CN102732555A

CN102732555A - 拟南芥钾离子转运体基因的植物表达载体及其应用

Info

Publication number: CN102732555A
Application number: CN2012101277281A
Authority: CN
Inventors: 李昆志; 王艺霖; 陈丽梅; 赵丽伟
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明公开了一种含有拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1且能提高植物钾素胁迫耐受能力的专用植物表达载体pK2-35S-AtKUP1，本发明使用RT-PCR的方法从植物拟南芥中克隆出AtKUP1基因，用35S启动子控制其在植物体内过量表达，并通过转化法将其转入植物中，实验结果表明在转基因植物中AtKUP1基因能够正常转录，在低钾营养条件下，转入AtKUP1基因的植株生长情况比对照的野生型植株要好，说明过量表达AtKUP1基因能够提高植物吸收利用钾的能力，从而满足植物生长发育的需要，本发明提供的载体适用于农作物的分子育种，提高其钾素利用率及对低钾胁迫的耐受力，能在钾素不足的情况下获得较高产量。

Description

拟南芥钾离子转运体基因的植物表达载体及其应用

技术领域

本发明属于植物工程领域，具体涉及一种钾离子转运体基因AtKUP1的植物表达载体pK2-35S-AtKUP1，其构建方法及其在转基因作物中的应用。

背景技术

钾是植物生长过程中需要的重要营养元素之一，也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，具有重要的生理功能。缺钾会影响多种代谢过程，包括光合作用、蛋白生物合成、渗透调节、膨压的驱动，以及维持膜电势等。近年来，人们对植物吸收利用钾的生理机制和遗传机制进行了较为深入的研究，发现植物体内K⁺吸收过程主要是通过两个机制进行的，一种是在高钾离子浓度(1-10 mmol/L)下由钾离子通道参与的低亲和性吸收机制，另一种是在低钾离子浓度(1-200 μmol/L）下由钾离子转运体介导的高亲和性吸收机制。目前已从多种植物中克隆出多个编码K⁺通道及K^＋转运体的基因。从植物体中克隆得到的K^＋转运体根据其同源性可分为三个家族：KT/HAK/KUP家族，TRK/HKT家族和阳离子质子反向转运体（CPA）家族。

植物体中的TRK/HKT家族一方面参与K⁺运输，另一方面与Na⁺运输以及盐耐受性相关。植物中第一个克隆到的HKT/Trk基因是小麦的TaHKT1，它一方面介导K⁺运输（Schachtman D.P.和Schroeder J.I.,1994)，另一方面参与K⁺-Na⁺同向转运（Rubio F., Gassmann W., Schroeder, J.I., 1995-1996）。在水稻中发现的多个HKT/Trk转运体中OsHKT2与TaHKT1一样，编码K⁺：Na⁺同向转运体蛋白，而OsHKT1与拟南芥AtHKT1功能类似，单向介导Na⁺运输（Horie T., et al. 2001; Garciadeblas B., et al. 2003）。

CPA是广泛存在的一类反向转运体家族，除植物外，它还普遍存在于真菌、动物和细菌中。最初发现它是做为Na⁺/H⁺反向转运体参与盐胁迫过程，后期研究证明有几个CPAs参与K⁺运输。CPA包含两个亚家族：CPA1和CPA2。首先鉴定出的CPA1成员是拟南芥AtSOS1，这是一个质膜Na⁺/K⁺反向转运体，对盐胁迫非常敏感（Gong D., et al. 2004），后来又陆续鉴定出了AtSOS2（Qiu Q.S., et al. 2004）和AtNHX8（An. R., et al. 2007）。随后，在日本牵牛花(Ohnishi M., et al. 2005）和水稻（Blumwald E., et al. 1985）中也发现了类似的K⁺/H⁺和K⁺/Na⁺的反向转运体。对于CPA2转运体，主要包括拟南芥中发现的6个成员：AtKEA1-6（K^＋exchange antiporter），参与钾离子装载过程；拟南芥AtCHX17（Cellier F., et al. 2004）和马铃薯LeNHX2（Venema K., et al. 2003），参与维持盐胁迫下的K⁺动态平衡以及pH值的调控。

KUP/HAK/KT家族最早是在大肠杆菌(Escherichia coli) (Schroeder, et al. 1994)和许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis) (Banuelos, et al. 1995)中鉴定得到的。后来又在多种植物中发现了同源的钾离子转运体。1997年，Santa-Maria G.E.等首先从大麦中分离得到了植物的第一个KT/HAK/KUP家族基因HvHAK1，同年，Quintero F.J.也从拟南芥中克隆得到了介导高亲和性K⁺吸收的转运体基因AtKUP1。随后，利用T-DNA插入突变体分析方法又从拟南芥中分离出AtKUP4（Rigas S., et al. 2001）和AtHAK5（Gierth M., et al.，2005），它们与AtKUP1（Fu. H. H., et al. 1998）一样，参与介导高亲和性Rb⁺（K⁺）的吸收。目前，从大麦（HvHAK1，Santa-Maria G.E. et al，1997)）、胡椒（CaHAK1，Martinez-Cordero M.A., et al. 2004）、冰叶日中花（Su. H., et al. 2002）、Lotus japonicus（Desbrosses G., et al. 2004）、葡萄（Davies C., et al. 2006）、马铃薯（Wang Y. H., et al. 2002）和浒苔（Garciadeblas B., et al. 2002）中也陆续克隆出KT/HAK/KUP家族成员。对这些基因的分子结构、功能表达、影响因素以及它们在植物K⁺吸收过程中所起的作用的研究结果发现，KUP/HAK/KT家族中部分成员参与高亲和性K⁺转运例如HvHAK1，OsHAK1，AtHAK5和CaHAK1，部分成员则主要在毫摩尔K⁺浓度范围内起作用，参与低亲和性的K⁺转运；部分成员受低钾胁迫诱导，例如，AtKUP3(Kim E.J., et al. 1998），AtHAK5(Sung, et al., 2004），HvHAK1（Santa-Maria G.E., et al. 1997），OsHAK1（Banuelos M.A., et al. 2002）和LeHAK1（Desbrosses G., et al. 2004）。对于已完成全基因组测序的植物（拟南芥、水稻、杨树），已经获得其整个KT/HAK/KUP家族成员，其中拟南芥13个，水稻25个，杨树24个，拟南芥和水稻（除OsHAK3外）中所有的KT/HAK/KUP转运体结构都是由10-14个跨膜结构域组成的。KUP/HAK/KT家族中的这些研究成果为进一步利用生物工程技术改良植物的钾素营养和培育钾高效利用型作物新品种奠定了基础。本研究选取拟南芥高亲和性钾离子转运体基因AtKUP1构建植物表达载体，并用其转化植物，使其在植物中组成型表达，以达到提高植物的钾素影响利用效率以及植物低钾胁迫耐受力的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟南芥钾离子转运体基因的植物表达载体，该载体pK2-35S-AtKUP1能提高植物钾素利用能力，所述载体含有拟南芥钾离子转运体AtKUP1基因的cDNA、卡那霉素筛选标记基因Km和组成型启动子CaMV 35S，35S启动子位于AtKUP1基因上游。

本发明所述拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1基因cDNA来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），GenBank登录号为AF029876.1。

用于构建该植物表达载体的起始载体为pK2GW7（购自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology，VIB）

本发明另一目的是将该拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1基因植物表达载体应用在制备具有较高钾素利用率的转基因植物中，转基因植物能高效吸收钾素。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、植物表达载体的构建

（1）从GenBank中查找拟南芥AtKUP1的编码区基因序列，并设计如下一对引物序列：

AtKUP15: 5’-ggatccatgaaccaatcaccatctctta-3’

AtKUP13: 5’-ctcgagttagacgtaataaaccattccaac-3’

5’端引物AtKUP15，末端添加BamHI位点；3’端引物AtKUP13，末端添加XhoI位点；对拟南芥(Arabidopsis thaliana, ecotype, Columbia)的总RNA进行RT-PCR，得到AtKUP1的编码区全长。

（2）回收AtKUP1的编码区基因片段，并将其连接到pMD19-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD19-AtKUP1。

（3）用BamHI和XhoI切割pENTR^TM-2B载体和pMD19-AtKUP1，回收载体pENTR*片段和AtKUP1基因片段，用连接酶连接pENTR*片段和AtKUP1基因片段，获得入门载体pENTR*-AtKUP1。

（4）通过Gateway技术的LR反应把AtKUP1亚克隆到植物表达载体pK2GW7（Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司）中，获得AtKUP1基因的植物表达载体pK2-35S-AtKUP1。

本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的作物都适用，如烟草、水稻、大豆等，在本发明的实施例中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。

2、植物的遗传转化

制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-AtKUP1转入农杆菌（C58C1(pPMP90)）中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子菌落。以农杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用AtKUP1基因的上下游引物进行菌落PCR检测，得到阳性转化子，将其接种于液体培养基中培养，离心收集菌体后使用MS液体培养基悬浮，通过农杆菌介导，使用叶盘法感染易分化的植物组织，然后通过组织培养获得小苗，筛选获得卡那霉素抗性植株。

3、AtKUP1基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测

为了确认用抗生素筛选获得的转基因植物确实含有AtKUP1基因，用PCR方法对筛选到的转基因植物做进一步的鉴定。首先提取转基因植物的基因组DNA，然后以植物基因组DNA为模板，用AtKUP1基因上下游引物做PCR检测，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。

为了考察在含有AtKUP1基因的转基因植株中AtKUP1基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录合成cDNA后用于RT-PCR分析，检测AtKUP1基因在转基因植物中的转录水平。以cDNA为模板，用AtKUP1基因内部片段特异性引物做PCR，经RT-PCR确认的转基因植株用于后续的氮素营养实验。

4、植物的氮素营养实验

将转AtKUP1基因的植株以及对照野生型植株小苗移栽入只有珍珠岩的外界培养条件下，施用低钾营养液，在持续光照条件下培养一段时间后观察植物表型的变化。转AtKUP1基因植物比野生型植株长势好，说明转入AtKUP1基因的植物确实具有较强的钾素吸收利用能力，达到预期效果。

本发明的技术优点及效果

土壤中钾素含量缺乏是影响作物产量的重要原因之一，本发明构建了钾离子吸收关键基因AtKUP1的植物表达载体，可通过遗传操作将其导入多种植物，改善作物性状并提高作物的低钾胁迫耐受性，可为获得高效利用钾素基因品种提供途径。

附图说明

图1是本发明拟南芥总RNA的提取电泳检测示意图，其中泳道1-3均为所提拟南芥总RNA。

图2是本发明AtKUP1基因的TA克隆策略示意图。

图3是本发明AtKUP1基因的扩增和TA克隆电泳检测示意图，图中A是以拟南芥RNA为底物反转录成的cDNA为模板进行RT-PCR后产物的电泳示意图，M：Marker III；1-5：AtKUP1的RT-PCR扩增产物；B是重组质粒pMD19-AtKUP1的电泳检测，1-3：重组质粒pMD19-AtKUP1，4：正对照（分子量为4.5 kb的质粒DNA）；C是重组质粒pMD19-AtKUP1的PCR检测， M：Marker III，1：以pMD19-AtKUP1质粒为模板用AtKUP15和AtKUP13引物扩增的PCR产物，2：正对照（以拟南芥cDNA为模板的PCR产物），3：负对照（以水为模板的PCR产物）；D是重组质粒pMD19-AtKUP1的PCR酶切检测，M：MarkerIII，1：EcoRI单酶切产物（3318bp和1513bp），2：BamHI单酶切产物（4831bp），3：BamHI和XhoI双酶切产物（2692bp和2139bp），4：HindIII单酶切产物（3685bp+1246），5：pMD19-AtKUP1质粒对照。

图4是本发明入门载体pENTR*-AtKUP1的构建策略示意图。

图5是本发明入门载体pENTR*-AtKUP1的电泳检测示意图，图中A是pENTR*-AtKUP1质粒的电泳检测，1：正对照（分子量4.4kb的质粒DNA），2-5：pENTR*-AtKUP1质粒DNA；B是pENTR*-AtKUP1的PCR检测，M：MarkerIII，1-2：pENTR*-AtKUP1质粒的PCR检测（引物为AtKUP15和AtKUP13），3：正对照（以pMD19-AtKUP1为模板的PCR产物，引物为AtKUP15和AtKUP13）；C是pENTR*-AtKUP1的酶切检测，M：MarkerIII；1-2：BamHI单酶切产物（4439bp），3-4：HindIII单酶切产物（993bp和3546bp），5-6：HindIII+XhoI酶切产物（993bp，1246bp和2300bp），7-8：BamHI+XhoI酶切产物（2139bp和2300bp），9：pENTR*-AtKUP1质粒对照。

图6是本发明AtKUP1植物表达载体pK2-35S-AtKUP1的构建策略示意图。

图7是本发明AtKUP1植物表达载体的电泳检测示意图，图中A是pK2-35S-AtKUP1质粒的电泳检测，1：质粒pK2GW7，2-3：质粒pK2-35S-AtKUP1；B是pK2-35S-AtKUP1的PCR电泳检测，M：MarkerIII，5：正对照（以pMD19-AtKUP1 质粒为模板扩增的PCR产物，引物为AtKUP15和AtKUP13），1-4：以pK2-35S-AtKUP1质粒为模板扩增的PCR产物，引物为AtKUP15和AtKUP13。

图8是本发明农杆菌菌落的PCR电泳检测示意图，其中M：Marker III；1-2：pK2-35S-AtKUP1的农杆菌转化子菌落的PCR扩增产物（引物为AtKUP15和AtKUP13）；3：负对照（以pK2GW7为模板，使用AtKUP15和AtKUP13引物进行扩增的PCR产物）。

图9是本发明转基因烟草的PCR电泳检测示意图，图中A是烟草的基因组，1-4泳道均为所提烟草基因组；B是转AtKUP1基因烟草的PCR电泳检测，M：Marker III，1-2：WT-AtKUP1烟草基因组DNA的PCR产物（引物为AtKUP15和AtKUP13），3：负对照（以野生型烟草基因组为模板，使用AtKUP15和AtKUP13做引物进行扩增的PCR产物），4：正对照（以pMD19-AtKUP1为模板，使用AtKUP15和AtKUP13做引物进行扩增的PCR产物）。

图10是本发明转AtKUP1基因烟草的RT-PCR电泳检测示意图，A是烟草总RNA，1-4泳道均为所提烟草总RNA；B是转AtKUP1基因烟草的RT-PCR电泳检测，M：Marker III，1：正对照（以pMD19-AtKUP1为模板，使用AtKUP15和AtKUP13做引物进行扩增的PCR产物），2-5：转AtKUP1基因烟草的RT-PCR产物（引物为AtKUP15和AtKUP13）。

图11是本发明转基因烟草株高的测定示意图，A是烟草植株照片，WT：野生型烟草植株，AtKUP1：转AtKUP1基因的烟草植株； B是株高柱状图，WT 1-3：野生型烟草植株，AKT1 1-3：转AtKUP1基因的烟草植株。

图12是本发明转基因烟草叶表面积的测定结果图，其中WT 1-3：野生型烟草植株；AKT1 1-3：转AtKUP1基因的烟草植株。

图13是本发明转基因烟草总叶绿素含量的测定结果图，其中WT 1-3：野生型烟草植株；AKT1 1-3：转AtKUP1基因的烟草植株。

图14是本发明转基因烟草总蛋白含量的测定结果图，其中WT 1-3：野生型烟草植株；AKT1 1-3：转AtKUP1基因的烟草植株。

图15是本发明转基因烟草糖类物质含量的测定结果图，其中A是总还原糖含量；B是葡萄糖含量；C是蔗糖含量； D是淀粉含量，图中WT 1-3：野生型烟草植株；AKT1 1-3：转AtKUP1基因的烟草植株。

图16是本发明转基因烟草糖类物质含量的测定结果图，其中A是淀粉含量，B是葡萄糖含量，图中WT 1-3：野生型烟草植株；AKT1 1-3：转AtKUP1基因的烟草植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

本实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂；各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自invitrogen公司，RevertAid^TM-MuLV Reverse Transcriptase Kit 购自Fermentas 公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。

所有引物序列均在大连宝生物公司合成，本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：拟南芥总RNA的制备与检测

拟南芥总RNA的提取使用TRIzoL Reagent（RNA提取试剂，Invitrogen），对说明书方法稍做修改后进行。取全株幼嫩拟南芥0.1 g，加入1 ml的TRIzoL RNA 提取液，混匀室温静置5 min，加入0.2 ml氯仿，振荡混匀，4 ℃，12000 rpm/min离心15 min。转移上清液，加入0.5 ml异丙醇，混匀室温放置10 min后12000rpm/min离心10 min。弃上清，75％的乙醇1 ml清洗沉淀，4 ℃，7500 rpm/min离心5 min，真空干燥沉淀，用20 μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA，-20 ℃。取1μl RNA用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果（图1）说明提取到的RNA 质量符合要求。

实施例2：拟南芥cDNA的合成

用拟南芥总RNA为模板，使用RevertAid^TM-MuLV Reverse Transcriptase Kit（Fermentas）进行cDNA的合成。取植物总RNA 0.1-0.5 μg，Oligo (dT) 50ng， 10 mM dNTP 1 μl, 用DEPC处理水补足至10 μl，混匀后，短暂离心将其收集于管底，置于65 ℃恒温干热加热器中加热5 min，冰浴10 min，加入反应混合物9 μl（10×RT Buffer 4μl，25 mM MgCl₂ 4 μl，0.1 M DTT 2 μl，RNA酶抑制剂 1 μl），混匀，短暂离心将其收集于管底，25 ℃保温2 min，加入1 μl RevertAid^TM-MuLV反转录酶，混匀25 ℃保温20 min，然后42 ℃保温70 min，冰浴10 min，-20 ℃保存备用。

实施例3：AtKUP1基因的扩增与TA克隆

AtKUP1基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首选从GenBank中查找AtKUP1的编码区序列全长，并设计一对引物，序列如下：

AtKUP15: 5’-ggatccatgaaccaatcaccatctctta-3’

AtKUP13: 5’-ctcgagttagacgtaataaaccattccaac-3’

5’端引物AtKUP15末端加BamHI酶切位点；3’端引物AtKUP13末端加XhoI酶切位点。

用AtKUP1基因上下游特异性引物AtKUP15和AtKUP13作RT-PCR，在RT-PCR 反应混合液中加入3μl的cDNA作为模板，同时加入50ng的特异性引物AtKUP15和AtKUP13、2.5μl dNTP（2.5mM），0.25μl的Ex taq DNA聚合酶（5U/μl）和2.5μl的10×Ex taq酶反应缓冲液（日本宝生物），加双蒸水使反应终体积为25μl。在PCR仪上于94℃加热2分钟，然后按照94℃、30秒，58℃、30秒，72℃、2分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72℃延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到AtKUP1基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离AtKUP1的PCR扩增产物（图3A），回收并纯化AtKUP1编码区全长片段（2.1kb），然后用宝生物（TaKaRa）的TA克隆试剂盒将其连接到pMD19-T（大连宝生物公司）载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5α（购自天根生化科技公司），采用碱裂解法提取质粒DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳（图3B），选取大小和理论值相符的重组质粒pMD19-AtKUP1做进一步的PCR检测，用AtKUP1基因上下游特异性引物AtKUP15和AtKUP13作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出2.1kb左右的AtKUP1基因DNA片段（图3C）。根据阳性重组质粒pMD19-AtKUP1载体两端的多克隆位点，用BamHI和XhoI双酶切重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD19-AtKUP1产生2条带，一条为2.1kb左右的AtKUP1基因DNA插入片段，另一条为2.7kb的载体片段（图3D），经序列分析证明该载体中的插入片段是AtKUP1的编码区全长片段。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pMD19-AtKUP1。

实施例4：Gateway入门克隆载体pENTR*-AtKUP1的构建

pENTR*-AtKUP1的构建策略如图4所示，用BamHI (Fermentas)和XhoI（Fermentas）切开纯化的质粒载体pENTR*-2B和pMD19-AtKUP1。通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片段pENTR*（2.3kb）及pMD19-AtKUP1被切割产生的AtKUP1基因的DNA片段（2.1kb），然后用宝生物（TaKaRa）的连接酶试剂盒连接pENTR*和AtKUP1基因的DNA片段产生入门载体pENTR*-AtKUP1。用连接反应混合物转化高效率（10⁸）的大肠杆菌感受态（DH5α，天根生化科技），把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素（Km，50μg/ml）的LB平板上，于37°C过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒（图5A），以AtKUP1基因上下游引物进行PCR扩增检测（图5B），连接成功的质粒载体pENTR*-AtKUP1可扩增出大小为2.1kb的AtKUP1片段。用多种酶进行酶切重组质粒进行检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生的条带与预期结果相符（图5C）。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-AtKUP1。

实施例5：AtKUP1基因植物表达载体的构建

AtKUP1基因植物表达载体的构建策略如图6所示，通过Gateway技术的LR反应把pENTR*-AtKUP1亚克隆到植物表达载体pK2GW7(Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7,在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-AtKUP1和pK2GW7各150ng，1μl LR ClonaseII Enzyme Mix（Invitrogen），混匀于25℃ 反应过夜，通过整合酶的作用把AtKUP1整合到pK2GW7中获得AtKUP1的植物表达载体质粒pK2-35S-AtKUP1。用反应混合物转化高效率（10⁸）的大肠杆菌感受态（DH5α，天根生化科技），把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素（Spe，50μg/ml）的LB平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒（图7A），用AtKUP1的上下游引物进行PCR检测，整合成功的质粒均能扩增出一条2.1 kb左右的条带（图7B），确认是重组成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒。

实施例6：用AtKUP1基因的植物表达载体转化农杆菌

制备农杆菌感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-AtKUP1转入农杆菌（C58C1(pPMP90)）中，在加有壮观霉素的LB平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混合液落至杯底，将电转化杯置于电转化仪（BIO-RAD）滑槽中，用1 mm的点击杯和200欧姆，2.5 Kv/0.2cm的参数进行电击，点击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5 ml SOC培养基，混匀，转移到1.5 ml的离心管中；28℃，200 rpm摇床培养3-5 h；室温下，7500 rpm离心1 min，弃大部分上清，保留100 μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于加有壮观霉素（Spe，50 μg/ml）的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先挑取农杆菌单菌落于20 μl ddH₂O中，98℃处理15分钟后取出10 μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用AtKUP1基因的上下游引物作PCR检测，转化成功的菌落能扩增出2.1 kb的条带（图8），经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。

实施例7：用含有AtKUP1基因植物表达载体的农杆菌转化烟草

首先挑取携带有pK2-35S-AtKUP1质粒的农杆菌单菌落接种于50 ml的LB液体培养基（含Spe，100 μg/ml），180 rpm，28℃培养2 h，待菌液OD₆₀₀至1.0左右，3500 rpm，离心10 min，沉淀菌体。再用10 ml左右的MS液体培养基悬浮菌体，3000 rpm离心10 min，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后用加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD₆₀₀值为0.5，静置1 h备用。

本发明选取容易转化的植物烟草作转化实验。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，把无菌苗的叶片切成小片叶盘，将其用以上制备好的农杆菌菌液浸染15～20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1（MS+NAA 0.21 μg/ml+BAP 0.02 μg/ml）上黑暗共培养2天，将外植体转移至含壮观霉素（50 μg/ml）的芽诱导培养基MS4（MS+NAA 0.53 μg/ml+BAP 0.5 μg/ml）上进行芽的诱导，获得转入AtKUP1基因的植株。

实施例8：AtKUP1基因在转基因烟草中的插入情况和转录水平的检测

为了确认从转化的烟草叶盘产生的转基因植株确实含有AtKUP1基因，用PCR方法对筛选到的转基因植株作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取0.1 g植物叶片置于1.5 ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉状。加入900 μl预热到65℃ 的2×CTAB缓冲液（Tris-HCl pH7.5 100 mM，EDTA 20 mM，NaCl 1.4 M，CTAB 2%），65℃ 水浴20 min，中间每隔2 min摇匀一次，取出冷却至室温，再加入500 μl氯仿：异戊醇（24：1）混合液，旋转摇匀，4 ℃, 7500 rpm，离心10 min，转移上清至一新的离心管，重复上述步骤；加入1/10体积3 M pH5.2 NaOAc和等体积的异丙醇，摇匀后4 ℃ ，12000 rpm，离心20 min，弃上清，用75％乙醇清洗两次后干燥，用含有RNase的1×TE缓冲液溶解并降解RNA，取2 μl以1%琼脂糖凝胶电泳检测（图9A）。以植物基因组DNA为模板，用AtKUP1基因内部部分序列的上下游特异性引物作PCR检测，成功转入AtKUP1基因的植株均能扩增出2.1 kb左右的DNA条带（图9B），经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。

为了考察在含有AtKUP1基因的转基因烟草株系中AtKUP1基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测AtKUP1基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent（RNA提取试剂，Invitrogen）提取RNA(图10A）后，使用RevertAid^TM-MμlV Reverse Transcriptase Kit（反转录试剂盒，Fermentas）进行cDNA的合成，植物总RNA约0.1-0.5 ug，Oligo（dT）50 ng，10 mM dNTP mix 1 μl，用DEPC处理水补足至9 μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5 min，冰浴10 min，加入反应混合物11 ul（5×reaction buffer 4 μl，25 mM MgCl₂ 4 μl，0.1 M DTT 2 μl，RNA酶抑制剂1 μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25 ℃保温2 min，然后42 ℃保温70 min，合成cDNA。以cDNA为模板，用AtKUP1基因上下游特异性引物作PCR，成功转入AtKUP1的植株均能扩增出2.1 kb的条带（图10B），证明AtKUP1基因可以在转基因植物中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于进一步的生理生化分析。

实施例9：转基因烟草在低氮营养条件下的生长情况

为了确认转AtKUP1基因的植株确实具有生长优势，将转AtKUP1基因的植株以及对照野生型植株小苗移栽入只有珍珠岩的外界培养条件下，施用低钾营养液（50 μM K⁺），在持续光照条件下培养一段时间后观察植物表型的变化。转AtKUP1基因植物都比野生型植株长势好（图11），说明转入的AtKUP1基因能够在植物中发挥预期的作用，转基因植物长势更为健壮。选取浇灌低氮营养液60天的烟草的前三片叶片，测量其长度和宽度，根据面积=长×宽×0.681，计算叶片表面积（图12）。可见转基因烟草植株的株高优势明显，但叶表面积无明显差异。

实施例10：转基因烟草叶片中叶绿素的含量检测

为了确认转入基因是否对植株叶片中叶绿素含量造成影响，选取转基因植物小苗和未转基因植物的野生型小苗叶片取叶片0.1 g，加入少量CaCO₃和1 ml 95%乙醇，充分研磨，收集样品，4 ℃，12000 rpm离心15 min后，收集上清，取100 μl上清液加入900 μl 95%乙醇，充分混合后，于分光光度计下分别测645 nm和663 nm的吸光度（95%乙醇作对照）。根据以下公式计算出叶绿素a（C_A）、叶绿素b（C_B）以及总叶绿素（C_T）的浓度以及含量（CA-Chl，CB-Chl和CT-Chl,图12)：C_A= 12.72 D663-2.59 D645；C_B= 22.88 D645-4.68 D663；C_T = 20.29 D645+8.02 D663；Chl(mg/g叶) =C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数/材料鲜重（g）。转基因植物的叶绿素含量与野生型对照相比明显增高（图13），说明转入的AtKUP1基因不但不会破坏植物叶片中的叶绿素，还增加了叶绿素的含量，为提高植物的光合作用提供有利条件。

实施例11：转基因烟草中总蛋白含量的测定

为了确认转入基因对植物体重总蛋白含量造成的影响，选取转基因和未转基因植物的幼嫩叶片0.2 g左右的植物叶片，加入1 ml蛋白抽提液（100 mM Tris-HCl (pH7.5)；10%(V/V)甘油；10 mM巯基乙醇；1 mM PMSF；5%(W/V) PVP），充分研磨；收集抽提液，4 ℃，12000 rpm离心25 min后，将上清液转移到新的EP管中，800 μl H20+200 μl Bradford+1 μl 样品，595 nm测定光吸收值。结果（图14）发现转基因植物叶片中的总蛋白含量只有轻微增加，证明转入的AtKUP1基因对于提高植物体内的总蛋白含量影响不大。

实施例12：转基因烟草中糖类物质含量的测定

为了确认转入基因是否对植物叶片中的糖类物质含量造成影响，故选取野生型烟草和转基因烟草的叶片1 g，液氮充分研磨，加入5 ml 85%乙醇，混匀，在50 ℃恒温水浴中保温30 min（期间不断摇动）；12000 rpm离心15 min，吸取上清；滤渣用2 ml 85%乙醇二次提取，再次12000 rpm离心15 min；收集两次离心的上清，用85% 乙醇定容至10 ml，摇匀备用（糖分提取液）。

吸取0.1 ml糖分提取液，加入0.1 ml H₂O和0.15 ml DNS试剂（亚硫酸氢钠6.9 g，结晶酚6.9 g，酒石酸钾钠 225 g，880ml 1% 3,5,-二硝基水杨酸，312.5 ml 10% NaOH），采用对照为0.2 ml H₂O+0.15 ml DNS试剂，混匀，沸水浴中加热5 min，冷却后每管加入2.15 ml ddH₂O使得总体积为2.5 ml，摇匀，520 nm处测定吸光度。根据标准曲线Y=(X+0.0400)/0.874（R²=0.9908）计算得到还原糖含量（图15A）。

吸取0.5 ml糖分提取液，加入0.5 ml 6 M HCl，摇匀，沸水浴中加热10 min，冷却后加入1%酚酞指示剂一小滴，以10% NaOH中和至溶液成微红色，加入1.5 ml ddH₂O使得总体积为2.5 ml，混匀，520 nm处测定吸光度。根据标准曲线以及前面测得的还原糖含量根据公式：蔗糖含量（mg/g叶片）=（对应的总还原糖含量-水解前还原糖含量）×0.95，计算得到蔗糖含量（图15B）。

将还原糖含量测定中敬85%乙醇浸提后的全部残渣中加入1 ml 6 M HCl，沸水浴加热10-30 min，用碘试剂（2 g KI和1 g碘溶于10 ml ddH₂O中，稀释10倍使用）检查淀粉水解程度，知道不显蓝色为止。冷却，加入1 ml ddH₂O，12000 rpm离心15 min；吸取上清，剩下的残渣再用蒸馏水冲洗3次，离心，收集上清，混合，定容至10 ml；取1 ml滤液加入酚酞5-10 μl，10%氢氧化钠中和至微红色；蒸馏水定容至25 ml。将1 ml提取液加入0.15ml DNS试剂摇匀，使用0.2 ml ddH₂O+0.15 ml DNS试剂作为对照，沸水浴中加热5min，冷却；每管加入1.35 ml ddH₂O使总体积为2.5 ml，摇匀，520nm处测定吸光度（A）值。根据标准曲线计算粗淀粉含量（图16A）。

取0.5g的新鲜植物材料，在液氮中迅速研磨成粉末状，加入4 ml磷酸钾缓冲液（KH₂PO₄0.27 g， K₂HPO₄1.83 g，pH 7.6）充分研磨，4 ℃，12000 rpm离心20 min，将上清转移入新管中。向每个反应体系中加入1 ml Solution2（NADP 110 mg，ATP 260 mg，溶于45 ml蒸馏水中），1.9 ml蒸馏水，再加入100 μl抽提液，将上述混合液加入比色杯中，3 min后读取340 nm处光吸收值A₁。再向反应体系中加入5.8 IU的HK（己糖激酶）和2.9 IU的G6PDH（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）以启动反应，15 min后读取340 nm处光吸收值A₂。根据反应方程c=3.020×180.16×（A₂-A₁）/ε×1.00×0.100×1000（g D-glucose/l sample）(其中ε=6.3（1×mmol^-1×cm^-1）)可计算出反应液中D-葡萄糖的浓度（图16B）。转入AtKUP1基因的植物叶片中糖类物质含量有不同程度的升高，其中以蔗糖升高最为明显。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大学

<120> 拟南芥钾离子转运体基因的植物表达载体及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatccatga accaatcacc atctctta 28

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcgagttag acgtaataaa ccattccaac 30

Claims

1.拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1植物表达载体pK2-35S-AtKUP1，所述载体含有拟南芥钾离子转运体AtKUP1基因的cDNA、卡那霉素筛选标记基因K₂和组成型启动子CaMV 35S。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于：拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1基因cDNA来源于拟南芥，GenBank登录号为AF029876.1。

3.权利要求1的拟南芥钾离子转运体基因AtKUP1基因植物表达载体在制备具有较高钾素利用率的转基因作物中的应用。