CN102071216B - 高赖氨酸蛋白基因sb401表达载体的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高赖氨酸蛋白基因Sb401表达载体的构建与应用。旨在解决将外源高赖氨酸蛋白基因导入植株中并高效并高效表达的技术难题。该方法将采用提取马铃薯的RNA，通过反转录获得马铃薯全长CDNA，用PCR方法获得sb401基因，并将该基因重组后克隆到植物双元表达载体中；通过农杆菌介导方法将该基因导入玉米基因组，并获得表达转基因阳性苗，并高效表达，可以提高玉米赖氨酸的含量，进而提高玉米的品质；本发明方法费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、同时具有转育周期短及能转化较大片段等独特优点。

Description

高赖氨酸蛋白基因SB401表达载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程领域，具体涉及一种高赖氨酸蛋白基因Sb401表达载体的构建方法及其应用。

背景技术

玉米是我国的重要粮食作物。随着玉米在产量、抗性等方面研究的深入，人们越来越关玉米米品质的提高。蛋白质、氨基酸的含量是品质的一 个重要指标。增加玉米中蛋白质和赖氨酸的含量将提高 玉米的生物价值，促进人和动物对其蛋 白质的消化吸收和利用。玉米是我国的重要粮食作物。随着玉米在产量、抗性等方面研究的深入，人们越来越关玉米米品质的提高。蛋白质、氨基酸的含量是品质的一个重要指标。增加玉米中蛋白质和赖氨酸的含量将提高玉米的生物价值，促进人和动物对其蛋白质的消化吸收和利用。应用传统育种手段改良玉米蛋白质品质虽然取得了可喜的成绩，但传统育种方法周期长、见效慢、受种质资源的限制，且难以解决诸如玉米中蛋白质的氨基酸营养组分不平衡和不含维生素A等问题。由于玉米蛋白质含量主要受遗传基因控制，利用基因工程将自然界植物体内分子量较小、且富含赖氨酸的蛋白质基因导入玉米，是一个改良玉米营养品质的可行途径。

向植物中导入富含赖氨酸的外源蛋白基因是提高植物赖氨酸含量的一个有效途径。此类方法国内也有一定的研究，孙学辉等（2001）将外源蛋白基因导入玉米自交系材料P12和综3获得了赖氨酸含量提高16%的转基因玉米材料，后通过常规育种方法获得了稳定的转基因玉米自交系该自交系的蛋白质和赖氨酸含量均提高50%以上；王为民等（2004）用基因枪法将该基因导入籼稻中优早5号，获得了蛋白质和赖氨酸的含量分别提高35.18％和45.09％的 T1代转基因植株。这些研究结果显示了sb401基因在提高作物赖氨酸含量、改良作物蛋白质品质方面的良好应用前景。但是由于植物表达载体所用的启动子不同，或者遗传转化的方法不同，导致基因表达水平低，外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同，宿主细胞也不同，将重组子导入宿主细胞的具体方法有许多优越性，但同时也存在着一些不足之处。例如，基因枪轰击的随机性导致转化率不高；基因枪插入往往是多拷贝成簇整合到受体基因组中，而且可能发生多种方式重排；同源序列能以DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA的方式相互作用，导致转录或转录后水平的基因沉默；轰击过程中还可能造成外源基因的断裂，并且使插入的基因成为无活性的片段；出现非转化体或嵌合体的可能性较高以及基因枪转化所用的成本较高等。

发明内容

本发明的目的是提供一种高赖氨酸蛋白基因SB401表达载体的构建方法及应用，该方法费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、同时具有转育周期短及能转化较大片段等独特优点。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

提取马铃薯花粉提取RNA,进行反转录，利用特异引物从马铃薯花粉里面克隆了高赖氨酸基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；根据克隆需要在序列两端加上限制性内切酶识别位点序列并构建到相应的表达载体上。主要包括以下步骤，

（1）提取马铃薯花粉高赖氨酸基因sb401总RNA，并逆转录成cDNA；

（2）以上述 cDNA为模板，以特异引物克隆马铃薯高赖氨酸基因sb401；

（3）将马铃薯高赖氨酸基因sb401与亚克隆载体pGSI连接，再将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，构建马铃薯高赖氨酸基因sb401亚克隆载体质粒；

（4）将上述克隆质粒构建到植物表达载体pCAMBIA1300，获得含高赖氨酸基因sb401片段重组表达载体CUB-sb401。

在植物双元表达载体pCAMBIA1300中插入SB401基因，启动子来自玉米基因组Ubiquitin基因，是一个在单子叶植物中有较强表达的启动子，负责启动SB401基因基因表达，Ubi启动子它来自于玉米多聚泛素蛋白基因（maizeployubigene）,它实际上包含Ubi基因的启动子区，5^，非翻译区和第一内含子；在胁迫条件下（如热休克）Ubiqutin启动子的表达活性显著增强。

所述马铃薯高赖氨酸基因SB401具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

所述特异引物序列如下（如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示）：

上游引物F1:5'-ggatccttttctttttgcaagttcctcc-3'；

下游引物R1:5'-gagctcaaagaaatccccaaaagaaag-3'。

将上述表达载体导入相应的农杆菌中，进而将含高赖氨酸基因sb401片段重组表达载体CUB-sb401导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗等阶段，获得转基因苗，培育高赖氨酸玉米；也可以对其它农作物（农作物、果树或蔬菜，如水稻、小麦等）进行遗传转化，提其赖氨酸的含量，进而提高农产品的品质。

上述高赖氨酸基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明具有积极有益的效果：

在载体构建中使用自玉米基因组高效表达启动子Ubiquitin基因，负责启动SB401基因基因表达，所用的筛选标记基因为 bar基因，bar基因在生物安全性上比其它标记基因要好，它的编码蛋白在人体内不存在，并且和已知的毒蛋白无同源序列，也不具过敏原，相对较为安全。

通过农杆菌介导的方法进行高赖氨酸基因的遗传转化，不但费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、同时具有转育周期短及能转化较大片段等独特优点；通过本发明方法使sb401基因成功转化到玉米中，并获得了稳定的转化苗。

编码马铃薯花粉特异水溶性蛋白的SB401基因编码的蛋白质中赖氨酸含量高达 16.7%，是目前报道的赖氨酸含量较高的蛋白质编码基因，该基因高效表达后可以提高玉米赖氨酸的含量，进而提高玉米的品质。

附图说明

图1  pGSI-SB401用BamHI和SacI酶切鉴定图，证明SB401基因连入pGSI载体中，所的到的片段为SB401基因片段； Marker分子量大小分别为2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 200bp；pGSI是上海生工提供的的亚克隆，是经过改造的pBSK；

图2 为CUBSB401用BamHI和SacI酶切鉴定图，证明SB401基因连入植物表达载体CUB中，所的到的酶切片段为SB401基因片段； Marker 分子量大小为2900bp, 1100bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp, 100bp；

图3 为CUB（pCAMBIA1300-Ubi-MCS-Bar）质粒图谱；

图4 为采用农杆菌介导法获得的转SB401基因玉米照片；其中，愈伤组织的筛选（左）、再生（中）以及转基因植株移栽到大田（右）；

图5为T0代转化体目的基因SB401的PCR检测结果图谱，其中，M为M:DL2000 plus；CK1为阳性质粒对照；CK2为未转基因阴性对照；空白为双蒸水对照；1-8是SB401-1到SB401-8。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。

实施例一  高赖氨酸蛋白基因Sb401表达载体的构建方法，具体步骤如下：

1. 选取新鲜马铃薯花粉材料0.1g，以Plant RNA Midi Kit试剂盒（购自上海生物工程有限公司）提取马铃薯高赖氨酸基因sb401总RNA

2.逆转录

第一链cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆转录酶在0.5mL离心管内混合下列试剂：

5μg                       RNA样品

2mL               Oligo(dT)₁₅（250ng/mL）

 H₂O

28mL                     Total

样品混匀后，短暂离心，65℃变性5min，迅速置于冰上冷却10min，短暂离心后，再向管内加入下列试剂：

8mL                      5×First-strand Buffer

2mL                      dNTP（10mM）

1mL                      RNA酶抑制剂

1mL                      逆转录酶（200units/mL）

12mL                   Total

用移液枪轻轻混匀样品，置于42℃空气浴中反应1小时，然后将样品置于70℃处理15分钟终止反应，冰上冷却后，-20℃保存。

3.马铃薯高赖氨酸基因sb401的克隆

根据克隆高赖氨酸基因SB401的需要，我们设计了克隆引物，并在上游引物序列的5’端添加BamHI内切酶识别位点序列CATATG，3’端添加HindIII内切酶识别位点序列AAGCTT。设计引物序列如下：

上游引物F1:5'-GGATCCttttctttttgcaagttcctcc-3'；

下游引物R1:5'-GAGCTCaaagaaatccccaaaagaaag-3'。

以逆转录后的 cDNA(全株总RNA逆转录)为模板，以F1、R1为引物，扩增SB401基因，PCR条件为：

95 ^oC， 5分钟；

95 ^oC 变性30秒；

58 ^oC退火30秒；

72 ^oC延伸60秒；

72 ^oC延伸10分钟；

反应体系为20μL 

目的片段大小：901bp，退火温度60℃，33个循环。

PCR产物经1%琼脂糖电泳确认后，回收。

4.构建高赖氨酸基因sb401基因克隆载体

（1）将上述扩增的SB401基因片段凝胶回收纯化，步骤如下：

①在UV灯下切胶，放入灭菌的1.5mL离心管中；

②加入等体积的NJ缓冲液；

③55～65℃温浴7分钟，至胶融解，每2分钟摇一下；

④将上述溶胶700μL转移至Mu-Pu DNA回收纯化柱中；

⑤室温下10000rpm离心1分钟，弃流出液；

⑥加入500μLSPW（乙醇稀释）洗涤2次（10000rpm离心洗），倒掉流出液；

⑦10000rpm离心2分钟；

将柱子放入1.5mL离心管中，加入30～50μL无菌水洗脱DNA。

（2）SB401基因片段和亚克隆载体pGSI连接，连接体系如下：

克隆载体pGSI       1μL 

T4DNA连接缓冲液   1μL

T4DNA连接酶       1μL 

PCR产物            7μL

Total                10μL  

以上混合物在16 ^oC连接反应16小时

（3）构建所得亚克隆载体命名pGSISB401，用BamHI 和SacI限制性内切酶进行酶切鉴定，表明载体构建正确（参见图1）。用pGSISB401质粒转化E.Coli JM109感受态细胞（购自于上海生物工程有限公司）。

5.植物表达载体构建

（1）用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切上述pGSISB401质粒，用凝胶回收纯化试剂盒回收SB401片段；同时用BamHI和SacI双酶切植物表达载体CUB（由山东大学提供，也可以从市场中购买），用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CUB片段；将两个片段进行连接反应，连接反应体系如下：

CUB植物表达载体（BamHI、SacI酶切后） 1μl

T4DNA连接缓冲液                     1μl 

T4DNA连接酶                           1μL

sb401基因片段                          7μL

Total                                        10μL   

以上混合物在16 ^oC连接反应16小时。

（2）构建好的植物表达载体为pCAMBIA1300-SB401-Bar（启动子为Ubiquitin，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar），将质粒pCAMBIA1300-SB401-Bar用BamHI和SacI进行酶切鉴定，鉴定出重组质粒CUB-sb401含有高赖氨酸基因sb401片段，表明载体构建正确（图2）。然后转化E.Coli JM109感受态细胞（购自于上海生物工程有限公司）。

其中，CUB（pCAMBIA1300-Ubiquitin-MCS-Bar（参见图3），质粒是在pCAMBIA1300质粒基础上构建的质粒，含有一个目的基因插入盒（35S－多克隆酶切位点－Tnos）和一个来自吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar质粒pCAMBIA1300为澳大利亚CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)公司产品，参考网址http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。

实施例二  玉米农杆菌转化

本实验采用根瘤农杆菌介导法将含高赖氨酸基因sb401片段重组表达载体CUB-sb401含导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗等阶段，获得转基因苗（参见图4）。其具体步骤如下：

1.农杆菌侵染幼胚  把刚剥离的幼胚放入含有D-inf（2ml）的离心管中，每管约20～100个幼胚，用这样的培养基浸泡1h以上，然后滤出D-inf，加入1～1.5ml特定浓度（OD600=0.3～0.4）的农杆菌菌液，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡，五分钟后将幼胚及菌液倒于灭菌的吸水纸上吸干（约2～5min）。

2.共培养  侵染后，把侵染过的幼胚转移到共培养上,使幼胚的盾片朝上，同时吸除培养基表面多余的农杆菌，将晾干后的愈伤组织置于铺有灭菌滤纸的共培养基上，用封口膜封住培养皿，培养箱中20℃左右暗培养3天。

3.恢复培养  共培养3天后，把幼胚（愈伤组织）转移到resting medium上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7～10天。

4.选择  7～10天后，把所有的幼胚（愈伤组织）转移到选择（依载体不同选择合适的选择标记）

培养基上面，可以经过多轮筛选，每次选择培养两周，选择标记浓度适当地增大。比如，选择培养基Ⅰ含有Bar 1.5mg/L，两周后再进行第二轮筛选时Bar的浓度可以增加到3mg/L，第三轮筛选时可以增Bar的浓度可以增加到4.5mg/L。

5.转基因植株的再生  经过多轮筛选后，将长出的颜色较鲜艳的抗性愈伤放在再生培养基I上面，暗培养2～3周，当出现胚状体后将胚状体转到再生培养基II上光照培养，诱导分化，约三天后胚状体将出现绿点；约2周后，会有幼苗分化出来，取处于再生培养基II中长至2cm以上高的苗将其转入生根壮苗培养基中，继续在光照培养室培养；在经2周后当幼苗长出3条根以上、高度约8cm以上时，打开瓶盖，在培养基上加少许灭菌水进行炼苗处理，并继续在光照培养室中生长。

6.三天后将幼苗从培养瓶中取出，将苗移栽含有泥炭土和蛭石（3:1）的营养钵中，最后把苗移入人工气候室中。

实施例三  转基因玉米植株PCR检测

实施例二中移栽成活的转化植株长出7～8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因；植物DNA提取以Saghai-Maroof等提出的CTAB的方法进行；采用PCR技术检测外源基因；图5中显示了T0代转化体目的基因sb401的PCR检测结果，其中M：M:DL2000 plus；CK1：阳性质粒对照；CK2：未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-8：sb401-1到sb401-8。所用的PCR检测引物为（如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示）：

F2-SB401: 5'-cacgcagttgcaacggagaacg-3'

R2-SB401 5'-ataaacactcttccttccatat-3'

目的片段大小：560 bp，退火温度58℃，35个循环。 

玉米植株DNA的提取步骤如下：

1.取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf 管中，然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度；

3.取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入600ul 提取缓冲液（65℃预热的CTAB，2%β-巯基乙醇），振荡混匀，在65℃ 水浴锅中温育30min，其间颠倒3-4次，混匀；

4.将离心机降温，在4℃条件下，12500rpm离心10min；

5.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），混匀, 抽提10min，至溶液呈乳浊状。在室温下离心，12500rpm，10min；

6.取上清液(约400ul) 移至一个新的1.5mL 离心管中，并加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，在 -20℃放置30min；

7.将离心机降温，在4℃条件下12500rpm离心10min；

8.沉淀用70％ 乙醇洗二次，7500rpm离心2min，将70% 乙醇倒，空甩，用移液枪吸弃残存的乙醇，然后在37℃烘箱中烘干20min左右；

12.将DNA溶于50-100ul无菌水中，4℃保存。

转基因植株PCR操作步骤如下:

1.先在PCR板每个孔中，加入DNA模板；

2.配制混合物：取一新的Eppendorf管，将除DNA模板以外的其它试剂按照所需要的总量混合在一起形成混合物，其试剂加入顺序为：无菌水、PCR反应缓冲液、引物、dNTP，最后加Taq DNA聚合酶。；

3.分装混合物：将配制的混合物混匀后分装到PCR板每个孔中；

4.混匀，在离心机上甩一下，加入一滴石蜡油；

5.将PCR板放入PCR仪中，按所需程序操作，PCR反应体系: 

      DNA模板                              2μL

10×PCR反应缓冲液                    2μL

      上游引物 (10mM)                    0.2μL

      下游引物(10mM)                     0.2μL

      dNTP（10mM each）                0.4μL

      Taq DNA聚合酶（5U/μl）         0.2μL

      无菌水                                   15μL

6.植物DNA的酶切、电泳均按常规方法进行。

实施例四  转基因玉米种子中赖氨酸含量检测

选取3个株系T0代转基因玉米株系，测定其赖氨酸和蛋白质在种子干重中的百分含量。测定结果表明：与非转基因苗相比，转高赖氨酸基因的转基因株系其赖氨酸和蛋白质的含量都有较大幅度的提高，提高幅度分别为32.26%～48.39%和37.94%～49.93%。测定结果如表1所示：

表1 T0代部分转基因玉米株系赖氨酸和蛋白质含量检测结果

 

 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南省农业科学院

 

<120>  高赖氨酸蛋白基因Sb401表达载体的构建方法及其应用

 

<130>  农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.2

 

<210>  1

<211>  901

<212>  DNA

<213>  Solanum tuberosum

 

<400>  1

ttttcttttt gcaagttcct ccaattcttc ataataaaaa gatgggttgt ggggaatcaa     60

 

agcacgcagt tgcaacggag aacgccacga ttcctaagaa caagagatca ttgagttcta    120

 

aatccgaatc cacaaagggt gaaaatgtcg taaaaactga aaatggggtt ggtagtgatg    180

 

aaaaagtgga ggaggagaag gagttgattg caccgaaagt ggtggctgtg gaaaaagaga    240

 

agtctgagaa gaaagagatg gtggaattgg aaaaggcgaa agaagatgag gttgttgaaa    300

 

agaaagaaga gaaagttgta gagacgaaga atgaaacaat ccatgttgct gttgtagaga    360

 

agaagaatga aaatgatgaa acaacaaccc ctgtttctgt tatagagaac gatgaaacaa    420

 

ctccggttgc tgttgtagag aagaagaatg aaaatgagga aacagtccct gtttctgttg    480

 

ttgctgttgt ggagaagaaa gaatctgttg aagaaattaa agtagaagag aaaactgagg    540

 

agaccatcaa gccaattgaa gaagtgaaag acaaagagaa ggaagaagtt atcgctattt    600

 

ctgaggccac agatgctact aaaccagaaa ctgtcaagga tgatgataaa ccagagacag    660

 

aggaaaagcc aaaagaggag gagcaactga aacaacagca acgacagact caaaaacaga    720

 

ttaaagtgca agcatgggaa tatggaagga agagtgttta ttagttaaat ccttgctttt    780

 

aaagcttgtt gtaatttcca ccttaagtat acatatttgc catgatctgt tttcatctct    840

 

tctgcttata taacatccca tttcatctaa atctacattt ctttcttttg gggatttctt    900

 

t                                                                    901

 

 

<210>  2

<211>  240

<212>  PRT

<213>  Solanum tuberosum

 

<400>  2

 

Met Gly Cys Gly Glu Ser Lys His Ala Val Ala Thr Glu Asn Ala Thr

1               5                   10                  15     

 

 

Ile Pro Lys Asn Lys Arg Ser Leu Ser Ser Lys Ser Glu Ser Thr Lys

            20                  25                  30         

 

 

Gly Glu Asn Val Val Lys Thr Glu Asn Gly Val Gly Ser Asp Glu Lys

        35                  40                  45             

 

 

Val Glu Glu Glu Lys Glu Leu Ile Ala Pro Lys Val Val Ala Val Glu

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Glu Lys Ser Glu Lys Lys Glu Met Val Glu Leu Glu Lys Ala Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Asp Glu Val Val Glu Lys Lys Glu Glu Lys Val Val Glu Thr Lys

                85                  90                  95     

 

 

Asn Glu Thr Ile His Val Ala Val Val Glu Lys Lys Asn Glu Asn Asp

            100                 105                 110        

 

 

Glu Thr Thr Thr Pro Val Ser Val Ile Glu Asn Asp Glu Thr Thr Pro

        115                 120                 125            

 

 

Val Ala Val Val Glu Lys Lys Asn Glu Asn Glu Glu Thr Val Pro Val

    130                 135                 140                

 

 

Ser Val Val Ala Val Val Glu Lys Lys Glu Ser Val Glu Glu Ile Lys

145                 150                 155                 160

 

 

Val Glu Glu Lys Thr Glu Glu Thr Ile Lys Pro Ile Glu Glu Val Lys

                165                 170                 175    

 

 

Asp Lys Glu Lys Glu Glu Val Ile Ala Ile Ser Glu Ala Thr Asp Ala

            180                 185                 190        

 

 

Thr Lys Pro Glu Thr Val Lys Asp Asp Asp Lys Pro Glu Thr Glu Glu

        195                 200                 205            

 

 

Lys Pro Lys Glu Glu Glu Gln Leu Lys Gln Gln Gln Arg Gln Thr Gln

    210                 215                 220                

 

 

Lys Gln Ile Lys Val Gln Ala Trp Glu Tyr Gly Arg Lys Ser Val Tyr

225                 230                 235                 240

 

 

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ggatcctttt ctttttgcaa gttcctcc                                        28

 

 

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gagctcaaag aaatccccaa aagaaag                                         27

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cacgcagttg caacggagaa cg                                              22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ataaacactc ttccttccat at                                              22

Claims (3)

1.一种高赖氨酸蛋白基因Sb401植物表达载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）提取马铃薯花粉高赖氨酸基因Sb401 总RNA，并逆转录成cDNA；

（2）以上述 cDNA为模板，以特异引物克隆具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的马铃薯高赖氨酸基因Sb401 ，所述特异引物序列如下：

上游引物F1:5'-ggatccttttctttttgcaagttcctcc-3'；

下游引物R1:5'-gagctcaaagaaatccccaaaagaaag-3'；

（3）将马铃薯高赖氨酸基因Sb401 与亚克隆载体pGSI连接，再将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，构建马铃薯高赖氨酸基因Sb401 亚克隆载体质粒；

（4）将上述克隆质粒构建到植物表达载体pCAMBIA1300，获得含高赖氨酸基因Sb401 片段重组表达载体CUB- Sb401 。

2.权利要求1所述高赖氨酸蛋白基因Sb401植物表达载体在玉米育种上的应用，其特征在于，采用根瘤农杆菌介导法将含如权利要求1所述的高赖氨酸基因Sb401 片段重组表达载体CUB- Sb401 导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗等阶段，获得转基因苗。

3.权利要求1所述高赖氨酸蛋白基因Sb401植物表达载体在提高转基因玉米高赖氨酸中的应用。

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