CN101490079B - 植物生长和耐逆性相关同功酶及其编码基因与应用 - Google Patents

植物生长和耐逆性相关同功酶及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101490079B
CN101490079B CN2006800553785A CN200680055378A CN101490079B CN 101490079 B CN101490079 B CN 101490079B CN 2006800553785 A CN2006800553785 A CN 2006800553785A CN 200680055378 A CN200680055378 A CN 200680055378A CN 101490079 B CN101490079 B CN 101490079B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
sequence
seq
dmyvvp1
stress tolerance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2006800553785A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101490079A (zh
Inventor
陈蕾
徐健勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIFANGJIESHI BIOLOGICAL SCIO-TECH Co Ltd BEIJING
Original Assignee
BEIFANGJIESHI BIOLOGICAL SCIO-TECH Co Ltd BEIJING
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIFANGJIESHI BIOLOGICAL SCIO-TECH Co Ltd BEIJING filed Critical BEIFANGJIESHI BIOLOGICAL SCIO-TECH Co Ltd BEIJING
Publication of CN101490079A publication Critical patent/CN101490079A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101490079B publication Critical patent/CN101490079B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关同功酶蛋白及其编码基因与应用。该植物耐逆性相关同功酶蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1和№：2；2)将序列表中SEQ ID №：1和№：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的蛋白质。本发明的蛋白及其编码基因能增强植物的生长，增强植物对逆境的耐性。

Description

植物生长和耐逆性相关同功酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域中一种与植物生长和耐逆性相关的同功酶及其编码基因和应用，特别涉及两个来源于大米草(Spartinaanglica)的与植物生长和耐逆性相关的叶泡H+-焦磷酸酶同功酶(vacular H+-pyrophosphatase)及其编码基因和应用。
背景技术
自然界的植物经常会遭受干旱、盐碱和低温等恶劣环境的胁迫危害，使其生长发育受到抑制，甚至导致植株死亡。植物对胁迫的抵抗或忍耐能力称为耐逆性，是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性。多年来，人们从各个角度对植物与逆境胁迫之间的关系进行了研究。从最初的生理现象的研究到生态、遗传的研究，再到生理生化、代谢的研究，己积累了丰富的资料。特别是随着分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐性机理，并且为利用基因工程手段改良植物抗盐胁迫性能开拓了新的途径。由于植物耐逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的耐逆性十分困难，随着分子生物学的发展，通过基因工程手段改良植物的耐逆性开辟了植物耐逆育种的新途径。
叶泡占整个植物细胞总体积的40％-99％(Rea，P.A.，etal.，Tonoplast Adenosine Triphosphate and InorganicPyrophosphatase.In：Methods Plant Biochem.，pp.385-405，Academic Press Limited，London(1990)).它是细胞内一个相对独立的腔室，负责储存营养物质，维持胞质pH值的稳定，隔离细胞内有毒的阴阳离子，维持细胞的膨压，调控胞质中的第二信使Ca离子浓度等等，在植物细胞的生理生化过程中起着重要作用。氢质子泵定位在叶泡膜上向叶泡内泵入氢质子(Rea，P.A.，et al.，Tonoplast Adenosine Triphosphateand inorganic Pyrophosphatase.In：Methods Plant Biochem.，pp.385-405，Academic Press Limited，London(1990)).由此所产生的叶泡膜内外的PH和电势差为叶泡内外离子的运输提供了主要的能量来源。定位在叶泡的氢质子泵有两种：叶泡H+-ATP酶(vacular ATPase)和H+-焦磷酸酶(H+-PPase)(Davies，J.M.，et al.，The Bioenergetics ofVacuolar H.sup.+Pumps.In：Plant Vacuole，pp.340-363，Leigh，R.A.，Sanders，D.(eds.)，Academic Press，San Diego(1997)).V-ATPase是由至少26个基因编码的亚基组成(Sze H，Schumacher K，Muller ML，Padmanaban S，Taiz L(2002)A simple nomenclature fora complex proton pump：VHA genes encode the vacuolar H_-ATPase.Trends Plant Sci 7：157-161)，H+-PPase由单基因编码，在拟南芥里分别有两个H+-PPase基因：AVP1(V.Sarafian，Y.Kim，R.J.Poole，P.A.Rea，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，1775(1992).)和AVP2(N.Mit suda，K.Enami，M.Nakata，K.Takeyasu，M.H.Sato，FEBSLett.488，29(2001).)，前者定位在叶泡膜上，两者在蛋白水平的同源性是35％。过量表达AVP1基因可使转基因植物的叶泡上各种泵蛋白的活性增强，如Ca/H+，Na/H+泵等，从而增强转基因植物耐旱，耐盐的能力(Gaxiola RA，Li J，Undurraga S，Dang LM，Allen GJ，Alper SL，Fink GR(2001)Drought-and salt-tolerant plants result fromoverexpression of the AVP1 H_-pump.Proc Natl Acad Sci USA 98：11444-11449)。同时，最新研究表明AVP1也定位在细胞膜上，过量表达AVP1可增加细胞膜上P-ATPase的数量，细胞膜外酸性增强，从而加大细胞生长激素向细胞内的运输，促进植物各器官的发育和生长(Science.2005Oct 7；310(5745)：121-5.Arabidopsis H+-PPase AVP1 regulatesauxin-mediated organ development.Li J，Yang H，Peer WA，RichterG，Blakeslee J，Bandyopadhyay A，Titapiwantakun B，Undurraga S，Khodakovskaya M，Richards EL，Krizek B，Murphy AS，Gilroy S，Gaxiola R.)。
发明公开
本发明的目的是提供两个与植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白有两个，名称分别为DMYVVP1和DMYVVP2，来源于大米草，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)序列表中的SEQ ID №：2；
3)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长和耐逆性相关的蛋白质；
4)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生长和耐逆性相关的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由764个氨基酸残基组成。DMYVVP1的自序列1的氨基端第69位至第749位氨基酸残基是H+-焦磷酸酶结构域。
序列表中的序列2由772个氨基酸残基组成。DMYVVP2的自序列2的氨基端第55位至第758位氨基酸残基是H+-焦磷酸酶结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白编码基因(dmyvvp1和dmyvvp2)也属于本发明的保护范围。
上述植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；
2)序列表中SEQ ID №：4的DNA序列；
3)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；
4)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
5)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
6)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在1×SSC，0.1％SDS的溶液中，在56℃下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №：3由2603个脱氧核苷酸组成，自5′第26位至2320位脱氧核苷酸为编码序列。
其中，序列表中的SEQ ID №：4由2563个脱氧核苷酸组成，自5′第41位至2359位脱氧核苷酸为编码序列。
含有本发明基因的表达载体、细胞系、宿主菌及表达盒均属于本发明的保护范围。
利用现有分子生物学的方法可以得到含有dmyvvp1和dmyvvp2的表达载体，如pC2300::dmyvvp1和pC2300::dmyvvp2(物理图谱如图1和图2所示)。
所述表达盒包括植物启动子、dmyvvp1和dmyvvp2基因和终止子。所述植物启动子可为组成型、诱导型或组织特异性启动子。
本发明的dmyvvp1和dmyvvp2基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，其中，单子叶植物可为草坪草、小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米等，双子叶植物可为马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油料种子、甜菜或向日葵等。
携带有本发明的dmyvvp1和dmyvvp2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的材料经组织培养成植株。
本发明的dmyvvp1和dmyvvp2基因通过与具有特定功能的启动子进行功能性连接可广泛用于培育生长增强和耐逆转基因植物。
附图说明
图1为dmyvvp1植物表达载体物理图谱
图2为dmyvvp2植物表达载体物理图谱
图3为转pC2300::dmyvvp1烟草的PCR验证照片
图4为转pC2300::dmyvvp2烟草的PCR验证照片
实施发明的最佳方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。除非有其它说明，本发明的实施使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学，和克隆技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Sambrook and Russell″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″(2001)；Cloning：A Practical Approach，″Volumes I andII(D.N.Glover，ed.，1985)；″王关林、方宏筠，“植物基因工程”第二版，2002年第2版。
实施例1、DMYVVP1和DMYVVP2及其编码基因的获得
以液氮研碎-70℃保存的大米草叶片，每0.1g的植物叶片中加入1mlTRIZOL RNA提取液(鼎国生物技术公司)，并按供应商提供的方案进行总RNA的提取。将得到的总RNA用DNase酶(Prmega，America)消化，以去除残存的DNA，以分光光度计(Eppendorf公司，德国)检测样品中总RNA的浓度。取1μg总RNA用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应，扩增DMYVVP1的cDNA片段。根据已知的H+-焦磷酸酶蛋白保守区域设计兼并引物，引物为：F1：5′--(A/G)GC(A/T/G)GC(C/T)GATGT(G/T/C)GGTGC--3′；R1：5′--(A/T/G/C)CC(T/A)CC(A/G)GC(A/G)TT(A/G)TCACT--3′。25ul PCR反应体系为：1μgcDNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM引物F1和1μM引物R1，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增得到的约780bp DNA片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，用pGEM-Teasyvector系统(Promega公司，美国)按试剂盒提供的方案克隆该片段，测序(三博远志生物技术公司)，得到两条高度同源序列，序列分析表明这两段序列都是H+-焦磷酸酶蛋白基因的保守区片段，由此初步推断大米草至少有两个H+-焦磷酸酶。根据这两条保守区段分别设计5’RACE和3’RACE的特异性引物，取1μg总RNA进行5’RACE和3’RACE。RACE程序按照宝生物工程(大连)有限公司提供的5’RACE和3’RACE试剂盒的说明书进行。其中DMYVVP1的5’RACE的引物为：磷酸化RT引物：5’-GCAGCGCAGGAAGA-3’，S2：5’-CTCTCAACTTTGCCAACAAGATCA-3’，S1：5’-GATCATCCTCGGGGATGTTCCT-3’，A1：5’-CGTTGGTGACAATGTCGGTGACA-3’，A2：5’-TGTCGGTGACATTGCTGG-3’。以磷酸化RT引物进行反转录反应，再以S1和A1为引物进行第一轮扩增，然后再用稀释100倍的第一轮PCR产物作模板，以S2和A2为引物进行第二轮PCR扩增。25ul PCR反应体系为：1μg cDNA、1.5mM MgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM正向及反向引物，以及1个单位的Pfu酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循。其中，第一轮PCR反应条件：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。第二轮PCR反应条件：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。
DMYVVP1的3’RACE的5’端引物为：5’-CTTGTTGGCAAAGTTGAGAGGAA-3’，3’端引物为：5’-CTCGAGTCTAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。反应条件：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。
所得5’-RACE和3’-RACE产物经克隆测序，合成引物，以1μg大米草叶片总RNA用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法反转录得到的cDNA为模板，克隆DMYVVP1基因的cDNA。合成的引物为5’引物F2：5’-gatatcGGTTAAGGTTCTGGTGGCCG(末端带有EcoR V位点)，3’引物R2：5’-ctcgagGGCAGGAGTTATTTGTGATG(末端带有XhoI位点)；25ul PCR反应体系为：1μg cDNA、1.5mM MgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM F2和1μMR2，以及1个单位的Pfu酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增DMYVVP1基因的cDNA：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增得到的片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，插入pGEM-T载体(promega)，测序(三博远志生物技术公司)，测序结果表明该片段大小为2603bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列，名称为DMYVVP1；序列分析表明该cDNA的自5′第26位至2320位脱氧核苷酸编码具有序列1的氨基酸残基序列的DMYVVP1。DMYVVP1的自序列1的氨基端第69位至第749位氨基酸残基是H+-焦磷酸酶结构域。将含有该dmyvvp1基因的质粒命名为pGEM::dmyvvp1。
DMYVVP2的5’RACE的引物为：磷酸化RT引物：5’-AGCAAGGCTGAAGC-3’，S2：5’-AACGACAAGAGCAGCACA-3’，S1：5’-AAAGGGTGGTTATCAAGC-3’，A1：5’-AGAGCCAGCCCTCAAGAA-3’，A2：5’-CTGCCGTGATGACTGTTG-3’。以磷酸化RT引物进行反转录反应，再以S1和A1为引物进行第一轮扩增，然后再用稀释100倍的第一轮PCR产物作模板，以S2和A2为引物进行第二轮PCR扩增。25ul PCR反应体系为：1μg cDNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mMdNTP混合物、1μM正向及反向引物，以及1个单位的Pfu酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循。其中，第一轮PCR反应条件：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。第二轮PCR反应条件：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。
DMYVVP2的3’RACE的5’端引物为：5’-TGAAATAGAGCCAGCCCTCA-3’，3’端引物为：5’-CTCGAGTCTAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。反应条件：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。
所得5’-RACE和3’-RACE产物经克隆测序，合成引物，以1μg大米草叶片总RNA用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)按试剂盒的方法反转录得到的cDNA为模板，克隆DMYVVP2基因的cDNA。合成的引物为5’引物F3：5’-gatatcAAAGACCCAAGCGCTTCG(末端带有EcoR V位点)，3’引物R3：5’-ctcgagGGATTCGTCATCATAATAAATTC(末端带有XhoI位点)；25ul PCR反应体系为：1μg cDNA、1.5mM MgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM F2和1μMR2，以及1个单位的Pfu酶(上海申能博彩生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增DMYVVP1基因的cDNA：94℃预变性5分钟；再94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增得到的片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，插入pGEM-T载体(promega)，测序(三博远志生物技术公司)，测序结果表明该片段大小为2563bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列，名称为DMYVVP2；序列分析表明该cDNA的自5′第41位至2359位脱氧核苷酸编码具有序列1的氨基酸残基序列的DMYVVP2。DMYVVP2的自序列1的氨基端第55位至第758位氨基酸残基是H+-焦磷酸酶结构域
实施例2、DMYVVP1和DMYVVP2植物表达载体构建和转基因烟草的生长情况及耐逆实验
用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，Fjellstrom RG，ElliottLF.，A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCRand RAPD analyses.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11；23(13)：2569-70.)提取水稻基因组DNA，具体方法如下：取水稻叶片，以液氮研磨，每1克的植物材料中加入5毫升经68℃预热的CTAB溶液(用前加10mM巯基乙醇)，60℃加热30分钟。然后加入等体积氯仿：异戊醇，15000g离心15分钟，取上清。在上清液中加入2/3倍体积的异丙醇，混匀，用注射针针尖将DNA丝搅出置于新管中，再加入75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁，然后将乙醇吸干，空气烘干剩余的乙醇，加入TE溶解DNA。并于-20℃保存。用PCR方法扩增水稻actin基因的启动子序列。25ul PCR反应体系含有100ng基因组DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Actin-S和1μM actin-A，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环：先94℃5分钟；再94℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。Actin-S：5’-gatatcTCTTCTACCTACAAAAAAGCTCC-3’(末端带有EcoR V位点)，actin-A：5’-gatatcGTCATTCATATGCTTGAG-3’(末端带有EcoR V位点)。将扩增得到的约1398bp长的DNA片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，插入pGEM-T载体(promega)，测序(三博远志生物技术公司)，得到质粒pGEM::Pactin。
用PCR方法扩增水稻actin基因的3’末端序列。25ul PCR反应体系含有100ng基因组DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Tactin-S和1μM Tactin-A，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环：先94℃5分钟；再94℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。Tactin-S：5’-aaagtcgacCTTCGGACCCAAGAATGCTA-3’(末端带有Sal I位点)，Tactin-A：5’-aaagtcgactctagaCGAGCTCGAATTCGTAATCA-3’(末端带有Sal I和Xba I位点)。将扩增得到的约1430bp长的DNA片段用凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，插入pGEM-T载体(promega)，测序(三博远志生物技术公司)，得到质粒pGEM::Tactin。
将质粒pGEM::Tactin用Sal I酶切下含水稻actin基因的3’末端序列的片段插入pGEM::dmyvvp1的Xho I位点，得到质粒pGEM::dmyvvp1-Tactin。
将质粒pGEM::Pactin用EcoR V酶切下含水稻actin基因的启动子序列片段插入pGEM::dmyvvp1-Tactin的EcoR V位点，得到质粒pGEM::P-dmyvvp1-T。
用Sal I和Xba I酶切pGEM::P-dmyvvp1-T，将得到的dmyvvp1表达盒，克隆到pCAMBIA2300(CAMBIA公司)的Sal I和Xba I酶识别位点之间，得到dmyvvp1的植物表达载体pC2300::dmyvvp1，质粒图如图1所示，在此载体中dmyvvp1受水稻actin启动子的调控。将pC2300::dmyvvp1转化根癌农杆菌LBA4404，得到含有pC2300::dmyvvp1的农杆菌菌株，命名为TpCdvp1，将质粒pCAMBIA2300转化根癌农杆菌LBA4404，得到含有pCAMBIA2300空载体的菌株，命名为TpCAMBIA2300。
同样，将质粒pGEM::Tactin用Sal I酶切下含水稻actin基因的3’末端序列的片段插入pGEM::dmyvvp2的Xho I位点，得到质粒pGEM::dmyvvp2-Tactin。
将质粒pGEM::Pactin用EcoR V酶切下含水稻actin基因的启动子序列片段插入pGEM::dmyvvp2-Tactin的EcoR V位点，得到质粒pGEM::P-dmyvvp2-T。
用Sal I和Xba I酶切pGEM::P-dmyvvp2-T，将得到的dmyvvp2表达盒，克隆到pCAMBIA2300(CAMBIA公司)的Sal I和Xba I酶识别位点之间，得到dmyvvp2的植物表达载体pC2300::dmyvvp2，质粒图如图2所示，在此载体中dmyvvp2受水稻actin启动子的调控。将pC2300::dmyvvp2转化根癌农杆菌LBA4404，得到含有pC2300::dmyvvp2的农杆菌菌株，命名为TpCdvp2，将质粒pCAMBIA2300转化根癌农杆菌LBA4404，得到含有pCAMBIA2300空载体的菌株，命名为TpCAMBIA2300。
用无菌刀片将烟草无菌苗叶片切成四边长约1cm的叶盘，分别在O.D.值为1的TpCdvp1、TpCdvp2和TpCAMBIA2300(转空载体对照)菌液中浸泡10分钟，转接入共培养培养基(MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L，pH 5.2)，于25℃暗培养3天，再转入继代培养基(MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸0.1mg/L、羧苄青霉素250mg/L、蔗糖30g/L，pH 5.8)中光照培养三天，转入筛选培养基(MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸0.1mg/L、羧苄青霉素250mg/L、卡那霉素75mg/L、蔗糖30g/L，pH 5.8)；继续培养7天，再转入再生培养基(MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、羧苄青霉素250mg/L、卡那霉素75mg/L、蔗糖30g/L，pH 5.8)。待叶片边缘长出丛生再生芽至2-3cm时，用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基(MS基本培养基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH 5.8。)中培养20天，共得到21棵转pC2300::dmyvvp1植株、24棵转pC2300::dmyvvp2植株和13株转pCAMBIA2300植株。
用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，Fjellstrom RG，ElliottLF.，A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCRand RAPD analyses.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11；23(13)：2569-70.)分别提取转pC2300::dmyvvp1、pC2300::dmyvvp1和pCAMBIA2300烟草基因组DNA。分别以100ng提取的基因组DNA为模板分别用引物F2和R4：TGCAATACCAGCGGTCATCA进行PCR反应扩增dmyvvp1基因，用引物F3和R5：CAGCAATATCTCCAACATTATCACC进行PCR反应扩增dmyvvp2基因。反应体系为25ul，含有100ng基因组DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM F2和1μM R2，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环：先94℃5分钟；再94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增产物进行电泳，结果如图3和图4所示，转pC2300::dmyvvp1烟草扩增产物在预计的约1150bp处有清晰的条带，转pC2300::dmyvvp2烟草扩增产物在预计的约900bp处有清晰的条带，而转pCAMBIA2300(空载体对照)烟草无PCR产物条带。图3中，泳道1为转pCAMBIA2300烟草的PCR扩增产物；泳道2为pC2300::dmyvvp1质粒的PCR扩增产物；泳道3为转pC2300::dmyvvp1烟草的PCR扩增产物；泳道M为1kbDNA分子量标准。
图4中，泳道1为转pCAMBIA2300烟草的PCR扩增产物；泳道2为pC2300::dmyvvp2质粒的PCR扩增产物；泳道3为转pC2300::dmyvvp2烟草的PCR扩增产物；泳道M为1kbDNA分子量标准。
在生根培养基(MS基本培养基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH 5.8。)中培养30天的转pC2300::dmyvvp1烟草和转pC2300::dmyvvp2烟草与转pCAMBIA2300(空载体对照)烟草相比，转pC2300::dmyvvp1和pC2300::dmyvvp2烟草主根及从根数多，主根长，植株的干物质更重。
将转pC2300::dmyvvp1、pC2300::dmyvvp2烟草和转pCAMBIA2300(空载体对照)烟草载于营养钵中用10倍稀释的MS营养液隔一天浇灌一次，4周后，停止浇灌，观察发现转pC2300::dmyvvp1、pC2300::dmyvvp2烟草比较转pCAMBIA2300烟草蔫萎程度慢，10天后复水，转pC2300::dmyvvp1、pC2300::dmyvvp2烟草比转pCAMBIA2300烟草恢复得更快。该实验表明转pC2300::dmyvvp1、pC2300::dmyvvp2烟草有更强的耐旱性。
工业应用
实验表明，本发明的蛋白及其编码基因能增强植物的生长，增强植物对逆境，特别是干旱胁迫的耐性。该基因将广泛用于培育耐逆转基因植物，具有深远的理论意义及广泛的实践意义。
Figure ISB00000575161700021
Figure ISB00000575161700031
Figure ISB00000575161700041
Figure ISB00000575161700061
Figure ISB00000575161700071
Figure ISB00000575161700081
Figure ISB00000575161700091

Claims (9)

1.一种植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白，是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)序列表中的SEQ ID №：2。
2.权利要求1所述的植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白的cDNA基因，是下述核苷酸序列之一：
1)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；
2)序列表中SEQ ID №：4的DNA序列。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述基因的细胞系。
7.含有权利要求3或4所述基因的宿主菌。
8.含有权利要求3或4所述基因的表达盒。
9.权利要求1-4所述的植物生长和耐逆性相关同功酶蛋白或编码基因在培育耐早性植物申的应用。
CN2006800553785A 2006-07-17 2006-07-17 植物生长和耐逆性相关同功酶及其编码基因与应用 Active CN101490079B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2006/001723 WO2008022486A1 (fr) 2006-07-17 2006-07-17 Isozyme liée à la croissance végétale et à la tolérance au stress, gène codant et utilisation de ces derniers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101490079A CN101490079A (zh) 2009-07-22
CN101490079B true CN101490079B (zh) 2012-08-22

Family

ID=39106458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800553785A Active CN101490079B (zh) 2006-07-17 2006-07-17 植物生长和耐逆性相关同功酶及其编码基因与应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101490079B (zh)
WO (1) WO2008022486A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ601341A (en) 2010-01-22 2014-02-28 Bayer Ip Gmbh Acaricide and/or insecticide active substance combinations
WO2013020985A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
CN208734792U (zh) 2014-09-24 2019-04-12 西门子公司 用于支撑电气设备的装置
CN113817038B (zh) * 2021-10-29 2023-09-19 海南大学 来源于小豆的蛋白VaVPAC及其编码基因在增强烟草抗旱性方面的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045494A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Basf Plant Science Gmbh Pyrophosphatase stress-related proteins and methods of use in plants
EP1114866A2 (en) * 1990-11-08 2001-07-11 Aventis CropScience GmbH Plasmids for the production of transgenic plants that are modified in habit and yield
CN1399512A (zh) * 1999-11-10 2003-02-26 康涅狄格州大学 能在盐化土壤中生长的抗胁迫、超大转基因植物
CN1772899A (zh) * 2005-05-09 2006-05-17 中国科学院植物研究所 野生稻的一个抗旱基因及其编码蛋白与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7534933B2 (en) * 2000-08-18 2009-05-19 University Of Connecticut Transgenic plants overexpressing a plant vacuolar H + -ATPase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1114866A2 (en) * 1990-11-08 2001-07-11 Aventis CropScience GmbH Plasmids for the production of transgenic plants that are modified in habit and yield
CN1399512A (zh) * 1999-11-10 2003-02-26 康涅狄格州大学 能在盐化土壤中生长的抗胁迫、超大转基因植物
WO2001045494A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Basf Plant Science Gmbh Pyrophosphatase stress-related proteins and methods of use in plants
CN1772899A (zh) * 2005-05-09 2006-05-17 中国科学院植物研究所 野生稻的一个抗旱基因及其编码蛋白与应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008022486A1 (fr) 2008-02-28
CN101490079A (zh) 2009-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102191254A (zh) 调节植物胁迫抗性的cbf转录因子及其编码基因和应用
CN109825510A (zh) 一种岷江百合LrWRKY2基因及应用
CN101490079B (zh) 植物生长和耐逆性相关同功酶及其编码基因与应用
CN109666681A (zh) 植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26及其编码基因和应用
CN112626069B (zh) 大豆gma-miR4359b基因、其表达载体、制备方法及其应用
CN101302523B (zh) 生理时钟调控蛋白lhy在培育耐逆植物中的应用
CN105400814B (zh) 一种培育抗虫转基因玉米的方法
CN1313486C (zh) 一种植物dreb转录因子及其编码基因与应用
CN104140462B (zh) 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用
CN103588867B (zh) 大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用
CN103172716A (zh) 植物抗热基因及其应用
CN109486833A (zh) 一种岷江百合LrWRKY25基因及应用
CN102050870A (zh) 胡杨scl7基因的鉴定及其功能研究
CN107384935B (zh) 一种冰缘植物蛋白及其编码序列与应用
CN112813092B (zh) GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用
CN109988775B (zh) 一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5及其应用
CN102952821B (zh) 紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体及其应用
CN102382841A (zh) 胡杨PeNHX1/3/6基因功能分析与利用
CN111500595A (zh) 一种木麻黄基因CeDREB1及其应用
CN101538321B (zh) 一种植物erf转录因子及其编码基因与应用
CN1982334A (zh) 胡杨PeDREB2基因及应用
CN105368848B (zh) 一种人工合成的抗虫基因及其应用
CN110643617A (zh) 一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法
CN105566466B (zh) 一种互花米草耐盐蛋白hkt及其编码基因和应用
CN102146139A (zh) 一种合成海藻糖的融合蛋白及其在培育矮化草坪草中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Beijing Guardian Technology Co., Ltd.

Document name: Notification that Application Deemed not to be Proposed

DD01 Delivery of document by public notice
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Beijing Guardian Technology Co., Ltd.

Document name: Notification that Application Deemed not to be Proposed

DD01 Delivery of document by public notice
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: BEIJING NORTH ELITE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Document name: payment instructions