CN103740725A - 一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及在盐碱调控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及前体基因，它来自于大豆品种吉育72，将前体基因插入经改造的pCAMBIA1301载体中，获得pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒，将载体质粒转入农杆菌EHA105中，转染拟南芥中，实验结果表明，转基因拟南芥提高了植物的耐盐碱胁迫能力。

Description

一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及在盐碱调控中的应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说是大豆中一个小RNA基因gma-miR1510a及在盐碱调控中的应用。

背景技术

植物生长、发育及环境应答是一个复杂的生理过程，是一系列基因表达调控的结果。microRNA（miRNA）作为一类内源、非编码小分子单链RNA，广泛参与了拟南芥、水稻、玉米等植物的生长、发育等生理调控过程。甚至植物在逆境胁迫条件下，microRNA通过自身基因表达水平的变化实现对靶基因的剪切或翻译抑制，从而响应逆境胁迫。

大豆（Glycine max）是世界上重要的粮食作物和油料作物。大豆含油量可达18 %至23 %左右。自然环境是限制农业生产的主要制约因素，盐碱、干旱等环境因素严重威胁了大豆的生长发育及产量。目前已经发现miR398等数个microRNA基因参与植物的抗逆调控机制。在植物逆境胁迫应答中，miRNA在转录后水平上与mRNA形成RISC复合体后，可实现对靶基因的降解或表达抑制。在拟南芥、水稻、玉米、杨树中已克隆到参与盐碱胁迫、磷硫缺乏、氧化、热等物理化学胁迫调控过程的miRNA基因，gma-miR394a、gma-miR482、gma-miR1512、gma-miR1515等基因均发现与逆境胁迫调控有关。miRNA作为靶基因的负调因子响应植物的逆境胁迫过程。

大豆受逆境胁迫的miRNA表达变化及调控机制研究是增强大豆耐逆境胁迫的新研究热点。通过研究miRNA在大豆中盐碱、干旱等逆境调控的生理生化作用，观察逆境胁迫条件下特定microRNA的表达及作用机制，挖掘耐逆境胁迫基因资源，对培育抗逆境胁迫新品系大豆，提高农作物产量具有重要的社会价值及经济价值。因而借助基因表达分析筛选并挖掘抗逆相关miRNA基因，进行相关的表达调控及应用研究，为提培育优良性状农作物奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及其前体基因。

一个小RNA基因gma-miR1510a前体基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

一个小RNA基因gma-miR1510a，其碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

一种小RNA基因gma-miR1510a的表达载体pCAMBIA-bar-miR1507a，它是由下述方法制备：

1）人工合成序列表SEQ ID No.3所示的bar基因序列；

2）用XhoI酶切bar基因序列和pCAMBIA1301，将bar插入pCAMBIA1301（购自pcambia公司）的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因；

3）用HindⅢ和BstEⅡ分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端；最后，将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，获得质粒pCAMBIA-bar；

4）目的基因和pCAMBIA-bar用BamHI和HindIII双酶切，连接，得pCAMBIA-bar-miR1510a。

本发明又一个目的是一个小RNA基因gma-miR1510a在培育耐盐碱植物品种中的应用。

一种培育耐盐碱植物品种的方法，它包括：

1）将pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞中；

2）农杆菌转化至植物中。

本发明提供了一种大豆中一个小RNA基因gma-miR1510a及前体基因，它来自于大豆品种吉育72，将前体基因插入经改造的pCAMBIA1301载体中，获得pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒，将载体质粒转入农杆菌EHA105中，转染拟南芥中，实验结果表明，转基因拟南芥提高了植物的耐盐碱胁迫能力。

附图说明

图1不同胁迫条件下，大豆叶片中gma-miR1510a在不同时间段的表达分析；

图2 T₁代转基因拟南芥PCR检测结果；

图3 T₂代转基因拟南芥PCR检测结果；

图4 盐碱条件下转基因拟南芥发芽率统计；A：200 mM NaCl处理；B：5 mM NaHCO₃处理；C：5 mM NaHCO₃+100 mM NaCl处理； 

图5 盐碱条件下转基因拟南芥耐逆境胁迫表型分析；A：空白对照组；B：200 mM NaCl处理；C：5 mM NaHCO₃处理；D：5 mM NaHCO₃ +100 mM NaCl处理。

具体实施方式：

实施例1 gma-miR1510a基因的表达分析

（1）gma-1510基因的逆境胁迫下表达分析

吉育72品种（吉林省长春市新城大街2888号，吉林农业大学王振民老师提供）大豆置于1×Hoagland营养液中，暗培养2天后，置于组培室中光照（10 h/d）培养，每三天换一次营养液。等到大豆幼苗长出第二对叶片时，分别移入添加120 mM NaCl、50 mM NaHCO₃、70 mM NaCl+50 mM NaHCO₃、2 % PEG8000的1×Hoagland培养液中胁迫处理，分别采集0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h大豆叶片，液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

（2）总RNA提取

5种条件胁迫处理后，收集8个时间段的大豆叶片材料，使用TRizol分别提取大豆叶片组织总RNA，提取总RNA步骤如下：

1.取植物材料100 mg，在液氮中研磨后加1 ml Trizol，剧烈震荡混匀；

2.15-30 ℃条件下放置5 min；

3.每1 ml Trizol里加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s后, 室温放3 min；

4.于12 000 rpm，4 ℃，离心15 min，取上层水相；

5.每1 ml Trizol加0.5 ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min；

6.于12 000 rpm，4 ℃，离心10 min，弃掉上清，保留沉淀；

7.加1 ml 75 %乙醇，洗涤沉淀；

8.于7 500 rpm，4 ℃，离心5 min，弃上清；

9.自然晾干5-10 min；

10.加入适量的DEPC水溶解样品。

（3）总RNA的反转录

对提取好的Total RNA进行反转录，反转录试剂盒购置于百泰克生物技术公司（BioTeke super RT Kit），总反转录成cDNA步骤如下：

1.按下表配制反转录反应液1：

2. 反应液1至于PCR仪上65 ℃反应5 min，结束后置于冰上，迅速冷却；

3. 在上述PCR管中加入以下反转录反应液2；

4.反转录反应条件为：（1）45 ℃，50 min；（2）70 ℃，10 min；

5.随即在冰上冷却，-20℃保存。反转录cDNA用作RT-PCR及前体基因克隆模版；

（4）实时荧光定量PCR分析gma-miR1510a在大豆中表达水平：

1.定量PCR反应体系：实时荧光定量PCR分析使用TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增，按照如下体系配置反应液，整个配置过程需要在冰上进行：

2. PCR扩增反应条件：

第一步：预变性：95 ℃，30 s，1 Cycle；

第二步：PCR反应：95 ℃，5 s，60 ℃，20 s，40个循环。

结果：NaCl胁迫处理后，大豆叶片中gma-miR1510a表达量从0 h到72 h之间呈现上升趋势；在3 h，gma-miR1510a的表达量达到峰值，相比对照，上调3.8倍。NaHCO₃ 胁迫处理下，大豆叶片中gma-miR1510a表达量呈现逐渐上升的趋势；72 h达到峰值，相比对照，上调2倍。在NaCl和NaHCO₃的共同胁迫处理下，大豆叶片中gma-miR1510a的表达量从0 h到3 h呈现逐渐上升的趋势；在3 h达到了峰值，上调1.9倍；PEG8000胁迫处理下，大豆叶片中gma-miR1510a表达量从0 h到6 h呈上升趋势；在6 h表达量达到峰值，上调1.8倍；结果见图1。

实施例2 gma-miR1510a的表达载体构建

（1）gma-miR1510a前体基因的克隆

以反转录的cDNA为模板，使用引物gma-miR1510a- F1，gma-miR1510a- R1，扩增两端带有BamHI和HindIII酶切位点的gma-miR1510a前体基因序列。其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

将含有gma-miR1510a前体序列构建重组质粒pMD19-T simple-miR1510a并进行测序验证。gma-miR1510a成熟序列，由gma-miR1510a前体加工获得，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

gma-miR1510a-F1 GGATCCTTATGGAACTGGAGGG

gma-miR1510a-R1 AAGCTTTACATGGAATGGGTG

（2） gma-miR1510a表达载体的构建

首先，化学合成两端含XhoI酶切位点的bar基因序列，然后将合成的序列插入pCAMBIA1301（购自pcambia公司）的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因；其次，用HindⅢ和BstEⅡ分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端。最后，将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，最终将鉴定正确的质粒载体命名为pCAMBIA-bar（由本实验室构建保存）。

合成的bar基因序列如序列表SEQ ID No.3所示。

用限制性内切酶BamHI和HindIII按照下列体系对pMD19-T simple-miR1510a进行双酶切，然后回收目的基因。

  用BamHI和HindIII双酶切回收的目的基因和表达载体pCAMBIA-bar，使用连接酶连入表达载体pCAMBIA-bar，并筛选阳性克隆。

用移液器吸取50 μL大肠杆菌感受态和10 μL重组质粒加入离心管，冰浴30 min，42 ℃热击90 s，放入37 ℃摇床，180 rpm摇菌1 h，在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB固体培养基上涂板，放入37 ℃培养箱中过夜培养。待长出单菌落后，挑取单菌落，放入含有卡那霉素（50 mg/L）的LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm过夜摇菌，提取质粒DNA。

质粒DNA提取步骤如下：

1.取1-2 ml菌液，12 000 rpm离心1 min，弃掉上清；

2.加入200 μL SolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮菌体；

3.加入200 μL Solution

，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次，让菌体充分得到裂解，待形成透亮的蛋清状溶液；

4.加入350 μL SolutionIII，温和并充分地上下翻转，混合8-10次，待充分混合后，室温下放置2-5 min。12 000 rpm，离心10 min；

5.将步骤4中的上清液转移到2 ml收集管内的离心柱中，室温下6000 rpm，离心1 min，取出离心柱，倒掉收集管中废液；

6.将离心柱重新放回收集管中，加入500 μL Solution IV，12000 rpm，室温离心1 min，倒掉收集管中废液；

7.将离心柱重新放回收集管中，加入500 μL Wash Solution，12000 rpm，室温离心1 min，倒掉收集管中废液；

8.重复步骤7一次；

9.弃去废液，室温下，12 000 rpm，离心1 min，将Wash Solution彻底除掉；

10.将离心柱放入干净的1.5 ml离心管中，对准离心柱膜的中央位置，加入50 μl-70 μl 去离子水（65 ℃加热），37 ℃放置2 min。然后在室温下12 000 rpm，离心1 min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液；

取2-5 μl质粒溶液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。待结果正确后，用限制性内切酶SacI和SalI按照如下酶切体系对pCAMBIA-bar和pCAMBIA-bar-miR1510a进行双酶切鉴定实验，结果成功后，进行测序验证；

（3）重组pCAMBIA-bar-miR1510a载体转化农杆菌感受态细胞

农杆菌EHA105感受态制备过程如下：

1.将-80 ℃保存的EHA105在含有50 mg/L卡那霉素的YEP固体培养基上，划线培养，放置于28 ℃培养箱中；

2.挑取单菌落接入5 ml YEP液体培养基中，180 rpm，28 ℃，培养12 h以上；

3.取600 μL培养液于50 ml YEP液体培养基中，180 rpm，28 ℃，培养6 h；

4.测OD₆₀₀在0.12-0.14时，在常温下，5 000 rpm，离心10 min；

5.弃去上清，用2 ml YEP溶解混匀后，转移至1.5 ml离心管中，4 ℃，5 000 rpm，离心10 min，弃去上清；

6.加入20 mM冰浴的CaCl₂ 250 μL，悬浮沉淀物，取50 μl冰上放置用于转化，剩余的-80 ℃保存；

农杆菌感受态细胞制备完成后，进行质粒转化。取pCAMBIA-bar-miR1510a质粒1 μg放入1.5 ml离心管中，冰浴30 min，37 ℃热击5 min，向离心管中加入1 ml YEP培养基，160 rpm，28 ℃，离心2 h，再用5 000 rpm，离心5 min，弃去上清。得到的沉淀用100 μL YEP培养基重悬，涂布于加有（50 mg/L）卡那霉素、利福平的YEP平板上，放置于28 ℃培养箱中，两天左右。待长出单菌落后，进行菌落PCR检测。通过电泳检测结果可以看到在959 bp处有明显的条带，证明pCAMBIA-bar-miR1510a质粒转化农杆菌EHA105成功，可用于后续拟南芥转化。

gma-miR1510a表达载体验证引物序列：

gma-miR1510a-F2：ATGGAACTGGAGGGATAGGT

gma-miR1510a-R2：GTGCTTGTCTCGATGTAGTG

实施例3.农杆菌介导的gma-miR1510a转化拟南芥

（1）野生型拟南芥的侵染

将转化后的农杆菌接种于50 ml含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平的YEP液体培养基中，28℃过夜培养后全部转移至1 L 含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平的YEP液体培养基中28℃过夜培养20-22 h, OD950到 1.0-1.2，菌液用4000 rpm，20度离心15min。用每L含有1/2MS+5%蔗糖、1000×B5维生素 1 ml、1mg/ml、6-BA 10 uL、silwet-77 200 uL。调整菌液OD590到0.8-0.9，将抽薹后刚开花的拟南芥向下浸入菌液侵染7分钟后，横置并用保鲜膜密封且避光放置48h后揭开保鲜膜透气。并置于正常生长条件下。侵染后15-20天隔天收获发黄的成熟荚。

（2）转基因拟南芥的筛选

将采集的T₁代拟南芥种子春化三天两夜后，用移液器吸取并播种在蛭石与土壤按3:1混合的无菌土上，种子不要种的太密，前三天盖上塑料盖注意保湿，三天后待种子萌发后，去掉盖子放置于人工气候室中，正常培养。

待拟南芥种子长出两对叶片时，可以对拟南芥植株喷洒1 %浓度的BASTA除草剂，每钵喷三下，每隔一天喷一次，共喷三次，可以观察到拟南芥植株叶片对BASTA的抗性程度变化情况。叶片如果是正常生长，叶色仍为绿色的，可以说明该植株为T1代转基因株系，植株明显萎蔫枯黄，说明无BASTA抗性基因存在，即为非转基因植株。通过引物gma-miR1510a-F2和gma-miR1510a-R2对T1代转基因拟南芥进行PCR扩增，在959 bp处可见有特异并且清晰的条带，并且与阳性对照一致，见图2。

将T1代转基因植株移栽至单盆中生长，放置于人工气候室中，等待种子成熟，收获T₂代转基因拟南芥种子。为筛选得到单拷贝的转基因拟南芥，将T₂代种子春化，待三天两夜后，用移液器每次吸取2-3粒种子，根据培养钵的大小平均种64处。等到拟南芥长出第一对叶片时，进行间苗处理，仅保留64株拟南芥，拟南芥长出第二对复叶时，进行1 %浓度的BASTA除草剂筛选，每钵喷三下，每隔一天喷一次，共喷三次，对存活下来的拟南芥进行统计分析，T₂代转基因拟南芥出现性状分离，将生长良好的T₂代拟南芥植株单株移入土中，置入人工气候室中正常培养，并对叶片提取基因组后进行PCR验证，见图3。T₃代获得gma-miR1510a纯和转基因株系，并利用PCR技术对转基因拟南芥进行分子检测。

实施例4.胁迫处理条件下转基因拟南芥的抗逆性能鉴定

（1）逆境胁迫下gma-miR1510a转基因拟南芥发芽率分析

挑取野生型和L3、L4株系转基因拟南芥种子，进行春化和消毒处理，将消毒好的种子分别使用含有200 mM NaCl、5 mM NaHCO₃、100mM NaCl+5mM NaHCO₃的MS固体培养基培养；培养条件为 4 ℃暗培养三天后，22 ℃光照培养16 h，暗培养8 h，一周后，统计发芽率。

结果：不同浓度的NaCl、NaHCO₃、NaCl+NaHCO₃胁迫培养条件下，培养第七天，200mM NaCl培养条件下转基因拟南芥发芽率平均为60%，低于野生型拟南芥发芽率。5 mM NaHCO₃条件下，培养第七天，转基因拟南芥发芽率平均为85%，同野生型拟南芥发芽率一致。在100mM NaCl+5mM NaHCO₃胁迫处理条件下，培养基中野生型拟南芥的发芽率略高于转基因拟南芥（发芽率平均70%），见图4。gma-miR1510a未能显著提高拟南芥在盐碱胁迫下的发芽率。

（2）转基因拟南芥的盐碱胁迫实验

分析L3、L4转基因拟南芥在逆境胁迫中表型变化，将在正常培养基下生长出两对叶片的野生型和转基因拟南芥分别放入含有200 mM NaCl、5 mM NaHCO₃、100mM NaCl+5mM NaHCO₃ MS培养基中胁迫处理一周，对转基因拟南芥表型进行对照分析。 

结果：在5 mM NaHCO₃、100mM NaCl+5mM NaHCO₃浓度下，野生型拟南芥与转基因拟南芥相比较，叶和根长势缓慢，苗死亡率一致。200mM NaCl胁迫条件下，野生型拟南芥对NaCl敏感，死亡率为65%，转基因拟南芥未出现死亡，转基因拟南芥的长势明显优于野生型，说明gma-miR1510a基因能够显著提高拟南芥的耐盐能力，见图5。

<110> 吉林农业大学

 

<120>一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及在盐碱调控中的应用

 

<160>  3  

 

<210>  1

<211>  93

<212>  RNA

 

<213>  大豆品种“吉育72”

 

<400>  1

uuauggaacu ggagggauag guaaaacaau gacugcugua uaaguaauug uuauaguuag    60

uuguuguuuu accuauucca cccauuccau gua                                 93

 

<210>  2

<211>  23

<212>  RNA

<213>  大豆品种“吉育72”

 

<400>  2

 

uuguuguuuu accuauucca ccc                                            23

 

<210>  3

<211>  564

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  3

 

ctcgagatga gcccagaacg acgcccggcc gacatccgcc gtgccaccga ggcggacatg    60

ccggcggtct gcaccatcgt caaccactac atcgagacaa gcacggtcaa cttccgtacc   120

gagccgcagg aaccgcagga gtggacggac gacctcgtcc gtctgcggga gcgctatccc   180

tggctcgtcg ccgaggtgga cggcgaggtc gccggcatcg cctacgcggg cccctggaag   240

gcacgcaacg cctacgactg gacggccgag tcgaccgtgt acgtctcccc ccgccaccag   300

cggacgggac tgggctccac gctctacacc cacctgctga agtccctgga ggcacagggc   360

ttcaagagcg tggtcgctgt catcgggctg cccaacgacc cgagcgtgcg catgcacgag   420

gcgctcggat atgccccccg cggcatgctg cgggcggccg gcttcaagca cgggaactgg   480

catgacgtgg gtttctggca gctggacttc agcctgccgg taccgccccg tccggtcctg   540

cccgtcaccg agatctgact cgag                                          564

Claims (5)

1.一个小RNA基因gma-miR1510a前体基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一个小RNA基因gma-miR1510a，其碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.一种小RNA基因gma-miR1510a的表达载体pCAMBIA-bar-miR1507a，它是由下述方法制备：

1）人工合成序列表SEQ ID No.3所示的bar基因序列；

2）用XhoI酶切bar基因序列和pCAMBIA1301，将bar插入pCAMBIA1301（购自pcambia公司）的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因；

3）用HindⅢ和BstEⅡ分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端；最后，将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，获得质粒pCAMBIA-bar；

4）目的基因和pCAMBIA-bar用BamHI和HindIII双酶切，连接，得pCAMBIA-bar-miR1510a。

4.权利要求1或2所述的一个小RNA基因gma-miR1510a在培育耐盐碱植物品种中的应用。

5.一种培育耐盐碱植物品种的方法，它包括：

1）将pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞中；

2）农杆菌转化至植物中。

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