CN107400670B - 控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方法、应用 - Google Patents

控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方法、应用，属于植物基因工程技术领域。本发明根据基因OsbHLH116编码序列设计RNA干扰片段，将干扰片段和载体pTCK303经一次酶切和连接获得OsbHLH116‑RNAi表达载体；然后利用农杆菌介导法转化水稻品种新丰2号，通过qRT‑PCR对RNAi转基因株系中OsbHLH116基因表达量验证，结果显示OsbHLH116基因表达极显著降低。与野生型相比，OsbHLH116‑RNAi株系种子萌发率显著降低，表明OsbHLH116基因与控制水稻种子萌发有关。

Description

控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方 法、应用
技术领域
本发明涉及控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方法、应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
碱性-螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)转录因子是广泛存在于真核生物中的一类转录因子，其在动植物新陈代谢、生理调控和生长发育过程中起着重要作用。bHLH转录因子包含一个约60个氨基酸组成的高度保守结构域，其由位于N端能与DNA结合的碱性区域和位于C端的HLH区域构成(Toledo-Ortiz et al.,2003；Carretero-Pauletet al.,2010)。作为一个大的转录因子家族，拟南芥中有162个bHLH转录因子，而水稻中包含167个bHLH转录因子(Bailey et al.,2003；Li et al.,2006)。在水稻中，bHLH转录因子在光形态建成与光信号转导(Zhou et al.,2014)，干旱胁迫响应(Seo et al.,2011；Li etal.,2015)，冷害胁迫响应(He et al.,2016)，花粉粒与花器官发育(Fu et al.,2014)和激素信号转导(Miyamoto et al.,2013)等方面发挥着重要作用。
种子萌发过程是植物生命周期的起始发育过程。这个过程决定了植物进入自然或者农业生态系统的状态，种子萌发过程也是种子打破休眠的过程。种子的休眠性是指健康的种子在适宜的条件下不萌发的现象，是植物在进化过程中形成的，广泛存在的。在生产中，水稻的休眠特性的影响主要表现穗发芽和发芽不整齐。水稻成熟期遇到高温高湿就会使休眠弱的品种出现籽粒在稻穗上发芽的情况，穗发芽会严重影响稻米的产量和品质(方希林等,2015)。第一个通过图位克隆方法得到的控制种子休眠的基因是拟南芥休眠基因DOG1，其功能缺失突变体完全无休眠性表明在休眠调控中起着重要作用(Bentsink etal.,2006)。拟南芥种子发育中表达的锌指基因DAG1，它是影响休眠和萌发的重要因子，其突变体休眠性降低(Papi et al.,2000)。近年来，已初步定位了多个与水稻休眠性有关的QTL，广泛分布于条染色体上，其中在第1、3、5、6、7和11染色体上检测到的休眠较多(Gu etal.,2005；Wan et al.,2005)。种子休眠是一种非常复杂的数量性状，不仅受许多基因调控，植物激素和环境因子对种子休眠也产生很大影响。植物激素与种子休眠的关系非常密切，脱落酸和赤霉素是主要的调节因子，油菜素内酯和乙烯也参与种子休眠的部分调控(Finch et al.,2006)。种子休眠是一个复杂的由多基因控制的可遗传性状，受遗传背景和环境因素的显著影响。因此挖掘优良的休眠基因，并对相关基因进行研究，对水稻生产尤为重要。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)指内源性或外源性双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱导细胞内与其序列同源的基因表达沉默或抑制其表达的现象。当生物细胞内有dsRNA存在时，Dicer酶可把长链dsRNA切割成长度为21-25nt小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)，siRNA可与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)结合，共同切割靶向mRNA，引起基因表达量降低或沉默表达。因此RNAi技术是一种适用于几乎所有真核生物体内功能缺失研究的方法，具有特异性、高效性和可遗传性等特点，在基因功能研究、基因治疗和病虫害防治等方面发挥着重要作用(Waterhouseet al.,1998；Fang et al.,2016；Wu et al.,2014；Mamta et al.,2017)。传统的RNAi载体构建通常采用酶切连接通过多步克隆分别连接正义RNA和反义RNA形成dsRNA(刘磊等,2015)，操作繁琐且试验周期较长；利用Gateway技术只需两步反应(BP和LR反应)即可将目的片段构建到表达载体中，具有高效快速的特点，但其通用性较差，成本较高。而简易RNAi载体构建是Chang于2004年提出的通过化学合成两条长寡核苷酸链并使末端包含一段短的重叠结构，使其形成短发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)以干扰目的基因的表达(Chang,2004)。与上述两种方法相比，简易RNAi载体构建具有操作简便、高效和低成本等特点，仅需化学合成两条寡核苷酸链。
OsbHLH116基因属于bHLH家族转录因子。Gu等利用强休眠杂草稻SS18-2和无休眠栽培稻EM93-1群体在杂草稻定位了一个控制种子休眠的主效基因qsD12，标记间距小于75kb，分析日本晴基因组序列发现该区间包含6个转座子/逆转座子基因簇和3个功能基因，OsbHLH116属于3个功能基因之一，但并未确定qsD12是哪一个基因(Gu et al.,2010)。
发明内容
本发明提供了控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因。
本发明还提供了上述OsbHLH116基因表达的OsbHLH116蛋白。
本发明还提供了用于干扰上述OsbHLH116基因表达的RNAi片段。
本发明还提供了包含上述RNAi片段的RNAi载体。
本发明还提供了上述RNAi载体的制备方法。
本发明还提供了上述OsbHLH116基因、蛋白、RNAi片段及RNAi载体的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述的OsbHLH116基因表达的OsbHLH116蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
用于干扰上述的OsbHLH116基因表达的RNAi片段，其制备包括如下步骤：将如SEQID NO.4及SEQ ID NO.5所示的两条引物经退火延伸后得到131bp的互补双链DNA，即为用于载体构建的RNAi片段。
本发明在OsbHLH116(LOC_Os12g40730)基因外显子区域靠近起始密码ATG一端选择一段60bp序列：
5′-ATCGGAGGAAGAGATGGCAGCGTGGCTCTATCCGATCGTCAGTGGCCACGAAGTCGCCGG-3′，作为小干扰片段(正引物)，在水稻基因组数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中进行比对，未发现同源序列。将其3′端9个碱基(5′-AGTCGCCGG-3′)反向互补(5′-CCGGCGACT-3′)作为反引物3′端的9个碱基，其余51个碱基作为反引物5′端序列。在构建OsbHLH116-RNAi表达载体，所采用的OsbHLH116基因RNA干扰片段的引物序列为：
siRNA-F：5′-gtacGGTACC ATCGGAGGAA GAGATGGCAG CGTGGCTCTA TCCGATCGTCAGTGGCCACG AAGTCGCCGG-3′；
siRNA-R：5′-tcgaGAGCTC ATCGGAGGAA GAGATGGCAG CGTGGCTCTA TCCGATCGTCAGTGGCCACG ACCGGCGACT-3′；下划线示限制性内切酶KpnI和SacI酶切位点，小写字母表示保护碱基。
包含上述的RNAi片段的RNAi载体。
上述的RNAi载体的制备方法，包括如下步骤：
使用限制性内切酶KpnI和SacI分别酶切基础质粒和RNAi片段，将酶切产物分别纯化后进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌，经培养验证得到简易RNAi表达载体。所述基础质粒为pTCK303质粒。
本发明的简易RNAi载体构建是通过化学合成两条长寡核苷酸链并使末端包含一段短的重叠结构，使其形成短发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)以干扰目的基因的表达。与其他RNAi载体相比，本申请的RNAi载体构建具有操作简便、高效和低成本等特点，仅需化学合成两条寡核苷酸链。
上述的OsbHLH116基因、OsbHLH116蛋白在水稻育种中的应用。具体的，OsbHLH116基因过表达后能够促进水稻种子萌发。OsbHLH116蛋白过量表达后能够促进水稻种子萌发。
上述的RNAi片段、RNAi载体在水稻育种中的应用。具体的，上述的RNAi片段、RNAi载体在控制水稻穗发芽方面的应用。具体的，通过抑制OsbHLH116基因的表达，进而抑制水稻穗发芽。
本发明的有益效果为：
本发明依据简易RNAi技术原理对水稻中OsbHLH116基因的表达进行干扰。设计OsbHLH116基因小干扰片段，构建OsbHLH116-RNAi表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种新丰2号，以潮霉素(Hyg)抗性标记和GUS染色筛选获得阳性转基因植株，利用qRT-PCR分析鉴定转基因株系中OsbHLH116基因表达量极显著降低。获得了具有重要应用价值的水稻OsbHLH116-RNAi转基因株系，与野生型新丰2号相比，OsbHLH116-RNAi转基因株系种子萌发速率显著减慢。
本发明针对当前人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，探讨了OsbHLH116基因在水稻改良中的作用。在阴雨潮湿环境中，休眠性较浅的水稻种子较易出现穗发芽现象，而本试验发现低表达OsbHLH116基因可抑制水稻种子萌发，因此利用RNAi技术研究水稻OsbHLH116的生物学功能，同时在生产上加以利用，对有效控制水稻穗发芽的发生和危害具有重要意义和潜在应用价值，对水稻高产和稳产育种具有重要的实践意义。
附图说明
图1为OsbHLH116干扰片段设计和表达载体构建图；
图2为载体构建中琼脂糖凝胶电泳检测图；
图3为qRT-PCR检测转基因株系中OsbHLH116基因表达量图；
图4为野生型和转基因株系种子萌发率对比图；
图5为野生型和转基因株系种子萌发第5d表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例中所使用的引物如下表1所示。
表1 引物序列及用途
Figure BDA0001373028350000041
Figure BDA0001373028350000051
实施例1
OsbHLH116干扰片段设计与合成
根据简易RNAi技术原理(Higuchi et al.,2009；刘燕霞等,2014)，在OsbHLH116基因外显子区域靠近起始密码ATG一端选择一段60bp序列(5′-ATCGGAGGAAGAGATGGCAGCGTGGCTCTATCCGATCGTCAGTGGCCACGAAGTCGCCGG-3′，如SEQ ID NO.3所示)作为小干扰片段(正引物OsbHLH116-F)，在水稻基因组数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中进行比对，未发现同源序列。将其3′端9个碱基(5′-AGTCGCCGG-3′)反向互补(5′-CCGGCGACT-3′)作为反引物(OsbHLH116-R)3′端的9个碱基，其余51个碱基作为反引物5′端序列(如图1A所示)，合成OsbHLH116基因RNA干扰片段的引物序列：siRNA-F：5′-gtacGGTACCATCGGAGGAAGAGATGGCAG CGTGGCTCTA TCCGATCGTC AGTGGCCACG AAGTCGCCGG-3′(如SEQ IDNO.4所示)；siRNA-R：5′-tcgaGAGCTC ATCGGAGGAA GAGATGGCAG CGTGGCTCTA TCCGATCGTCAGTGGCCACG ACCGGCGACT-3′(如SEQ ID NO.5所示)；下划线示限制性内切酶KpnI和SacI酶切位点，小写字母示保护碱基。
根据表达载体pTCK303酶切位点，分别在正反引物5′端添加KpnI和SacI酶切位点及相应保护碱基。OsbHLH116小干扰片段合成：正反引物(终浓度10μM)各取7.5μL，加入15μL2×Taq MasterMix，94℃变性5min，室温放置30min以使两条引物相结合，72℃延伸15min最终形成互补双链DNA，用于后续载体构建。两条引物经退火延伸后得到131bp的互补双链DNA(如SEQ ID NO.12所示)，如图2A所示，其中M为DNA maker，1-4为互补双链DNA；经琼脂糖凝胶电泳检测4个PCR产物片段大小均为131bp，与预期目的片段大小一致，可用于后续OsbHLH116-RNAi表达载体构建。
实施例2
OsbHLH116-RNAi表达载体构建
使用限制性内切酶KpnI和SacI分别酶切pTCK303质粒和OsbHLH116小干扰片段，50μL酶切体系如下：pTCK303质粒2μg(OsbHLH116小干扰片段1μg)，10×L Buffer 5μL，KpnI10U，SacI 10U，加ddH2O至50μL，37℃酶切4h。将酶切产物分别纯化后加入如下连接体系：线性质粒4μL，小干扰片段4μL，10×Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，4℃连接过夜。连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含50mg/L卡那霉素平板，过夜培养后选取单克隆摇菌扩繁，使用引物pTCK303-VF(如SEQ ID NO.6所示)和pTCK303-VR(如SEQ IDNO.7所示)进行菌落PCR验证。pTCK303空载体扩增片段大小为893bp，连接干扰片段后扩增片段大小应为483bp，检测结果如图2B所示，其中M为DNA maker，1-6不同菌落PCR片段；2和5号菌落扩增片段大小与预期结果一致。表明OsbHLH116-RNAi表达载体构建成功，RNAi表达载体LB和RB之间线性结构如图1B所示，其中OsbHLH116干扰片段由玉米泛素基因(Ubi)启动子驱动，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子分别驱动潮霉素抗性基因(Hyg)和β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)，以便筛选转基因阳性植株。该简易RNAi表达载体中的OsbHLH116干扰片段转录出的RNA可互补配对形成dsRNA(如SEQ ID NO.13所示)，与序列5′-AGUCGCCGG-3′形成的茎环(loop)结构，共同组成shRNA(如图1C所示)。在OsbHLH116-RNAi转基因植株中，siRNA可使OsbHLH116基因mRNA发生降解，特异性干扰OsbHLH116基因的表达。
实施例3
RNAi载体在水稻育种中的应用。
农杆菌介导水稻愈伤遗传转化和阳性转基因植株检测
OsbHLH116-RNAi表达载体转化农杆菌EHA105，参照Nishimura等方法(Nishimuraet al.,2007)侵染水稻新丰2号成熟胚愈伤组织，潮霉素(Hyg)抗性筛选获得再生苗。利用GUS染色筛选阳性植株，以T2代转基因阳性植株(OsbHLH116-RNAi-1、OsbHLH116-RNAi-2、OsbHLH116-RNAi-3株系)进行后续试验。
试验例1
RNAi转基因株系OsbHLH116基因表达量检测
取OsbHLH116-RNAi转基因植株，以野生型新丰2号为对照，使用TRIzol试剂提取植株总RNA，反转录得到cDNA。以β-actin为参照基因，以稀释(1:10)的cDNA为模板，利用qRT-PCR，采用2-ΔΔCT法(Livak et al.,2001)计算OsbHLH116基因相对表达量，OsbHLH116荧光定量所使用的引物为OsbHLH116-F(SEQ ID NO.8)和OsbHLH116-R(SEQ ID NO.9)，β-actin荧光定量所使用的引物为β-actin-F(SEQ ID NO.10)和β-actin-R(SEQ ID NO.11)。
qRT-PCR反应体系：
20μl定量体系，其中模板cDNA按1:10稀释后加5μl，正反引物各加0.8μl，再加入4.2μl的ddH2O，荧光染料(SYBR Green qRT-PCR Master Mix；Toyobo)为10μl，使用CFX96Real Time System(BioRad,USA)进行定量检测。
qRT-PCR反应条件：如表2所示
表2 OsbHLH116基因qRT-PCR反应条件
Figure BDA0001373028350000071
qRT-PCR结果如图3所示，与野生型新丰2号相比，三组转基因株系中OsbHLH116基因表达量均极显著降低，其中，株系RNAi-1中OsbHLH116基因表达量降低最为显著，降幅达87.96％；表达量降低最少的株系RNAi-2的降幅也达53.32％。由此表明，利用简易RNAi技术构建的OsbHLH116-RNAi的表达载体在转基因株系中发挥了干扰OsbHLH116基因表达的作用，使其表达量显著降低，表明所设计RNA干扰片段对OsbHLH116基因成功并发挥干扰作用。
试验例2
OsbHLH116基因功能初步分析
取T2代OsbHLH116-RNAi转基因株系和野生型新丰2号抽穗后40d成熟种子，收获后即置于4℃冰箱保存，以保持种子休眠性，参照国家标准《农作物种子检验规程发芽试验》(GB/T 3543.4-1995)测定各株系种子发芽率。随机选取发育良好的种子40粒，均匀排列于垫有双层滤纸的培养皿内，加适量无菌水后置于30℃培养箱(相对湿度100％)内萌发，设三组重复。以胚芽长度不短于1/2种子长度且胚根长度不短于种子长度作为种子萌发标准。萌发结果如图4所示，在萌发第4d，与野生型新丰2号相比，三组OsbHLH116-RNAi转基因株系种子萌发率均显著低于野生型，其中RNAi-3株系萌发率比WT低75.64％，达极显著水平。随萌发时间增加，在萌发第5d，野生型新丰2号发芽率94.15％，几乎全部萌发，而三组OsbHLH116-RNAi转基因株系种子萌发率虽有所升高，但与WT相比仍极显著低于野生型种子萌发率(如图5所示，其中右下角的白色线条为标尺，为1cm)。
以上对本发明的具体实施例进行了描述，但本发明的实施方式不受上述特定实施例的限制。本领域技术人员在权利要求的范围内做所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 河南农业大学
<120> 控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因、RNAi载体及其制备方法、应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 996
<212> DNA
<213> 序列
<221> OsbHLH116基因外显子序列
<400> 1
atgtggcaag gaggaggagg aggaggagcc agcagcttcg accagccgcc gccgccggtt 60
tcctaccacc gcctgtcgcc gccgccgccg gcgatgggga cgacgacgac gacgttactg 120
ccggagcagc cactagttga tgatcatcat ctcccagctg ctgctgctgc tcctccatcg 180
gaggaagaga tggcagcgtg gctctatccg atcgtcagtg gccacgaagt cgccggcggc 240
gggtggcggt cgccggaggc tcaggatgac cggcgagccg caccggcgcc ggagaagaaa 300
cagatggaga aaatgccggc ggcggcatcg ccaacgacga cgatgaataa ggatgaaaca 360
agcgacgact ccggcgagag gaagaagaag aaggcgtcat cagcggcagg aaaaagcaag 420
caagcatcac cacgcggctg caggagctca caaccttaca gaaaaagtgg ggattcgatc 480
gatgaactct tcactaaatt tcataggcgg aggttcaaga taactgagag gttcaggacg 540
ctgcagcgtc tcgtccccgg atgcgataag tccaaccagg cgtcgacgct ggaccagaca 600
atccagtaca tgaagtcgct gcagcaccag ctcaaggcca tgtccgtcgt cggctcgccg 660
ccggcgctgc tgtaccccgc cgccgtgcac ccgcagtcgt acatgcatcc accgccaccg 720
ccgccgccgg tcacgatgcc gatgcatcca gggatggttc ttgctgctcc tcctccaggg 780
gcggcgccgc cgcccggccc tccggcgatg gtgccattcg gagctatgct cccttaccct 840
ccctacccgg cggtgctgct gccgccgccg gcggcggcga cactgtacgg acggccgccg 900
gcccccgctc ccggcgttgc agctcgtcga catggatcca gcggcggcgg cagaattagc 960
aagagcagta gcagcagcct gtgcaagaaa ttgtaa 996
<211> 331
<212> PRT
<213> 序列
<221> OsbHLH116基因氨基酸序列
<400> 2
Met Trp Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ser Phe Asp Gln
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Val Ser Tyr His Arg Leu Ser Pro Pro Pro Pro
16 20 25 30
Ala Met Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Leu Pro Glu Gln Pro Leu
31 35 40 45
Val Asp Asp His His Leu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ser
46 50 55 60
Glu Glu Glu Met Ala Ala Trp Leu Tyr Pro Ile Val Ser Gly His
61 65 70 75
Glu Val Ala Gly Gly Gly Trp Arg Ser Pro Glu Ala Gln Asp Asp
76 80 85 90
Arg Arg Ala Ala Pro Ala Pro Glu Lys Lys Gln Met Glu Lys Met
91 95 100 105
Pro Ala Ala Ala Ser Pro Thr Thr Thr Met Asn Lys Asp Glu Thr
106 110 115 120
Ser Asp Asp Ser Gly Glu Arg Lys Lys Lys Lys Ala Ser Ser Ala
121 125 130 135
Ala Gly Lys Ser Lys Gln Ala Ser Pro Arg Gly Cys Arg Ser Ser
136 140 145 150
Gln Pro Tyr Arg Lys Ser Gly Asp Ser Ile Asp Glu Leu Phe Thr
151 155 160 165
Lys Phe His Arg Arg Arg Phe Lys Ile Thr Glu Arg Phe Arg Thr
166 170 175 180
Leu Gln Arg Leu Val Pro Gly Cys Asp Lys Ser Asn Gln Ala Ser
181 185 190 195
Thr Leu Asp Gln Thr Ile Gln Tyr Met Lys Ser Leu Gln His Gln
196 200 205 210
Leu Lys Ala Met Ser Val Val Gly Ser Pro Pro Ala Leu Leu Tyr
211 215 220 225
Pro Ala Ala Val His Pro Gln Ser Tyr Met His Pro Pro Pro Pro
226 230 235 240
Pro Pro Pro Val Thr Met Pro Met His Pro Gly Met Val Leu Ala
241 245 250 255
Ala Pro Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gly Pro Pro Ala Met
256 260 265 270
Val Pro Phe Gly Ala Met Leu Pro Tyr Pro Pro Tyr Pro Ala Val
271 275 280 285
Leu Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ala Thr Leu Tyr Gly Arg Pro Pro
286 290 295 300
Ala Pro Ala Pro Gly Val Ala Ala Arg Arg His Gly Ser Ser Gly
301 305 310 315
Gly Gly Arg Ile Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Leu Cys Lys Lys
316 320 325 330
Leu
331
<211> 60
<212> DNA
<213> 序列
<221> OsbHLH116基因小干扰片段
<400> 3
atcggaggaa gagatggcag cgtggctcta tccgatcgtc agtggccacg aagtcgccgg 60
<211> 70
<212> DNA
<213> 引物
<221> siRNA-F
<400> 4
gtacggtacc atcggaggaa gagatggcag cgtggctcta tccgatcgtc agtggccacg 60
aagtcgccgg 70
<211> 70
<212> DNA
<213> 引物
<221> siRNA-R
<400> 5
tcgagagctc atcggaggaa gagatggcag cgtggctcta tccgatcgtc agtggccacg 60
accggcgact 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<221> pTCK303-VF
<400> 6
gccctgcctt catacgctat 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<221> pTCK303-VR
<400> 7
taacatagat gacaccgcgc 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物
<221> OsbHLH116-F
<400> 8
ctgctgctgc tgctcctc 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物
<221> OsbHLH116-R
<400> 9
cggcattttc tccatctgtt 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<221> β-actin-F
<400> 10
ggaagtacag tgtctggatt ggag 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<221> β-actin-R
<400> 11
tcttggctta gcattcttgg gt 22
<211> 131
<212> DNA
<213> 序列
<221> 互补双链DNA
<400> 12
gtacggtacc atcggaggaa gagatggcag cgtggctcta tccgatcgtc agtggccacg 60
aagtcgccgg tcgtggccac tgacgatcgg atagagccac gctgccatct cttcctccga 120
tgagctctcg a 131
<211> 111
<212> RNA
<213> 序列
<221> shRNA
<400> 13
aucggaggaa gagauggcag cguggcucua uccgaucguc aguggccacg aagucgccgg 60
ucguggccac ugacgaucgg auagagccac gcugccaucu cuuccuccga u 111

Claims (5)

1.OsbHLH116基因在促进水稻种子萌发方面的应用，其特征在于：所述OsbHLH116基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.OsbHLH116蛋白在促进水稻种子萌发方面的应用，其特征在于：所述OsbHLH116蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.RNAi片段在控制水稻种子萌发方面的应用，其特征在于：所述RNAi片段的制备包括如下步骤：将如SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示的两条引物经退火延伸后得到131 bp的互补双链DNA，即为用于载体构建的RNAi片段。
4.RNAi载体在控制水稻种子萌发方面的应用，其特征在于：所述RNAi载体中包含RNAi片段，所述RNAi片段的制备包括如下步骤：将如SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示的两条引物经退火延伸后得到131 bp的互补双链DNA，即为用于载体构建的RNAi片段。
5.根据权利要求4所述的RNAi载体在控制水稻种子萌发方面的应用，其特征在于：所述RNAi载体的制备包括如下步骤：使用限制性内切酶KpnI和SacI分别酶切基础质粒和RNAi片段，将酶切产物分别纯化后进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌，经培养验证得到RNAi表达载体。
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