响因素做了研究，(1)确定了转化过程中的最佳侵染浓度为OD600=0.2；(2)MS培养基比CC培养基更适合水稻成熟胚愈伤组织的诱导，但CC培养基比MS培养基更适合成熟胚愈伤组织的继代培养；(3)水稻尤其是籼稻在分化过程中对潮霉素(Hyg)最为敏感，在分化培养基中添加20mg/L Hyg就足以将转化细胞与非转化细胞区分开。在壮苗生根培养阶段，需要15mg/L的Hyg；（4)出愈率与甘露醇的浓度密切相关，出愈率随着甘露醇的减少而增加。2005年，PutuSupartana等^[20]利用农杆菌介导直接侵染粳稻品种越光的胚芽生长点获得转基因植株，转化效率高达40%。2010年，Kenjirou Ozawa等^[21]发现，利用农杆菌介导转化，在共培养过程中，用N6液体培养基比用N6固体培养基转化率提高了10倍。2011年，李笑寒等^[22]通过培养条件的优化，建立了一个高效的水稻转化技术体系。他们的研究结果表明，相比较于暗培养，光照培养进行愈伤诱导可以使诱导天数缩短4-5d；诱导培养基中加入适量的激素可以使籼稻愈伤诱导提高25%-30%；分化培养基中加入适量的氨基酸和甘露醇可以使植株再生频率提高15%-20%。AlagarsamyKarthikeyan等^[23]利用农杆菌侵染籼稻ADT43叶片来源的愈伤获得转基因植株，将籼稻的转化率提高到9.33%，且在T₀与T₁代植株中，目的基因拷贝数为1或2。2012年，牟晨等^[24]通过对经典水稻转基因方法的优化和改进，使用成熟胚，采取升汞灭菌，侵染时农杆菌的OD₆₀₀值为0.1时，转化效率较原方法提高约23%。

综上所述，农杆菌介导转基因技术经过近二十几年的发展和优化，转化条件、转化效率等都得到了长足的改进和提高，但与现代农业形势对转基因产品的需求相比，其步伐仍然不够快，仍存在许多障碍和安全隐患，仍需进一步加强农杆菌介导转化技术的研发，突破核心技术，以培育满足人们需求的转基因水稻新品种。

利用植物生长点转化的原理可能是外源DNA通过细胞间隙进入茎尖生长点细胞部位，并转化生长点细胞，产生转基因后代。近年来，有一些关于植物生长点用于转化的报道，特别是在小麦、玉米上。1996年，杜立群等^[25]用小麦的生长点作为外源基因的直接受体，利用基因枪轰击小麦生长点获得转基因小麦。2005年，RAZZAQ Abdul等^[26]以小麦为材料，尝试了一种对生长点直接进行转化的方法，并初步证明了这一方法的可行性。2009年，董福双等^[27]以小麦品种石4185为对象，建立了“用解剖刀去除种子根、用镊子把芽鞘掰去、用镊尖扫去包盖生长点的未展开叶、将带生长点的部分与胚乳分离”为特点的受体制备方法，初步建立了基因枪法转化小麦种子芽生长点的技术，但到目前为止还未见利用该技术在水稻转基因操作相关的报道。2011年，孙传波等^[28]以玉米自交系郑58的茎尖为受体，通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中，初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中，以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。在水稻上，2001年，林拥军利用农杆菌浸种法将反义Wx基因导入水稻品种珍汕97B^[29]。2005年，PutuSupartana等^[20]利用农杆菌介导直接侵染粳稻品种越光胚芽生长点获得转基因植株。但是，该文献没有提及在籼稻品种上成功转化，不但所用的质粒载体偏小，而且只包含了1个外源基因。本技术方案不但在籼稻上获得成功转化，而且还成功将2个抗虫基因同时转入水稻中。

本技术建立了一套利用根癌农杆菌介导，直接以水稻胚芽生长点为转化受体而不需诱导愈伤组织以及之后的一系列组织培养过程，避免对组织培养的过分依赖的高效、简单、快速的水稻转化体系；克服了在其它方法中基因型为籼稻品种难以转化的问题；可以不需在质粒载体上插入选择标记基因，直接对转化植株进行目的基因的检测，减轻人们对转基因生物安全性的担忧，为转化水稻提供一种简单、快速、高效、安全的方法，从而为满足现代农业形势对转基因产品的需求增添一份力量。

主要参考文献：

1)杨长青,王凌健,毛颖波,等.植物转基因技术[J].科学,2011,63(3):21‐24.

2)James C.2009年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J].生物工程学报,2010,30(2):1‐22.

3)万建民.我国转基因植物研发形势及发展战略[J].生命科学,2011,23(2):157‐167.

4)Chilton M D,Saikir K.Highly conserved DNA of Ti plasmids overlaps T‐DNA maintained plant tumours[J].Nature,1978,275:147‐149.

5)Baba A,Hasezawa S,Syono K.Cultivation of rice protoplasts and their transformation mediated byAgrobacterium protoplasts[J].Plant Cell Physio,1986,27:463‐468.

6)郑腾,陆承平.转基因技术对粮食生产的影响[J].生物学通报,2004,39(1):6‐9.

7)宁约瑟,刘雄伦.根癌农杆菌介导水稻遗传转化研究进展及展望[J].中国农学通报,2007,23(3):47‐51.

8)李卫,郭光沁,郑锠.根癌农杆菌介导遗传转化研究的若干新进展[J].科学通报,2000,45(8):798‐807.

9)李双成,王世全,尹福强,等.提高农杆菌介导转化水稻效率的因素[J].中国水稻科学，2005,19(3):231‐237.

10)Komari T,Hiei Y,Satito Y,et al.Vectors carrying two separate T‐DNAs for cotransformation of higher plantsmediated by Agrobacterium tumefiens and segregation of transformants free from selection markers[J].Plant J,1996,10(1):165‐174.

11)殷丽青,王新其,沈革志.去除标记基因的水稻转基因研究[J].上海农业学报,2004,20(1):33‐36.

12)夏志辉.利用双右边界(DRB)双元载体系统获得无标记基因的转基因水稻的研究[D].海南:华南热带农业大学,2004.

13)朱祯,李旭刚.一种利用双T－DNA载体培育无选择标记的转基因水稻的方法[P].中国专利:02107429,200508‐10.

14)朱丽,傅亚萍,刘文真.利用共转化和花药培养技术快速获得无选择标记的三价转基因水稻[J].中国水稻科学,2007,21(5):475‐481.

15)Rashid H,YokoiS,ToriyamaK,et al.Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in Indica rice[J].Plant Cell Rep,1996,15:727‐730.

16)HieiY,OhtaS,ToshilhroK,et al.Efficient transformation of rice(OryzasativaL.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T‐DNA[J].Plant J,1994,6:271‐282.

17)Aldemita R R,Hodges T K.Agrobacterium tumefaciens‐mediated transformation of Japonica and Indica ricevarieties[J].Planta,1996,199:612‐617.

18)Khanna H K,Raina S K.Agrobacterium‐mediated transformation of Indica rice cultivars using binary andsuperbinary vectors[J].Plant Physio,1999,26:311‐324.

19)陈秀花,刘巧泉,王宗阳,等.根癌农杆菌介导转化籼稻影响因素的研究[J].江苏农业研究,2001,22(1):1‐6.

20)Putu S,Tsutomu s,Hidenari S,et al.Development of simple and efficient in plantatransformationmethod forrice(Oryza sativa L.)using Agrobacterium tumefaciens[J].Bioscience and Bioengineering,2005,100(4):391–397.

21)Kenjirou O,Fumio T.Highly efficientAgrobacterium‐mediated transformationofsuspension‐culturedcellclustersofrice(Oryza sativa L.)[J].Plant Science,2010,179:333‐337.

22)李笑寒,李莉,宋风顺,倪大虎,等.根癌农杆菌介导的水稻转基因技术体系的优化[J].生物学杂志,2011,28(2):13‐16.

23)Alagarsamy K,Shunmugiah K P,Manikandan R.Agrobacterium‐mediated transformation of leaf base derivedcallus tissues ofpopularindica rice(Oryza sativa L.sub sp.indica cv.ADT43)[J].Plant Science,2011,181:258‐268.

24)牟晨,金菁,石金磊.根癌农杆菌介导的水稻转基因方法的优化研究[J].安徽农业科学,2012,40(7):3867‐3880.

25)杜立群,李银心,麻密,等.小麦生长点转化法初报[J].植物学报,1996,38(11):921‐924.

26)RazzaqAbdul,张艳敏,杨帆,等.小麦茎生长点转化研究初报[J].华北农学报,2005,20(1):17‐22.

27)董福双,张艳敏,杨帆,等.小麦芽生长点的基因枪转化技术研究[J].华北农学报,2009,24(5):1‐6.

28)孙传波,李海华,郭嘉,等.农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究[J].生物技术通报,2011,3:91‐93.

29)林拥军.农杆菌介导的水稻转基因研究[D].武汉:华中农业大学,2001.

发明内容

本发明针对传统农杆菌介导法过度依赖一系列的组织培养过程，而组织培养筛选周期较长，耗时耗费，对受体愈伤状态要求高，基因型依赖强的技术难题，以水稻胚芽生长点为转化受体，建立了优化的农杆菌介导水稻转化法，规避了传统农杆菌介导法对组织培养的过度依赖性，是本发明的宗旨。

本发明所采用的技术方案是：一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法，不进行愈伤组织培养，而是将沾有外源基因的根癌农杆菌菌液的接种针直接侵染受体水稻种子的胚芽生长点，完成转基因操作。

本发明方法中所述受体水稻种子的胚芽生长点是切除种根和幼芽后的胚芽生长点，或者是未去壳萌发后的胚芽生长点。

本发明的方法既适用于粳稻品种也适用于籼稻品种。

本发明方法所述受体水稻种子可选自用成熟水稻种子浸泡24～36h后的材料。

本发明的一个实例，其主要步骤包括：

1）选用南粳45(粳稻)和9311（籼稻）的成熟胚作为转基因受体。

2）选用的转化质粒载体pBI121-GUS含gus基因；质粒载体pCDMARUBA-Hyg含sbk、sck和hpt基因。

3）将未去壳的水稻种子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞杀菌18min，无菌水冲洗3～4次，消毒后的种子浸放在无菌水中，置于26～28℃恒温培养箱中培养1～3d。

4）用沾有扩大培养后的农杆菌液的接种针直接侵染已经处理过水稻种子的胚芽生长点（或者已切除种根和幼芽的胚芽生长点），然后将侵染后的水稻种子放入植物培养瓶中（植物培养瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上铺有一张湿润的滤纸）；22～24℃暗培养9～14d。

5）将暗培养后苗长为10cm左右的转化苗浸泡在浓度为1mg/mL的头孢霉素溶液中1h，之后将苗移到网室中种在盆钵中，盆钵直径30cm，5棵/盆

6）在水稻长至7、8叶期，对转pBI121-GUS载体的植株取叶片进行DNA检测和GUS组织化学检测，对转pCDMARUBA-Hyg载体的植株取叶片进行外源基因DNA检测和抗虫试纸条检测。

本发明的水稻转化方法，具有以下优点：

1）本发明方法不需诱导愈伤组织以及之后的一系列组织培养过程，即不须配制各种培养基、控制各种培养条件并对其不断进行优化调整，利用传统农杆菌介导法获得转基因植株的周期至少为2-4个月，而应用本方法只需10-15d，由此可见，本发明技术在大大缩短培养周期的同时节省了大量的财力物力，极大的简化了农杆菌介导转化法的流程，提高了转化的工作效率。

2）本发明方法克服了在其它方法中基因型为籼稻品种难以转化的问题，不仅将基因成功的导入粳稻品种南粳45中，而且也成功导入籼稻品种9311中。

3）本发明方法所用的转化载体可以不须插入标记基因或报告基因，转化载体只需携带目的基因和基本构件，在进行农杆菌侵染转化后待转化植株成苗，直接对转化植株进行目的基因的检测，提高了转基因水稻的安全性，减轻了人们对转基因生物安全性的担忧。

附图说明

图1质粒PBI121-GUS结构示意图。

图2质粒pCDMARUBA-Hyg结构示意图。

图3转gus基因T₀代植株的PCR检测（M:DL2000DNA Marker；ck:未转化植株DNA；

P:阳性质粒DNA；1-26：转gus基因植株）。

图4T₀转化植株的抗虫基因sbk检测（注:CK:未转化植株；P:阳性质粒DNA；M:DL2000Marker；9:9311；45：南粳45；83:南粳47）

图5部分转基因T₀代植株gus基因的组织化学检测（ck-:未转化植株叶片）。

图6部分转基因T₁代植株群体的PCR检测（注:ck:未转化植株DNA；P:阳性质粒DNA；

M:DL2000Marker；其余为转基因T₁代植株）。

图7部分转基因T₁代植株gus基因的组织化学检测（注：ck:未转化植株）

图8T₀转化植株的PCR检测（注:CK:未转化植株；P:阳性质粒DNA；M:DL2000Marker；41-49:南粳45）。

具体实施方式

质粒载体pBI121-GUS（Plant Cell Reports,2009,28(9):1319-1327）携带有pBI121-GUS质粒的EHA105菌株，南京晓庄学院蔡小宁教授实验室提供；

质粒载体pCDMARUBA-Hyg（ZL02107429.1,朱祯李旭刚，一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法）引自中国科学院遗传与发育研究所朱祯研究员项目组。

实施例1——胚芽生长点直接侵染法

1.选用水稻(Oryza sativa L.)品种南粳45(粳稻)、南粳47（粳稻）和9311（籼稻）成熟种子作为转基因受体，其种子均已商品化，来源于江苏省农业科学院粮食作物研究所。

2.将未去壳的水稻种子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞杀菌18min，无菌水冲洗3～4次，消毒后的种子浸放在无菌水中，置于26～28℃恒温培养箱中培养1～3d。

3.植物表达载体农杆菌的培养与检测

1）植物表达载体农杆菌的培养

A.分别取农杆菌LBA4404菌液（带有转化质粒pBI121-GUS，质粒pBI121-GUS结构如图1）和农杆菌EHA105菌液（带有转化质粒pCDMARUBA-Hyg，质粒pCDMARUBA-Hyg结构如图2）200μL于1.5ml离心管中，用接种环进行平板划线（培养皿中含卡那霉素，50ug/mL;利福平，50ug/mL)，28℃倒置培养48h，挑选单菌落接种于10ml的LB液体培养基中(含50mg﹒L^-1利福平和50mg﹒L^-1卡那霉素)，28℃，200rpm振荡培养24h。

B.取培养好的检测有阳性质粒的上述两种菌液各1ml，分别放至100ml液体LB培养基（含100uM乙酰丁香酮）中扩大培养，28℃200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.4。为了便于观察和使菌状态良好，扩大培养液里不加抗生素。

2）植物表达载体农杆菌阴阳性的检测

A.质粒DNA的提取

用BIOMIGA EZgene公司生产的Plasmid Miniprep Kit试剂盒对上述两种质粒DNA进行微量提取，步骤如下：

①取1～4mL(一般2mL)在LB液体培养基中培养过夜的菌液，室温下10,000rpm离心1min，收集菌体，并尽可能的吸去上清。

②加入250μL已加入RNaseA的Bufffer A1，用涡流震荡器震荡重悬细菌沉淀，悬浮需充分，不应留有小菌块。

③加入250μL Bufffer B1，温和并充分地上下翻转混合10次，然后静置5min至溶液粘稠而澄清。

④加入350μLBufffer N1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

⑤将离心管转至高速离心机，在室温下13000rpm离心10min。

⑥小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中，室温下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。

⑦向DNA柱中加入500μL Buffer KB，室温下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。

⑧向离心柱中加500μL DNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇！)，室温下13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复该步骤1次。

⑨将离心柱放回高速离心机中开盖，室温下13000rpm离心2min，以彻底去除残留的乙醇。

⑩将离心柱移入新的1.5mL离心管中，向DNA柱正中央加入50～100μL的ddH₂O或Elution Buffer，室温静置2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。将洗脱液再加入柱中，13000rpm离心1min，收集洗脱液。

B.质粒DNA检测

①质粒pBI121-GUS基因扩增

目的基因gus。

PCR扩增体系：PCR buffer2.0μL，dNTP2.0μL，引物2.0μL（表1），TaqDNA聚合酶0.2μL，DNA2.0μL，补充ddH₂O至20μL。

PCR扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，57℃，30sec，72℃,30sec，35个循环；72℃,10min。扩增结果加指示剂后用1%的琼脂糖凝胶进行110v、1h电泳后照相。

选取PCR扩增结果为阳性的菌液进行扩大培养。

②质粒pCDMARUBA-Hyg基因扩增

目的基因sbk、sck和标记基因hpt的PCR扩增体系和扩增程序均一致。

PCR扩增体系：PCR buffer2.0μL，dNTP2.0μL，引物2.0μL（表1），TaqDNA聚合酶0.2μL，DNA2.0μL，补充ddH₂O至20μL。

PCR扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，35个循环；72℃，10min。扩增结果加指示剂后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳110v，1h后照相。

选取PCR扩增结果为阳性的菌液进行扩大培养。

4.转基因受体水稻品种的遗传转化

以下操作均要求在无菌条件下进行。

用沾有扩大培养后的OD₆₀₀值为0.4扩大培养的农杆菌液的接种针刺入胚芽生长点；将针刺后的种子放入植物培养瓶中（植物培养瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上铺有一张湿润的滤纸），10粒/瓶，22～24℃暗培养9～14d。

用含质粒pBI121-GUS的农杆菌按照上述方法侵染90粒南粳45水稻种子；用含质粒pCDMARUBA-Hyg的农杆菌按照上述方法侵染98粒9311、100粒南粳45和100粒南粳47水稻种子。

5.水稻转化苗的杀菌与移苗

将暗培养后苗长为10cm左右的转化苗浸泡在1mg/ml的头孢霉素溶液中1h，之后将苗移到网室中种在盆钵中，盆钵半径15cm，5棵/盆。

6.转基因苗的PCR检测

待处理后的苗长至7、8叶，株高40cm以上，每株取200mg左右嫩叶(以未针刺水稻苗为阴性对照)进行DNA检测。

用SDS法从水稻(转基因T₀代与非转基因)新鲜叶片中微量提取总DNA。

(1)取约200mg新鲜的水稻叶片用液氮速冻后研磨成粉末，迅速转移至2mL离心管中；

(2)加入650μL经65℃预热的SDS抽提缓冲液（0.1M Tris-HCl，pH8.0；0.05M EDTA，pH8.0；0.5M NaCl；1.25%SDS），65℃水浴30min，每隔10min摇动混匀；

(3)加入150μL5M KAc（pH5.2）摇匀，冰浴30min；

(4)加入350μL24:1的氯仿异戊醇混合液，摇动混匀，静置3min；

(5)12,000rpm离心10min，小心转移上清于一洁净的1.5mL离心管中；

(6)加入800μL-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，在-20℃冰箱自由沉降20min；

(7)10000rpm离心6min，弃上清收集沉淀；

(8)加入400μL75%的乙醇洗涤沉淀；

(9)倒掉乙醇，超净台上吹干沉淀后加入200μL1×TE(pH8.0)溶解，-4℃保存备用。

非转基因单株设为阴性对照，上述质粒DNA检测为阳性的质粒DNA为阳性对照。以水稻基因组DNA为模板，转质粒pBI121-GUS的水稻植株以GUS基因的序列设计引物进行转基因植株的PCR分析；转质粒pCDMARUBA-Hyg的水稻植株分别以SBK、SCK、HPT基因的序列设计引物进行转基因植株的PCR分析（表1）。

表1基因位点或连锁标记的引物序列

7.转基因植株gus基因的组织化学检测

（1）对上述DNA检测有gus基因的水稻，每株取2张叶片，另取2张阴性水稻叶片做对照，先用90%丙酮在-20℃浸泡至少2h。

（2）将丙酮浸泡后的水稻叶片用无菌水冲洗后转到已过滤除菌的X-Gluc染色液（100mM NaH₂PO4；10mM Na₂EDTA；0.5mMK₄[Fe(CN)₆]·3H₂O；0.5mMK₃[Fe(CN)₆])；0.1%Triton·X-100；pH7.0）中，37℃水浴或温育10h。

（3）水浴或温育后弃染色液，转入70%～100%乙醇中脱色2～3次，至阴性对照材料呈白色（室温下）。

（4）肉眼或显微镜下观察，具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

8.T₁代转gus基因水稻苗的PCR分析与组织化学检测

（1）对T₀代检测有gus基因的水稻苗，待其成熟后单株收种，做好编号，放入45℃烘箱2d。

（2）2天后将水稻种子拿出，待其温度退到室温时，将其泡在0.5%的升汞溶液中浸种24h。浸种后经清水冲洗包在湿布里放在白炽灯管上催芽至露白，期间勤加水，保持布处于湿润状态。

（3）将催芽后的种子按编号分块播种在网室里盖上保温膜，1个月后分群体取样进行DNA检测和GUS组织化学检测，操作过程同步骤6和7。

9.检测结果

其中含gus基因质粒农杆菌侵染的90粒南粳45种子，成苗48株，成苗率达53.3%；对这48棵T₀代转化植株进行PCR检测，凝胶电泳显像结果中，由于有些DNA扩增条带较模糊，本实验把它们归为阴性植株。保守确定，PCR检测中有16棵植株扩增条带为阳性，转化率达33.3%，初步证实gus基因已导入水稻基因组中，如图3所示。

其中含pCDMARUBA-Hyg基因质粒农杆菌侵染的100粒南粳45种子，成苗30株，成苗率达30%，5株移栽到海南时成活3株；侵染的98粒9311种子，成苗45株，成苗率达46%，10株移栽到海南时成活9株；侵染的100粒南粳47种子，成苗33株，成苗率达33%，5株移栽到海南时成活1株；对在海南成活的13株取叶片提取DNA进行PCR检测（如图4所示），初步证实抗虫基因sbk已经导入水稻基因组中。

取未进行针刺转化的南粳45叶片2张做阴性对照，对上述DNA检测为阳性的水稻，每个单株取两张叶片，共34张叶片进行GUS组织化学检测。对照CK经酒精脱色后呈白化颜色，而32张转GUS阳性T₀代叶片经酒精脱色后均有不同程度的蓝色斑点显现。再次验证了gus基因已导入南粳45基因组中，并在蛋白质水平上表达。如图5所示。

对8个T₁代转基因群体进行了PCR检测，发现4个T₁代转基因群体99%可检测到gus基因，其群体植株总数分别为32、37、46和15。而其余4个T₁代转基因群体则呈分离现象，群体中只有部分单株检测到gus基因，群体植株总数依次为24、64、52和66，阳性植株与阴性植株的分离比依次为1:3、1:1.5、1:2.4、1:10，如图6，左图群体植株数46，99%可检测到gus基因的；右图群体植株数64，阳阴性植株分离比为1：1.5。初步说明了gus基因已从T₀代传递到T₁代了。

对种植的8个T₁代群体分别随机在4棵苗上各取1张叶片，阴性对照叶片2张，共34张叶片进行GUS组织化学染色（图7）：对照CK经酒精脱色后呈白化颜色，而转gus阳性T₁代苗经酒精脱色后均显蓝色。进一步说明了T₁代植株中存在gus基因，且已在蛋白质水平上表达。

实施例2——切除种根和幼芽后侵染胚芽生长点法

1.选用水稻(Oryza sativa L.)品种南粳45成熟种子作为转基因受体，其种子来源于江苏省农业科学院粮食作物研究所。

2.同实施例1中相应部分

3.植物表达载体农杆菌的培养与检测——同实施例1中相应部分

4.转基因受体水稻品种的遗传转化

以下操作均要求在无菌条件下进行。

培养3d后的种子幼苗其种根和幼苗冒出种孔约0.5cm，用手术刀将种子的种根和幼芽轻轻切除（使其生长点裸露）；用沾有扩大培养后的OD₆₀₀值为0.4扩大培养的农杆菌液的接种针刺入水稻种孔冒白处胚芽生长点；将针刺后的种子放入植物培养瓶中（植物培养瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上铺有一张湿润的滤纸），10粒/皿，22～24℃暗培养9～14d。

用含质粒pCDMARUBA-Hyg的农杆菌分别侵染78粒南粳45水稻种子。

5.水稻转化苗的杀菌与移苗——同实施例1中相应部分

6.转基因苗的DNA检测——同实施例1中相应部分

7.结果

共转化78粒南粳45，成活28株，成活率为35.9%；其中9株移栽到海南，成苗后取叶片提取DNA进行PCR分析，结果（图8）表明9株南粳45均未检测到hpt基因；编号41、45、47和48含有双价抗虫基因，即既有sbk基因又有sck基因；编号42和46只有sbk基因；编号43和49只有sck基因。

Claims (4)

1.一种运用根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于该方法不进行愈伤组织培养，将沾有外源基因的根癌农杆菌菌液的接种针直接侵染受体水稻种子的胚芽生长点，完成转基因操作。

2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于所述受体水稻种子的胚芽生长点是切除种根和幼芽后的胚芽生长点，或者是未去壳萌发后的胚芽生长点。

3.根据权利要求1或2所述的根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于所述的水稻是粳稻品种或籼稻品种。

4.根据权利要求1或2所述的根癌农杆菌介导的水稻转化方法，其特征在于所述受体水稻种子是用成熟水稻种子浸泡24～36h后的材料。

Images