CN104004072A - Duf994蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用 - Google Patents

Duf994蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DUF994蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物生长发育中的应用；所述植物生长发育，具体体现在如下1)-3)中至少一种：1)种子结实率；2)种子重量；3)花粉育性。实验证明，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术将水稻中DUF994蛋白表达水平下调，可导致水稻种子表现出如下表型：比野生型水稻种子相比，花粉育性和结实率降低，种子的重量也显著减少。本发明为找出更简单的创制作物高产性状的思路和方法奠定了基础。

Description

DUF994蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及一种DUF994蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。 
背景技术
从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求，能否进一步发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻挑战。 
杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄性不育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。 
目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制约因子。按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的创新都受到知识产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制作物种子大小及产量的思路和方法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地区所面临的无法回避、亟待解决的关键问题之一。 
长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育杂交作物，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。基因工程方法相比传统方法具有一些特点：选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少，环境污染少。 
发明内容
本发明的目的是提供一种DUF994蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。 
本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(命名为DUF994蛋白)或其编码基因(命名为DUF994基因)在调控植物如下1)-3)中至少一种中应用： 
1)种子结实率； 
2)种子重量； 
3)花粉育性。 
上述应用具体体现在：所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的DUF994蛋白在所述植物中的表达量越低，所述植物的种子结实率越低、和/或种子重量越轻、 和/或花粉育性越低；所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的DUF994蛋白在所述植物中的表达量越高，所述植物的抗旱性种子结实率越高、和/或种子重量越重、和/或花粉育性越高。 
由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的(DUF994蛋白)或其编码基因(DUF994基因)在选育具有如下I)-III)目的性状中至少一种的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围： 
I)种子结实率提高或降低； 
II)种子重量增加或减少； 
III)花粉育性提高或降低。 
在实际应用中，当所选育的植物品种为种子结实率提高、和/或种子重量增加、和/或花粉育性提高的植物品种时，需将所述DUF994蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交。当所选育的植物品种为种子结实率降低、和/或种子重量减少、和/或花粉育性降低的植物品种时，需将所述DUF994蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。 
本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。 
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为如下(A)或(B)： 
(A)培育具有如下b1)-b3)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤： 
a)向目的植物中导入由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； 
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下b1)-b3)目的性状中至少一种的转基因植物： 
b1)种子结实率提高； 
b2)种子重量增加； 
b3)花粉育性提高。 
(B)培育具有如下d1)-d3)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤： 
c)在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物； 
d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下d1)-d3)目的性状中至少一种的转基因植物： 
d1)种子结实率降低； 
d2)种子重量减少； 
d3)花粉育性降低。 
在上述应用或方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(DUF994蛋白)的编码基因(DUF994基因)是如下(1)至(3)中任一所述的DNA分子： 
(1)序列表中序列2所示的DNA分子； 
(2)在严格条件下与(1)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； 
(3)与(1)或(2)所限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。 
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。 
其中，序列2由2859个核苷酸组成，为所述DUF994基因的编码序列(ORF)；序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质，序列1由952个氨基酸残基组成。 
在上述方法(B)中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，可为任何可降低所述目的植物中所述DUF994基因的表达的方法。 
在本发明中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，具体是通过将如下式(I)所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的： 
SEQ正向-X-SEQ反向  (I) 
所述SEQ正向是序列表中序列3的第7-292位核苷酸； 
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补； 
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。 
在本发明中，所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3的第7-791位。 
序列3由803个核苷酸组成。其中，第7-292位为所述DUF994基因的一个片段的正向序列(对应上述式(1)中的SEQ正向，与序列表中序列2的第1951-2236位一致)，第293-505位(第300-498位为GA20内含子核苷酸序列)对应上述式(1)中的X，第506-791位为所述DUF994基因的一个片段的反向序列(对应上述式(1)中的SEQ反向，为序列表中序列2的第1951-2236位的反向互补序列)。 
进一步，所述式(I)所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式(I)所示的DNA片段转录的启动子是Actin启动子。具体的，所述RNA干扰表达载体为在pCAM23A载体的多 克隆位点处插入所述DUF994基因的RNA干扰序列(序列3)后得到的重组质粒；更为具体的，所述RNA干扰表达载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用Spe I和Sal I双酶切序列表中序列3所示的DNA片段，胶回收后与经过Xba I(Xba I与SpeI为同尾酶)和Sal I双酶切的pCAM23A载体骨架大片段相连，得到所述RNA干扰表达载体。 
在上述方法(A)中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因可通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中。 
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 
在上述培育转基因植物的方法(A)和方法(B)中，将携带有所述DUF994基因的所述重组表达载体或所述DUF994基因的所述RNA干扰表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。 
在上述各应用或各方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明中，所述植物具体为单子叶植物水稻，如水稻品种中花11。 
在本发明中，上述各应用或各方法中所述的种子结实率均为实粒数占总粒数(实粒数+空秕粒数)的百分率(参考文献“张毅,沈福成.水稻称重结实率与计数结实率 的关系.杂交水稻,2006,21(2):64-68”)。 
如下式(I)所示的DNA片段也属于本发明的保护范围： 
SEQ正向-X-SEQ反向  (I) 
所述SEQ正向是序列表中序列3的第7-292位核苷酸； 
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补； 
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补； 
所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第7-791位。 
含有所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。 
所述重组载体既可以为重组表达载体，也可以为重组克隆载体。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述RNA干扰序列转录的启动子为Actin启动子，具体的，所述重组表达载体为在pCAM23A载体的多克隆位点处插入所述DUF994基因的RNA干扰序列(序列3)后得到的重组质粒；更为具体的，所述RNA干扰表达载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用Spe I和Sal I双酶切序列表中序列3所示的DNA片段，胶回收后与经过Xba I(Xba I与Spe I为同尾酶)和Sal I双酶切的pCAM23A载体骨架大片段相连，得到所述RNA干扰表达载体。 
实验证明，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术将水稻中DUF994蛋白表达水平下调，可导致水稻种子表现出如下表型：比野生型水稻种子相比，花粉育性和结实率降低，种子的重量也显著减少。本发明为找出更简单的创制作物高产性状的思路和方法奠定了基础。 
附图说明
图1为pUCCRNAi干扰载体的结构图谱。 
图2为部分T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻的PCR鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000，3000，2000，1000，750，500，300，200bp；泳道1-7、9、11、12和15为11株鉴定阳性的转基因植株(分别记为994R14、994R21、994R34、994R40、994R49、994R141、994R142、994R146、994R201、994R204、994R205)；泳道8、10、13和14为鉴定阴性的转基因植株；泳道16为未转基因的野生型植株中花11号。 
图3为部分T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻的实时荧光定量PCR检测。其中，WT表示未转基因的野生型植株中花11号；“994R-”即为11个实施例1中PCR鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株。图中以WT中DUF994基因的表达量为1。 
图4为DUF994基因各遗传材料水稻稻穗表型。其中，WT表示未转基因的野生型植株中花11号；1-11为11个实施例1中PCR鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株。 
图5为DUF994基因各遗传材料水稻花粉解剖结果。其中，WT表示未转基因的野生型植株中花11；“994R-”即为实施例1中鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株。 
图6为DUF994基因各遗传材料水稻花粉育性检测结果(亚历山大染色)。其中，WT表示未转基因的野生型植株中花11；“RNAi”即为实施例1中鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株(994R49)。 
图7为DUF994基因各遗传材料水稻种子结实率。其中，WT表示未转基因的野生型植株中花11号；“994R-”即为实施例1中鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株(其结实率与WT相比，均在P<0.01水平上差异显著)。 
图8为DUF994基因各遗传材料稻种子千粒重。其中，WT表示未转基因的野生型植株中花11号；“994R-”即为实施例1中鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株(除了994R21与WT相比，在P<0.05水平上差异显著外，其余株系均与WT相比，在P<0.01水平上差异显著)。 
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
pUCCRNAi干扰载体：从中科院遗传所储成才教授处获得，记载在“颜培强,白先权,万秀清等.应用RNAi技术培育抗TMV病毒转基因烟草.遗传,2007,29(8):1018-1022”一文中。在pUCCRNAi干扰载体中，限制性内切酶Spe I和Bgl II的识别位点位于intron上游，限制性内切酶BamH I和Xba I的识别位点位于intron下游。pUCCRNAi干扰载体的结构图谱如图1所示。 
pCAM23A载体：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。记载于“池正昌.水稻减数分裂基因OsSG01功能研究与分析.扬州大学，2010年，硕士论文”一文中。pCAM23A载体上自带的位于Xba I上游的启动子是Actin启动子。 
水稻品种中花11号：购自于中国农业科学院作物研究所；由中国农科院作物所1979年用京风五号/特特普/福锦进行花培。记载于“倪丕冲.水稻花培新品种—中花11号.作物品种资源，1989年04期”。 
农杆菌EHA105：北京全式金生物工程有限公司。 
下述实施例中获得转基因植物的过程中所涉及的培养基如下： 
1、水稻愈伤诱导及继代培养基(粳稻)NB基本培养基 
2、AAM培养基 
3、共培养培养基 
4、抗性筛选培养基1L，倒在一次性平板上约40-50个 
5、水稻分化培养基(粳稻)1L倒在大试管，约20个左右 
6、水稻生根培养基(粳稻) 
以上各培养基所涉及的激素母液配制方法： 
(1)0.5mg/ml2,4-D母液的配法：称取100mg2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇使之完全溶解；把2,4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中，如果出现沉淀，需要重新配置；用水定容至200ml，4℃保存。 
(2)0.5mg/mlα-NAA母液的配法：称取100mgNAA置于小烧杯内；用1M的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200ml，4℃保存。 
(3)0.5mg/ml6-BA母液的配法：称取100mg6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。 
(4)100mM乙酰丁香酮(As)的配制：称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，并定容至10ml，分装入无菌的小管，-20℃冰冻保存。 
(5)5mg/ml KT的配法：称取100mg激动素Kinetin，用少量1M KOH溶解，用水稀释定容至20ml。过滤灭菌后，分装入无菌小管中，-20℃冰冻保存。 
实施例1、DUF994基因RNAi水稻植株的获得及鉴定 
本实施例中所涉及的DUF994基因来源于水稻(Oryza.sativa L.)，其cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2859个核苷酸组成，；序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质(DUF994蛋白)，序列1由952个氨基酸残基组成。 
一、RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的构建 
根据序列表中序列2设计如下RNAi引物序列： 
RNAi-23A994-F：5’-cc ACT AGT TCG GCT CTC CTG TCA TTG-3’(下划线处为酶切位点Spe I的识别序列，其后为序列2的第1951-1968位)； 
RNAi-23A994-R：5’-cc GGA TCC GCA CCA TGT TAA GCA CTA-3’(下划线处为酶切位点BamH I的识别序列，其后为序列2的第2219-2236位的反向互补) 
以序列表中的序列2为模板，用引物RNAi-23A994-F和RNAi-23A994-R进行PCR扩增。用限制性内切酶Spe I和BamH I酶切PCR产物后回收目的片段，将其与用限制性内切酶Spe I和Bgl II酶切后的pUCCRNAi载体骨架大片段相连(Bgl II和BamH I是同尾酶)，得到中间质粒1。再用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切中间质粒1，回 收骨架大片段，连入以上用限制性内切酶Spe I和BamH I酶切的PCR产物(Xba I和Spe I是同尾酶)，得到中间质粒2。再用限制性内切酶Spe I和Sal I酶切中间质粒2，回收目的片段(大小约为803bp)，与经过限制性内切酶Xba I和Sal I酶切的pCAM23A载体骨架大片段相连(Xba I和Spe I是同尾酶)，得到重组质粒。将经测序表明在pCAM23A载体的酶切位点Xba I和Sal I之间插入序列表中序列3所示的DNA片段的重组质粒命名为pCAM23A-DUF994R。在RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R中，启动序列表中序列3所示的DNA片段转录的启动子为Actin启动子。其中，序列3由803个核苷酸组成。其中，第7-292位为所述DUF994基因的一个片段的正向序列(与序列表中序列2的第1951-2236位一致)，第300-498位为来自于pUCCRNAi载体上的GA20内含子(intron)核苷酸序列，第506-791位为所述UCH320基因的一个片段的反向序列(为序列表中序列2的第1951-1136位的反向互补序列)。正向序列和反向序列之间由一段内含子(intron)序列隔开以维持载体的稳定性；该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构(hairpin)的dsRNA，引发RNAi，从而抑制目的基因的表达。 
二、DUF994基因RNAi水稻植株的获得及鉴定 
1、DUF994基因RNAi水稻植株的获得 
(1)水稻转化受体的准备 
A.水稻幼胚愈伤组织的诱导培养 
取开花后12-15天左右的水稻品种中花11号的幼穗脱粒，用清水漂去秕粒，用70％乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有1％(v/v)Tween20的1.25％的次氯酸钠水溶液(活性氯含量为1.25％(w/v))浸泡90分钟，进行表面灭菌。(灭菌时要经常搅拌)用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB基本培养基)上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基(NB基本培养基)上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。 
B.水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养 
去壳的水稻成熟种子先用70％乙醇浸泡1-2分钟，然后用30％-40％的次氯酸钠水溶液(活性氯含量为30％-40％(w/v))浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基(NB基本培养基)上，26℃暗培养(可以光培养，光培养长得快)。约20天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基(NB基本培养基)上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。 
(2)农杆菌的转化及培养 
A.抽提纯化质粒 
将含有步骤一构建的RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R和pCAM23A空载体的大肠杆菌DH5α菌种分别接种于5ml LB(含卡那霉素50mg/L)液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒。 
B.取电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。 
C.农杆菌EHA105电击预备处理 
I.农杆菌EHA105接种于5ml YEP(含链霉素Sm50mg/L)液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。 
II.1.5ml离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。 
III.去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。 
IV.重复步骤III三次。 
V.去残液，沉淀用ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。 
D.电击 
I.取质粒(步骤一构建的RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R或pCAM23A空载体)至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。 
II.准备好电击装置(BioRad)，电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。 
III.室温静置2min后加入YEP液体培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。 
IV.8000rpm离心30s，收集菌液，沉淀用ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEB固体培养基平板，28℃培养48h。刮取菌苔重新悬浮于YEB液体培养基，在28℃培养至对数生长晚期；再从中取0.5ml转接至100ml同样的YEB液体培养基中2-3h后至OD600为0.5左右，将培养好的重组农杆菌4000g离心10分钟，沉淀用100ml的AAM液体培养基悬浮成重组农杆菌悬浮液。 
(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养 
挑选步骤1中得到的状态较好的继代到一定时间的水稻愈伤组织(继代培养4-5天、色泽淡黄、颗粒状)放入100ml无菌三角瓶中，然后加入适量步骤2获得的重组农杆菌悬浮液(至少保证有足够的菌液与材料接触)，以80-100r/min室温放置20min。取出愈伤组织，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，将诱导愈伤和继代培养时始终紧贴培养基的那一面依然朝下放置，愈伤应摆放整齐，相互之间最好不要叠放，25℃黑暗培养3天。 
(4)抗性愈伤组织的筛选 
共培养后的愈伤用无菌水充分洗涤4-6次，直至洗过愈伤的水溶液变清亮，再用加入浓度为300mg/L的头孢霉素cef的无菌水洗4-5次，每次15-20min，用无菌滤纸吸干愈伤。 
将愈伤组织放在含有25mg/L潮霉素Hygromycin的筛选培养基上筛选14天后转入含有50mg/L潮霉素Hygromycin的筛选培养基上继续筛选。2周一代。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。选择一般持续6-8周。 
(5)抗性愈伤组织的分化 
从经两-三轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素Hygromycin的分化培养基培养先暗培养3天，后再转到16-20h/d，光照强度100-120μmolm-2s-1的光照条件下培养，30-40天后进一步分化出小苗。 
(6)生根、壮苗和移栽 
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2-4cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)。 
通过上述操作，最终获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入步骤一构建的RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R和pCAM23A空载体的水稻植株(T1代)。 
2、DUF994基因RNAi水稻植株的鉴定 
从步骤1获得的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻，以及转入pCAM23A空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻，以引物1和引物2进行PCR扩增，经鉴定得到大小约为797bp目的条带(带有DUF994正向序列、GA20内含子序列以及DUF994反向序列)的植株即为转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的阳性植株。对于转入pCAM23A空载体的对照植株，用引物1和引物2进行PCR扩增，无条带植株即为转入pCAM23A空载体的阳性植株。 
引物1：5’-ACTAGTTCGGCTCTCCTGTC-3’(序列3的第1-20位)； 
引物2：5’-TCTAGTTCGGCTCTCCTGT-3’(序列3的第779-797位的反向互补序列)。 
部分步骤1获得的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻的鉴定结果如图2所示。经过上述PCR鉴定，最终获得26株PCR鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株。 
(2)实时荧光定量PCR检测 
取步骤(1)鉴定阳性的T1代转入重组表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水 稻，转入pCAM23A空载体的对照植株，分别从叶片中提取总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，用引物994RT-F和994RT-R对基因DUF994的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，以GAPDH为内参，引物为GAPDH-RT-F和GAPDH-RT-R。 
994RT-F：5’-AGGGAGCAGTTTGATCTGGC-3’(序列2的第283-302位)； 
994RT-R：5’-GGACTCGAAGACGGCGTTTA-3’(序列2的第362-381位的反向互补序列)； 
GAPDH-RT-F：5’-AAGCCAGCATCCTATGATCAGATT-3’； 
GAPDH-RT-R：5’-CGTAACCCAGAATACCCTTGAGTTT-3’。 
具体采用ABI公司Prism7000型荧光定量PCR系统，power SYBR Green I混合试剂盒，来进行qPCR实验。实时荧光定量PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。采用Power(2－△△Ct)来计算不同样品之间的模板比例来表示不同基因的相对表达量。 
实验重复三次，结果取平均值。 
结果显示，与未转基因的水稻品种中花11(WT)相比，步骤(1)鉴定阳性的T1代转入重组表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻中DUF994的表达量显著被抑制。部分植株的鉴定结果如图3所示。而转入pCAM23A空载体的对照植株中DUF994的表达量与未转基因的水稻品种中花11(WT)相比基本一致，无统计学差异。 
实施例2、DUF994基因RNAi水稻植株功能鉴定 
以实施例1鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻转基因植株、未转基因的野生型水稻品种中花11号，以及实施例1得到的转入pCAM23A空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在培养皿中进行催芽(每种实验材料播种80-100粒)，催芽后的幼苗移栽在花盆里出苗，然后转到北京郊区大田里进行生长。待收获各实验材料植株的稻穗后，对其进行如下几方面的分析鉴定： 
1、稻穗表型分析 
结果显示，与未转基因的野生型水稻品种中花11号相比，实施例1鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株的稻穗均出现了发育异常的表型(图4)。而对于实施例1得到的转入pCAM23A空载体的对照植株，其稻穗表型与未转基因的野生型水稻品种中花11号基本一致，无统计学差异。 
2、花粉育性检测 
一方面对各遗传材料水稻花粉进行解剖形态学观察；另一方面，利用亚历山大染 料对各遗传材料的花粉育性进行检测，具体如下：摘取水稻成熟花浸泡在亚历山大染色液中2-4小时，然后在体视镜下观察。其中，亚历山大染色液配制方法如下：取10mlA液、5ml B液、5g苯酚、5ml C液、0.5ml D液、2mL冰醋酸、25mL甘油、50mL H2O混合，使用时用水按照1:50稀释。 
A液：浓度为95％的乙醇水溶液； 
B液：向A液中加入孔雀绿，至其终浓度为1％(1g/100mL)，得到B液； 
C液：浓度为1％(1g/100mL)的酸性品红水溶液； 
D液：浓度为1％(1g/100mL)的橙黄G染料水溶液。 
各遗传材料水稻花粉解剖结果如图5所示。另外，亚历山大染色结果显示，与未转基因的水稻品种中花11相比，实施例1鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株的花粉明显出现了败育的现象，见图6。而对于实施例1得到的转入pCAM23A空载体的对照植株，其花粉育性与未转基因的水稻品种中花11基本一致，无统计学差异。以上结果表明，在水稻中特异的下调DUF994基因的表达会减低植株花粉育性。 
3、种子结实率及种子重量统计分析 
结果显示，与转入pCAM23A空载体中花11号相比，实施例1鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株的稻穗上有很多干瘪籽粒。对各实验材料植株稻穗上的籽粒进行结实率、以及种子千粒重统计分析。其中，结实率＝实粒数/总粒数×100％，实粒指的是有米籽粒，总粒数为实粒数加上空秕粒数(无米空壳)。其详细结果见图7和图8。从以上结果中可以看出，与未转基因的野生型水稻品种中花11号相比，实施例1鉴定阳性的T1代转入RNAi表达载体pCAM23A-DUF994R的转基因水稻植株的种子结实率以及种子重量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。而对于实施例1得到的转入pCAM23A空载体的对照植株，其种子结实率以及种子重量与未转基因的野生型水稻品种中花11号基本一致，无统计学差异。 

Claims (10)

1.由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物生长发育中的应用；
所述植物生长发育，具体体现在如下1)-3)中至少一种：
1)种子结实率；
2)种子重量；
3)花粉育性。
2.由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育具有如下I)-III)目的性状中至少一种的植物品种中的应用：
I)种子结实率提高或降低；
II)种子重量增加或减少；
III)花粉育性提高或降低。
3.培育转基因植物的方法，为如下(A)或(B)：
(A)培育具有如下b1)-b3)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤：
a)向目的植物中导入由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下b1)-b2)目的性状中至少一种的转基因植物：
b1)种子结实率提高；
b2)种子重量增加；
b3)花粉育性提高；
(B)培育具有如下d1)-d3)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤：
c)在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下d1)-d2)目的性状中至少一种的转基因植物：
d1)种子结实率降低；
d2)种子重量减少；
d3)花粉育性降低。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下(1)至(3)中任一所述的DNA分子：
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)或(2)所限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式(I)所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的：
SEQ正向-X-SEQ反向  (I)
所述SEQ正向是序列表中序列3的第7-292位核苷酸；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3的第7-791位。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述式(I)所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式(I)所示的DNA片段转录的启动子是Actin启动子。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.如下式(I)所示的DNA片段：
SEQ正向-X-SEQ反向  (I)
所述SEQ正向是序列表中序列3的第7-292位核苷酸；
所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；
所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；
所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第7-791位。
10.含有权利要求9所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系。
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