CN107418972B - 一种获得生长特性改良水稻品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻品种生长特性的改良，具体涉及一种获得生长特性改良水稻品种的方法。其特征在于，包括：向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的过表达载体，获得转基因水稻植株；所述生长特性指植株高度、生物量积累和耐低氮胁迫能力。该方法提高了水稻对氮的利用效率，增强了对低氮胁迫的适应力，能够在保证作物产量的同时，减少氮肥的施用量，节省农业生产成本。

Description

一种获得生长特性改良水稻品种的方法
技术领域
本发明涉及水稻品种生长特性的改良，具体涉及一种获得生长特性改良水稻品种的方法。
背景技术
氮肥是作物正常生长和发育、完成生命循环必需的矿物质元素之一。在20世纪后期的农业生产中，提高氮肥施用量逐步地提高了作物的单位产量，然而，当氮肥施用突破适度的临界点时，过量的氮肥施用量已经不再能对应地提高作物的单位产量。相反，过度的施用氮肥带来了一系列的环境和生态问题，包括水资源的富营养化，耕作土壤的板结和酸化，温室气体的大量排放，以及大气污染的加剧，等等。
据氮肥调研报告指出现在氮肥的施用量已远远超过粮食作物的需求量，肥效迅速下降。我国在氮肥过量施用的问题上尤其严重，全国已有17个省氮肥平均施用量超过国际公认的上限225公斤/公顷。施用的氮肥仅有1/3被农作物吸收，而其他部分或进入大气，或沉留在土壤中，残留氮已经成为巨大的污染暗流。因此，合理而适当地施用氮肥是避免农业负效应、节省农业生产成本、减少环境污染的必要措施。
在当前的农业生产条件下，如何改善作物对低氮胁迫的适应性，提高氮肥的有效利用是解决当前氮肥过度施用和保证作物产量的最终途径之一。
近几年的研究成果表明，miRNAs不仅在植物的生长发育过程中发挥重大的作用，而在应对环境逆境中也发挥着重要的调控作用。
2009年，我国公开颁发了水稻的转基因安全证书，这为利用生物技术手段来改良水稻的产量提供了新的契机和信号。miRNAs又因其不编码具体产物而最大程度地降低了公众对转基因事件的抵触和反对。因此，寻求和开发更多改善和提高水稻氮利用的miRNAs，并应用于水稻的遗传改良，从而提高水稻对氮肥的高效利用，在保证产量的基础上提高水稻对低氮胁迫的适应性，是解决我国乃至世界氮肥过量施用的一个捷径。
发明内容
为提高水稻对氮肥的利用率以及对低氮胁迫的适应性，本发明提供一种促进水稻生长和耐低氮胁迫的方法。
本发明请求保护的技术方案如下：
一种获得生长特性改良水稻品种的方法，其特征在于，包括：
向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示基因的过表达载体，获得转基因水稻植株；所述生长特性指植株高度、生物量积累和耐低氮胁迫能力。
优选地，还包括：将获得的转基因水稻植株与其它水稻植株进行杂交。
优选地，所述过表达载体通过农杆菌介导到水稻受体材料中。
优选地，所述过表达载体采用双元表达载体pCXUN且含有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
一种用于改良水稻品种的表达载体，其特征在于，骨架表达载体的多克隆位点装载有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段。
优选地，所述骨架表达载体为双元表达载体pCXUN，还装载有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(a)以水稻基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增并分离核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段；(b)将扩增并分离的基因片段克隆到骨架载体中。
优选地，所述PCR方法采用如下引物：
上游引物osa-miR169o-F：5'-CTTCCTTTCTGGCTTATCCAAGATG-3'；
下游引物osa-miR169o-R：5'-GTCCAAAATTGCACCAAATGAACAG-3'。
优选地，所述骨架载体为双元表达载体pCXUN，骨架载体上还装载有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
优选地，步骤(b)具体如下：
所述双元表达载体pCXUN用XcmI酶进行酶切，获得线性化pCXUN-XcmI载体，
用T4连接酶连接所述线性化pCXUN-XcmI载体和核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的osa-miR169o前体基因，然后利用热激转化法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆并测序验证序列信息正确的阳性克隆，采用碱裂解法提取质粒，获得osa-miR169o过表达载体。
本发明经过大量实验研究发现osa-miR169o具有两种突出的生物学功能特性，一是osa-miR169o可以显著促进水稻的生长，二是osa-miR169o能够提高水稻对氮的利用效率，增强水稻对低氮胁迫的耐性。
在miRBase数据库中，osa-miR169o的mRNA序列号为MI0001130，其茎环序列对应水稻数据库(MSU7)Chr11:6081528..6081700(-)，长度为173bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；其成熟miRNAs序列在miRBase数据库中的mRNA序列号为MIMAT0001060，长度为21bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。基因注解为“This sequence is a predicted paralogueof the previously identified miR169 family.It is predicted to target mRNAscoding for the CCAAT Binding Factor(CBF)and HAP2-like transcription factors.”
本发明选取包含Chr11:6081528..6081700序列及其上、下游序列在内的444bp片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，构建过量表达载体并转入水稻中，获得了水稻osa-miR169o过表达植株。分别在正常氮供应条件下和低氮胁迫条件下对比osa-miR169o过表达植株与对照植株的长势，结果如图4和表1所示，不论是在正常氮供应条件下还是在长期低氮胁迫条件下，过量表达osa-miR169o的水稻转基因植株，其植株高度和生物量积累均明显高于对照植株；并且，在过表达植株体内，尤其是根部的硝酸根(氮肥的一种重要形式之一)和氨基酸含量与对照植株相比明显增高。由此表明，过量表达osa-miR169o促进了水稻的生长，提高水稻对氮的利用效率，增强了对低氮胁迫的适应力。
本发明优选pCXUN载体构建osa-miR169o过量表达载体，利用泛素启动子驱动osa-miR169o基因的表达，获得的转基因植株的高表达水平具有遗传稳定性。但本发明的实现并不依赖于pCXUN载体，也可以利用本领域已知的其它带选择性标记或不带选择标记的表达载体来构建osa-miR169o过量表达载体，也可以利用CaMV 35S强启动子或玉米泛素(Ubiquitin)强启动子来驱动osa-miR169o的表达。
本发明采用农杆菌侵染水稻植株，所述农杆菌包含携带SEQ ID NO：1所示的基因序列的植物双元表达载体。除此之外，也可以采用基因枪法转化水稻，提取表达载体质粒，用金粉包埋后，轰击水稻组织，获得相关转基因植株。
过量表达osa-miR169o可以促进水稻生长、增强氮利用率的特性可用在水稻品种的遗传改良上。一方面，可以构建osa-miR169o的过量表达载体直接转化水稻生产品种，将遗传稳定的转基因材料应用于生产。另一方面，构建osa-miR169o的过量表达载体转化水稻材料，将获得的转基因水稻材料与其它水稻生产品种进行杂交，从而达到水稻遗传改良的作用。在保证作物产量的同时，减少氮肥的施用量，节省农业生产成本，这将有助于解决粮食生产中的氮肥过量使用所造成的生态环境恶化、生产成本高的难题，进而产生巨大的经济效益和社会效益。
附图说明
图1.PCR扩增osa-miR169o前体基因的电泳结果；
其中，扩增模板用水稻基因组DNA，扩增引物为osa-miR169o-F和osa-miR169o-R，扩增片段的长度为444bp。
图2.pCXUN-osa-miR169o双元表达载体的构建原理示意图；
其中，PCR扩增的osa-miR169o前体基因片段(末端加A)，插入XcmI消化后的pCXUN载体中(位于组成性启动子泛素启动子下游)，形成pCXUN-osa-miR169o双元表达载体，筛选标记为潮霉素抗性。
图3.osa-miR169o转基因T1代植株中潮霉素基因的检测结果(A)和osa-miR169o表达水平的qRT-PCR检测结果(B)；
其中，A.CK：非转基因植株，1-9：Hyg检测阳性植株，10：Hyg检测阴性植株；B.以非转基因植株为对照，其osa-miR169o表达水平视为1；26、51、53分别代表osa-miR169o过表达植株的不同株系。
图4.在正常氮供应条件下和低氮胁迫条件下osa-miR169o过表达植株的长势分析；
其中，A.正常氮供应条件(3mM KNO3)和长期低氮胁迫条件(0.3mM KNO3)下，水稻植株的植株高度示意图；B.正常氮供应条件(3mM KNO3)和长期低氮胁迫条件(0.3mM KNO3)下，水稻植株的植株高度数据分析；WT代表非转基因对照植株，miR169o OX-1和miR169o OX-2代表osa-miR169o过表达植株。
图5.osa-miR169o转基因T2代植株根(A)、茎(B)和叶(C)中的硝酸根含量；
其中，WT为非转基因对照植株，OX指osa-miR169o过表达转基因植株T2代；正常N指正常氮供应条件(3mM KNO3)下，N胁迫指低氮胁迫供应条件(0.3mM KNO3)下；*表示与对照相比差异达到显著水平。
图6.osa-miR169o转基因T2代植株根(A)、茎(B)和叶(C)中的总氨基酸含量；
其中，WT为非转基因对照植株，OX指osa-miR169o过表达转基因植株T2代；正常N指正常氮供应条件(3mM KNO3)下，N胁迫指低氮胁迫供应条件(0.3mM KNO3)下；*表示与对照相比差异达到显著水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
植物材料：日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)，已知品种，研究用野生稻，由中国农业科学院植物保护研究所保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
XcmI酶，购买自NEB公司；
T4连接酶，购买自Invitrogen公司；
2×Det PCR Master Mix，购买自天根生化科技(北京)有限公司；
Figure BDA0001397673340000051
qPCR Master Mix，购买自Promega公司；
载体pCAMBIA1300，购买自BioVector NTCC典型培养物保藏中心；
Figure BDA0001397673340000052
MicroRNA Reverse Transcription Kit，购自ABI公司；
以下各实施例中，未特别说明的各种试验材料、试剂、载体等，均可通过商业途径获得；未特别说明的各种试验操作方法，包括RNA的提取、cDNA的制备、克隆或表达载体的构建、酶切、连接、菌株转化、筛选等等，均为本领域内常规的试验手段，具体可参见分子克隆实验指南或相关产品的目录、技术支持和产品说明书部分。
实施例1
利用反向遗传学方法证明osa-miR169o对水稻的促生长以及耐低氮胁迫的影响。
1、克隆osa-miR169o前体基因
osa-miR169o定位于水稻第11号染色体上，在Genbank中的Locus为：LM379338(成熟序列)；在miRBase数据库中osa-miR169o的成熟序列的序列号为：MIMAT0001060，茎环序列的序列号为：MI0001130；过表达植物miRNAs通常是将包含miRNA茎环序列在内的上、下游各50-200bp左右的片段转化入植物体中，这段包含茎环序列在内的序列片段称为miRNA前体基因。本申请采用的水稻osa-miR169o前体基因为包含miR169o茎环序列在内444bp的片段，其碱基编码序列如SEQ ID NO：1所示；osa-miR169o的茎环序列如SEQ ID NO：4所示；osa-miR169o的成熟序列如SEQ ID NO：5所示。
利用CTAB法提取水稻叶片基因组DNA，以基因组DNA为PCR模板，扩增osa-miR169o前体基因的编码序列(SEQ ID NO：1)，扩增用特异性引物如下：
上游引物osa-miR169o-F(SEQ ID NO：2)：
5'-CTTCCTTTCTGGCTTATCCAAGATG-3'；
下游引物osa-miR169o-R(SEQ ID NO：3)：
5'-GTCCAAAATTGCACCAAATGAACAG-3'。
2、构建osa-miR169o过表达载体
以水稻基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的特异性引物，按照下列反应体系和程序扩增osa-miR169o前体基因，扩增产物末端加A(适用于TA克隆)。
PCR体系(25μL)：基因组DNA(20ng/μL)1μL，10μM引物osa-miR169o-F 0.5μL，10μM引物osa-miR169o-R 0.5μL，dNTPs 1μL，Taq酶0.2μL，10×缓冲液2.5μL，ddH2O 20.25μL。
PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃10min；10℃保存。
采用植物转化双元载体pCXUN(经pCAMBIA1300修饰而成，载体的修饰方法参考文献Chen S,Songkumarn P,Liu J,Wang GL.A versatile zero background T-vectorsystem for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol.2009,150:1111–1121.doi:10.1104/pp.109.137125中所记载的方法)，用XcmI酶按照厂家说明书上的酶切体系和条件对载体pCXUN进行酶切，获得线性化的pCXUN-XcmI载体。
用T4连接酶按照厂家说明书上的连接体系和条件，连接消化后的pCXUN-XcmI载体(形成T突出末端)和osa-miR169o前体基因(A突出末端)，然后利用热激转化法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆并测序验证序列信息正确的阳性克隆，采用碱裂解法提取质粒，获得osa-miR169o过表达载体。
3、获得osa-miR169o过量表达的转基因水稻植株
采用电击转化法将osa-miR169o过表达载体转入农杆菌EHA105感受态细胞中，利用卡那霉素抗性筛选阳性转化子。
利用携带osa-miR169o过表达载体的农杆菌侵染水稻，获得T1代转基因植株。通过潮霉素基因的PCR检测以及osa-miR169o的qRT-PCR检测，筛选得到osa-miR169o表达明显增高的植株。
(1)潮霉素基因的PCR检测：用CTAB法分别提取每个转基因植株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用如下引物：
Hyg上游引物序列：5’-TCCATACAAGCCAACCACG-3’，
Hyg下游引物序列：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’，
按照下列PCR体系和程序进行扩增，
PCR体系(20μL)：基因组DNA(20ng/μL)1μL，10μM Hyg上游引物0.5μL，10μM Hyg下游引物0.5μL，2×Det PCR Master Mix 10μL，ddH2O 8μL。
PCR程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃5min；4℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图3(A)所示，其中CK为非转基因植株，1-9为Hyg检测阳性的植株，10为Hyg检测阴性的植株。
(2)osa-miR169o的qRT-PCR检测：提取Hyg检测阳性植株的RNA，采用茎环引物法反转录成miRNA(参照
Figure BDA0001397673340000071
MicroRNA Reverse Transcription Kit的使用说明书)，采用的反转录茎环引物序列为：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTCCA-3’，
定量PCR检测引物为：
反向引物：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTCCA-3’
正向引物：5’-GCCGCATAGTTCAAGAAAGTCC-3’，
按照如下反应体系和程序进行实时定量PCR，
PCR体系(20.0μL)：
Figure BDA0001397673340000072
qPCR Master Mix 10.0μL，10μM正向引物0.4μL，10μM反向引物0.4μL，cDNA(20ng/μL)2.0μL，无核酸酶水7.2μL。
PCR程序：预变性95℃，10min；然后95℃15s，60℃60s，反应40个循环。
结果如图3(B)所示，26、51、53分别代表osa-miR169o表达水平为非转基因植株的26倍、51倍和53倍的osa-miR169o过表达植株株系，这里将非转基因植株中的osa-miR169o表达水平视为1。
4、检测T2代转基因植株的长势
将T2代转基因植株和野生型植株各36株在正常氮供应条件下进行培养，同时将相同株数的T2代转基因植株和野生型植株在低氮胁迫条件下进行培养，于1月苗龄时测定各种指标。其中，正常氮供应条件：水稻培养液中KNO3的浓度为3mM；低氮胁迫条件：水稻培养液中KNO3的浓度为0.3mM。
水稻培养液采用Hogland培养液，具体配方为：10mM KH2PO4，2mM MgSO4，1mMCaCl2，0.1mM Fe-EDTA，50μM H3BO4，12μM MnSO4，1μM ZnCl2，1μM CuSO4，0.2μM Na2MoO4，pH5.5-6.0，3mM KNO3(Hoagland and Arnon，1950)。
(1)测量植株高度
当植株长至1月苗龄时，观察植株的高度，测定单株植株的高度并进行统计分析。结果如图4所示，无论是在正常氮供应条件下还是在长期低氮胁迫条件下，osa-miR169o过表达植株都明显高于对照植株，表明osa-miR169o的表达促进了植株的生长状况。
(2)测定植物生物量
当植株长至1月苗龄时，分别测定单株的鲜重：新鲜组织样品直接称重；和干重：新鲜组织样品在干燥烘箱中烘烤7天后，称重。计算单株总重量：等于根部重量加上茎叶部重量。结果如表1所示，在正常氮供应条件下和低氮胁迫条件下，osa-miR169o过表达植株的根、茎、总重都显著高于对照植株，因此，无论是鲜重还是干重，都表明过表达osa-miR169o促进了水稻的生长。此外，osa-miR169o过表达植株的根茎比也都高于对照植株，表明osa-miR169o过表达植株的根部更发达。对比单株在低氮条件下与正常氮条件下的生物量的比值则发现，osa-miR169o过表达植株的比值较对照植株有了显著的提高，这也间接表明osa-miR169o过表达植株更适应低氮供应条件。
表1.osa-miR169o过表达植株生物量分析a
Figure BDA0001397673340000081
注：a代表4次实验的平均值；*比率代表作物在低氮胁迫条件下的组织总重量与在正常氮供应条件下的组织总重量的单株比值。WT：对照植株；OE：osa-miR169o过表达植株。
5、检测T2代转基因植株的氮吸收
分别测定每一株水稻的根部、茎部和叶片的硝酸根含量和总氮含量(总氨基酸含量)，测定方法参考Yan,Y.,Wang,H.,Hamera,S.,Chen,X.and Fang,R.(2014)MiR444a hasmultiple functions in the rice nitrate-signaling pathway.Plant Journal 78:44-55.文献中所记载的方法。
如图5所示，无论是在正常氮供应条件下还是在低氮胁迫条件下，Osa-miR169o过表达植株根部的硝酸根含量显著高于非转基因对照植株，由此表明过表达植株对硝酸根的吸收明显增强。在低氮供应条件下，除根部外，Osa-miR169o过表达植株茎叶部的硝酸根含量也显著增加，表明osa-miR169o过表达明显增强了水稻对硝酸根类氮的吸收。
如图6所示，无论是在正常氮供应条件下还是在低氮胁迫条件下，osa-miR169o过表达植株根部的总氮含量都显著高于非转基因对照植株，表明osa-miR169o过表达促进了根部总氮的积累；而茎叶部的总氮含量变化不显著。
结合植株的高度，生物量积累，硝酸根含量和总氮含量的结果表明，过表达osa-miR169o不仅促进了水稻的生长，同时也提高了水稻植株的氮利用效率，提高了水稻植株对低氮胁迫的适应性。
实施例2
先转化实验用水稻材料，通过杂交将osa-miR169o过表达性状转移到生产品种，筛选表达水平较高植株，构建高表达稳定遗传株系。
将实施例1中获得的过量表达osa-miR169o的转基因水稻与生产品种杂交，收获杂交一代的种子，杂交二代分离群体中挑选农艺学性状接近杂交用生产品种，且osa-miR169o表达量高的植株；挑选出的植株经过自交后，再继续挑选农艺学性状更接近杂交用生产品种，且osa-miR169o表达量高的植株；如此循环几次后，使最终筛选到植株的农艺学性状与生产品种非常接近，且osa-miR169o的表达量明显增高的植株，即为osa-miR169o高表达的稳定遗传株系。
Figure BDA0001397673340000091
Figure BDA0001397673340000101
Figure BDA0001397673340000111
Figure BDA0001397673340000121
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 一种获得生长特性改良水稻品种的方法
<130> P170363/ZWB
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
cttcctttct ggcttatcca agatgagaga gagagagaga tatctgaaga gtgaagagaa 60
gaggggagcc ttacatggag attgagaggc tactcccttt ggtagccaag aatgacttgc 120
ctacgctttt gccctctgtt ggctcatcca tccgtctatc tatctgccat ggcagatggc 180
agattaaggg tttctgaaag aaattcttgt gataggatgt gcaatgaggc tgcatgggcc 240
ggtcttcttg gctagccaga gtggctctca tccaccatgc taggccaccc ctcttcagaa 300
tttttcagct tattttgcat tctctctgca aatgaaattt ggtaatgtac taatgttcat 360
catgacctct caaatttcct ctcttttatt gtttatattg gtaaggaaca ttattatttc 420
tgttcatttg gtgcaatttt ggac 444
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 扩增osa-miR169o前体基因的上游引物
<400> 2
cttcctttct ggcttatcca agatg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 扩增osa-miR169o前体基因的下游引物
<400> 3
gtccaaaatt gcaccaaatg aacag 25
<210> 4
<211> 173
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
cucccuuugg uagccaagaa ugacuugccu acgcuuuugc ccucuguugg cucauccauc 60
cgucuaucua ucugccaugg cagauggcag auuaaggguu ucugaaagaa auucuuguga 120
uaggaugugc aaugaggcug caugggccgg ucuucuuggc uagccagagu ggc 173
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
uagccaagaa ugacuugccu a 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR检测Hyg的上游引物
<400> 6
tccatacaag ccaaccacg 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR检测Hyg的下游引物
<400> 7
cctgacctat tgcatctccc 20
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> osa-miR169o的反转录茎环引物
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactttcca 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> qRT-PCR检测osa-miR169o的反向引物
<400> 9
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactttcca 50
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> qRT-PCR检测osa-miR169o的正向引物
<400> 10
gccgcatagt tcaagaaagt cc 22

Claims (4)

1.一种获得生长特性改良水稻品种的方法，其特征在于，包括：向水稻受体材料中转入过量表达核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因的过表达载体，获得转基因水稻植株；所述生长特性指植株高度、生物量积累和耐低氮胁迫能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：将获得的转基因水稻植株与其它水稻植株进行杂交。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达载体通过农杆菌介导到水稻受体材料中。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述过表达载体采用双元表达载体pCXUN且含有用于驱动外源基因表达的泛素启动子。
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