CN1772899A - 野生稻的一个抗旱基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了野生稻的一个抗旱基因及其编码蛋白与应用。该基因可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该基因的编码蛋白可具有下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗旱性的蛋白质。本发明的抗旱基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻)中发挥重要的作用。

Description

野生稻的一个抗旱基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及野生稻中的一个抗旱基因及其编码蛋白与其在培育抗旱能力提高植物中的应用。

背景技术

植物的生长受到环境中多种非生物因素的影响，其中水分胁迫是影响农作物产量的主要因素之一。研究表明大量逆境应答基因的表达为植物获得抗逆性所必需(Gonget al.，PNAS，99：11507-11512)。在多数干旱、高盐或冻害等水分胁迫应答基因的启动子区都含有一个或多个脱水反应元件或叫C重复(Dehydration-responsiveelement/C-repeat，即DRE/CRT)，该元件的核心序列为G/ACCGAC(Shinozaki et al.，Curr.Opin.Plant Biol.，3：217-223)。DREB1/CBF(Dehydration-responsiveelement binding protein/C-repeat binding factor)转录因子家族通过和该顺式作用元件结合来激活下游基因的表达(Liu et al.，Plant Cell，10：1391-1406)。近年来，在对模式植物拟南芥的研究中发现组成型表达的bHLH(basicHelix-Loop-Helix)类转录因子ICE1(inducer of CBF expressionl，ICE1)能够和CBF3基因启动子区内的MYC识别序列结合并调节DREB1/CBF基因的转录。ICE1可被修饰(或与配体结合)后激活，引起CBF及其下游基因的转录表达，从而提高植物的抗逆性(Chinnusamy et al.，Genes Dev 17：1043-1054)。

我国江西省东乡普通野生稻(O.rufipogon)是分布在世界上最北端的野生稻品种，蕴含丰富的抗病虫基因和耐冷基因，具有优良的耐冷性、耐旱性、耐瘠性和抗病性等，而且蛋白质含量较高，可利用价值巨大。因此充分利用东乡野生稻的一系列有益基因，在植物育种研究中具有重大价值。此外，拟南芥和水稻基因组测序工作的完成，为利用这些模式植物进行基因功能的研究提供了便利条件。

发明内容

本发明的目的是提供野生稻中的一个抗旱基因及其编码蛋白。

本发明所提供的抗旱基因，名称为OrICLa，来源于普通野生稻(O.rufipogon)，它可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.101％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由1706个碱基组成，其编码序列为自5’端第41-1615位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明抗旱基因所编码的蛋白(OrICLa)，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗旱性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由524个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OrICLa中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的抗旱基因导入植物细胞，可获得对干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用OrICLa构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明OrICLa的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米等单子叶植物，也可以是拟南芥等双子叶植物。

本发明的抗旱基因OrICLa为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻)中发挥重要的作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为RT-PCR扩增的OrICLa的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为OrICLa超表达载体pSNICLa的物理图谱

图3为OrICLa转基因拟南芥外源基因的PCR鉴定结果

图4为OrICLa转基因拟南芥外源基因的RT-PCR鉴定结果

图5为OrICLa超表达拟南芥经水分胁迫处理后的表型

图6为OrICLa超表达拟南芥经水分胁迫处理后根长统计结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、OrICLa的克隆

根据ICE1 bHLH结构域的氨基酸残基序列“GKKKGMPAKNLMAERRRRKKLNDRLYMLRSVVPKISKMDRASILGDAIDYLKELLQRINDLHNELES”，在NCBI数据库中进行检索(blastp)，在水稻基因组中发现两个同源性较高的全长cDNA序列，根据其中一个基因(OrICLa)的核苷酸序列设计以下引物：5’端引物：CGC GGATCCCATCTCCTTCCCCACCCC(带下划线部分碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；3’端引物：CGG GGTACCGCCCTGAGCAGGTCTAAAACTA(带下划线部分碱基为限制性内切酶Kpn I识别位点)。以东乡野生稻(O.rufipogon)幼苗经4℃处理30分钟的总RNA为模板，在上述引物对的引导下，RT-PCR扩增OrICLa的cDNA序列，具体方法包括以下步骤：

1、总RNA的提取：把在不含激素的1/2MS培养基上生长两周的东乡野生稻幼苗放在低温培养箱中4℃处理30分钟，用Trizol法(所用试剂购自Invitrogen公司)提取幼苗总RNA，具体方法为：收集经4℃低温处理的水稻材料100mg，立即置于液氮中研磨，加入1mL Trizol试剂，充分混匀后，室温放置5分钟；加入0.2mL氯仿，剧烈振摇15秒，室温温育3分钟；4℃，12000g离心15分钟；将上清液转移到一个新的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇沉淀RNA；最后将RNA沉淀用1mL 75％乙醇洗涤后溶于适量经DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

2、第一链cDNA的合成：用Superscript^TMII RT试剂盒(Invitrogen)并按试剂盒说明书进行操作：取1-5μg步骤1获得的水稻总RNA放入灭活了RNase的PCR管中，加入Oligo(dT)_12-18(500mg/mL)1μL和dNTP Mix(10mM each)1μL，用DEPC处理后的双蒸水补充至12μL，混匀后在65℃下加热5分钟，然后迅速置于冰上，1分钟。短暂离心后再加入5×第一链合成缓冲液4μL、0.1M DTT 2μL和RNaseOut^TM(40unit/μL)1μL，轻轻混匀后，42℃温育2分钟，然后加入Superscript^TMII反转录酶(200unit/μL)1μL，混匀，42℃温育50分钟，70℃加热15分钟使酶失活，得到第一链cDNA。

3、OrICLa cDNA的合成：取1μL步骤2获得的反转录产物为模板，在5’端引物和3’端引物的引导下，用PCR的方法合成OrICLa的cDNA，PCR反应体系为：LA Taq(TaKaRa公司)0.5μL、2×GC缓冲液(TaKaRa公司)25μL、dNTP 1μL、5’端引物(10μM/L)1μL、3’端引物(10μM/L)1μL、模板1μL、加双蒸水补充反应体系至50μL。PCR反应条件为：先94℃ 4分钟；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共35个循环；最后72℃ 10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为Marker，泳道1为OrICLa的RT-PCR产物)，得到分子量约为1.8kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天为时代公司)回收该片段，然后将该回收片段与载体pGEM-T Easy(Promega)进行连接，连接体系为：T₄DNA连接酶(3u/μL)、2×连接酶缓冲液5μL、pGEM-T Easy(50ng/μL)0.5μL和回收PCR产物3.5μL，4℃反应12-24小时。参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pTE-OrICLa。以该质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明OrICLa具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，由1706个碱基组成，其其开放阅读框(ORF)为自5’端第41-1615位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第1022-1222位碱基为ICE1 bHLH保守结构域的编码序列，编码67个氨基酸。与ICE1进行同源性比较，核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为42％和40％。

实施例2、OrICLa超表达载体pSNICLa的构建

1、玉米泛素启动子(UbiPro)的获得

1)玉米基因组DNA的提取：剪取约0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃ 12000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

2)PCR扩增玉米泛素启动子(UbiPro)：取2μL步骤1)获得的玉米基因组DNA溶液作为模板，在带有HindIII识别位点的5′引物(GG AAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CG GGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃ 3分钟；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共35个循环，最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后回收，得到带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)，备用。

2、用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI 221(Clontech公司)上切下，连接到载体pUC19(TaKaRa公司)的相应位点中，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与步骤1获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子(UbiPro)相连，得到重组载体，命名为pUN19。

3、用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从步骤2购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriclture，www.cambia.org)多克隆位点的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

4、用限制性内切酶HindIII和BamHI对质粒载体pBI221进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后回收长度约为0.8kb的35S启动子片段，将其与经相同酶双酶切的质粒载体pUN1301进行连接，得到含有35S启动子片段的重组载体，命名为pSN1301。

5、对重组质粒载体pTE-OrICLa和pSN1301分别用限制性内切酶KpnI和BamHI进行双酶切，酶切体系为：质粒5μL、10×酶切缓冲液2.5μL、KpnI 1μL、BamHI 0.8μL，加ddH₂O补充反应体系至50μL，37℃酶切8小时。用琼脂糖电泳对酶切产物进行分离，回收1.7Kb的OsICLa片段和13Kb的载体pSN1301大片段，分别溶解于45μL ddH₂O中。再按以下反应体系将两者进行连接：T₄DNA连接酶2μL、10×连接酶缓冲液2μL、回收的OsICla 10μL、pSN130 16μL，16℃连接16小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经Kan⁺平板筛选得到阳性菌株，将该重组质粒命名为pSNICLa，其物理图谱如图2所示。在该质粒中采用CaMV 35S强启动子启动目的基因OrICLa在植物中超表达，转基因植物的获得方法见下述实施例。

实施例3、OrICLa超表达拟南芥的获得及其鉴定

含有表达载体的农杆菌浸泡转化的植株所结种子以及由该种子长成的植株用T₀代表，T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株。

一、转化有OrICLa超表达质粒pSNICLa的拟南芥的获得

1、OrICLa超表达质粒pSNICLa转化拟南芥

用EasyJecT Plus电激仪(英国EquiBio公司)并参照说明书进行操作，将质粒pSNICLa用电激法转化农杆菌C58，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到农杆菌的阳性克隆；再参照Clough等的方法(Clough SJ and Bent AF，1998Plant J 16：735-43)，在上述阳性克隆农杆菌的介导下，将pSNICLa转化拟南芥。

2、转基因拟南芥阳性苗的抗菌素筛选

将收获的步骤1获得的转基因拟南芥的种子用0.2％ TritonX-100浸泡10分钟；再用10％的次氯酸钠表面消毒，12分钟；灭菌水洗涤五次，每2分钟一次；用水将种子铺在含25mg/L潮霉素的MS平板上，用锡箔纸包裹，在4℃、黑暗条件下放置2天，取出后于23℃的培养室中暗培养3-4天；3-4天后，长势最高的为初筛到的阳性转化苗，在避光条件下取出，光下再培养3天，然后将转基因阳性苗移至花盆中培养，得到T1代转基因材料。

二、转基因拟南芥的鉴定

GUS染色液：100mmol/L磷酸盐pH 7.0，0.1％Triton X-100，10mmol/L EDTA，0.5mmol/L铁氰化钾，X-Gluc 1mg/mL。

Edwards提取缓冲液：200mM Tris-Cl pH7.5，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS。

1、拟南芥阳性苗的GUS染色鉴定

取生长3周的步骤1筛选的拟南芥阳性幼苗叶片尖部2-3mm材料进行GUS染色。37℃温育12小时，再用75％酒精脱色，叶片呈蓝色的为阳性植株。

2、转基因植株的PCR鉴定

1)基因组DNA的提取

取一片用步骤1的方法鉴定的拟南芥阳性植株的叶片放入1.5mL Eppendorf管中，加入液氮，用组织研磨杵研磨10秒钟，磨碎；加入400μL Edwards提取缓冲液，轻轻研磨(洗去杵上组织)；振荡5秒钟，离心1分钟，转移300μL的上清液到新管中，加入300μL异丙醇，混合，于室温放置2分钟；离心、弃上清，风干沉淀，溶于100μL水中，得到转基因材料的基因组DNA。

2)转基因植株的PCR鉴定

以步骤1)获得的基因组DNA为模板，在引物1(5’端引物)：CGCGGATCCCATCTCCTTCCCCACCCC和引物2(3’端引物)：CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG的引导下，用PCR的方法对转基因植株进行鉴定，PCR反应体系为：基因组DNA溶液1μL、LA taq0.5μL、2×GC缓冲液25μL、dNTP 1μL、引物1(10μM/L)和引物2(10μM/L)各1μL、加双蒸水补充反应体系至50μL。PCR反应条件为：先94℃ 4分钟；再94℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 2分钟，共35个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示(泳道Marker为DNA标准分子量)，泳道6、8、10、11和15为不同转基因株系，泳道WT为野生型植株)，所有转基因株系都扩出了约1.8kb的阳性条带，与预期大小相符，而野生型则没有，表明目的基因已成功转入拟南芥中。

3、转基因植株的RT-PCR鉴定

分别提取步骤2所用的WT和五个转基因株系开花期的总RNA，各取2μg总RNA进行反转录，合成其cDNA，RNA提取和反转录方法参照实施例1中的步骤进行。以此反转录产物为模板，在OrICLa特异引物(5’引物：GTGCCCAAGATCAGCAAGATGGACAG，3’引物：GGTACCTGTCGAAAATGCCACATGACC)的引导下，进行RT-PCR检测(以Actin为参照)，PCR反应体系为：rTaq 0.2μL、dNTP 2μL、10X PCR缓冲液2μL、(10μM)5’引物0.4μL、(10μM)3’引物0.4μL、20X cDNA 2μL、加ddH₂O补充反应体系至20μL。PCR反应条件为：先94℃ 4分钟；再94℃ 45秒，59℃ 45秒，72℃ 90秒，共35个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示(泳道6、8、10、11和15为不同转基因株系，泳道WT为野生型植株)，所有转基因株系都扩出了清晰的OrICLa的片段，而野生型则没有，表明OrICLa已成功转入拟南芥中。

实施例4、水分胁迫处理后的OrICLa转基因拟南芥的表型

将在正常MS无激素培养基上萌发2天的OrICLa转基因拟南芥幼苗转移到含有300mM甘露醇的MS培养基上进行缺水胁迫处理，生长10天后，观察表型并对其根长度进行统计，表型观察结果如图5所示(A：无胁迫的野生型植株；B：无胁迫的转基因植株；C：受缺水胁迫的野生型植株；D：受缺水胁迫的转基因植株)，对根长的统计结果如图6所示，上述试验结果表明OrICLa转基因拟南芥具有明显的水分胁迫抗性。

                        序列表

<160>2

<210>1

<211>524

<212>PRT

<213>普通野生稻(O.ruffipogon)

<400>1

Met Leu Pro Arg Phe His Gly Ala Met Trp Met Gln Asp Asp Gly Gly

1               5                   10                  15

Gly Asp Gln Glu His Gly Gln Ala Ala Pro Pro Gly Gln Glu Gln His

            20                  25                  30

His His Asp Gln His Leu Met Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly

        35                  40                  45

Ala Gly Phe Gly Ala Ala Gln Ala Pro Ala Pro Leu Leu Asp Glu Asp

    50                  55                  60

Trp Tyr Phe Asp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala His Gly Ser

65                  70                  75                  80

Met Met Leu Gly Leu Ser Ser Val His Gly Gly Ile Gly Ala Gly Thr

                85                  90                  95

Ser Gly Gly Gly His Gly Gln Gln Phe Ser Leu Leu Asn Met Gly Ala

            100                 105                 110

Ala Ala Ala Pro Phe Asp Val Ser Gly Phe Asp Leu Gly Ile Ala Cys

        115                 120                 125

Gly Gly Val Gly Gly Gly Gly Asp Val Val Ser Phe Leu Gly Gly Gly

    130                 135                 140

Asn Ala Ser Asn Thr Ala Leu Leu Pro Val Gly Asn Ala Gly Phe Leu

145                 150                 155                 160

Gly Thr Phe Gly Gly Phe Gly Thr Ala Ala Ser Gln Thr Pro Glu Phe

                165                 170                 175

Gly Gly Leu Ala Gly Phe Asp Met Phe Asp Ala Gly Ala Val Asn Thr

            180                 185                 190

Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala

        195                 200                 205

Ser Ala His Val Ser Asn Thr Ala Pro Phe Ser Gly Arg Gly Lys Ala

    210                 215                 220

Ala Val Leu Arg Pro Leu Asp Ile Val Pro Pro Val Gly Ala Gln Pro

225                 230                 235                 240

Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Leu Arg Arg Asn Ala Gly Glu Asp Asp

                245                 250                 255

Asp Asp Lys Lys Arg Lys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Leu

            260                 265                 270

Ser Ala Asp Gly Ala Asp Met Val Leu Asp Asp Gly Asp Asp Asp Gly

        275                 280                 285

Leu Ser Ile Asp Ala Ser Gly Gly Leu Asn Tyr Asp Ser Glu Asp Ala

    290                 295                 300

Arg Gly Gly Glu Asp Ser Gly Ala Lys Lys Glu Ser Ash Ala Asn Ser

305                 310                 315                 320

Thr Val Thr Gly Asp Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Met Pro Ala Lys

                325                 330                 335

Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn Asp Arg Leu

            340                 345                 350

Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala

        355                 360                 365

Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Leu Gln Lys

    370                 375                 380

Ile Asn Asp Leu Gln Asn Glu Leu Glu Ser Ser Pro Ala Thr Ser Ser

385                 390                 395                 400

Leu Pro Pro Thr Pro Thr Ser Phe His Pro Leu Thr Pro Thr Leu Pro

                405                 410                 415

Thr Leu Pro Ser Arg Ile Lys Glu Glu Ile Cys Pro Ser Ala Leu Pro

            420                 425                 430

Ser Pro Thr Gly Gln Gln Pro Arg Val Glu Val Arg Leu Arg Glu Gly

        435                 440                 445

Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu

    450                 455                 460

Leu Ser Ala Met Arg Ala Val Glu Gly Leu Gly Leu Asp Val Gln Gln

465                 470                 475                 480

Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Thr Leu Asp Ile Phe Lys Ala

                485                 490                 495

Glu Gln Cys Lys Asp Gly Pro Gly Leu Leu Pro Glu Glu Ile Lys Ala

            500                 505                 510

Val Leu Met Gln Ser Ala Gly Leu His Thr Met Ile

        515                 520

<210>2

<211>1706

<212>DNA

<213>普通野生稻(O.rufipogon)

<400>2

ccatctcctt ccccacccca ccgccattgc cgccgcggcg atgctgccgc ggtttcacgg     60

cgccatgtgg atgcaggacg acggcggcgg cgaccaagaa cacgggcagg cggcgccgcc    120

tgggcaggag cagcaccacc acgaccagca tctcatggcg ttggcggccg cggccgcggg    180

cggcgccggg ttcggcgcgg cgcaggcgcc ggcgccgctg ctcgatgagg actggtactt    240

cgacgcggcg ggtggtggtg gtggtggcgc gcatgggtcc atgatgctgg gtttgtcgtc    300

cgtccatggc gggattgggg cggggacgtc tggtggtggg catgggcagc agttctcgct    360

gctcaacatg ggcgccgcgg ccgcgccgtt cgacgtctcc gggttcgacc tcgggatcgc    420

ctgcggcggc gttggcggcg gcggcgacgt ggtgtcgttt cttggcggcg ggaacgcgtc    480

gaacaccgcg ctgctccccg tcgggaacgc ggggttcctc ggcacgttcg gcgggttcgg    540

caccgcggcg tcccaaacgc cggagttcgg cgggctcgcc gggttcgaca tgttcgacgc    600

gggcgccgtg aacaccgggg gcagctcctc ctcctcgtcg gcggcggcgg cggcggcgtc    660

cgcctcggcg cacgtgagca acaccgcgcc gttctccggg cgcggcaagg cggcggtgct    720

gcggccgctg gatatcgtcc cgcccgtggg cgcgcagccg acgctgttcc agaagcgcgc    780

gctccgccgc aacgccggcg aggacgacga cgacaagaag cgcaaggccg ccgcgggcgc     840

gggcgcgggc gcgctgtccg ccgacggcgc cgacatggtg ctcgacgacg gcgacgacga     900

cggcctcagc atcgacgcgt cgggcggcct caactacgac tccgaggacg ccaggggcgg     960

cgaggacagc ggcgccaaga aggagtcgaa cgccaacagc acggtcaccg gcgacgggaa    1020

ggggaagaag aaggggatgc cggccaagaa cctcatggcg gagcgccgcc gccggaagaa    1080

gctcaacgac cgcctctaca tgctccgctc cgtcgtgccc aagatcagca agatggacag    1140

ggcttccatt ctcggcgacg cgattgagta cctgaaggag ctgctgcaga agatcaatga    1200

tcttcagaat gagctcgagt cgtcccccgc gacgtcgtca ttgcctccaa cacccacaag    1260

cttccatccc ctgacaccga cgctgcccac attgccgtcc cgcatcaagg aagagatctg    1320

cccaagtgca ttgccaagcc ccactggaca acagccaagg gttgaggtta ggctgaggga    1380

aggccgggct gtcaatatcc acatgttctg tgctcggagg cccggtctac tgctctctgc    1440

catgagggcc gtcgaaggcc ttggtctcga tgtccagcaa gctgtaatca gttgcttcaa    1500

tggctttacg ttggatattt ttaaggctga gcaatgcaag gacggccctg ggctgttgcc    1560

tgaagaaatc aaggccgttc tgatgcaatc cgccgggctc cataccatga tctaggacag    1620

gagagctcaa tcaaactcca aaggacagag tagctcagga attgacaaag taccggtgtt    1680

tcctggtcat gtggcatttt cgacag                                         1706

Claims (9)

1、野生稻的一个抗旱基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的抗旱基因，其特征在于：所述抗旱基因具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。

3、权利要求1所述抗旱基因编码的蛋白，其特征在于：是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物抗旱性的蛋白质。

4、根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白具有序列表中的SEQ ID №：1氨基酸残基序列。

5、含有权利要求1所述基因的表达载体。

6、含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求1所述基因的宿主菌。

8、一种培育抗旱植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1所述的抗旱基因导入植物细胞，获得对干旱耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述被转化的植物宿主为水稻。

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