CN103194449A - 大豆小RNA基因gma-miR169d及其在干旱调控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆小RNA基因gma-miR169d，它是利用Solexa测序技术获得了的microRNAs，分析结果表明，豆小RNA基因gma-miR169d与大豆干旱调控相关，将含有gma-miR169d的成熟基因片段连接到载体上，并转入拟南芥，通过抑制拟南芥细胞内的靶基因的表达来进一步提高拟南芥对干旱的耐受能力。解决了转耐干旱基因操作涉及基因序列过长而遭遇转化困难等问题，该类干旱诱导的miRcroNA为小分子表达调控基因，且为大豆内源性microRNA，不编码产生蛋白。

Description

大豆小RNA基因gma-miR169d及其在干旱调控中的应用

技术领域：

本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及一个大豆抗干旱大豆microRNA基因gma-miR169d，及其在抗旱调控中的应用。

背景技术

植物在生长过程中受到生物和非生物类的逆境胁迫，其中干旱是植物正常生长重要限制性因素之一。干旱会引起植物原生质体脱水，改变细胞膜的结构与透性，最终导致农作物产量降低。植物在干旱的过程中，通过关键基因的调控抵御或防卫干旱带来的不利影响。利用抗性基因资源改良植物的抗旱性，是提高农作物产量的有效方法。

植物对环境变化作出应激反应是基因水平调控和表观遗传调控的共同结果。microRNA分子作为一类非编码小分子，直接参与植物的生长、发育及对胁迫环境的耐受性。成熟的miRNA通过与靶mRNA的特定位点结合，引发mRNA的降解或抑制翻译来介导作用靶基因的转录后沉默。microRNA作为细胞逆境应答的激活因子出现，特异的回应逆境胁迫。有研究指出玉米在盐胁迫下，高粱在干旱胁迫下均涉及大量microRNAs表达水平改变。大豆受干旱胁迫的microRNA基因调控研究亦是增强或改善大豆抗逆的焦点。

MiRNA169是对干旱产生应答的一个重要小RNA，在大豆中共有21个家族成员。根据研究发现，在干旱处理条件下不同植物miR169的表达具有差异。在水稻中，干旱处理下miR169g的表达下调，miR169g 和miR169n是一个小RNA簇以串联形式存在，两者距离是3707bp。在miR169n(o)基因的上游有ABRE脱落酸响应元件说明miR169n（o)可能受到ABA的调控。在干旱渗透胁迫下miR169g通过脱水响应元件DRE被诱导。NF-Y是一个可以和CCAAT box结合的一类蛋白复合体，是进化保守的转录因子。NF-Y核转录因子包括三个亚基，NF-YA，NF-YB，NF-YC，编码亚基的基因包含一个进化保守区域，负责和DNA结合。研究表明，番茄在受到干旱胁迫时Sly-miR169表达上调，所预测的三个靶基因（NF-YA1，NF-YA2，NF-YA3）的表达量明显下降，超表达Sly-miR169c番茄植株的气孔开放数量减少，降低了蒸腾作用叶片的水分损失率，抗干旱能力明显增强。

发明目的

本发明的目的是提供一种大豆干旱调控相关的microRNAs，大豆小RNA基因gma-miR169d。

大豆小RNA基因gma-miR169d，它包括碱基序列如序列表SEQ ID No.1和/或2所示的基因。

大豆小RNA基因gma-miR169d，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示；

一种重组载体质粒，它是在RNA表达载体中插入大豆小RNA基因gma-miR169d；

所述的表达载体为pBASTA-RD，它是用多克隆位点接头替换pEGAD载体中的EGFP（Ala）₁₀ 基因序列构建而成；

所述的表达载体为p35S-NOS，它是用化学合成的MCS序列替换HBT-sGFP(S65T)-NOS载体PST I（3978）和Hind Ⅲ（3025）酶切位点间的C4ppdk1Zm-sGFP(S65T)序列构建而成。

大豆小RNA基因gma-miR169d在生产耐旱转基因植物中的应用。

本发明提供了大豆小RNA基因gma-miR169d，它是利用Solexa测序技术获得了的microRNAs，分析结果表明，大豆小RNA基因gma-miR169d与大豆干旱调控相关， 将含有gma-miR169d的成熟基因片段连接到载体上，并转入拟南芥，通过抑制拟南芥细胞内的靶基因的表达来进一步提高拟南芥对干旱的耐受能力。解决了转耐干旱基因操作涉及基因序列过长而遭遇转化困难等问题，该类干旱诱导的miRcroNA为小分子表达调控基因，且为大豆内源性microRNA，不编码产生蛋白。

附图说明

图1 HBT-sGFP(S65T)-NOS载体图谱；

图2 p35S-NOS载体图谱；

图3 大豆原生质共转化基因的表达水平分析图；A 组转化p35S-NOS质粒；B 组转化p35S-NOS-169d质粒；C 组转化HBT-sGFP(S65T)-NOS质粒；D 组转化HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10质粒；E 组共转化p35S-NOS和HBT-sGFP(S65T)-NOS；F 组共转化p35S-NOS-169d和HBT-sGFP(S65T)-NOS；G 组共转化p35S-NOS和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10；H 组共转化p35S-NOS-169d和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10。

图4  pBASTA-RD载体图谱；

图5野生型和转基因拟南芥的发芽率对比；

图6野生型和转基因拟南芥的叶片及根系生长状况。

具体实施方式

本发明的前期研究结果显示采用大豆品种吉育72水培幼苗作为实验材料，在干旱诱导条件下，gma-miR169d表达水平增高。

实施例1：gma-miR169d前体基因的克隆

以吉育72大豆品种（吉林省长春市新城大街2888号，邮编130118，吉林农业大学，农学院，王振民老师提供）为实验对象，进行水培。大豆种子使用灭菌蒸馏水清洗3次后，1× Hogland营养液水培，每2天更换一次培养液。设置对照组和处理组。待大豆培养至第2对复叶萌发后，处理组大豆使用2% PEG8000胁迫处理24h后，液氮冷冻材料，对照样组和PEG8000处理组提取总RNA。将大豆叶片使用液氮研磨成粉末后，将100 mg叶片干粉用小药匙转移至RNase-free的eppendorf离心管中，并加入1 ml RNAiso Plus（购买自Takara），摇匀后室温静置5 min，4℃、12000rpm 离心5min，将清液转入新的离心管中，加入200ul氯仿后盖紧离心管盖，震荡30 s，4℃ 、13000rpm 离心5min，取上清，加入400 ul异丙醇，-20°C放置1h，4℃ 、13000rpm 离心15min，沉淀用1ml 70%酒精洗涤2次，沉淀放超净工作台上吹干，用20 ul RNase-free水溶解，置于-80℃保存。总RNA反转录（BioTeke super RT Kit 购买自北京宝泰克生物技术有限公司），得到的cDNA作为PCR模板。

Gma-miR169d前体基因序列的PCR引物：

miR169d F1  AGATTAGTGGATGTGAGCCAAG 

miR169d R1  TAAGAATAGTAAATAAGAACC  

PCR反应条件和体系：

TaKaRa Ex Taq(5U/ul)  0.25ul；10× Ex Taq Buffer 5ul ；dNTP Mixture(各2.5mM)  4ul；模板cDNA  2.5ng；引物F1（10uM）2ul；引物R1（10uM）2ul；灭菌蒸馏水  up to 50ul。95℃ 5min；95℃ 30s， 60℃ 30s，72℃ 30s（30 Cycles）；72℃ 7min。

将扩增出的PCR产物连接克隆载体(pEASY-T1 Simple Cloning Kit，购自北京全式金生物技术有限公司)，得载体pEASY-T1-169d,酶切鉴定后测序（金唯智生物科技有限公司）。克隆的169d前体序列如序列表SEQ ID No.1；前体序列表达的成熟序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：鉴定gma-miR169d对靶基因NF-YA10的调控作用

1.构建gma-miR169d与靶基因NF-YA10的相互作用载体

（1）gma-miR169d表达载体的构建

用化学合成的MCS序列替换HBT-sGFP(S65T)-NOS载体PST I（3978）和Hind Ⅲ（3025）酶切位点间的C4ppdk1Zm-sGFP(S65T)序列，得到的重组载体命名为p35S-NOS（见附图2）。将含有miR169d基因的序列进行化学合成后插入p35S-NOS载体的BamH I和Xba I酶切位点间（委托金唯智生物科技有限公司完成）。将测序正确的载体命名为p35S-NOS-169d。合成的序列如序列表SEQ ID No.3所示，其中包括SEQ ID No.1序列及其在基因组中两端的部分序列。

（2）靶基因NF-YA10表达载体的构建

将含有与gma-miR169d作用位点的178bp长的部分NF-YA10基因序列（NCBI：ACCESSION XM_003519062）进行化学合成（委托金唯智生物科技有限公司完成）后，利用BamHⅠ和NcoⅠ酶切位点连接到HBT-sGFP(S65T)-NOS载体（NCBI： ACCESSION  EF090408；载体图谱见附图1）上，得到靶基因表达载体HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10。合成的靶基因NF-YA10基因序列如序列表SEQ ID No.4所示。

3.大豆原生质体细胞的制备及转染

 (1)大豆悬浮细胞系的建立：选择粒大、饱满、无霉病斑的种子，Cl₂灭菌8小时后用无菌水浸泡3-4小时，取幼胚接于MS+2,4D（2mg/l）培养基上诱导愈伤，每2周继代一次。将诱导30天的愈伤悬浮于MS+2,4D（2mg/l）液体培养基中于摇床中暗培养(25℃) , 转速为100-110r/min，每周继代一次。

(2)原生质体的制备：将培养好的悬浮细胞进行收集后，利用含有2%纤维素酶与0.4%离析酶的酶解液对大豆悬浮细胞进行室温酶解4小时，显微镜下监测细胞壁裂解情况。用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液，然后用75um的尼龙膜过滤含有原生质体的酶解液。150g，2min离心沉淀原生质体，显微镜下进行血球计数板计数，W5溶液重悬，使细胞最终浓度在10⁵个/ml。

（3）转染：每EP管体系中加入10 ug DNA，100 ul原生质体，110 ul 20% PEG4000,轻柔混合，诱导转化混合物5-15分钟。室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液以终止转化反应，W5溶液悬浮清洗一次，用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多24孔板中。室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。本实验共分8组，每组3个重复。A 组转化p35S-NOS质粒；B 组转化p35S-NOS-169d质粒；C 组转化HBT-sGFP(S65T)-NOS质粒；D 组转化HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10质粒；E 组共转化p35S-NOS和HBT-sGFP(S65T)-NOS；F 组共转化p35S-NOS-169d和HBT-sGFP(S65T)-NOS；G 组共转化p35S-NOS和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10；H 组共转化p35S-NOS-169d和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10。

4.real-time PCR检测gma-miR169d及NF-YA10基因表达水平

分别提取A，B，C，D，E，F，G,H 8组转染后大豆原生质体细胞的total RNA，并反转录成cDNA。然后对A，B实验组中gma-miR169d基因、C，D实验组中NF-YA10基因和E，F，G,H实验组中的GFP基因进行表达分析。

　　real-time PCR引物：

gma-miR169d　　F2   5'  AGTGGATGTGAGCCAAGG  3'

　　　　　　　　R2   5'  AAGATTTTGCATGTGAGT  3'

NF-YA10　　　　F3  5'  TTGTGACGAATTTTGTTTTG  3'     

　　　　　　　　R3   5'  ATGGCAGCCATTAGCATG  3'

GFP           F4    5'  CAGAAGAACGGCATCAAGGT  3'

              R4   5'  CGGACTGGGTGCTCAGGTAG  3'

内参5S         F5   5’ GCGTAGAGGAACCACACCAATC  3’

               R5    5’ TGGCGCCGAGCTATTTTTC  3’

PCR反应条件和体系为：12.5 ul SYBR premix Taq，0.5 ul 浓度为10um的正向引物，0.5 ul浓度为10um的反向引物，0.5 ul ROX reference Dye II，2.0 ul cDNA模版， 9.0 ul dH₂O。反应条件为95℃预变性 30s，95℃变性5 s， 60℃延伸退火20 s， 40个循环。以5s rRNA为内参，采用相对定量法计算gma-miR169d、NF-YA10及GFP基因在大豆原生质体中的表达水平，结果见附图3。

结果与分析：Ａ组p35S-NOS空质粒转化和Ｂ组p35S-NOS-169d超表达169d质粒转化相比，Ｂ组gma-miR169d表达量明显升高。C组HBT-sGFP(S65T)-NOS空质粒转化和D组HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10超表达NF-YA10质粒相比，D组NF-YA10基因表达水平明显升高。E组和F组，NF-YA10基因表达水平相当，分析原由，E组和F组中转化的质粒中不具有miR169d的靶向作用位点，不对GFP基因的表达产生影响。G组中NF-YA10基因表达水平相对E组和F组有所降低，这是由于HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YA10质粒中的GFP和NF-YA10基因偶联，内源的miR169d对NF-YA10靶向作用，从而影响了GFP基因的表达水平。H组中NF-YA10基因表达水平明显降低，这主要是超表达的miR169d对NF-YA10基因的靶向负调控作用所至，从而使NF-YA10基因偶联的GFP表达水平降低。

实施例3 gma-miR169d的超表达载体的构建

pBASTA-RD载体（为Eduado Blumwacd，Department of Plant Sciences, University of California惠赠）它是用多克隆位点接头替换pEGAD载体中的EGFP（Ala）₁₀ 基因序列构建而成。pBASTA-RD载体图谱见附图4。

通过常规分子生物学操作技术，利用BamH I和Xba I酶切位点将克隆的169d基因（序列如序列表SEQ ID No.1）插入pBASTA-RD质粒中，转化大肠杆菌      DH5α，将测序正确的克隆提取质粒进行酶切验证。构建的植物超表达载体命名为pBASTA-RD-Gma-miR169d。取50 ul 农杆菌感受态（EHA105）加入1ｕg pBASTA-RD-gma-miR169d质粒，热激法转化农杆菌细胞，涂布抗性含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平的YEP固体培养基上，28℃培养48 h。挑选平板上长出的单菌落接种到含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平的YEP液体培养基中，于试管28℃培养8-10 h,并利用菌液PCR鉴定转化结果是否为阳性。

实施例4 转gma-miR169d拟南芥植株的获得

将转化后的农杆菌接种于50 ml含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平的YEP液体培养基中，28℃过夜培养后全部转移至1 L 含有50 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平的YEP液体培养基中28℃过夜培养20-22 h, 培养至OD590到 1.0-1.2，菌液用4000 rpm，20度离心15min。用每L含有1/2MS+5%蔗糖、1000×B5维生素 1ml，1mg/ml6-BA 10 uL,silwet-77 200 uL的培养液调整菌液OD590到0.8-0.9，将抽薹后刚开花的拟南芥向下浸入菌液侵染7分钟后，横置并用保鲜膜密封且避光放置48h后，改在正常生长条件下直立培养。侵染15-20天后，隔天收获发黄的成熟荚。收获的种子利用含有10 mg/L的草铵膦培养皿筛选转基因拟南芥。根据孟德尔基因分离定律的3:1分离关系，重复筛选，直至Ｔ３代可获得转gma-miR169d基因拟南芥的纯和株系。并利用PCR技术对转基因拟南芥进行分子检测。

实施例5 ：转基因植株耐干旱胁迫能力的鉴定

为了鉴定转基因拟南芥耐干旱胁迫的能力，采用MS+15% 蔗糖+PEG8000（2%、3%、4%、5%）的模拟不同干旱程度的培养基中培养14天后，观察转基因拟南芥对比野生型拟南芥的叶片、根系生长状况及发芽率变化。

结果显示，转基因拟南芥在含2%、3%、4%、5%PEG8000的培养基条件下发芽率分别为96%，95.5%，92%，93%，对应野生型拟南芥的发芽率分别为93%,93％，91％，90.5％，结果见附图5。可见，拟南芥在超表达gma-miR169d基因前后，发芽率均大于90%,始终保持高发芽率状态。此外，在正常生长条件下，野生型拟南芥和超表达gma-miR169d基因拟南芥植株并无明显生长差异，但随PEG 8000浓度的增加，野生型拟南芥逐渐表现出叶片萎蔫的状态。在５%的PEG 8000 胁迫环境中培养7天后，超表达gma-miR169d基因的转基因拟南芥与野生型相比叶片生长状态稍好，根系数较多，转基因植株失水率为8.5%。而野生型植株叶片显得枯黄，根系数少，失水率为12%，结果见附图6。由此推断，超表达miR169d基因的转基因拟南芥植株相比野生型植株干旱耐受性升高。

SEQUENCE LISTING                         

 

<110> 吉林农业大学

 

<120>大豆小RNA基因gma-miR169d及其在干旱调控中的应用

 

<160>  4    

 

<210>  1

<211>  88

<212>  cDNA

<213>  大豆

 

<400>  1

agattagtgg atgtgagcca aggatgactt gccggttgta taatagcacc cggtttaagt   60

ccttcttggt tcttatttac tattctta                                      88

 

<210>  2

<211>  23

<212>  RNA

<213>  大豆

 

<400>  2

 

ugagccaagg augacuugcc ggu                                          23

 

<210>  3

<211>  130

<212>  cDNA

<213>  人工

 

<400>  3

 

aggtaatttg catgaagagt agattagtgg atgtgagcca aggatgactt gccggttgta   60

taatagcacc cggtttaagt ccttcttggt tcttatttac tattcttact cacatgcaaa  120

atctttggac                                                         130

 

<210>  4

<211>  178

<212>  cDNA

<213>  人工

<400>  4

 

atgtttcctg tgttcattgt gacgaatttt gttttggagg cgtgcctcta catctggttt   60

aggcaatcca ttcttggcta ctgcttaggc aactcatcct tggctcatta tattaatagt  120

actttccttt tctttctgca caggcttgtc ataacatggt tatacatgct aatggctg    178

Claims (6)

1.大豆小RNA基因gma-miR169d，它包括碱基序列如序列表SEQ ID No.1和/或2所示的基因。

2.大豆小RNA基因gma-miR169d，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示。

3.一种重组载体，它是在RNA表达载体中插入大豆小RNA基因gma-miR169d。

4.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于：所述的表达载体为pBASTA-RD，它是用多克隆位点接头替换pEGAD载体中的EGFP（Ala）₁₀ 基因序列构建而成。

5.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于：所述的表达载体为p35S-NOS，它是用化学合成的MCS序列替换HBT-sGFP(S65T)-NOS载体PST I（3978）和Hind Ⅲ（3025）酶切位点间的C4ppdk1Zm-sGFP(S65T)序列构建而成。

6.大豆小RNA基因gma-miR169d在生产耐旱转基因植物中的应用。

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