CN102952821B - 紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体及其应用 - Google Patents
紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿铝诱导的苹果酸通道蛋白基因的植物表达载体pK2-35S-MsALMT1，其为含有花椰菜花叶病毒的组成型启动子(35S)和紫花苜蓿铝诱导的苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体。从紫花苜蓿中扩增出MsALMT1基因，用组成型启动子控制它在烟草中过量表达，提高烟草抗铝毒的能力。实验表明转MsALMT1基因烟草在含有30μM的AlCl3溶液中胁迫生长24h后，转基因烟草的根尖分泌的苹果酸和抗铝能力均显著性高于野生型对照植物，而根尖铝含量显著性低于野生型植物。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物抗铝毒胁迫能力的紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体pK2-35S-MsALMT1及其在制备降低铝吸收和抗铝毒能力增强的转基因植株中的应用。
背景技术
铝毒是酸性土壤中植物生长和作物产量的主要限制因素。酸性土壤占世界可耕种土壤的30%，主要分布在南非、中亚和东南亚等对粮食需求量最大的发展中国家。我国的酸性土壤主要分布在长江以南的热带、亚热带及云贵川等地区，面积达204万公顷，大部分土壤的pH值小于5.5，其中很大一部分小于5.0。农业上通常靠施加生石灰以缓解酸性土壤中的铝毒问题，然而这种方法只能改良表层土壤，并不能改变深层土壤的pH值，且耗费大量的经济和人力。因此，在降低土壤酸度的同时，挖掘植物自身的抗铝潜力，利用基因工程手段在植物中过量表达抗铝基因，是解决酸性土壤中铝毒害和农业生产可持续发展的有效策略。
铝诱导的植物根尖苹果酸的分泌是植物抗铝的主要机制，苹果酸的分泌由苹果酸通道蛋白基因（ALMT1）所控制。ALMT1是一类含有UPF0005结构域且具有5-7个跨膜结构域的跨膜蛋白。TaALMT1是从耐铝小麦（Triticum aestivum）ET8中克隆得到的第一个植物耐铝基因，生理及电生理实验发现，铝耐受性小麦品种在铝胁迫下有机酸的分泌是通过开启有机酸阴离子通道来实现。如抗铝小麦ET8主要的抗铝基因TaALMT1在水稻和烟草细胞中异源表达后引起铝诱导的苹果酸外流，因而提高烟草细胞的耐铝能力。将TaALMT1基因转入大麦中过量表达，转基因大麦具有与ET8相似的苹果酸分泌和抗铝毒能力。如Delhaize等发现表达TaALMT1的转基因大麦具有一个铝激活的苹果酸流，当转基因大麦收到铝胁迫时可以增加苹果酸分泌和对铝毒的抗性。进一步的研究发现转基因大麦在酸性土壤上可以更有效的吸收磷元素，产量也比非转基因株系高。Pereira等在小麦种过量表达TaALMT1基因，结果9个T2代转基因株系的TaALMT1表达增强，苹果酸的分泌量和铝耐受性显著提高。一些T2代转基因株系在含有铝溶液和土壤中培养时铝耐受性都高于抗铝小麦品种ET8,。抗铝油菜品种中铝诱导根的苹果酸分泌与BnALMT1和BnALMT2的高表达有关。过量表达BnALMT1和BnALMT2的转基因烟草细胞在铝胁迫下苹果酸分泌比野生型细胞高8-11倍，鲜重增加3-4倍。AtALMT1是拟南芥的重要抗铝基因之一，该基因的突变使其对铝敏感性增加。Ryan等的研究证实过表达AtALMT1的转基因拟南芥RRG比野生型高大约3倍。然而，值得我们关注的是，目前用于转基因的ALMT1基因的植物来源还很不广泛，基因均来源于单一的抗铝或模式植物。紫花苜蓿由于产草量高、茎叶富含蛋白质和适口性好等特点而被称为“牧草之王”，在我国广泛种植。渝苜一号为西南大学玉永雄教授培育的具有耐湿、耐贫瘠且在西南地区广泛种植的苜蓿新品种。我们的前期研究结果发现，在紫花苜蓿渝苜一号根中，铝诱导了MsALMT1基因的上调表达和苹果酸的分泌。为了进一步开发该基因在植物抗铝中的应用，本发明使用紫花苜蓿渝苜一号的根为材料，克隆获得了铝诱导的苹果酸通道蛋白基因（MsALMT1）。本发明通过Gateway技术构建了植物表达载体pK2-35S-MsALMT1，通过叶盘转化法成功将MsALMT1基因转入烟草中实现了过表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植物抗铝毒能力基因的植物表达载体，该载体是含有来自于紫花苜蓿根中的铝诱导的苹果酸通道蛋白基因（即MsALMT1基因）的植物表达载体；同时提供该载体的构建方法，以及该载体在制备降低铝吸收和提高抗铝能力的转基因植物中的应用。
本发明所提供的用于提高植物抗铝能力的载体，是具有组成型启动子和苹果酸通道蛋白基因cDNA的植物表达载体。
上述载体中，所述的苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的cDNA来源于紫花苜蓿铝敏感性栽培种渝苜一号（Medicago sativa L.cv.YM1），所述的来源于紫花苜蓿的苹果酸通道基因MsALMT1的GenBank登录号为GU550122。
上述苹果酸通道蛋白基因cDNA的上游为CaMV 35S的组成型启动子。
本发明中用于构建所属植物表达载体的起始载体为pK2GW7（购自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology，VIB）。
本发明的上述植物表达载体pK2-35S-MsALMT1由下述方法构建而成：
（1）根据MtALMT1的ORF设计的引物为：
上游引物：5′- GGATCCATGGTGTCTGAACCAAATTCAAG-3’（BamHI）
下游引物：5’- AAGCTTTAGTTAATTATAATAACATGTTG -3’（HindIII）
上游引物5’端加GGATCC特征序列，并由此形成BamHI酶切位点；下游引物3’加AAGCTT特征序列，形成HindIII酶切位点，以紫花苜蓿第一链cDNA为模板扩增，得到MsALMT1基因的全长cDNA；
2）回收并纯化MsALMT1全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-MsALMT1。对该质粒进行测序，结果发现与MtALMT1具有95%的相似性，NCBI的登录号为GU550122；
（3）构建中间载体pENTRTM2B- MsALMT1，用BamHI和HindIII酶切pMD18-MsALMT1和pENTR*-PrbcS-*T-GFP（Invitrogen）得到目的基因片段和载体片段pENTRTM-2B，回收后进行连接、转化感受态细胞，得到重组载体pENTRTM2B- MsALMT1；
（4） 构建植物表达载体pK2-35S-MsALMT1，通过Gateway技术的LR反应把MsALMT1亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得MsALMT1基因的植物表达载体pK2-35S-MsALMT1。
本发明另一目的是将重组载体pK2-35S-MsALMT1在制备吸收和抗铝毒能力增强的转基因植株中的应用。
本发明利用组成型CaMV 35S启动子构建MsALMT1基因的植物表达载体，以便在转基因植物中过量表达苹果酸通道蛋白基因，由于该基因编码了铝诱导的苹果酸通道蛋白，因此增强了植物苹果酸分泌的同时，也提高了转基因植物的抗铝能力和降低了植物根尖对铝的吸附。
附图说明
图1是本发明中间载体pMD18-MsALMT1的构建策略示意图；
图2是本发明中中间载体pENTRTM2B-MsALMT1的构建策略示意图；
图3是本发明中间载体pMD18-MsALMT1的构建和检测；其中A是MsALMT1的PCR扩增产物，图中：1为使用铝处理的植物根提取的RNA反转录合成cDNA第一链为模板的扩增产物；2为以水为负对照；M为Maker III；B是重组质粒pMD18-MsALMT1的酶切检测，图中：1为BamHI和HindIII酶切pMD18-MsALMT1产物；M为Maker III。
图4是本发明中间载体pENTRTM2B-MsALMT1的检测电泳示意图；其中A是 pENTRTM2B-MsALMT1的质粒提取电泳检测图，图中：1-3为pENTRTM2B-MsALMT1的质粒，M为Maker III；B是pENTRTM2B-MsALMT1的质粒酶切检测示意图，图中1为SalI和XbaI的双酶切检测，2为BamHI和HindIII的双酶切检测，3为pENTRTM2B-MsALMT1的质粒对照，M为Maker III。
图5是本发明中用Gateway的LR反应构建MsALMT1基因的植物表达载体的策略示意图。
图6 是本发明中MsALMT1植物表达载体pK2-35S-MsALMT1的检测电泳示意图；其中A是重组质粒pENTRTM2B-MsALMT1和pK2GW7质粒电泳图，图中：1为中间克隆载体pENTRTM2B-MsALMT1，2和3为植物表达载体pK2GW7，M为Maker III；B是植物表达载体pK2-35S-MsALMT1的质粒提取电泳示意图，图中：1-4为pK2-35S-MsALMT1质粒，5为pK2GW7质粒，M为Maker III。
图7是本发明中MsALMT1植物表达载体pK2-35S-MsALMT1的农杆菌转化子菌落的检测电泳示意图；其中A是pK2-35S-MsALMT1质粒双酶切检测电泳示意图，图中1为BamHI和HindIII双酶切，M为Maker III；B是农杆菌菌落PCR检测pK2-35S-MsALMT1的转化农杆菌的效果示意图，图中1-5为转化子，6为pK2-35S-MsALMT1质粒正对照，7为pK2GW7负对照， M为Maker III。
图8是本发明中MsALMT1转基因烟草的中基因组水平和转录水平的检测示意图；其中A是转基因植物的基因组水平的检测电泳图，图中：M为Maker III，1为以pK2-35S-MsALMT1为模板进行PCR的正对照，2为WT植物，3为转基因株系A4，4为转基因株系A5，5为转基因株系A6，6为转基因株系A9；B是RT-PCR分析转基因植物MsALMT1的表达水平电泳图，图中：A5-A9为转基因株系，WT为野生型烟草。
图9是本发明中转基因和野生型植物根尖苹果酸分泌量结果比较示意图，图中：+Al为0.5 mM CaCl2（pH4.2）的处理液中添加30μM AlCl3处理24 h，-Al为不添加AlCl3的CaCl2溶液（pH4.2）处理24 h，WT为野生型烟草，A5-A9为转基因株系。
图10 是本发明中转基因和野生型烟草的抗铝能力--铝胁迫下根的相对生长率分析比较示意图；图中WT为野生型烟草，A5-A9为转基因株系。
图11是本发明中转基因和野生型烟草的抗铝能力--铝胁迫后根尖铝含量分析比较示意图；
WT为野生型烟草，A5-A9为转基因株系。
具体实施方式
本实施例中采用的试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。
所用仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：MsALMT1基因cDNA扩增、TA克隆和序列分析
由于模式植物截形苜蓿和紫花苜蓿具有很高的相似性，因此根据NCBI上公布的截形苜蓿的铝诱导的苹果酸通道蛋白的基因序列（MtALMT1，ABD32183），设计引物如下：
上游引物：5′- GGATCCATGGTGTCTGAACCAAATTCAAG-3’（BamHI）
下游引物：5’- AAGCTTTAGTTAATTATAATAACATGTTG -3’（HindIII）
上游引物5’端加GGATCC特征序列，并由此形成BamHI酶切位点；下游引物3’加AAGCTT特征序列，形成HindIII酶切位点。
铝敏感性紫花苜蓿YM1经铝处理24 h后，剪取0.1g根，使用液氮研磨后加入1ml的TRIzoL提取液，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA，取1μl电泳检测。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT) 50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于72℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。
以cDNA为模板，用MsALMT1基因上下游特异性引物进行PCR，扩增得到全长MsALMT1的序列 (图3A)。切胶回收并纯化MsALMT1全长基因片段，并将其连接到pMD-18T (大连宝生物公司)载体上（图1），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（天根生化科技），采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的双酶切并测序和测序。根据阳性重组质粒pMD18-MsALMT1载体两端的多克隆位点，用BamHI和HindIII双酶切重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD18-MsALMT1单酶切产物理论上为1.4kb左右的条带（图3B）。测序结果表明，MsALMT1的全长序列为1347 bp，且编码了一个编码由448个氨基酸组成的跨膜蛋白（上传至NCBI的登录号为GU550122）。使用CLUSTAL（http://clustalw.genome.jp）对MsALMT1预测的蛋白与其他已知的抗铝基因编码的蛋白如BnALMT1，BnALMT2，AtALM1和TaALMT1序列比对发现，它们均具有一个ALMT1结构域，且具有极高的相似性。
实施例2：构建中间载体pENTRTM2B-MsLAMT1
用HindIII和BamHI 双酶切pMD18-MsALMT1和pENTR*-PrbcS-*T-GFP载体（图2），通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，分别回收pMD18-MsALMT1被切割后产生的MsALMT1基因片段（约1.4kb）和pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片段pENTRTM2B，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTRTM2B和MsALMT1基因的DNA片断产生中间载体pENTRTM2B-MsALMT1（图2）。用连接反应混合物转化高效率（108）的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体pENTRTM2B-MsALMT1（图4A）。用HindIII和BamHI以及SalI和XbaI双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，均分别为约2.7kb和1.4kb（图4B）。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTRTM2B-MsALMT1。
实施例3：植物表达载体pK2-35S-MsALMT1的构建
通过Gateway技术的LR反应把MsALMT1亚克隆到植物表达载体pK2GW7（Gateway的目的载体, 比利时VIB/Gent公司）中。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7（图6A），在Gateway的LR反应体系中加pENTRTM2B-MsALMT1和pK2GW7各150ng，1μl LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把MsALMT1整合到pK2GW7中获得MsALMT1的植物表达载体pK2-35S-MsALMT1（图5）。用反应混合物转化高效率（108）的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落。从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，选出大小和对照质粒pK2GW7相似的整合成功的质粒pK2-35S-MsALMT1进行酶切检测（图6B）。用HindIII和BamHI酶切检测pK2-35S-MsALMT1，酶切结果得到11.1kb和1.4 kb左右的两条带（图7A）。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pK2GW7携带的筛选标记基因为卡那霉素抗性基因（Kmr），这样可用加有卡那霉素的平板筛选转基因植物。
实施例4：用MsALMT1基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-MsALMT1转入农杆菌（C58Cl(pPMP90)）中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5 ml SOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃, 200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用灭菌牙签挑取农杆菌菌落于20μl ddH2O中，98℃处理5分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。PCR检测pK2-35S-MsALMT1转化结果，正对照扩增体系模板使用pK2-35S-MsALMT1质粒，负对照使用pK2GW7质粒，扩增片断理论长度约为1.4 kb，PCR产物经电泳分析显示其片段大小与理论预测值相符，表明质粒已转入农杆菌（图7B）。
实施例5：用含有MsALMT1基因植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携带有质粒pK2-35S-MsALMT1的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中（含Spe，100μg/ml），180rpm，28℃培养24h，待菌液OD600至1.0左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1（MS+NAA02.1μg/ml+BAP 0.02μg/ml）上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4（MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml）上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上进行根的诱导。
实施例6：MsALMT1基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液（Tris-HCl pH 7.5 100 mM,EDTA 20 mM,NaCl 1.4 M,CTAB 2%），65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500 μl氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2 醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min（12000rpm）；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase 的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA样品。以转MsALMT1烟草抗性苗基因组作为模板，用MsALMT1基因上下游引物进行PCR扩增检测MsALMT1是否插入烟草基因组。扩增产物大小约为1.4 kb左右，和预期推测一致，说明目的基因均已插入这些转基因株系的基因组，野生型烟草基因组PCR产物未出现目标条带（图8A）。
为了进一步检测目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA, 反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测MsALMT1基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent（Invitrogen）提取RNA，取植物根约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75%乙醇1ml清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT) 50ng,10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10 μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用MsALMT1基因的上下游引物进行RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明转基因烟草植株均有目的基因的转录物，而野生型的烟草则没有（图8B）。
实施例7：转基因烟草根系苹果酸的分泌量测定
选取在MS培养基上生长两周、大小一致的烟草幼苗，于1/2 MS液体培养基上生长1周后，分别置于15 mL 含30μM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2（0.5 mM/L，pH4.2）溶液中，置于25℃恒定光照（100μmol/m2/s1）下处理24 h后，收集处理液用于苹果酸分泌量的测定。将得到的烟草根尖分泌物，使用真空干燥仪真空干燥后，溶于1 mL 蒸馏水中。将0.35 mL 样品与0.45 mL缓冲液Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 9.0）以及30μL氧化型辅酶I (NAD)溶液(30 g/L)混合，读取波长为340 nm处的OD值(A1)。接着加入2μL苹果酸脱氢酶悬浮液（16.5 U/μL）于上述反应溶液中并混合均匀。15 min后，读取340 nm处的OD值A2。根据样品和苹果酸标准溶液吸光度的增加值（A2-A1）计算样品中苹果酸的含量。结果表明，在没有铝的情况下，转基因株系A5，A6和A9根系分泌的苹果酸分别为野生型的2.92、4.19和4.09倍。在铝处理下，野生型和转基因烟草根尖苹果酸的分泌均有所增加，转基因株系A5、A6和A9分泌的苹果酸分别是WT根系的2.88、3.56和3.88倍（图9）。可见，在烟草中过表达MsALMT1基因可以有效的增加铝胁迫下烟草根系苹果酸的分泌。
实施例8：铝胁迫下转基因和野生型烟草的抗铝能力和根尖铝含量
选取在MS培养基上生长两周、大小一致的烟草幼苗，于1/2 MS液体培养基上生长1周后，分别置于15 mL 含30 μM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2（0.5 mM/L，pH4.2）溶液中，使用直尺测定根的长度；随后置于25℃恒定光照（100μmol/m2/s1）下处理24 h后，使用直尺测定根的长度。每个株系测定9个根尖的长度，相对根伸长率为铝溶液处理植株的根伸长量/无铝溶液处理植株的根伸长量。铝处理结束后，取根尖称鲜重后在65℃烘箱烘至衡重，用灰化炉550℃灰化10 h左右，使用1ml浓硝酸溶解过夜，定容至50 ml，使用原子吸收分光光度法测定铝的含量。结果表明，铝处理使野生型烟草的根明显受到了抑制，其根的RRG仅为未经铝处理的0.48。而转基因株系A5、A6和A9的RRG与野生型相比分别提高了1.58、1.80和1.59倍（图10）。对于根尖铝含量测定结果表明，30μM处理24 h后，转基因株系A5、A6和A9根尖的铝含量仅为野生型根尖铝含量的60%、48%和50%（图11）。可见，MsALMT1是紫花苜蓿中编码苹果酸通道蛋白的一个重要抗铝基因，在烟草中过表达可以有效的提高转基因烟草对铝的抗性。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学
<120> 紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体及其应用
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1.紫花苜蓿苹果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表达载体在制备降低铝吸收和抗铝毒能力增强的转基因植株中的应用。
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