CN112979777B

CN112979777B - 水稻OsWRKY74基因在调控种子萌发和穗发芽中的应用

Info

Publication number: CN112979777B
Application number: CN202110438585.5A
Authority: CN
Inventors: 陈兵先; 刘军; 彭远璇
Original assignee: Agro-Biological Gene Research Center Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Agro-Biological Gene Research Center Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN112979777A

Abstract

本发明公开了水稻OsWRKY74基因在调控种子萌发和穗发芽中的应用。本发明实验表明，过表达OsWRKY74基因可明显加快水稻种子萌发，而敲除OsWRKY74基因株系则表现为穗发芽抑制表型及种子发芽迟缓。本发明可为解决水稻种子直播过程中的萌发迟缓、种子发芽不整齐以及克服水稻成熟后期的穗上发芽问题提供基因资源，具有广阔的应用前景。

Description

水稻OsWRKY74基因在调控种子萌发和穗发芽中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsWRKY74基因在调控种子萌发和穗发芽中的应用。

背景技术

水稻是世界重要粮食作物之一，也是我国的第一大粮食作物，全国有近三分之二的人口以稻米为主食。水稻种子萌发的质量在很大程度上决定着植株的生产状况和产量。特别是在水稻种子直播过程中，种子在大田条件下能够迅速萌发并长成根系发达的健壮幼苗的能力与高产量有着直接的关系。因此，播种过程中种子具备的迅速、健壮、整齐的发芽能力有利于粮食生产。而另一方面，水稻种子休眠性状的过早丧失及萌发能力的提前获得也同样对于水稻生产是不利的。比如，我国华南地区因受夏秋季节长期阴雨气候影响，超过6％的水稻种植区出现穗发芽，杂交稻穗萌率最高可达20％，对于穗发芽的种子，基本丧失了种用价值，而对于尚未出现穗萌表型的，其籽粒内部已经开始营养物质的动员，在种子贮藏过程中更容易发生裂变，种子活力迅速下降，严重影响播种质量和加工品质。因此，在水稻穗发育后期，适当程度的休眠对于预防穗子早萌，保证制种和粮食生产的质量和产量是积极有力的。

发掘调控水稻种子萌发和穗上发芽的基因并致力于在生产上的应用一直以来都是分子生物学家和遗传育种学家们研究的热点。ABA生物合成基因OsABA1(NCED)突变后导致ABA合成受阻，成熟期的种子中ABA含量减少，出现种子提早萌发和穗发芽表型(Agrawalet al.,2001；Fang et al.,2008)。Fan et al.(2007)认为OsVP1(ABI3)基因的大部分转录本在外显子区域的错误剪切导致了水稻种子早萌和穗发芽表型。Sugimoto et al.(2010)克隆得到一个休眠基因Sdr4，该基因在转录水平受OsVP1调控，所编码的蛋白与已知功能蛋白的同源性低，推测可能为调控水稻萌发的特异性转录因子。近年来，我国科学家在水稻萌发和穗发芽研究方面取得了较好的成绩，Du et al.(2018)利用图位克隆技术获得淀粉脱脂酶基因PHS8，发现在突变体phs8种子胚乳内糖原分解和糖积累加快，并抑制ABA信号通路中两个重要转录因子OsABAI3和OsABI5的表达，种子出现早萌的表型。Liu et al.(2019)发现水稻钼辅因子基因OsCNX6参与调控ABA的合成，该基因在调控水稻籽粒发育、尤其是种子休眠、萌发和穗发芽控制方面中发挥重要作用。中科院储成才课题组发现穗发芽基因PHS9在水稻种子胚胎发育晚期特异性表达，该基因编码一类谷氧还蛋白，可与ABA受体RCAR结合，负调控ABA信号转导(Xu et al.,2019)。中国水稻研究所种子发育团队近期揭示了SAPK10-bZIP72-AOC通路介导脱落酸和茉莉酸协同抑制水稻种子萌发的分子机制，该研究为改良水稻种子萌发特性和提高穗发芽抗性提供了重要的理论依据(Wang et al.,2020)。华南农业大学王洲飞团队发现水稻种子萌发过程中，异丙基苹果酸脱氢酶合酶基因OsIPMS1与淀粉水解、糖酵解活性及能量代谢密切相关，该基因或可作为预测种子萌发能力的分子标记(He et al.,2019)。

WRKY蛋白是一类植物特有的序列特异性的DNA结合转录因子，其家族基因也是高等植物最大的基因家族之一，在调控植物生长发育、对抗生物和非生物胁迫等许多过程中发挥着重要的作用(Rushton et al.,2010；黎家和李传友,2019)。在调控种子萌发的过程中，WRKY蛋白既可作为阻遏物，又可作为激活物与靶基因的启动子结合。研究表明，在拟南芥中WRKY往往通过正调节或负调节ABA代谢与信号转导途径相关基因的表达起作用，比如AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY41、AtWRKY60、AtWRKY63被认为是ABA信号过程的正调控因子(伍静辉等,2018)。另一些WRKY转录因子如AtWRKY2、AtWRKY40、OsWRKY24则通过负调控ABA信号起作用。

尽管在拟南芥中有许多WRKY类转录因子参与调控种子休眠和萌发的报道，但该家族基因调控水稻萌发和穗发芽方面的研究却未见报道。水稻基因组中共包含109个WRKY家族成员，广泛参与水稻形态建成、光合作用、非生物胁迫等许多过程(钱前等,2019；Ross etal.,2007；Dai et al.,2016；Sahebi et al.,2018)。

OsWRKY74基因当前仅有一篇相关的文献报道，该基因在水稻的根和叶中存在高表达，其主要功能是参与水稻磷饥饿的调控(Dai et al.,2016)。然而，有关该基因在水稻种子萌发和穗发芽调控中的功能和应用则未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供水稻OsWRKY74基因在调控种子萌发和穗发芽中的应用。

本发明研究发现，水稻OsWRKY74基因与水稻种子萌发以及水稻穗发芽相关，OsWRKY74基因及其编码的蛋白可用于调控种子萌发、休眠的表型和穗上发芽表型。本发明涉及的OsWRKY74基因序列全长1086bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码361个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

因此，本发明提供OsWRKY74基因在如下(1)-(2)中的至少一种中的应用：

(1)调控种子休眠或萌发；

(2)调控穗发芽；

所述的OsWRKY74基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。

优选，所述的OsWRKY74基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选，所述的应用，为超表达OsWRKY74基因在促进种子萌发中的应用。

优选，所述的应用，为敲除OsWRKY74基因在抑制种子萌发或穗发芽中的应用。

优选，所述的应用为在水稻中的应用。

因此，可以将水稻OsWRKY74基因或蛋白应用在植物育种中，通过将OsWRKY74基因利用过表达载体导入到植物中进行过表达或利用敲除载体敲除OsWRKY74基因，控制OsWRKY74基因的表达量从而调控水稻种子萌发和穗发芽。所述的OsWRKY74基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA全基因组序列用已知的方法分离和/或修饰和/或设计得到的。所述的植物包括：水稻、小麦、玉米、高粱、谷子等其它禾谷类作物，也包括其他一些重要的经济作物，例如棉花、油菜或番茄等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的OsWRKY74基因及其编码蛋白可用于控制水稻种子萌发和穗发芽。过表达OsWRKY74基因的植株会出现穗发芽表型，所收获的种子也较对照组种子萌发快(图5)；而OsWRKY74基因敲除株系表现为穗发芽抑制表型，所收获的种子也较对照组种子萌发慢(图5)。因此，本发明对于解决水稻直播过程中的种子发芽困难以及成熟后期的穗上易于发芽等问题意义重大，具有广阔的应用前景。

(2)本发明的OsWRKY74基因与水稻种子发育有关，为我们研究控制种胚相关基因的表达调控提供了材料，也有助于植物种子发育机制的研究。

附图说明

图1为黄熟期水稻种子的胚中WRKY家族基因的转录表达水平。

图2为黄熟期水稻在穗发芽过程中OsWRKY74基因的转录表达水平。

图3为利用原位杂交实验分析水稻穗发芽期间OsWRKY74在种胚和糊粉层处的表达量。

图4为利用Western blot技术分析水稻在穗发芽过程的OsWRKY74蛋白表达水平。

图5为OsWRKY74过表达和敲除株系种子以及野生型种子在水中的萌发情况。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中涉及的OsWRKY74基因，其CDS序列全长1086bp，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；编码361个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例1 OsWRKY74基因过表达载体的构建及转基因水稻植株的获得

1、水稻的培养

水稻种子放在50mL的三角瓶中，先用75％酒精消毒90s，再用2.5％的次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗5次后，放在无菌滤纸上晾干，最后播种在灭菌的MS固体培养基(1.5％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.8)上，16h/8h(28℃)的昼夜交替，白炽灯光照培养。

2、水稻RNA提取：采用本领域常规的Trizol法提取水稻RNA。

3、逆转录反应(cDNA合成)

用Takara公司的反转录试剂盒进行逆转录反应，反应体系和反应条件参考试剂盒说明书。

4、目的基因的PCR扩增

根据OsWRKY74基因的CDS以及酶切信息，分别选取合适的酶切位点将目的片段克隆到Pcambia1390表达载体上，其中所用引物如下：

5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ggatccATGGAGAGCATGGAGGGCAATG-3’

3’端引物序列为：

5’-ggatccCATGCGAAGAAGCTGGTGATATC-3’

PCR反应体系：10×Buffer 2μL，10mM dNTP mix 2μL，MgSO₄0.8μL，PrimerN(10μmol/L)0.5μL，Primer C(10μmol/L)0.5μL，DNA模板1μL，KOD酶(2.5U/μl)0.5μL，ddH₂O补充至20μL；PCR反应程序：98℃变性2min；按98℃10s，56℃30s，68℃30s共28个循环；68℃终延伸6min。

5、构建基因的过表达载体

过量表达OsWRKY74用的是PHQSN1载体，该载体由植物表达载体pCAMBIA1390改造而来，含有一个细菌复制起始点(ori)、卡那霉素基因、潮霉素抗性基因(Hygr)、UBI和CaMV35S启动子，NOS基因的终止信号序列以及后两者之间的限制性内切酶克隆位点(MCS)。将目标基因的编码序列克隆到UBI启动子之后，能够在其强驱动下获得很高的表达。

6、EHA105介导的水稻转化

用农杆菌转化野生型中花11愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有抗性的愈伤组织，分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见Agrobacterium-mediated transformation ofrice usingimmature embryos or calli induce from mature seed，2008，Nature protocol.Doi:10.1038/nprot.2008.46)基础上进行。经筛选的阳性植株移至种植盆中，待成熟后收集种子即得T0代植株，经过HPT(潮霉素)筛选和定量RT-PCR分析，选择OsWRKY74转录表达量高的株系进行后续实验。实验表明，分别将收获的OsWRKY74纯合过表达株系种子、纯合敲除株系种子(实施例2)和野生型种子选50粒种子于培养皿中，加水10ml，于28℃光照培养箱中发芽，结果如图5所示，与野生型种子相比，OsWRKY74过表达株系(WRKY74 OE-1)的种子萌发速率快，而敲除株系wrky74-3(实施例2)的萌发速率慢(图5)。

实施例2 OsWRKY74基因敲除载体的构建及水稻基因敲除植株的获得

1、OsWRKY74纯合突变体植株的构建

本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对野生型水稻(日本晴)中OsWRKY74基因进行编辑来获得突变体植株。利用CRISPR-P v2.0网站(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi- bin/CRI SPR2/CRISPR)对目标基因OsWRKY74的外显子序列进行分析，挑选出两个特异性靶点序列，分别为AGGCAGCTGGAGGGACACCTGGG和GGCCAGGTGCTTGCAGAGGTCGG。通过重叠PCR分别获得了两个与sgRNA相连接的表达盒Pu6a-靶点1-sgRNA和Pu6b-靶点2-sgRNA。利用BsaI酶的切割位点和识别位点不重叠的特性把这两个表达盒连入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，产生含有OsWRKY74特异性靶点的pCRISPR-OsWRKY74载体，并转化至DH5α感受态细胞中。将阳性克隆提取质粒后，送至公司进行测序，选择结果正确的pCRISPR-OsWRKY74质粒通过农杆菌侵染水稻愈伤组织的方法来获得突变体植株。

2、OsWRKY74纯合突变体植株的鉴定

提取单株T0代转基因植株的基因组总DNA，并以此为模板，使用位于OsWRKY74靶点两端侧翼的引物对含有靶点1和2的序列进行PCR扩增，将目的条带单一且清晰的扩增产物进行回收，并送至公司进行测序。测序之后，利用DSDecodeM网站(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)对测序结果进行解码分析，选取了独立的突变位点不同的纯合突变系3-5个进行后续实验。实验表明，OsWRKY74敲除株系(wrky 74-3)的种子其萌发速率比野生型种子慢(图5)。

实施例3 OsWRKY74基因的功能鉴定

1、qPCR技术分析水稻穗发芽过程中OsWRKY74在mRNA水平的表达

RNA提取参照百泰克多糖多酚RNA植物提取试剂盒(含DNA酶)说明书进行；反转录cDNA第一链的合成计算所需的1000ng RNA模板体积，将其与试剂盒的溶液混合轻微震荡混匀，37℃短暂离心5min去除掉RNA基因组残留的DNA；上述反应后，进行第一链cDNA合成，在上述去基因组DNA反应液中加入试剂盒中的试剂短暂离心，42℃保持15min，85℃加热5min至Star ScriptⅡRT Mix失活，得到cDNA溶液。反应完成后，将所得到的cDNA稀释10倍；用Primer Premier 5设计特异扩增引物，WRKY74上下游引物分别为：F：ATTCTTGATCACTCTTCTTGGT，R：TAGCTCGATCTTGCAGGTT，以水稻种子中的内参基因GAPDH(引物为F：GCAATCAAGGAGGAGGCTGA，R:ACGTGTCGCTCAAAGCAATG)作为对照。检测黄熟期的水稻在高温高湿环境下，在穗发芽3天时WRKY家族基因的转录表达量，图1结果表明，OsWRKY74较其他同源基因的转录表达量高。检测黄熟期的水稻在高温高湿环境下，在穗发芽过程中OsWRKY74基因的转录表达水平，图2结果表明，OsWRKY74的转录表达量随着穗发芽的过程逐渐升高，至穗发芽第10天时才所有降低。

2、原位杂交技术检测水稻穗发芽过程中OsWRKY74在mRNA水平的表达

采用原位杂交技术进一步验证OsWRKY74在发育过程中的水稻种子中的表达模式，以确定该基因在不同发育时期的表达情况。分别取高温高湿下穗发芽3天、5天和7天种子材料，沿种胚处均匀纵切，将种子纵切面进行mRNA原位杂交分析。原位杂交OsWRKY74反义链探针序列为5‘-DIG-GCTTCGCGGTACAAGAATGGCAAGAACGA-DIG-3’，同时以OsWRKY74正义探针作为阴性对照(5‘-DIG-TCGTTCTTGCCATTCTTGTACCGCGAAGC-DIG-3’)。结果表明：在转录水平，OsWRKY74主要在种胚和糊粉层处表达，且随着穗发芽的进行，OsWRKY74表达量逐渐升高(图3)。

3、Western blot技术检测水稻穗发芽过程中OsWRKY74在蛋白水平的表达

为进一步明确OsWRKY74在水稻穗发芽过程中的功能，进一步采用Western blot技术检测该基因在蛋白水平的表达。实验过程参考陈兵先(2014)博士毕业论文进行，主要包括多克隆抗体制备，种胚总蛋白的提取，蛋白质的SDS-PAGE电泳，PAGE胶染色和洗脱，蛋白质点转移，蛋白条带的灰度值分析等。实验结果表明，穗发芽环境下，穗发芽5天的OsWRKY74蛋白表达量显著高于穗发芽3天的该蛋白表达量(图4)。

序列表

<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心

<120> 水稻OsWRKY74基因在调控种子萌发和穗发芽中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1086

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atggagagca tggagggcaa tggaggaggg cggctggtgg tgacggagct gagccacatc 60

aaggagctcg tgaggcagct ggagggacac ctgggtggct ccggctcccc cgacctctgc 120

aagcacctgg cctcgcagat cttctccgtc accgagcgct ccatcggcat gatcaggtcc 180

ggccacttcg acggccaccg caagcgctcc gccgccgctg tcgccgccgg tgacctcgac 240

tcggcgactc ccagccccct cagcgacgtc tccgacttgc ctttcaaggc caccaagaag 300

aggaagacgt cgacggagaa gaagaggcat cagattaggg tgagctcgac gggaggggtg 360

gagaatccac cggtagatga tggccatagc tggagaaagt atgggcagaa agagattctt 420

ggagccaagc acccaagggg ttactaccgt tgcacccacc gccactcgca gggatgcatg 480

gcgacgaagc aggtgcagcg caccgacgag gacgcgacgg tgttcgacgt gatctaccac 540

ggcgagcaca cgtgcgtcca caaggcggtg gccgccggcg ccggcaagcc ggagacggag 600

acggacacga acgccgccgc cgagagccgc ctccacgacc tgagctccgg cctgacggtg 660

aagatcgagg ggctgacggc gccgccgcag caacagcagg gcggcggcgg ctggaacgcc 720

atgccgccgt tctgcctgtc gtcgccggtg agcggcctgg cgccgccgga tcagcacaac 780

ccgttctccg cgccgtcgac gccggagaac cgcctcgccg ccgccgcgtc gtcggcggcc 840

tcgccggcga cctccgactc gatggccgcc gcgccgttcc accaggcggc ggccggcggc 900

ggcgatgagg cgtggcggga cgccgagctc caggaggtgg tgtccgcgct cgtcgccgcg 960

acgacgacga cggcgaccgc gcagccggcg cccgccaccg ccatggtcga cgccgacctc 1020

tccgccctcg acgccttcga gttcgacccc ggattcacca ttgatatcac cagcttcttc 1080

gcatga 1086

<210> 2

<211> 361

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Glu Ser Met Glu Gly Asn Gly Gly Gly Arg Leu Val Val Thr Glu

1 5 10 15

Leu Ser His Ile Lys Glu Leu Val Arg Gln Leu Glu Gly His Leu Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Ser Pro Asp Leu Cys Lys His Leu Ala Ser Gln Ile Phe

35 40 45

Ser Val Thr Glu Arg Ser Ile Gly Met Ile Arg Ser Gly His Phe Asp

50 55 60

Gly His Arg Lys Arg Ser Ala Ala Ala Val Ala Ala Gly Asp Leu Asp

65 70 75 80

Ser Ala Thr Pro Ser Pro Leu Ser Asp Val Ser Asp Leu Pro Phe Lys

85 90 95

Ala Thr Lys Lys Arg Lys Thr Ser Thr Glu Lys Lys Arg His Gln Ile

100 105 110

Arg Val Ser Ser Thr Gly Gly Val Glu Asn Pro Pro Val Asp Asp Gly

115 120 125

His Ser Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Glu Ile Leu Gly Ala Lys His

130 135 140

Pro Arg Gly Tyr Tyr Arg Cys Thr His Arg His Ser Gln Gly Cys Met

145 150 155 160

Ala Thr Lys Gln Val Gln Arg Thr Asp Glu Asp Ala Thr Val Phe Asp

165 170 175

Val Ile Tyr His Gly Glu His Thr Cys Val His Lys Ala Val Ala Ala

180 185 190

Gly Ala Gly Lys Pro Glu Thr Glu Thr Asp Thr Asn Ala Ala Ala Glu

195 200 205

Ser Arg Leu His Asp Leu Ser Ser Gly Leu Thr Val Lys Ile Glu Gly

210 215 220

Leu Thr Ala Pro Pro Gln Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Trp Asn Ala

225 230 235 240

Met Pro Pro Phe Cys Leu Ser Ser Pro Val Ser Gly Leu Ala Pro Pro

245 250 255

Asp Gln His Asn Pro Phe Ser Ala Pro Ser Thr Pro Glu Asn Arg Leu

260 265 270

Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala Thr Ser Asp Ser Met

275 280 285

Ala Ala Ala Pro Phe His Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Asp Glu Ala

290 295 300

Trp Arg Asp Ala Glu Leu Gln Glu Val Val Ser Ala Leu Val Ala Ala

305 310 315 320

Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Gln Pro Ala Pro Ala Thr Ala Met Val

325 330 335

Asp Ala Asp Leu Ser Ala Leu Asp Ala Phe Glu Phe Asp Pro Gly Phe

340 345 350

Thr Ile Asp Ile Thr Ser Phe Phe Ala

355 360

Claims

1.超表达OsWRKY74基因在促进水稻种子萌发中的应用，所述的OsWRKY74基因为编码SEQID NO.2所示蛋白的基因。

2.敲除OsWRKY74基因在抑制水稻种子萌发或水稻穗发芽中的应用，所述的OsWRKY74基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的OsWRKY74基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。