CN101050234A - 一种植物wrky转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物WRKY转录因子及其编码基因与应用。该植物WRKY转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物WRKY转录因子功能的蛋白质。本发明的植物WRKY转录因子转录受多种非生物胁迫和激素诱导。UV－B、茉莉酸甲酯、机械伤害、高盐、冷(4℃)、热(37℃)和乙烯利、脱落酸能诱导其表达；本发明的植物WRKY转录因子的超表达转基因株系的T2代植株对UV－B抗性增强，而干涉转基因植株却使UV－B抗性减弱，表明该基因介导了植物对紫外的防卫反应。

Description

一种植物WRKY转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种WRKY转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是单子叶植物研究的模式植物。与其它禾本科植物，如小麦、玉米、高梁、甘蔗基因组间存在共线性(colineariy)。水稻是基因组最小、进化程度最低的禾本科植物。因此，水稻基因组结构与功能的研究对其它禾本科植物的相关研究具有很大的借鉴意义。随着水稻基因组全序列测定的完成，发现新基因和鉴定基因的功能是功能基因组研究的迫切任务。水稻又是重要的经济作物，是世界半数以上人口的主要食物来源。从水稻基因组中挖掘有用的基因，用于提高产量、改善品种、提高抗逆性，是目前植物功能基因组学和农业高技术领域的研究热点。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，对所控制的基因起转录激活或抑制作用。从蛋白质结构分析，转录因子一般由DNA结合区(DNA-binding domain，BD)、转录调控区(transcription regulation domain)(包括激活区或抑制区)、寡聚化位点(oligomerization site)以及核定位信号(nuclear localization signal，NLS)这4个功能区域组成。转录因子通过这些功能区域与基因的启动子顺式元件结合、或者与其它转录因子或蛋白互作以调控基因的表达。但并不是每个转录因子都含有这些区域，少数不含DNA结合结构域或者转录调控区的转录因子可以与含上述功能域的转录因子相互作用，从而实现其转录调控的功能。转录因子处于信号途径的中游，起承上启下的作用，上可接受被感知、加工放大的信号，下则通过与其它转录因子或辅助蛋白的相互作用结合特定基因的启动子元件，调控基因的表达；同时，可作为共同的信号转导组分位于几条信号的交汇点，参与信号途径的整合与对话。因此，要从分子水平了解植物生长发育和适应外界环境的生理柔性的机制，必须详细研究各类转录因子在生物体内的功能。

SPF1是从甜马铃薯中分离的一个具有C2H2锌指纹的调节蛋白(Ishiguro S，Nakamura K.(1994).Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-bindingprotein，SPF1，that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions ofgenes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato.Mol Gen Genet，244：563-571)，随后，在几种植物中发现了相似的蛋白，如野燕麦的ABF1和ABF2(Rushton PJ，Macdonald H，Huttly AK，Lazarus CM，Hooley R.(1995).Membersof a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element inthe promoters of alpha-Amy2 genes.Plant Mol Biol，29：691-702)、拟南芥的ZAP1(Chern M-S，Eiben HG，BustosMM.(1996).The developmentally regulatedbZIP factor ROM1 modulates transcription from lectin and storage proteingenes in bean embryos.Plant J，10：135-148)和欧芹的PcWRKY1，2，3(RushtonPJ，Torres JT，Parniske M，Wernert P，Hahlbrock K，Somssich IE.(1996).Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor responseelements in the promoters of parsley PR1 genes.EMBO J，15：5690-5700)。这些蛋白的共同结构特征是，都含一个高度保守的DNA结合域，其中的WRKYGQK是非常保守的序列，称WRKY结构域。含有该结构域的蛋白因而被统称为WRKY蛋白(Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，Somssich IE.(2000).The WRKYsuperfamily of plant transcription factors.Trends Plant Sci，5：199-206)。据初步统计，到目前为止，大约有20余种植物发现有WRKY蛋白(Wu KL，Guo ZJ，Wang HH，Li J.(2005).The WRKY Family of Transcription Factors in Rice andArabidopsis and Their Origins.DNA Res，12：9-26)。WRKY蛋白在高等植物中构成一个基因超家族(superfamily)。拟南芥中有74个成员(Kalde M，Barth M，Somssich IE，Lippok B.(2003).Members of the Arabidopsis WRKY group IIItranscription factors are part of different plant defense signaling pathways.Mol Plant Microbe Interact，16：295-305)。水稻中有100余个成员(Zhang YJ，Wang LJ.(2005).The WRKY transcription factor superfamily：its origin ineukaryotes and expansion in plants.BMC Evol Biol，5：1)。近年来，许多实验表明，WRKY蛋白参与植物对生物和非生物胁迫反应和一些生理发育过程而倍受关注。

WRKY基因的表达受生物或非生物胁迫诱导。真菌、细菌、病毒侵染、激发子、植物防卫反应的信号分子如水杨酸(SA)及其类似物、H₂O₂处理导致一些WRKY基因的表达上升(Eulgem T，Rushton PJ，Schmelzer E，Hahlbrock K，Somssich IE.(1999).Early nuclear events in plant defence signaling：rapid geneactivation by WRKY transcription factors.EMBO J，18：4689-4699；Guo ZJ，Chen XJ，Wu XL，Ling JQ，Xu P.(2004a).Overexpression of the AP2/EREBPtranscription factor OPBP1 enhances disease resistance and salt tolerancein tobacco.Plant Mol Biol，55：607-618)。拟南芥中，大部分WRKY成员的表达被SA和/或病原诱导(Kalde M，Barth M，Somssich IE，Lippok B.(2003).Members of the Arabidopsis WRKY group III transcription factors are partof different plant defense signaling pathways.Mol Plant Microbe Interact，16：295-305；Dong J，Chen C，Chen Z.(2003).Expression profiles of theArabidopsisWRKY gene superfamily during plant defense response.Plant MolBiol，51：21-37)。马铃薯WRKY基因与马铃薯抗病性数量性状的形成有关，并受晚疫病菌诱导表达(Dellagi A，Helibronn J，Avrova AO，Montesano M，Palva ET，Stewart HE，Toth IK，Cooke DE，Lyon GD，Birch PR.(2000).A potato geneencoding a WRKY-like transcription factor is induced in interactions withErwinia carotovora subsp.atroseptica and Phytophthora infestans and iscoregulated with class I endochitinase expression.Mol Plant MicrobeInteract，13：1092-1101；Trognitz F，Manosalva P，Gysin R，Ninio-Liu D，SimonR，del Herrera MR，Trognitz B，Ghislain M，Nelson R.(2002).Plant defensegenes associated with quantitative resistance to potato late blight inSolanum phureja×dihaploid S.tuberosum hybrids.Mol Plant MicrobeInteract，15：587-597)。非生物胁迫诱导的范围很广，包括伤害(Hara K，YagiM，Kusano T，Sano H.(2000).Rapid systemic accumulation of transcriptsencoding a tobacco WRKY transcription factor upon wounding.Mol Gen Genet，263：30-37；Cheong YH，Chang HS，Gupta R，Wang X，Zhu T，Luan S.(2002).Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding，pathogen，abiotic stress，hormone responses in Arabidopsis.Plant Physiol，129：661-677)、冷(冻)适应(Huang T，Duman JG.(2002).Cloning andcharacterization of a thermal hysteresis(antifreeze)protein withDNA-binding activity from winter bittersweet nightshade，Solanum dulcamara.Plant Mol Biol，48：339-350；Sanchez-Ballesta MT，Lluch Y，Gosalbes MJ，Zacarias L，Granell A，Lafuente MT.(2003).A survey of genes differentiallyexpressed during long-term heat-induced chilling tolerance in citrus fruit.Planta，218：65-70)、干旱、高盐、热、氧化胁迫(Mare C，Mazzucotelli E，CrosattiC，Francia E，Stanca AM，Cattivelli L.(2004).Hv-WRKY 38：a newtranscription factor involved in cold-and drought-response in barley.PlantMol Biol，255：399-416；Seki M，Narusaka M，Ishida J，Nan jo T，Fujita M，Oono Y，Kamiya A，Nakajima M，Enju A，Sakurai T，et al.(2002).Monitoringthe expression profiles of 7,000 Arabidopsis genes under drought，cold andhigh-salinity stresses using a full-length cDNA microarray.Plant J，31：279-292)等。植物衰老过程中，一些WRKY基因的表达明显上调(Hinderhofer K，Zentgraf U.(2001).Identification of a transcription factor specificallyexpressed at the onset of leaf senescence.Planta，213：469-473；RobatzekS，Somssich IE.(2002).Targets of AtWRKY6 regulation during plantsenescence and pathogen defense.Gene Dev，16：1139-1149)。一些WRKY基因对多种环境条件有反应。如，病原、伤害都能诱导AtWRKY6、Tizz和OsiWRKY的表达(Robatzek S，Somssich IE.(2001).A new member of the Arabidopsis WRKYtranscription factor family，AtWRKY6，is associated with both senescence-and defence-related processes.Plant J，28：123-133；Yoda H，Ogawa M，Yamaguchi Y，Koizumi N，Kusano T，Sano H.(2002).Identification ofearly-responsive genes associated with the hypersensitive response totobacco mosaic virus and characterization of a WRKY-type transcriptionfactor in tobacco plants.Mol Genet Genom，267：154-161)，其中AtWRKY6还受衰老调节；大麦Hv-WRKY38受干旱、冷诱导。这些发现提示，WRKY参与了植物对胁迫的反应和发育等生理过程，并且可能作为这些信号途径的共同组分参与相互对话(cross talk)。最近，cDNA微阵列实验证明WRKY参与植物蓝光应答(Jiao Y，YangH，Ma L，Sun N，Yu H，Liu T，Gao Y，Gu H，Chen Z，Wada M，Gerstein M，ZhaoH，Qu LJ，Deng XW.(2003).A genome-wide analysis of blue-light regulationof Arabidopsis transcription factor gene expression during seedlingdevelopment.Plant Physiol，133：1480-1493)。植物中，防卫反应相关基因的启动子含有W盒元件。病原侵染或模拟病原接种处理下，WRKY基因被诱导表达。

从以上研究报道可以看出，WRKY家族基因参与许多生物或非生物胁迫反应过程。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物WRKY转录因子及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物WRKY转录因子，名称为OsWRKY89，其来源于水稻，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物WRKY转录因子功能的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中的序列2由263个氨基酸残基组成。自序列2的氨基端第106至168位氨基酸残基序列为WRKY结构域。在该结构域有一个典型的C2H2锌指结构域(自序列2的氨基端第130至168位氨基酸残基序列)，属于第IIIb亚组。在自序列2的氨基端第55至65位氨基酸残基和自序列2的氨基端第87至92位氨基酸残基区域有两个核定位信号区。

上述植物WRKY转录因子基因(OsWRKY89)也属于本发明的保护范围。

上述植物WRKY转录因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由792个脱氧核苷酸组成，自5′端第1位至792位脱氧核苷酸为编码序列。

所述植物WRKY转录因子的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：3的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中序列3，由990个脱氧核苷酸组成，含有两个内含子(自序列3的5′端第267位至359位脱氧核苷酸，自序列3的5′端第469至573位脱氧核苷酸)和三个外显子(自序列3的5′端第1位至266位脱氧核苷酸，自序列3的5′端第360至468位脱氧核苷酸，自序列3的5′端第574至990位脱氧核苷酸)。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

本发明的植物WRKY转录因子含1个WRKY结构域，在该结构域有一个典型的C2H2锌指结构域，属WRKY第IIIb成员。它与水稻或其它物种的WRKY蛋白的同源性低，说明它是新的WRKY成员。该植物WRKY转录因子能与W盒元件特异的结合，N端的亮氨酸拉链样结构参与蛋白质同源互作和DNA与蛋白质互作。该植物WRKY转录因子是核蛋白。本发明的植物WRKY转录因子具有转录激活活性，C端的酸性区(自氨基端第197位至263位氨基酸残基)是负责转录激活的区域；亮氨酸拉链样结构增强该蛋白的转录激活能力。实验证明，本发明的植物WRKY转录因子转录受多种非生物胁迫和激素诱导。UV-B、茉莉酸甲酯能快速、强烈地诱导其表达；机械伤害、高盐、冷(4℃)、热(37℃)和乙烯利、脱落酸也能诱导其表达；而UV-A、水杨酸、赤霉素处理下，其表达无明显变化。本发明的植物WRKY转录因子的超表达转基因株系的T2代植株矮化，不定根少，超表达T2代植株对UV-B抗性增强，而干涉转基因植株却使UV-B抗性减弱，表明该基因介导了植物对紫外的防卫反应。

附图说明

图1为OsWRKY89及缺失突变体的原核表达。

图2为OsWRKY89与W盒特异结合。

图3为OsWRKY89的同源二聚化。

图4为OsWRKY89的亚细胞定位。

图5为OsWRKY89的转录激活活性分析和转录激活域的确定。

图6为OsWRKY89在激素处理和胁迫下的表达。

图7为OsWRKY89超表达载体(A)和OsWRKY89 RNAi载体(B)示意图。

图8为OsWRKY89超表达苗的表型观察。

图9为OsWRKY89超表达和干涉植株对UV-B的抗性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过实施例予以进一步的说明，但并非对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实验过程中涉及到的限制性内切酶和T₄DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。

实施例1、OsWRKY89 cDNA的分离

1、OsWRKY89 cDNA的分离

用WRKY结构域对水稻基因组数据进行BLAST搜索，通过基因注释(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和与公布的EST或cDNA比较，发现了100个完整的WRKY基因。在此基础上，从水稻中花17(购于中国农业科学院杭州水稻研究所)中分离了1个WRKY基因的cDNA，命名为OsWRKY89。对这个基因的生化功能、表达模式及在体内的功能进行分析。

根据BAC克隆号OSJNBb0004B05的序列设计用于扩增OsWRKY89基因的引物w89F和w89R等(各引物序列如表1所示)。以w89F和w89R为引物，用LaTaq DNA聚合酶通过RT-PCR从水稻中扩增出OsWRKY89 cDNA。水稻用UV-B照射15分钟，暗修复6小时后取样，提取RNA，反转录，进行PCR扩增。扩增在DNA thermal cyclerPTC-220(MJ Research，USA)中进行。扩增条件为：94℃预变性3分；再94℃30秒，58℃30秒，72℃50秒，30个循环，最后在72℃下延伸10分。扩增得到792bp的cDNA片段。PCR产物纯化后，连接到pUCmT载体上，测序验证，测序表明获得的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，将其命名为OsWRKY89。自序列1的第1-792位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。将OsWRKY89与pUCmT的正确连接产物命名为pUCmT-OsWRKY89。

                            表1  扩增OsWRKY89 cDNA的引物

引物名称	引物序列(带下划线的碱基为酶识别位点)	核酸位置(以序列表中序列1中第一位为+1)
			w89FN1FN2FN3Fw89Rxhow89Rw89SmaIw89EIw89ΔCRΔCN1FΔCN2F	5’-TT GGATCCTAGTGACTGTCAAGTAGTGATC-3’( BamH I)5’-TT GGATCCGAGCGACAATGAACAAGCCA-3’( BamH I)5’-TT GGATCCACTTGGTGGAGACACTAAAAAG-3’( BamH I)5’-TT GGATCCCAATAGTAAAGTGCAAGGCTGTC-3’( BamH I)5’-TCA CTCGAGTCCCCATATGCATATTGGACTG-3’( Xho I)5’-AGCTTATAGCTAACATAAGTC-3’5’-TT CCCGGGCATGATAGAGCACCAAAAGGCT-3’( Sma I)5’-TT GAATTCATGATAGAGCACCAAAAGGCT-3’( EcoR I)5’-TCA CTCGAGGGCTATTGCATTCGTTTTGATTGA-3’( Xho I)5’-TT CCCGGGCATGGCCATGCCATTACTT-3’( Sma I)5’-TT CCCGGGCATGGGAGGTAAGAGAAAAG-3’( Sma I)	-25-363-82147-168393-415768-789793-814-1-211-21566-58942-60184-199

89SmaFΔC1RΔC3RYN1FYN2FYN3F

5’-TT CCCGGGCATGATAGAGCACCAAAAGGCT-3’( Sma I)5’-TCA CTCGAGGGCTATTGCATTCGTTTTGATTGA-3’( Xho I)5’-TCA CTCGAGCTGTGTGTTCTGCATTCTTTCT-3’( Xho I)5’-TT CCCGGGCATGGCCATGCCATTACTTC-3’( Sma I)5’-TT CCCGGGTGGAGGTAAGAGAAAAGGTGAC-3’( Sma I)5’-TTC CCGGGTACACTTGAACACGAAGCCCA-3’( Sma I)

-1-21566-589265-28642-61183-204591-611

数据库的搜索用NCBI上的BLAST工具。蛋白质序列的比对采用ClustalW和BOXSHADE程序(http://bioweb.pasteur.fr/)(Thompson等，1994)。蛋白质螺旋-螺旋结构采用COILS程序(http://www.isrec.isb-sib.ch)。蛋白质的疏水性轮廓分析和二级结构预测采用DNAMAN软件(http://lynnon.com/download/index/html/)。一级结构分析表明，OsWRKY89与水稻或其它物种的WRKY蛋白的同源性不高，说明它是一个新的WRKY成员。自序列2的氨基端第106至168位氨基酸残基序列为WRKY结构域。在该结构域有一个典型的C2H2锌指结构域(自序列2的氨基端第130至168位氨基酸残基序列)，属于第IIIb亚组。在自序列2的氨基端第55至65位氨基酸残基和自序列2的氨基端第87至92位氨基酸残基区域有两个核定位信号区。水稻基因组序列分析结果表明OsWRKY89的基因组序列如序列表中序列3所示，由990个脱氧核苷酸组成，含有两个内含子(自序列3的5′端第267位至359位脱氧核苷酸，自序列3的5′端第469至573位脱氧核苷酸，)和三个外显子(自序列3的5′端第1位至266位脱氧核苷酸，自序列3的5′端第360至468位脱氧核苷酸，自序列3的5′端第574至990位脱氧核苷酸)。通过COILS程序预测发现，在OsWRKY89中，该区域形成一个螺旋-螺旋结构，其中的L-X₆-A-X₆-L-X₆-S-X₆-L可能形成亮氨酸拉链样(leucine zipper-like)结构(自序列2的氨基端第20位至48位氨基酸残基)。DNAMAN软件分析也表明，该结构位于α-螺旋(α-helix)中。OsWRKY89的N端和C端的少部分区域的疏水性较强，其它区域的亲水性较强。

实施例2、OsWRKY89的原核表达

为了在E.coli中表达OsWRKY89，首先，以pUCmT-OsWRKY89为模板，用引物w89F(在起始密码子前引入BamH I位点)和w89Rxho(终止密码子后引入Xho I位点)扩增其完整的编码序列。PCR产物用BamH I和Xho I(Novagen，USA)双酶切，然后插入到pET-29b(+)(购于TAKARA公司)表达载体BamH I和Xho I间，构建成含有OsWRKY89的重组载体，将测序验证阅读框一致和序列正确的载体命名为pET-OsWRKY89。

将上述构建的表达载体pET-OsWRKY89或pET-29b(+)空质粒分别转化E.coliBl21(DE3)菌株，分别将经鉴定表明转入pET-OsWRKY89的E.coli Bl21(DE3)工程菌株命名为BlpET-OsWRKY89；将经鉴定表明转入pET-29b(+)的E.coli Bl21(DE3)工程菌株命名为BlpET-29b。

分别将BlpET-OsWRKY89或BlpET-29b接种到5mL含100mg L^-1卡那霉素(Kan)的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养12小时。取1mL菌液接种到100mL新鲜LB培养基(含100mg L^-1Kan)中进一步培养，待培养物的OD₆₀₀达到0.5至0.7，加入0.4mmol L^-1或0mmol L^-1 IPTG诱导蛋白表达。分别经37℃4h培养或25℃培养12-16小时，然后按照如下步骤进行蛋白的提取和纯化：

BlpET-OsWRKY89或BlpET-29b表达的蛋白的提取和纯化步骤为：4℃离心收集菌体，用STE(100mmol L^-1 NaCl，10mmol L^-1 Tris·HCl，1mmol L^-1 EDTA，pH 8.0)洗涤一次然后悬浮于100mmol L^-1磷酸缓冲液(PBS)(含1mmol L^-1 DTT，1mmol L^-1PMSF，1％Triton X-100)中。细胞反复冻融3次，再用超声波破碎(3×45s，150W，1min间隔)。裂解液在12,000g，4℃下离心15分钟，得到上清和沉淀。用Ni-NTA柱对蛋白进行纯化。纯化方法按供应商(Qiagen，Germany)说明书。往上清液加入1mL Ni-NTA树脂，混匀后上柱。纯化的蛋白经冷冻干燥，加入10％甘油，1mmol L^-1PMSF和1mmol L^-1 DTT，收集包含目标蛋白的组分以用于蛋白复性。纯化蛋白依次在含有6、4、3、2、1mol L^-1脲的PBS(pH 7.4)中4℃透析，每次4h，最后用50mmolL^-1的PBS平衡过夜。离心去除沉淀后冷冻浓缩，-80℃保存备用。将上述得到的上清和沉淀和纯化的蛋白进行SDS-PAGE，以检测蛋白的表达和表达在上清和沉淀中的分布。结果如图1所示，结果表明，WRKY89蛋白在沉淀中表达比较多，在37℃和25℃下都可以诱导WRKY89蛋白表达。图1中A为OsWRKY89在37℃的诱导表达，其中泳道1为未经IPTG诱导BlpET-OsWRKY89表达的蛋白，泳道2为BlpET-29b经IPTG诱导表达的蛋白，泳道3为BlpET-OsWRKY89在37℃经IPTG诱导的表达的蛋白，泳道M为蛋白分子量标准；图1中B为表达的OsWRKY89在上清和沉淀中的分布情况，其中泳道M为标准蛋白，泳道1为未经IPTG诱导的BlpET-OsWRKY89表达的蛋白，泳道2为37℃经IPTG诱导BlpET-OsWRKY89的表达的总蛋白电泳，泳道3为37℃下经IPTG诱导的BlpET-OsWRKY89的表达，取培养液上清液电泳，泳道4为25℃诱导，37℃下经IPTG诱导BlpET-OsWRKY89表达的总蛋白电泳，泳道5为25℃下经IPTG诱导BlpET-OsWRKY89表达，取培养液上清液电泳；图1中C为BlpET-OsWRKY89表达的OsWRKY89蛋白的纯化，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道2为溶菌液，泳道3为洗脱液B，泳道4为洗脱液C，泳道5为洗脱液D，泳道6为洗脱液E；WRKY89蛋白在洗脱液E中洗下来。图1中A、B、C中箭头表示的为OsWRKY89蛋白。

实施例3、OsWRKY89与W盒元件的结合

转录因子与特定的顺式元件结合是转录因子的典型特征。WRKY类转录因子可与含有TGAC核心序列的W盒特异性结合。利用这个特征鉴定OsWRKY89是否可以和W盒结合，从而确定OsWRKY89是否为WRKY家族转录因子。

合成含有4个W盒的序列(TGAC和它的互补序列GTCA)的探针P22：5′GATCTG TGACTGGTC TGACGCCA GTCAC GTCATG 3′( W盒)作为探针，将P22中W盒TGAC中的GA突变为CT，其互补序列GTCA中的TC突变为AG，即突变探针mP22：5′GATCTGTCTCTGGTCTCTCGCCAGAGACGAGATG 3′。标记的P22探针与OsWRKY89结合后，在电泳中移动的速度减慢，会呈现一条滞后的条带；突变的探针mP22不能与OsWRKY89蛋白结合。具体实验方法如下：

先将BlpET-OsWRKY89表达的蛋白进行蛋白竞争实验，蛋白竞争实验的反应体系为总共20μl，包括800ng纯化的BlpET-OsWRKY89表达的蛋白(或者不添加蛋白)、0.2pmol[α-³²P]末端标记的寡核苷酸探针(P22或mP22)、DNA结合缓冲液(甘油5％，EDTA 1mmol L^-1，DTT 1mmol L^-1，NaCl 50mmol L^-1，poly(dI-dC)50ng mL^-1，Tris·HCl 10mmol L^-1，pH 7.5)，其中，添加标记P22的体系配制五份，其中一份不添加蛋白，添加标记mP22探针的体系配制一份，配制时，先加入探针，然后加入蛋白。在添加标记P22而未添加蛋白的体系中不加未标记的探针，其余四份添加标记P22的体系分别进行如下处理：(1)不添加未标记探针；(2)添加是标记探针十倍摩尔比的未标记P22；(3)添加是标记探针200倍摩尔比的未标记P22；(4)添加是标记探针200倍摩尔比的未标记mP22。在添加标记mP22探针的体系中不添加任何未标记的探针。上述体系混匀后，先在25℃下保温1分钟，然后在0.5×TBE缓冲液(45mmol L^-1 Tris，45mmol L^-1硼酸，1mmol L^-1 EDTA)中进行电泳，胶浓度6％。压X片，放射自显影。结果如图2所示，结果表明重组OsWRKY89能与标记的P22探针强烈结合(左起第二泳道)。加入10倍未标记的P22由于未标记P22与OsWRKY89的结合，显降低了OsWRKY89与标记的P22探针的结合活性(左起第三泳道)，加入200倍未标记的P22几乎完全阻止OsWRKY89与标记的P22探针之间的相互作用(左起第四泳道)。与此相反，相同浓度的突变探针mP22不能有效地竞争OsWRKY89与标记的P22探针之间的结合(左起第五泳道)。突变的探针mP22也不能与OsWRKY89发生相互作用(左起第六泳道)，从而证明OsWRKY89可与W盒元件特异结合。图2中10×，200×分别表明加在反应体系中的未标记探针是标记探针摩尔数的10倍，200倍；“+”和“-”分别表示在反应体系中加入和没加入反应物；“S”表示蛋白和探针特异结合后的条带，“F”表示没有结合蛋白的探针条带。

实施例4、OsWRKY89的同源相互作用

OsWRKY89的同源相互作用研究采用酵母双杂交的方法。将OsWRKY89的完整编码区连到GAL4AD载体上构成被诱载体；OsWRKY89的不同缺失体的编码序列连到GAL4 BD载体上构成诱捕载体，分别共转化酵母菌株AH109。具体方法如下：

以表1中w89ΔCR和w89SmaI，w89ΔCR和ΔCN1F，w89ΔCR和ΔCN2F组成三对引物，以pET-OsWRKY89为模板分别扩增的得到OsWRKY89的羧基端缺失体ΔC(自序列2的氨基端第1位至196位氨基酸残基)的编码区(自序列1的5′端第1-588核苷酸)、OsWRKY89的氨基端和羧基端缺失体ΔCN1(自序列2的氨基端第15位至196位氨基酸残基)的编码区N1C(自序列1的5′端第43-588核苷酸)，OsWRKY89的氨基端和羧基端缺失体ΔCN2(自序列2的氨基端第62位至196位氨基酸残基)的编码区N2C(自序列1的5′端第184-588核苷酸)。将扩增产物分别用XhoI和SmaI双酶切后插入GAL4 DNA结合结构域(BD)载体pGBKT7(购自Clontech公司)的XhoI和SmaI酶识别位点之间，酶切和测序验证，将鉴定正确的含有ΔC、N1C或N2C的重组载体分别命名为pBD-OsWRKYΔC、pBD-OsWRKYΔN1或pBD-OsWRKYΔN2。按同样的方法以pET-OsWRKY89为模板，以表1中所述w89EI和w89Rxho为引物，扩增OsWRKY89的完整编码区(自序列1的5′端第1-792位核苷酸)，然后用EcoRI和XhoI双酶切、连接到GAL4激活结构域(activating domain，AD)载体pGADT7(购自Clontech公司)的EcoRI和XhoI酶切位点之间，经鉴定正确的重组载体命名为pAD-OsWRKY89。将上述构建的pBD-OsWRKYΔC、pBD-OsWRKYΔN1或pBD-OsWRKYΔN2分别与pAD-OsWRKY89共转化酵母菌株AH109，分别得到含有pBD-OsWRKYΔC和pAD-OsWRKY89、pBD-OsWRKYΔN1和pAD-OsWRKY89或pBD-OsWRKYΔN2和pAD-OsWRKY89的酵母菌株。另外，将pBD-OsWRKYΔC与pGADT7共转化酵母菌株AH109得到含有pBD-OsWRKYΔC和pGADT7的酵母菌株，将pGBKT7-p53(购自Clontech公司)和pGADT7-T(购自Clontech公司)共转化酵母菌株AH109得到含有pGBKT7-p53和pGADT7-T的酵母菌株，用pGBKT7(购自Clontech公司)转化酵母菌株AH109得到含有pGBKT7的酵母菌株，将这些菌株分别在YPDA培养基和SD-Leu-Trp-Ade-His培养基(SD培养基加0.06g L^-1的Leu-Trp-Ade-His(购自Clontech公司))上30℃培养3天，观察结果。结果如图3所示，结果表明3个截断的、带亮氨酸拉链或不带亮氨酸拉链的OsWRKY89蛋白与GAL4 BD区融合的酵母载体作为诱捕物，以OsWRKY89全长蛋白与GAL4 AD区融合的酵母载体作为被诱捕物(图3中A，B)，分别共转化酵母菌株AH109。所有带有诱捕质粒和被诱捕质粒的酵母细胞都能正常生长在YPDA培养基上(图3中C，a)。携带pGBKT7和pAD-OsWRKY的酵母，以及携带pBD-OsWRKYΔC和pGADT7的酵母不能在SD-Leu-Trp-Ade-His选择培养基上生长(图3中C，c)。另一方面，携带pBD-OsWRKYΔC和pAD-OsWRKY的酵母细胞能较好地生长在选择培养基上，说明OsWRKY89间存在蛋白相互作用。尽管它的α-半乳糖苷酶活性比带有pGBKT7-p53和pGAKT7-T阳性对照低一些。去掉N端的14位aa，没有明显降低OsWRKY89间的相互作用。但是，当进一步缺失到第61位aa，转化的酵母细胞则失去在选择培养基上生长的能力。而缺失的这个区域包括整个亮氨酸拉链样结构，这暗示着亮氨酸拉链样结构在OsWRKY89间的同源相互作用中起重要作用。

其中，图3中A为OsWRKY89的缺失体连到GAL4BD酵母载体上，构成诱捕载体；OsWRKY89全长连到GAL4AD酵母载体上，构成pAD-OsWRKY载体(被诱载体)。图3中B为3个截断的、带亮氨酸拉链或不带亮氨酸拉链的OsWRKY89的不同缺失体。数字表示相对于序列表中序列2的第一位甲硫氨酸的氨基酸的位置，黑色实心框表示WRKY域。图3中C为使用酵母双杂交体系检验OsWRKY89中亮氨酸拉链样结构是否参与蛋白间的相互作用。图3中C中，a为所有带有诱捕质粒和被诱捕质粒的酵母在YPDA培养基上30℃培养3天。b为带有不同载体的酵母在培养基上的位置。b中1.pBD-OsWRKYΔC和pAD-OsWRKY，2.pBD-OsWRKYΔCN2和pAD-OsWRKY，3.pBD-OsWRKYΔC和pGADT7，4.pGBKT7-p53和pGADT7-T，5.pGBKT7，6.pBD-OsWRKYΔCN1和pAD-OsWRKY。c为所有带有诱捕质粒和被诱捕质粒的酵母在SD-Leu-Trp-Ade-His选择培养基上30℃培养3天。

实施例5、OsWRKY89的亚细胞定位

构建了p35S-WRKY89-GFP载体，运用了粒子轰击法将它瞬时表达在洋葱表皮细胞中，同时用pCam35S-GFP载体作为对照。

pBluescript-SK-GFP(将GFP基因(自GENBANK号为AY596277第67-781位核苷酸)插入到pBluescript SK(购于clontech公司)的多克隆位点HindIII和EcoRI之间得到的重组载体)、pCam35S分别用Pst I和Sal I双酶切，将得到的GFP片段和pCam35S大片段连接，用PCR和酶切鉴定含有CaMV 35S启动子和GFP基因的载体命名为pCam35S-GFP。

用表1所示引物W89F/W89Rxho为引物，以pUCmT-OsWRKY89为模板扩增OsWRKY89的完整编码序列，用BamH I和Xho I双酶切后插入到相同酶切的pCam35S-GFP上的GFP 3’端，将测序验证正确的重组载体命名为p35S-WRKY89-GFP。

其中，pCam35S按照如下方法构建：用引物5’-ACGAATTCGGTC CCCAGATTAGCC-3’和5’-CCGAGCTCGTCCCCCGTGTTC-3’从pCAMBIA1301载体上扩增一个35S启动子，EcoR I和Sac I分别酶切pCAMBIA1301和扩增片段，回收扩增片段酶切产物插入到pCAMBIA1301载体EcoR I和Sac I酶切位点之间得到重组载体。将该重组载体用Pst I和HindIII酶切，回收大片段。用引物5’-AACCTGCAGTA ACTAGCATAAC-3’和引物5’-TTAAGCTTGCGCGCAAAAAACCC-3’从pGBKT7载体上扩增T7 terminator，用Pst I和HindIII酶切，回收。将两个回收片段连接，得到载体pCam35S。

p35S-WRKY89-GFP用于洋葱(Allium cepa)表皮细胞的基因枪转化，以pCam35S-GFP作对照。具体步骤如下所述：

1)质粒的准备：用试剂盒提取纯化p35S-WRKY89-GFP或pCam35S-GFP(对照)质粒，定量后取2.5μg备用。

2)洋葱的准备：撕下白色洋葱内表皮(1cm×1cm)，内侧置上，置于含氨苄青霉素(Amp，100μg mL^-1)改进的MS培养基(1×MS盐，1×Gamborg’s B5维生素，30g L^-1蔗糖，2％琼脂，pH 5.7)备用。

3)金粉悬浮液制备：称取60mg金粉(直径1.0μm)于1.5mL离心管；加1000μL无水乙醇，振荡悬浮1-2分；10,000rpm离心，10秒；弃上清，重复一次；用1000μL无菌ddH₂O悬浮，振荡1-2分；10,000rpm离心，10秒；弃上清，重复一次；用1000μL无菌ddH₂O悬浮，振荡1-2分，现用或-20℃保存备用。

4)金粉与DNA的包埋：取均匀的金粉悬浮液50μL，加入质粒2.5μg，并混匀；加20μL 0.1mol L^-1亚精胺，混匀；轻轻地一滴一滴地加入50μL 2.5mol L^-1CaCl₂，并不时轻轻摇晃；震荡器上温和震荡3-5分后，室温放置10分；10,000rpm离心，10秒，弃上清，无水乙醇漂洗2次；加60μL无水乙醇悬浮，混匀。

5)轰击受体材料：将压力膜和轰击膜在70％的酒精中浸泡1-2小时后取出，于超净工作台中晾干；金属挡板用70％酒精浸泡后，于酒精灯上灭菌；取10μL制备好的金粉-DNA复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置，凉干，不要涂布于整个膜上，大小应与载体固定圈上的孔径范围一致；安装到发射装置上；将可裂膜安装到气体加速管的下端；靶材料集中到培养皿的中部，放入真空室内，取下培养皿盖；抽真空指针到26；放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂圆片所能承受的压力时，可裂膜破开；气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金属颗粒却透过金属挡板的网孔，射向靶细胞；可裂膜压力为1,000p.s.i.。平皿用Parafilm封好，22℃暗培养18小时后，用激光共聚焦扫描显微镜(Bio-Rad MRC1024)40倍镜下观察、并采集图象。激光光源为氩-氪激光(Argonm-Krypton)，激发波长设定为488nm，另外还有一通道用于可见光下的透射显微观察。图象叠加及其它处理用Confocal Assistant和Adobe Photoshop 6.0软件进行。

结果如图4所示，结果表明OsWRKY89定位于细胞核内。其中，图4中的照片为在激光共聚焦显微镜下，放大40×10倍拍照。图4中A，B和C为pCam35S-GFP载体瞬时表达照片，D，E，F为pCam35S-OsWRKY89-GFP载体瞬时表达照片。图4中A和D为蓝色光激发下的绿色荧光；图5中C和F为可见光下的洋葱细胞；图4中B为A和C的叠加，图4中E为D和F的叠加。

实施例6、OsWRKY89转录激活的分析和激活域的确定

用89SmaF和w89Rxho引物以pET-OsWRKY89为模板扩增得到OsWRKY89的完整编码区，用Sma I和Xho I双酶切，插入到含有酵母GAL4 DNA结合域(binding domain，BD)载体pGBKT7的Sma I和Xho I酶识别位点之间，得到含有OsWRKY89的完整编码区的重组载体pBD-WRKY89。

以同样的方法构建OsWRKY89缺失体ΔC1(自序列2的氨基端第1位至196位氨基酸残基)、ΔC2(自序列2的氨基端第1位至138位氨基酸残基)、ΔC3(自序列2的氨基端第1位至95位氨基酸残基)、N1(自序列2的氨基端第19位至263位氨基酸残基)、ΔN2(自序列2的氨基端第62位至263位氨基酸残基)、C1(自序列2的氨基端第197位至263位氨基酸残基)编码基因的载体：各缺失体编码区的扩增引物对如下：

ΔC1：89SmaF/ΔC1R；ΔC3：89SmaF/ΔC3R；N1：YN1F/w89Rxho；ΔN2：YN2F/w89Rxho；C1：YN3F/w89Rxho。以pUCmT-OsWRKY89为模板进行扩增。

上述扩增得到的cDNA片段用相应的引物携带的酶酶切，分别插入到pGBDKT7(购自Clontech公司)的C端相同酶识别位点之间，构建各缺失突变体载体，测序验证。将含有ΔC1的重组载体命名为pBD-ΔC1；将含有ΔC2的重组载体命名为pBD-ΔC2；将含有ΔC3的重组载体命名为pBD-ΔC3；将含有C1的重组载体命名为pBD-C1；将含有N1的重组载体命名为pBD-N1；将含有ΔN2的重组载体命名为pBD-ΔN2；。

缺失体ΔC2是利用OsWRKY89中的Sal I位点，将pBD-WRKY89用Sma I和SalI酶切，回收小片段(ΔC2)得到，然后将ΔC2与pBD-WRKY89用Sma I和Xho I酶切的载体片端连接，酶切鉴定，将经鉴定表明含有ΔC2与GAL4DNA结合域的载体命名为pBD-ΔC2。

将上述构建的载体分别转化酵母菌株AH109，然后分别在SD培养基(6.7g L^-1yeast nitrogen base without aa，2g Agar，PH 5.8)和SD-Trp-Ade-His培养基(SD培养基加0.06g L^-1的Trp-Ade-His(购自Clontech公司))上30℃培养3天。然后进行α-半乳糖苷酶活性测定，α-半乳糖苷酶活性用试剂盒(购自Clontech公司)测定，按供应商说明书进行，底物为PNP-α-Gal(p-nitrophenylα-D-galactopyranoside)。以pGBDKT7空载体转化酵母菌株AH109得到的转化子(pBD)为阴性对照和pGBDKT7-53(购自Clontech公司)转化酵母菌株AH109得到的酵母转化子(pBD-53)为阳性对照(培养基SD-Leu)。

α-半乳糖苷酶活性测定原理：

结果如图5所示，结果表明携带pBD-WRKY89的酵母在SD-Trp-Ade-His培养基上生长良好，说明OsWRKY89具有转录激活的能力。缺失C端74aa(190-263aa)的转化子(pBD-ΔC1)不能在SD-Trp-Ade-His培养基生长；而该段与Gal4-BD融合的转化子(pBD-C1)却能在选择培养基上生长，表明C端74aa对OsWRKY89的转录激活活性来说，不仅是足够的、而且是必需的。另一方面，去除N端19位aa(ΔN1)或61位aa(ΔN2)不影响各自的转化子在选择培养基上的生长(图5中B)。但后者的a-半乳糖酶活性与OsWRKY89全长比降低了46.8％(图5中C)，说明第20位到第61位aa这一段对OsWRKY89的转录激活活性有促进作用。这种促进作用可能是由于该区域的亮氨酸拉链样结构介导的蛋白互作所致。

图5中A为OsWRKY89全长和不同的缺失体ΔC1(aa 1-196)，ΔC2(aa 1-138)，ΔC3(aa 1-95)，N1(aa 19-263)，ΔN2(aa 62-263)，C1(aa 197-263)的编码区插入到酵母GAL4 DNA结合域载体pGBKT7上组成重组载体示意图；图5中B为pBD-ΔC1、pBD-ΔC3、pBD-N1、pBD-ΔN2、pBD-C3、pBD-ΔC2转化酵母菌株AH109得到的转化子，在SD-Trp(左)或SD-Leu-Trp-Ade-His(右)选择培养上30℃培养3天后的结果；其中位置1为pBD-OsWRKY89的酵母转化子，位置2为pBD-ΔC1的酵母转化子，位置3为pBD-ΔC2的酵母转化子，位置4为pBD-ΔN2的酵母转化子，位置5为pBD-ΔC3的酵母转化子，位置6为pGBDKT7的酵母转化子。图5中C为β-半乳糖苷酶活性测定结果。分别以pGBKT7的酵母转化子(pBD)和pGBDKT7-53(Gal BD和AD融合)的酵母转化子(pBD-53)为阳性对照(培养基SD-Leu)作对照，取三次独立的实验中得出的值的平均值。

实施例7、OsWRKY89的逆境诱导表达

1、水稻培养与逆境处理

水稻品种秀水11种子在37℃下浸泡1-2天，露白后催芽1天，然后播种在营养土中，在温室中培养。28℃(昼)/22℃(夜)，自然光周期。25天苗用于各种处理，于不同时间取样，取叶片提取RNA。

将水稻品种秀水11植株接种稻瘟病菌菌株p131。具体方法为：将稻瘟菌菌株p131培养、产孢，将产生的孢子配成以10⁵/L的浓度，喷接到生长至三叶期的水稻品种秀水11植株上，在黑暗、保湿的条件下培养分别于0、1、6、12、24h后取叶片提取总RNA。

激素处理：生长21天的水稻品种秀水11植株分别进行如下处理：用100μmolL^-1茉莉酸甲酯(MeJA)、100μmol L^-1脱落酸(ABA)、5mmol L^-1水杨酸(SA)、1mmol L^-1乙烯利(ethephon)、100μmol L^-1赤霉素(GA3)喷施，分别于0、1、6、12、24h取叶片提取总RNA。其中MeJA和GA3先溶于少量甲醇，再用ddH₂O溶，甲醇终浓度为0.1％(体积百分含量)。上述激素处理以ddH₂O或0.1％甲醇(MeOH)喷施为对照。

盐处理：生长21天的水稻品种秀水11植株移至含有200mMol L^-1NaCl的营养液中培养，分别于0、1、6、12、24h后取叶片提取总RNA。

冷(cold)、热(heat)处理：生长21天的水稻品种秀水11植株植株置培养箱，维持4℃(冷)或42℃(热)，黑暗培养，分别于0、1、6、12、24h后取叶片提取总RNA。

机械伤害(Wound)处理：生长21天的水稻品种秀水11植株用止血钳压伤叶片，分别于0、1、6、12、24h后取叶片提取总RNA。

紫外(UV)处理：生长21天的水稻品种秀水11植株在用于杀菌的紫外灯(20w/m²)下照射15分，作为全波段紫外处理。

然后进行紫外A或B(UV-A，UV-B)处理：分别用两盏UV-A或UV-B灯(天津英泽尔科技公司)悬于生长21天的水稻品种秀水11植株上方约0.5m照射30min，剂量分别为2.0、8.0w/m²，紫外辐射强度用UV光辐射仪(北京师范大学光学仪器厂)测定。照射后，持续黑暗。UV-B处理时，灯管上覆盖聚乙烯滤膜以去除280nm以下的辐射。分别于0、1、6、12、24h后取叶片提取总RNA。

2、RNA提取与Northern分析

取上述逆境诱导的水稻品种秀水11植株叶片样品，RNA提取按Chomczyski和Sacchi(1987)的方法。总RNA(10μg)在1.2％甲醛变性琼脂糖胶中电泳分级，然后转移至Hybond-N⁺尼龙膜上，与[α-³²P]-标记的OsWRKY89特异性探针(自序列1的477-792位核苷酸的单链核苷酸序列)在65℃下杂交。65℃下，用2×SSC加0.1％SDS洗5分，在同样温度下用1×SSC加0.1％SDS再洗5分。膜压磷屏(AmershamPharmacia，UK)。

结果如图6所示，结果表明，OsWRKY89的表达受到MeJA和UV-B诱导，同时伤害对OsWRKY89也有诱导，说明OsWRKY89可能参与到MeJA和UV-B的信号途径中，也可能与伤害有关。

图6中A为100μmol L^-1脱落酸(ABA)、100μmol L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)、1mmol L^-1乙烯利(ethephon)、100μmol L^-1赤霉素(GA3)、5mmol L^-1水杨酸(SA)和200mmol L^-1NaCl处理后OsWRKY89的表达。图6中B为稻瘟菌菌株p131接菌后OsWRKY89的表达。图6中C为UV-A、UV-B(剂量分别为2.0、8.0w/m²)、UV(20w/m²)、机械损伤(用止血钳压伤叶片)，冷(4℃)，热(42℃)处理后OsWRKY89的表达。

实施例8、OsWRKY89转基因水稻的获得以及OsWRKY89超表达植株的表型分析

OsWRKY89的超表达载体构建：用w89F和w89RXho从pUCmT-OsWRKY89扩增OsWRKY89的完整编码序列，用BamH I和Xho I双酶切，插入到pUCmT的相同酶切位点间，将经鉴定正确的载体命名为pUCmT-F-WRKY89；将pUCmT-F-WRKY89用Pst I和Xho I双酶切后，得到800bp的OsWRKY89片段，将其插入pUC18的Pst I和XhoI酶识别位点之间，经鉴定正确的质粒命名为pUC18-F-WRKY89；将pUC18-F-WRKY89用BamH I和Sac I双酶切，得到800bp的OsWRKY89片段，将其插入到pCoU(用引物5’-TAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGG-3’和5’-GTGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAG-3’从玉米基因组中扩增Ubiquitin启动子，用EcoRI和BamHI分别酶切扩增片段和pCam35S，回收扩增片段和pCam35S酶切的大片段，连接的产物叫做pCoU)的BamHI和SacI酶识别位点之间，构建OsWRKY89的超表达载体，将其命名为pCoU-WRKY89。pCoU-WRKY89为基因的超表达载体，受玉米Ubi基因启动子驱动，在E.coli中为卡那霉素抗性，在农杆菌EH105中为潮霉素抗性，OsWRKY89的超表达载体pCoU-WRKY89示意图如图7中A所示。

OsWRKY89的RNAi载体构建：用引物F：5’-CGTTGACTACTATGAC-3’和R：5’-CATCCCCATATGCATAT-3’，以pUCmT-OsWRKY89为模板，扩增得到315bp片段(序列表中序列1的5′端第477-792核苷酸片段)，将其连接到pUCmT载体上得到的重组载体pUCmT-89m，用Pst I和Xho I双酶切pUCmT-89m，回收得到320bp的片段，将pUC-CatIN(过氧化氢酶(catalase，Cat)基因的内含子(具有GENBANK号为AY436346的5′端第31-220核苷酸序列)插入到pUCmT载体，得到pUC-CatIN)用Pst I和Sal I双酶切，回收2900bp的片段。将回收的两个片段连接，将经鉴定表明正确的重组载体命名为pUC-IN-89mR；将pUC-IN-89mR用EcoR I和Xho I双酶切后，回收510bp的片段，插入到pUCmT-89m的EcoR I和Xho I酶识别位点之间，将经鉴定表明正确的重组载体命名为pUC-89mF-IN-89mR；pCam35S用Pst I酶切，回收13337bp的片段，再将pUC-89mF-IN-89mR用Pst I酶切、回收900bp的89mF-IN-89mR片段，将两个片段连接，用Xba I酶切鉴定，选择按pCam35S-89mF-IN-89mR正向插入的重组载体，即OsWRKY89的RNAi载体，将其命名为pCam35S-ds89。pCam35S-ds89载体示意图如图7中B所示。

pCam35S-ds89和pCoU-WRKY89通过根瘤农杆菌介导的转化入水稻(pCam35S-ds89转化的是水稻品种中花17，pCoU-WRKY89转化的水稻品种为秀水11)，具体方法为：成熟水稻种子用70％的乙醇进行表面消毒1分后，用20％(v/v)的次氯酸钠消毒30分，在NBI培养基上培养(MS添加0.5g L^-1谷氨酰胺，0.5g L^-1脯氨酰胺，2.0mg L^-1 2，4-D；PH 5.8)，大概14天后长出愈伤，将愈伤组织剥下来放到新的NBI培养基上培养，4天后即可侵染；将含有pCam35S-ds89或pCoU-WRKY89的农杆菌液均匀涂在固体YEP平板上培养2-3天，用无菌药匙从平板上刮菌于液体共培养培养基(MS+2g L^-1肌醇+0.3g L^-1CEH+100uM AS)中至细胞浓度为3×10⁹cfu mL^-1，将愈伤放入菌中侵染20分钟，将愈伤倒在干净滤纸上吸干表面的菌液，移到Nbco培养基上培养(NBI培养基加100uM AS)；培养2天后，将愈伤转移到筛选培养基NBs上培养(NBI培养基加500mg L^-1头孢霉素，30mg L^-1潮霉素)；等到愈伤出绿点后(大概30天)移至分化培养基(MS培养基中添加2.0mg L^-1 6-BAP、0.5mg L^-1 NAA、30g L^-1山梨醇和30mg L^-1 Hyg)上培养。获得的小苗种于温室直到收种。共获得14株转pCam35S-ds89水稻和9株转pCoU-WRKY89水稻(pCam35S-ds89转化的是水稻品种中花17，pCoU-WRKY89转化的水稻品种为秀水11)，即T0代转基因植株。T0代转基因植株自交所得的种子和由该种子长成的植株为T1代。T1代转基因植株自交所得的种子和由该种子长成的植株为T2代。

测量转pCoU-WRKY89水稻T2代植株14天苗龄时的株高(cm)、全展叶(第二叶)长(cm)、宽(最宽处)(cm)、种子根和不定根长(cm)。统计不定根数。按Debi等(Debi BR，Mushika J，Taketa S，Miyao A，Hirochika H，Ichii M.(2003).Isolation and characterization of a short lateral root mutant in rice(Oryzasativa L.).Plant Sci，165：895-903)的方法统计侧根数。侧根数＝肉眼观察到的、种子根长。每株系统计20株。整株用数码相机拍照。结果如图8所示，结果表明一些转pCoU-WRKY89水稻植株矮小，叶长明显变短，叶宽稍变窄，不定根少，种子根长与野生型无明显差异，在发育上也与野生型同步(只观察至4叶期)；另一些与野生型的表型一样(图8中A，C)。经PCR和潮霉素检验，矮小植株为转基因阳性。

图8中A为部分转pCoU-WRKY89水稻T2代株系S9、S11、S1、S3、S13，SNT(分离株：T1代株系种下去后代进行遗传学分离，一些植株恢复为野生型，我们叫分离株)和对照(野生植株)WT的表型，Bar＝8cm。图8中B为转pCoU-WRKY89水稻T2代株系S9、S11、S1、S3、S13，SNT(分离株)和对照(野生植株)WT在植株重(a)，种子根长(b)，侧根长(c)，不定根数(d)，叶长(e)，叶重(f)和不定根长(g)的比较。图8中C为对照WT、超表达(转pCoU-WRKY89水稻)T2代株系S3和S13的表型，Bar＝2cm。

实施例9、OsWRKY89超表达植株和干涉植株抗UV-B分析

转pCam35S-ds89水稻和转pCoU-WRKY89水稻T2代植株25天苗龄的转基因植株连续暴露在UV-B(10w/m²)下2.5小时，UV-B灯离植株0.5米。暗修复24小时，然后持续光照恢复，光强30μmol m^-2s^-1。2天后用数码相机拍照。

UV-B处理后暗适应10分，用便携式脉冲放大可调荧光仪(PAM-2000，HeinzWalz，Effeltrich，Germany)测定第2叶的叶绿素荧光。PSII光化学最大量子产率(Fv/Fm)计算按(Genty B，Briantais JM，Baker NR.(1989).The relationshipbetween the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenchingof chlorophyll fluorescence.Biochim Biophys Acta，990：87-92)的方法。Fv/Fm＝(Fm-F0)/Fm，其中F0为叶绿素起始荧光，Fm为叶绿素最大荧光，Fv为叶绿素可变荧光。结果如图9所示，结果表明pCoU-WRKY89水稻可以增强水稻对UV-B抗性，而转pCam35S-ds89水稻对UV-B抗性减弱。说明WRKY89与水稻的UV-B抗性有关。

图9中A为生长25天的转pCoU-WRKY89水稻T2代和转pCam35S-ds89水稻T2代幼苗用UV-B照射2.5小时，暗培养1天，野生型水稻(WT)、转pCoU-WRKY89水稻T2代植株和转pCam35S-ds89水稻T2代植株在UV-B照射后的比较，Bar＝5cm。图10中B为在不同的时间点测对照水稻秀水11和中花17(购于种子公司)、转pCoU-WRKY89水稻T2代和转pCam35S-ds89水稻T2代植株的第三叶Fv/Fm值。图10中C为转pCoU-WRKY89水稻T2代植株和转pCam35S-ds89水稻T2代植株的表达分析。图9中A和图9中B中的其中D14、D7为转pCam35S-ds89水稻T2代的两个植株；ZH、XS分别为对照中花17和秀水11；S1、S13为转pCoU-WRKY89水稻T2代的两个植株。图9中C的XS、ZH分别为对照秀水11和中花17；S1、S3、S7、S8、S10、S11、S13为转pCoU-WRKY89水稻T2代的不同植株；I1、I2、I3、I4、I5、I7、I8、I11、I14为转pCam35S-ds89水稻T2代的不同植株。上图为对照水稻秀水11和中花17(购于中国农业科学院杭州水稻研究所)、转pCoU-WRKY89水稻T2代和转pCam35S-ds89水稻T2代植株的表达变化；下图为对照水稻秀水11和中花17、转pCoU-WRKY89水稻T2代和转pCam35S-ds89水稻T2代植株在UV-B照射15分钟，暗培养3小时后的表达变化。

                            序列表

<160>3

<210>1

<211>792

<212>cDNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)

<400>1

atgatagagc accaaaaggc tctcatggtg gagctgcgtg gcatggccat gccattactt    60

ccgagcgaca atgaacaagc caagcttgct cttcaactct tgggagatat attgagttgc    120

tcagataagg ctatctccat gctagaactt ggtggagaca ctaaaaagct gaccaatctt    180

gttggaggta agagaaaagg tgacaagcat agcatggaca accacaactt ggaggaggaa    240

gctaaagaaa gtgttagcaa gagaagaaag aatgcagaac acacaggttc aactgtggct    300

caagcacctc acaatgatgg acatcaatgg aggaagtatg gtcagaaatg gatctctaga    360

gcaaaacatt ccaggagcta ctataggtgt gccaatagta aagtgcaagg ctgtcctgct    420

acaaagacag tgcaacaaat ggattccagt ggaaatggaa catcaaagtt gttcaacgtt    480

gactactatg accaacacac atgcagggga gatggcatag ccgatccata tgttgtcgac    540

acagcccatc acagtatgga acctatcaat caaaacgaat gcaatagccc tacacttgaa    600

cacgaagccc atgaagttca agatgaaaga tttgaaaact tgtgtatggt acaaaatatg    660

ccagagtatt tgatagattt tgaattggag agagccttcg agtttattgt gaactcacca    720

ttgggttctg agcattggac gttcgatgat tcaataagat gtgagcacag tccaatatgc    780

atatggggat ga                                                        792

<210>2

<211>263

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)

<400>2

Met Ile Glu His Gln Lys Ala Leu Met Val Glu Leu Arg Gly Met Ala

1               5                   10                  15

Met Pro Leu Leu Pro Ser Asp Asn Glu Gln Ala Lys Leu Ala Leu Gln

            20                  25                  30

Leu Leu Gly Asp Ile Leu Ser Cys Ser Asp Lys Ala Ile Ser Met Leu

        35                  40                  45

Glu Leu Gly Gly Asp Thr Lys Lys Leu Thr Asn Leu Val Gly Gly Lys

    50                  55                  60

Arg Lys Gly Asp Lys His Ser Met Asp Asn His Asn Leu Glu Glu Glu

65                  70                  75                  80

Ala Lys Glu Ser Val Ser Lys Arg Arg Lys Asn Ala Glu His Thr Gly

                85                  90                  95

Ser Thr Val Ala Gln Ala Pro His Asn Asp Gly His Gln Trp Arg Lys

            100                 105                 110

Tyr Gly Gln Lys Trp Ile Ser Arg Ala Lys His Ser Arg Ser Tyr Tyr

        115                 120                 125

Arg Cys Ala Asn Ser Lys Val Gln Gly Cys Pro Ala Thr Lys Thr Val

    130                 135                 140

Gln Gln Met Asp Ser Ser Gly Asn Gly Thr Ser Lys Leu Phe Asn Val

145                 150                 155                 160

Asp Tyr Tyr Asp Gln His Thr Cys Arg Gly Asp Gly Ile Ala Asp Pro

                165                 170                 175

Tyr Val Val Asp Thr Ala His His Ser Met Glu Pro Ile Asn Gln Asn

            180                 185                 190

Glu Cys Asn Ser Pro Thr Leu Glu His Glu Ala His Glu Val Gln Asp

        195                 200                 205

Glu Arg Phe Glu Asn Leu Cys Met Val Gln Asn Met Pro Glu Tyr Leu

    210                 215                 220

Ile Asp Phe Glu Leu Glu Arg Ala Phe Glu Phe Ile Val Asn Ser Pro

225                 230                 235                 240

Leu Gly Ser Glu His Trp Thr Phe Asp Asp Ser Ile Arg Cys Glu His

                245                  250                  255

Ser Pro Ile Cys Ile Trp Gly

            260

<210>3

<211>990

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)

<400>3

atgatagagc accaaaaggc tctcatggtg gagctgcgtg gcatggtcat gccattactt    60

ccgagcgaca atgaacaagc caagcttgct cttcaactct tgggagatat attgagttgc    120

tcagataagg ctatctccat gctagaactt ggtggagaca ctaaaaagct gaccaatctt    180

gttggaggta agagaaaagg tgacaagcat agcatggaca accacaactt ggaggaggaa    240

gccaaagaaa gtgttagcaa gagaaggtat atgtatataa atacatgcca ctagaggaat    300

gtccactagc ttatcattca ttgctaacga aatttgattg atcctcttga ttatgataga    360

aagaatgcag aacacacagg ttcaactgtg gctcaagcac ctcacaatga tggacatcaa    420

tggaggaagt atggtcagaa atggatctct agagcaaaac attccaggta taaatgagca    480

tatgaactcc tgtttatttc cattcctcga agcatattgg ttttatctaa cagcaaaata    540

tatacatcta atgagctcat ttgcttaagc aggagctact ataggtgtgc caatagtaaa    600

gtgcaaggct gtcctgctac aaagacagtg caacaaatgg attccagtgg aaatggaaca    660

tcaaagttgt tcaacgttga ctactatggc caacacacat gcaggggaga tggcatagcc    720

gatccatatg ttgtcgacac agcccatcac agtatggaac ctatcaatca aaacgaatgc    780

aatagcccta cacttgaaca cgaagcccat gaagttcaag atgaaagatt tgaaaacttg    840

tgtatggtac aaaatatgcc agagtatttg atagattttg aattggagag agccttcgag    900

tttattgtga actcaccatt gggttctgag cattggacgt tcgatgattc aataagatgt    960

gagcacagtc caatatgcat atggggatga                                     990

Claims (10)

1、一种植物WRKY转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物WRKY转录因子功能的蛋白质。

2、权利要求1所述植物WRKY转录因子的编码基因。

3、根据权利要求2所述植物WRKY转录因子的编码基因，其特征在于：所述植物WRKY转录因子基因的编码序列为自序列2的5′端第1位至792位脱氧核苷酸。

4、根据权利要求2或3所述的编码基因，其特征在于：所述植物WRKY转录因子的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求2或3所述的编码基因，其特征在于：所述植物WRKY转录因子的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：3的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

6、含有权利要求2-5任一所述的基因的重组表达载体。

7、含有权利要求2-5任一所述的基因的转基因细胞系。

8、含有权利要求2-5任一所述的基因的工程菌。

9、权利要求2-5任一所述的基因在培育抗逆性植物中的应用。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。

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