CN113444734B

CN113444734B - 耐盐型转基因杨树的制备方法及应用

Info

Publication number: CN113444734B
Application number: CN202110882389.7A
Authority: CN
Inventors: 林晓飞; 陈首业; 耿新; 闫春霞
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-08-02
Also published as: CN113444734A

Abstract

本发明公开了耐盐型转基因杨树的制备方法及应用。具体地公开了将Na⁺/H⁺逆向转运蛋白质NsSOS1的编码基因构建到过表达载体上，导入受体杨树中，得到耐盐性高于所述受体杨树的耐盐型杨树(转NsSOS1基因杨树)的方法，过表达NsSOS1基因在不同程度上提高了转基因杨树的耐盐性、耐碱性和抗氧化的能力，减少了转基因杨树MDA的积累，增加了脯氨酸的含量，提高了抗氧化酶类的活性。本发明的转NsSOS1基因杨树无论是在无菌培养条件下还是在土壤栽培条件下，比非转基因杨树表现出了更强的耐盐性，具有优良的遗传稳定性，为培育杨树新品种提供了高效的遗传转化体系，加快了杨树的育种进程，具有广泛的应用前景。

Description

耐盐型转基因杨树的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及超表达西伯利亚白刺质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的耐盐型转基因杨树的制备方法及应用。

背景技术

植物在生长发育过程中，经常会受到诸如高盐、低温、高温、干旱等非生物胁迫的影响，造成生长不良、严重时导致减产甚至死亡。进入21世纪以来，随着全球人口的不断增长、工农业污染日益加剧、淡水资源的急剧减少，土壤盐碱化日趋严重，造成了森林和草原的退化，已经成为一个世界性的资源和生态问题，严重制约了农林业生产的可持续发展，对生态环境和经济发展都造成了巨大的影响。盐胁迫是受影响的植物的细胞中水势的下降，以及影响植物细胞的关键生化途径的过量的钠离子造成的，其对植物的危害主要在渗透压胁迫和离子胁迫等方面，它们破坏植物细胞膜结构，影响许多酶的活性和光合作用器官的功能，还在植物体内产生活性氧，进而引起氧化胁迫，使植物生长受阻。随着转基因技术的日趋完善，利用基因工程手段获得抗干旱耐盐渍的转基因植物，已成为当今植物生物技术领域研究的热点之一，选育抗盐碱、耐干旱能力强的植物，提高林木、牧草耐旱耐盐性是解决干旱和盐渍问题的一条经济而有效的途径。提高植物的耐盐性，挖掘重要的耐盐遗传资源，对于培育耐盐性植物新品种起着关键的作用，耐盐植物的开发和利用具有无法估量的生态效益、经济效益和社会效益。

杨树(Populus spp.)生长迅速、生物产量高，是营造生态公益林和短周期工业原料林的重要树种。目前，我国杨树人工林面积已超1亿亩，居世界之首。在理想条件下，杨树大约4年即可成材，具有适应性强、繁殖速度快、容易杂交、容易改良遗传性、容易无性繁殖等特点，同时还可作为可再生能源的原料。采用基因工程手段培育多抗性的速生、丰产、优质杨树新品种，是近年来林木遗传改良的重要领域。目前的杨树耐盐转基因研究虽然取得了一些进展，但仅在部分树种中进行了遗传转化，且耐盐性还需进一步提高，仍然处在一个初级阶段，还存在许多问题有待于解决。因此，开发创制更优良的可商品化的转基因耐盐杨树品种，对促进林木分子育种发展及林业生态文明建设具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备耐盐型杨树和/或如何提高杨树的耐盐性。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备耐盐型杨树的方法，所述方法包括将Na⁺/H⁺逆向转运蛋白质的编码基因导入受体杨树中，得到耐盐性高于所述受体杨树的耐盐型杨树(转NsSOS1基因杨树)，所述蛋白质名称为NsSOS1，为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签，但不限于此。

表1：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的NsSOS1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的NsSOS1蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的NsSOS1蛋白质。

上述方法中，所述蛋白质NsSOS1来源于西伯利亚白刺(Nitraria sibiricaPall.)。

进一步地，所述蛋白质NsSOS1来源于西伯利亚白刺质膜，为Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。

上述方法中，所述方法包括提高或增加杨树中所述蛋白质NsSOS1的含量和/或活性。

上述方法中，所述提高或增加杨树中所述蛋白质NsSOS1的含量和/或活性可为通过提高所述蛋白质NsSOS1的编码基因的表达量实现。

所述蛋白质NsSOS1的编码基因名称为NsSOS1。

上述方法中，所述蛋白质NsSOS1的编码基因可为如下任一所示的核酸分子：

B1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；

B2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；

B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质NsSOS1的DNA分子或cDNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码NsSOS1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的NsSOS1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码NsSOS1蛋白质且具有NsSOS1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述方法中，所述杨树可为84K杨(Populus alba×Populus glandulosa)。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

D1)含有所述核酸分子的表达盒；

D2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；

D3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；

D4)含有所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

D5)含有所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D2)所述重组载体的转基因植物组织；

D6)含有所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D2)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pPZP221，也可为将pPZP221改造后得到的载体。

上述生物材料中，所述重组载体具体可为pPZP221-NsSOS1，所述pPZP221-NsSOS1重组载体是以包含NsSOS1 ORF的片段为模板，设计带有pPZP221载体同源臂的引物进行PCR，从而获得带有pPZP221载体同源臂的NsSOS1 ORF片段(即NsSOS1基因的CDS，序列为SEQID No.2)，将带有pPZP221载体同源臂的NsSOS1 ORF片段与pPZP221载体通过同源重组的方法进行连接，得到所述pPZP221-NsSOS1重组载体。

所述pPZP221-NsSOS1重组载体为过表达载体。

所述带有pPZP221载体同源臂的引物如下：

NsSOS1-ORF-F：5’-GGGGACTCTAGAGGATCCCC ATGGCAAGCCTGATGGAGGTTCT-3’

NsSOS1-ORF-R：5’-GAAATTCGAGCTCGG TACCCTCAGCCCTGGCGAAATGAGAGC-3’

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述细菌具体可为大肠杆菌。

所述蛋白质NsSOS1和/或所述核酸分子和/或所述生物材料也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了所述蛋白质NsSOS1和/或所述核酸分子和/或所述生物材料在调控杨树的耐盐性中的应用。

本发明还提供了本发明中任一所述的方法在创制耐盐型杨树和/或杨树育种中的应用。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明首次将NsSOS1基因用于制备耐盐型杨树，通过将NsSOS1基因构建到过表达载体上，转入受体杨树中，得到转NsSOS1基因的耐盐型杨树。制备的NsSOS1基因过表达的耐盐型杨树无论是在无菌培养条件下还是在土壤栽培条件下，相比于非转基因杨树表现出了更强的耐盐性。

2、本发明制备耐盐型杨树的方法具有高效、快捷、操作简便，利用本发明的方法制备的NsSOS1基因过表达的耐盐型杨树具有优良的遗传稳定性，为培育杨树新品种提供了高效的遗传转化体系，可以加快耐盐型杨树的育种进程，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为包含NsSOS1 ORF的cDNA片段。M1:200bp(Dye Plus)Marker；L1：包含NsSOS1ORF的3800bp的cDNA目的片段。

图2为NsSOS1 ORF的扩增与重组质粒的酶切鉴定，其中图2中(A)为NsSOS1 ORF(即NsSOS1基因的CDS)的扩增；图2中(B)为重组质粒的菌落PCR鉴定。M1:200bp(Dye Plus)Marker；M2:DL5000 Marker。

图3为叶盘法遗传转化杨树(比例尺＝1cm)；其中图3中(A)为预培养；图3中(B)为共培养；图3中(C)为分化培养；图3中(D)为筛选培养；图3中(E)为生根培养；图3中(F)为抗性植株。

图4为转NsSOS1基因杨树的基因组PCR鉴定；M：200bp DNA Ladder；+：重组质粒pPZP221-NsSOS1；-：非转基因杨树；S1、S8、S10、S11：转NsSOS1基因杨树。

图5为转NsSOS1基因杨树的RT-PCR鉴定；NT：非转基因杨树84K杨；S1、S8、S10、S11：转NsSOS1基因杨树。

图6为转NsSOS1基因杨树叶圆盘的抗逆性检测；其中图6中(A)为NaCl处理后的叶圆盘；图6中(B)为经NaCl处理后叶圆盘的叶绿素含量；图6中(C)为NaHCO₃处理后的叶圆盘；图6中(D)为经NaHCO₃处理后叶圆盘的叶绿素含量；图6中(E)为H₂O₂处理后的叶圆盘；图6中(F)为经H₂O₂处理后叶圆盘的叶绿素含量；NT:非转基因杨树84K杨；S1、S10、S11：转NsSOS1基因杨树

图7为转NsSOS1基因杨树在1/2MS培养基中的耐盐性检测。其中图7中(A)为非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树在含有不同浓度NaCl的1/2MS培养基中的生长状况；图7中(B)为非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树的存活率；图7中(C)为非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树在含有不同浓度NaCl的1/2MS培养基中的生根情况；图7中(D)为非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树的根生物量；NT:非转基因杨树84K杨；S1、S10、S11:转NsSOS1基因杨树

图8为转NsSOS1基因杨树在土壤栽培下的耐盐性检测。其中图8中(A)为非转基因杨树84K杨和转NsSOS1基因杨树在盐胁迫下的生长状况(比例尺＝5cm)；图8中(B)为盐胁迫下非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树的叶片(比例尺＝5cm)；图8中(C)为盐胁迫下非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树的根系(比例尺＝3cm)；图8中(D)为盐胁迫条件下非转基因与转基因杨树的株高增长量；图8中(E)为盐胁迫条件下非转基因与转基因杨树的相对含水量；图8中(F)为盐胁迫条件下非转基因与转基因杨树的叶绿素含量；图8中(G)为盐胁迫条件下非转基因与转基因杨树的根生物量。

图9为盐胁迫下转NsSOS1基因杨树的生理指标。其中图9中(A)为丙二醛(MDA)含量；图9中(B)为脯氨酸(PRO)含量；图9中(C)为过氧化氢酶(CAT)活性；图9中(D)为过氧化物酶(POD)活性；图9中(E)为超氧化物歧化酶(SOD)活性；NT:非转基因杨树84K杨；S1、S10、S11：转NsSOS1基因杨树。

图10为非转基因杨树和转NsSOS1基因杨树根、茎和叶中的Na⁺、K⁺含量。其中图10中(A)为根的Na⁺含量；图10中(B)为茎的Na⁺含量；图10中(C)为叶的Na⁺含量；图10中(D)为根的K⁺含量；图10中(E)为茎的K⁺含量；图10中(F)为叶的K⁺含量；图10中(G)为根的Na⁺/K⁺比；图10中(H)为茎的Na⁺/K⁺比；图10中(I)为叶的Na⁺/K⁺比；NT:非转基因杨树84K杨；S1、S10、S11：转NsSOS1基因杨树。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述定量实验，如无特别说明，均设三次重复，采用IBM SPSS Statistics 19软件进行差异显著性分析，不同小写字母的处理间具有显著差异(p＜0.05)。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1转NsSOS1基因杨树的制备

1、载体的构建

1-1目的基因的扩增

根据GenBank上已登录的唐古特白刺(Nitraria tangutorum)的cDNA序列(KC292267)，设计一对包含SOS1开放阅读框的特异性引物(NtSOS1-F:5’-AGTGTGTCCAAGTCAACTGTAA-3’,NtSOS1-R:5’-CAGATTGTCACCGACTGTTT-3’)，以西伯利亚白刺(Nitraria sibirica Pall.)cDNA为模板，利用全式金

TopTaq DNAPolymerase扩增包含NsSOS1 ORF(CDS)的cDNA片段，反应条件为：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃3min，35cycles；72℃10min，得到包含西伯利亚白刺质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(简称NsSOS1)CDS的3800bp的目的片段(图1)。

NsSOS1基因的CDS的核苷酸序列为SEQ ID No.2；

所述NsSOS1基因编码氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.1所示的蛋白质NsSOS1；

1-2目的基因与载体连接

以上述3800bp的目的片段为模板，使用带有载体同源臂的引物NsSOS1-ORF-F：GGGGACTCTAGAGGATCCCC ATGGCAAGCCTGATGGAGGTTCT，NsSOS1-ORF-R：GAAATTCGAGCTCGGTAC CCTCAGCCCTGGCGAAATGAGAGC(下划线标记为载体同源序列)，利用全式金

TopTaq DNA Polymerase扩增带有同源臂的NsSOS1ORF片段(图2中(A))，反应条件：95℃2min；95℃20s，68℃20s，72℃90s，35cycles；72℃5min；12℃Forever。利用

Seamless Cloning and Assembly Kit将所得片段与Sma I酶切后的pPZP221载体(内蒙古大学哈斯阿古拉教授惠赠,记载于文献：Wuyi Wang,Jeff J.Esch,Shin-Han Shiu,HasiAgula,Brad M.Binder,Caren Chang,Sara E.Patterson,AnthonyB.Bleecker.Identification of Important Regions for Ethylene Binding andSignaling in the Transmembrane Domain of the ETR1 Ethylene Receptor ofArabidopsis.The Plant Cell.Volume 18,Issue 12,December 2006,Pages 3429–3442.)通过同源重组的方法进行连接，得到pPZP221-NsSOS1重组载体，经菌落PCR验证(图2中(B))和测序后用于杨树转化。pPZP221-NsSOS1重组载体含有NsSOS1的CDS，表达氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.1所示的蛋白质NsSOS1。

2、植物材料及培养

2-1植物材料

84K杨(Populus alba×Populus glandulosa)无菌组培苗由内蒙古农业大学杨海峰副教授惠赠；培养条件：温度为24±2℃，光照强度为200μmol·m^-2·s^-1，光照周期为16h光照/8h黑暗。

2-2培养基

(1)预培养培养基的组成：MS(4.33g·L^-1)+Sucrose(30g·L^-1)+6-BA(0.5mg·L^-1)+NAA(0.05mg·L^-1)+Agar(7g·L^-1)，其余为水。

(2)共培养培养基的组成：MS(4.33g·L^-1)+Sucrose(30g·L^-1)+6-BA(1.0mg·L^-1)+NAA(0.1mg·L^-1)+AS(200μmol·L^-1)+Agar(7g·L^-1)，其余为水。

(3)分化培养基的组成：MS(4.33g·L^-1)+Sucrose(30g·L^-1)+6-BA(1.0mg·L^-1)+NAA(0.1mg·L^-1)+Cef(300mg·L^-1)+Agar(7g·L^-1)，其余为水。

(4)筛选培养基的组成：MS(4.33g·L^-1)+Sucrose(30g·L^-1)+6-BA(1.0mg·L^-1)+NAA(0.1mg·L^-1)+Cef(300mg·L^-1)+Kan(50mg·L^-1)+Agar(7g·L^-1)，其余为水。

(5)生根培养基的组成：1/2MS(2.17g·L^-1)+Sucrose(30g·L^-1)+IBA(0.4mg·L^-1)+Cef(300mg·L^-1)+Kan(50mg·L^-1)+Agar(7g·L^-1)，其余为水。

3、杨树的遗传转化

将pPZP221-NsSOS1转化农瘤杆菌(根癌农杆菌)EHA105菌株，得到含有重组质粒pPZP221-NsSOS1的EHA105菌株，利用叶盘法转化杨树，具体步骤如下：

(1)杨树叶片的预培养：挑选生长旺盛的杨树组培苗于无菌条件下剪取叶片，挑选舒展、厚实、颜色深绿的叶片，背面朝上放置到灭菌滤纸上，用刀片垂直叶脉划出伤口，划出伤口的叶片背面朝上平铺到预培养培养基上(图3中(A))，光照培养2-3d。

(2)侵染和共培养：挑取含有重组质粒pPZP221-NsSOS1的EHA105菌株到加入到含有50mg·L^-1Gent(庆大霉素)、50mg·L^-1Rif(利福平)及200μmol·L^-1AS(乙酰丁香酮)的LB液体培养基中，转速200rpm，28℃恒温震荡培养至菌液OD_600nm约0.8，加入0.01％的SilwetL-77后作为侵染液。向侵染液中放入经过预培养的叶片，侵染10-15min，期间不时摇晃。侵染完成后用滤纸吸去叶片上的菌液，把叶片平铺在共培养培养基上，暗培养2-3d(图3中(B))。

(3)分化培养：暗培养过程中，观察到叶片边缘出现可见的菌落时，将叶片转移至分化培养基上进行光照培养，直至伤口处生长出不定芽(图3中(C))。

(4)筛选培养：将不定芽移至筛选培养基上进行筛选培养(图3中(D))。

(5)生根培养：将抗性芽扦插到生根培养基中(图3中(E))，等待抗性植株生根，生根后的抗性植株(图3中(F))用于后续鉴定。

4、转NsSOS1基因杨树的鉴定

4-1基因组PCR鉴定

不定芽在含有Gent的筛选培养基上经过3周培养后，提取抗性植株基因组DNA进行PCR鉴定。以重组质粒pPZP221-NsSOS1为阳性对照，非转基因杨树为阴性对照，使用正向引物35S-F：5’-AGGAAGGTGGCTCCTACAAATG-3’和反向引物NsSOS1-R：5’-TCAGCCCTGGCGAAATGAGAGC-3’进行PCR检测，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃3min 30s，35cycles；72℃5min；12℃Forever。PCR产物约为3800bp。结果如图4所示，最终得到4株转NsSOS1基因杨树:S1、S8、S10、S11，S1、S8、S10、S11和重组质粒pPZP221-NsSOS1均可扩增出NsSOS1基因的特异性条带，而非转基因杨树没有扩增出该条带，说明NsSOS1基因已经被成功转化到杨树中。

4-2RT-PCR鉴定

提取经基因组PCR鉴定后的转NsSOS1基因杨树的RNA，进行RT-PCR鉴定。利用4株转NsSOS1基因杨树S1、S8、S10和S11反转录得到的cDNA作为模板，使用引物NsSOS1-ORF-F和NsSOS1-ORF-R检测NsSOS1基因的表达，反应条件：95℃2min；95℃20s，68℃20s，72℃90s，35cycles；72℃5min。使用引物Actin(Populus)-F：5’-AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG-3’，Actin(Populus)-R：5’-GCATCATCACAATCACTCTCCGA-3’检测Actin基因的表达，反应条件：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃20s，30cycles；72℃5min。结果如图5所示，非转基因杨树仅有Actin的扩增片段，没有NsSOS1基因的扩增片段，而在4个转NsSOS1基因杨树株系中均能扩增出Actin和NsSOS1片段，表明NsSOS1基因在转基因杨树中稳定表达。

实施例2转NsSOS1基因杨树的耐盐性检测

1、转NsSOS1基因杨树叶圆盘的抗逆性检测

为了研究转NsSOS1基因杨树的抗逆性，将温室中生长的转NsSOS1基因杨树三个株系(S1、S10和S11)和非转基因杨树84K杨(Non-transgenic，NT)的叶片进行打孔，取下直径1cm的叶圆盘，分别浸入到含有不同浓度NaCl溶液(0、50、100及150mM)、NaHCO₃溶液(0、100、200及300mM)及H₂O₂溶液(0％、1.0％、1.5％及2.0％)的培养皿中，于光照培养箱中孵育3d后记录表型并使用苏州科铭叶绿素含量测试盒测定叶绿素的含量。

如图6中(A)、(B)所示，在0mM NaCl处理下，非转基因杨树(NT)和转NsSOS1基因杨树的叶圆盘表型和叶绿素含量没有显著差异；在50mM NaCl溶液处理下，NT和转NsSOS1基因杨树的叶圆盘未表现出明显的损伤，但转基因株系S1和S11的叶绿素含量要略高于NT；随着NaCl浓度的增加，NT和转NsSOS1杨树的叶片开始受到明显的损伤，软化的叶圆盘逐渐沉浸到溶液中，在100mM NaCl溶液处理下，三个转基因株系的叶绿素含量均高于NT，其中S10和S11株系显著高于NT；在150mM NaCl溶液处理下，三个转基因株系的叶绿素含量均显著高于NT，这表明在NaCl处理下，转NsSOS1基因杨树相比于非转基因杨树表现出了更强的耐受性。

如图6中(C)、(D)所示，在0mM NaHCO₃处理下，NT和转NsSOS1杨树的叶圆盘表型和叶绿素含量没有显著差异；随着NaHCO₃浓度的增加，NT和转NsSOS1杨树的叶圆盘均受到明显的损伤，表现为叶圆盘软化、颜色暗沉、出现褐斑，但各株系受到损伤的程度不同。在100mM NaHCO₃溶液处理下，NT和转NsSOS1杨树的叶圆盘表型和叶绿素含量没有显著差异，但S10株系的叶绿素含量略高于S1、S11和NT；在200mM和300mM NaHCO₃溶液处理下，三个转基因株系的叶绿素含量均高于NT，这表明在NaHCO₃处理下，转NsSOS1杨树相比于非转基因杨树表现出了更强的耐受性。

如图6中(E)、(F)所示，在0％H₂O₂处理下，NT和转NsSOS1基因杨树的叶圆盘表型和叶绿素含量没有显著差异；在1.0％H₂O₂溶液处理下，NT和转基因杨树的叶圆盘已经可见明显的损伤，表现出叶片白化的现象，且NT受到的损伤更加严重，叶片白化的面积明显更大，其叶绿素含量低于S1和S11株系，显著低于S10株系；在1.5％H₂O₂溶液处理下，S10和S11株系的叶绿素含量显著高于NT；在2.0％H₂O₂溶液处理下，S1、S11和NT的叶绿素含量无明显差异，但S10株系的叶绿素含量显著高于NT，这表明在一定浓度的H₂O₂处理下，转NsSOS1基因杨树相比于非转基因杨树表现出了更强的耐受性。

以上结果表明，过表达NsSOS1基因在不同程度上提高了转基因杨树的耐盐性、耐碱性和抗氧化的能力。

2、无菌培养条件下的耐盐性检测

为了研究过表达NsSOS1基因对转基因杨树耐盐性的影响，首先在1/2MS培养基中进行了耐盐性的检测。实验重复三次，每次将长势一致的非转基因杨树(Non-transgenic，NT)和三个转基因株系的组培苗各3株扦插到含有不同浓度NaCl溶液的1/2MS培养基中(0、50、100、150及200mM)，培养两周后观察表型，统计存活率并使用分析天平测量根的生物量。

结果如图7中(A)、(B)所示，在不含有NaCl的1/2MS培养基中，NT和各转基因株系的生长状况均良好，表型没有明显的差异，存活率均为100％；随着NaCl浓度的增加，在含有50mM NaCl的培养基中NT和各转基因株系的生长开始受到抑制，存活率均为100％，但各转基因株系的根生物量均高于非转基因杨树(图7中(C)、(D))；NaCl浓度增加到100mM时，NT和各转基因株系的叶片出现黄化的表型，其中NT叶片的黄化现象更严重(图7中(A))，其存活率也低于各转基因株系(图7中(B))，同时，各株系的生根受到明显的抑制(图7中(C))，但各转基因株系的根生物量高于NT，其中株系S10的根生物量显著高于NT(图7中(D))；NaCl浓度增加到150和200mM时，各株系的生长均受到严重的抑制，表现出植株不生根、叶片黄化皱缩甚至枯萎的现象，但各转基因株系的生长状况优于NT(图7中(A))，其存活率也高于NT，其中株系S11的存活率显著高于NT(图7中(B))。以上结果表明，在无菌培养条件下，过表达NsSOS1基因能够提高转基因杨树的耐盐性。

3、移栽到土壤中的转基因植株的耐盐性检测

为进一步验证在土壤栽培下过表达NsSOS1基因能否提高转基因杨树的耐盐性，将NT和三个转NsSOS1基因株系移栽到营养土中，在温室培养的条件下进行耐盐性的检测。基于1/2MS培养基中进行盐胁迫的实验结果，选择浇灌含150mM NaCl的Hoagland营养液进行胁迫处理，浇灌0mM NaCl的Hoagland营养液作为对照。经过15d的胁迫处理，对各株系的表型进行观察，测定处理后各项生长和生理指标。

(1)根生物量测定：洗去杨树根部的土壤并吸干表面的水分。使用分析天平称量根的生物量(单位：g)。

(2)株高增长量：使用直尺测量处理后杨树的株高，减去处理前的株高得到株高增长量(单位：cm)。

(3)叶片相对含水量(RWC)测定：选取相同位置的叶片，测量其鲜重W_f，然后将叶片浸入蒸馏水中避光放置24h后，测量其吸重W_t，最后将叶片放入烘箱烘干至恒重，测量其干重W_d。计算叶片RWC，RWC＝(W_f-W_d)/(W_t-W_d)×100％。

(4)叶绿素含量：取各植株相同位置的叶片，使用苏州科铭叶绿素含量测试盒测定叶绿素的含量。

(5)丙二醛含量测定：按照丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量试剂盒说明书操作测定MDA含量。

(6)脯氨酸含量测定：按照脯氨酸(proline，PRO)含量试剂盒说明书操作测定PRO含量。

(7)抗氧化酶类含量的测定：按照过氧化氢酶(Catalase，CAT)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(Superoxidase，SOD)试剂盒说明书操作测定CAT、POD和SOD含量。

结果显示，在0mM NaCl处理下，NT和各转基因株系的表型无明显差异(图8中(A))，其株高增长量、叶片相对含水量、叶绿素含量和根的生物量均无显著差异(图8中(D)、(E)、(F)、(G))。在150mM NaCl处理下，NT和各转基因株系的生长均受到明显的抑制，但各转基因株系的长势要明显优于非转基因杨树(图8中(A))，各转基因株系的株高增长量均显著高于NT(图8中(D))；比较各株系的叶片(顶芽向下第三、四片)发现，NT和各转基因株系的叶片都表现出萎蔫、失水和泛黄的表型，但NT杨树叶片受到的损伤更加严重，已经出现坏死的枯斑(图8中(B))；比较RWC和叶绿素含量发现，各转基因株系的RWC均显著高于NT(图8中(E))，叶绿素含量略高于NT(图8中(F))；比较各植株的根系发现，NT和转基因杨树根系的发达程度明显弱于对照组，但各转基因株系的发达程度明显优于NT，通过比较根生物量发现，各转基因株系的根生物量均显著高于NT(图8中(G))。以结果上进一步表明，过表达NsSOS1基因能够提高转基因杨树的耐盐性。

盐胁迫除了直接造成高渗毒害，通常还伴随着氧化胁迫，使得植物的氧还原系统受到损害，因此，为了调查盐胁迫条件下过表达NsSOS1基因对转基因杨树抗氧化系统的影响，检测了非转基因杨树和转基因杨树的丙二醛(MDA)和脯氨酸的含量，以及抗氧化酶类CAT、POD和SOD的活性。结果显示，在150mM NaCl处理下，NT和各转基因株系的MDA和脯氨酸含量均显著增加，但NT的MDA含量高于转基因株系S1，显著高于S10和S11(图9中(A))；各转基因株系的脯氨酸含量均显著高于NT(图9中(B))。CAT、POD和SOD活性检测结果显示，在150mM NaCl处理下，NT和转基因杨树的CAT、POD和SOD的活性均显著增强，且各转基因株系的CAT、POD和SOD活性均高于非转基因杨树(图9中(C)、(D)、(E))，其中各转基因株系的CAT活性均显著高于NT(图9中(C))；转基因株系S1、S11的POD活性显著高于NT(图9中(D))；转基因株系S1、S11的CAT活性显著高于NT(图9中(E))。以上结果表明，过表达NsSOS1减少了转基因杨树MDA的积累，增加了脯氨酸的含量，提高了抗氧化酶类的活性，从而减轻了盐胁迫对转基因杨树造成的氧化损伤。

4、盐胁迫下转NsSOS1基因杨树的离子含量检测

为了调查过表达NsSOS1基因对转基因杨树Na⁺、K⁺分布的影响，使用ICP-OES(电感耦合等离子体光谱仪)对三个转基因株系和非转基因杨树各组织中的Na⁺、K⁺含量进行了测定，结果如图10所示，在0mM NaCl处理下，各株系根、茎和叶中的Na⁺、K⁺含量和Na⁺/K⁺比均没有显著差异；在150mM NaCl处理下，各株系根、茎和叶中的Na⁺含量均显著增加，K⁺含量均显著减少，但各转基因株系根、茎和叶中的Na⁺含量均显著低于NT(图10中(A)、(B)、(C))，K⁺含量均显著高于NT(图10中(D)、(E)、(F))，比较各株系根、茎和叶的Na⁺/K⁺比可以发现，各转基因株系根、茎和叶的Na⁺/K⁺比显著低于NT(图10中(G)、(H)、(I))。以上结果表明，过表达NsSOS1基因减少了盐胁迫下转基因杨树根、茎和叶中Na⁺含量的积累，增加了K⁺的含量，从而使植物体保持较低的Na⁺/K⁺比，这表明NsSOS1基因介导了盐胁迫下转基因杨树中过量的Na⁺外排，从而提高转基因杨树的耐盐性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古大学

<120> 耐盐型转基因杨树的制备方法及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1171

<212> PRT

<213> 西伯利亚白刺（Nitraria sibirica Pall.）

<400> 1

Met Ala Ser Leu Met Glu Val Leu Pro Pro Phe Arg Ile Leu Ala Glu

1 5 10 15

Gly Thr Asp Ser Asn Ala Val Glu Gly Ser Trp Asn Pro Thr Asp Ala

20 25 30

Val Ile Phe Val Ala Ile Ser Leu Val Leu Gly Ile Ala Ser Arg His

35 40 45

Leu Leu Arg Gly Thr Arg Val Pro Tyr Thr Val Ala Leu Leu Val Ile

50 55 60

Gly Ile Ala Leu Gly Ser Leu Glu Tyr Gly Thr Ser His Arg Leu Gly

65 70 75 80

Lys Ile Gly Asp Gly Ile Arg Leu Trp Ser Asn Ile Asp Pro Glu Leu

85 90 95

Leu Leu Ala Val Phe Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Ser Ser Phe Ser

100 105 110

Met Glu Val His Gln Ile Lys Arg Cys Leu Val Gln Met Val Leu Leu

115 120 125

Ala Gly Pro Gly Val Leu Ile Ser Thr Phe Leu Leu Gly Ala Ala Val

130 135 140

Lys Leu Ala Phe Pro Tyr Asp Trp Asn Trp Lys Thr Ser Leu Leu Leu

145 150 155 160

Gly Gly Leu Leu Ser Ala Thr Asp Pro Val Ala Val Val Ala Leu Leu

165 170 175

Lys Glu Leu Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Thr Val Ile Glu Gly Glu

180 185 190

Ser Leu Met Asn Asp Gly Thr Ala Ile Val Val Tyr Gln Leu Phe Leu

195 200 205

Gln Met Ala Leu Gly Lys Thr Phe Thr Trp Asp Ala Val Val Ala Phe

210 215 220

Leu Ala Lys Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Met Gly Leu Ala Phe Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ser Val Leu Trp Leu Gly Phe Ile Phe Asn Asp Thr Val Ile

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Thr Leu Ala Val Ser Tyr Ile Ala Tyr Phe Thr Ala

260 265 270

Gln Glu Gly Ala Asp Ile Ser Gly Val Leu Thr Val Met Thr Leu Gly

275 280 285

Met Phe Tyr Ala Ala Phe Ala Arg Thr Ala Phe Lys Gly Glu Ser Gln

290 295 300

Glu Ser Leu His Asn Phe Trp Glu Met Val Ala Tyr Ile Ala Asn Thr

305 310 315 320

Leu Ile Phe Ile Leu Ser Gly Val Val Ile Ala Glu Gly Ile Leu Ser

325 330 335

Ser Asp Asn Ile Phe Lys Asn His Gly His Ala Trp Gly Tyr Leu Ile

340 345 350

Leu Leu Tyr Ile Phe Val Leu Val Ala Arg Leu Ile Val Val Ala Thr

355 360 365

Leu Phe Pro Phe Leu Arg Tyr Phe Gly Tyr Gly Leu Asp Val Lys Glu

370 375 380

Ala Gly Ile Leu Thr Trp Ala Gly Leu Arg Gly Ala Val Ala Leu Ser

385 390 395 400

Leu Ser Leu Ser Val Lys Arg Ser Ser Gly Gly Thr Ser Asp Ile Thr

405 410 415

Ser Glu Thr Gly Thr Trp Phe Val Phe Phe Thr Gly Gly Ile Val Phe

420 425 430

Leu Thr Leu Thr Val Asn Gly Thr Thr Thr Gln Tyr Val Leu His Met

435 440 445

Leu Gly Leu Asp Lys Leu Ser Ala Ala Lys Arg Arg Ile Leu Asp Tyr

450 455 460

Thr Lys Tyr Glu Met Leu Asn Lys Ala Leu Glu Thr Phe Gly Asp Leu

465 470 475 480

Gly Asp Asp Glu Glu Leu Gly Pro Ala Asp Trp Pro Thr Val Lys Lys

485 490 495

Tyr Ile Thr Ser Leu Asn Asp Leu Glu Gly Glu Gly Thr His Pro His

500 505 510

Asn Thr Ser Asp Ser Glu Asn Met Asp Leu Thr Asn Leu Lys Asp Ile

515 520 525

Arg Ile Arg Leu Leu Asn Gly Val Gln Ala Ala Tyr Trp Gly Met Leu

530 535 540

Asp Glu Gly Arg Ile Asn Gln Thr Ser Ala Ser Leu Leu Met Gln Ser

545 550 555 560

Val Asp Glu Ala Ile Asp Leu Ala Pro Thr Glu Pro Leu Cys Asp Trp

565 570 575

Lys Gly Leu Lys Ala Tyr Val Asn Phe Pro Ser Tyr Tyr Arg Phe Leu

580 585 590

Gln Thr Gly Leu Phe Pro Arg Lys Leu Val Thr Tyr Phe Thr Val Glu

595 600 605

Arg Leu Glu Ser Ala Cys Tyr Ile Cys Ala Ala Phe Leu Arg Ala His

610 615 620

Arg Ile Ala Gln Gln Gln Leu His Asp Phe Ile Gly Asp Ser Ala Ile

625 630 635 640

Ala Ser Thr Val Ile Glu Glu Ser Gln Ala Glu Gly Glu Glu Ala Arg

645 650 655

Lys Phe Leu Glu Asp Val Arg Val Thr Phe Pro Gln Val Leu Arg Val

660 665 670

Val Lys Thr Arg Gln Val Thr Tyr Ser Val Leu Asn His Leu Leu Glu

675 680 685

Tyr Val Gln Asn Leu Glu Lys Val Gly Ile Leu Glu Glu Lys Glu Met

690 695 700

Leu His Leu His Asp Val Leu Gln Arg Asp Leu Lys Lys Leu Leu Arg

705 710 715 720

Asn Pro Pro Leu Val Lys Val Pro Lys Ile Gly Glu Ser Ile Gly Val

725 730 735

His Pro Phe Met Gly Ala Leu Pro Leu Asp Ile Arg Gln Pro Leu Glu

740 745 750

Gly Ser Thr Lys Glu Val Met Lys Leu Arg Gly Thr Thr Leu Tyr Lys

755 760 765

Glu Gly Ser Lys Ala Thr Gly Val Trp Leu Val Ser Ser Gly Val Val

770 775 780

Lys Trp Thr Ser Lys Ser Ile Arg Asn Arg His Ser Leu His Pro Val

785 790 795 800

Phe Thr His Gly Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Glu Val Leu Ile Gly Lys

805 810 815

Pro Tyr Ile Cys Asp Ile Val Thr Asp Ser Val Ala Leu Cys Phe Phe

820 825 830

Ile Asp Lys Asp Lys Ile Leu Ser Ala Leu Arg Ala Asp Pro Ala Ile

835 840 845

Glu Glu Phe Leu Trp Gln Glu Ser Ala Ile Val Leu Ala Arg Leu Leu

850 855 860

Leu Pro Gln Val Phe Glu Lys Met Thr Met Gln Asp Leu Arg Ala Leu

865 870 875 880

Val Ala Glu Arg Ser Met Met Thr Thr Phe Leu Arg Gly Glu Thr Ile

885 890 895

Glu Val Pro Arg His Ser Ile Gly Phe Leu Leu Glu Gly Phe Ile Lys

900 905 910

Thr His Val Gln Glu Glu Leu Ile Thr Ser Pro Ala Ala Leu Phe Pro

915 920 925

Gly Gln Gly Asn Leu Ser Phe Leu Ser Met Asp Ala Ser Ala Ile Lys

930 935 940

Ser Val Ser Phe Ser His Gln Gly Ser Cys Tyr Gln Val Glu Thr Arg

945 950 955 960

Ala Arg Val Ile Ile Phe Asp Ile Ala Ala Phe Glu Thr Glu Lys Thr

965 970 975

Leu Met Arg Arg Gln Ser Ser Leu Ile Ser His Ser Gly Asp Gln Pro

980 985 990

His Lys Ser Leu Ser Arg Glu His Gly Gly Leu Met Ser Trp Pro Glu

995 1000 1005

Asn Phe Phe Leu Ala Lys Gln His Lys Gln Asn Pro Glu Gly Lys

1010 1015 1020

Thr Tyr Ala Lys Thr Asn Ser Leu Ser Ala Lys Ala Met Gln Leu

1025 1030 1035

Ser Ile Phe Gly Ser Thr Asp Asp Arg Val Arg Pro Gly Ser Phe

1040 1045 1050

Ser Asn Gly Asn Gln Ala Gly Ala Gly Val Pro Ser Tyr Ser Arg

1055 1060 1065

Ala Gln Ser Tyr His Gly Tyr Pro Leu Pro Thr Ser Gly Arg Pro

1070 1075 1080

Glu Asp Ala Gly Thr Arg Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr Gly Ala

1085 1090 1095

Arg Ala Ala Ala Gly Ser Ala Thr Gly Ser Gly Ala Thr Thr Lys

1100 1105 1110

Thr Lys Arg Leu Gln Phe Ser Lys Ser Ala Gly Gln Met Ser Pro

1115 1120 1125

Pro Leu Pro Pro Arg Ala Gly Ile Asn Glu Gly His Gly Gln Glu

1130 1135 1140

Arg Asp His Ser Ser Asp Glu Ser Gly Asp Asp Asp Phe Ile Val

1145 1150 1155

Arg Ile Asp Ser Pro Ser Thr Leu Ser Phe Arg Gln Gly

1160 1165 1170

<210> 2

<211> 3516

<212> DNA

<213> 西伯利亚白刺（Nitraria sibirica Pall.）

<400> 2

atggcaagcc tgatggaggt tctgcctccc tttagaatct tggcggaagg cactgattct 60

aacgctgttg aaggtagttg gaatcctacg gacgccgtca ttttcgtcgc aataagtttg 120

gttctcggaa ttgcttccag acatttactc cgtggaacca gagttcctta tactgttgct 180

cttcttgtta tcgggattgc tctcggatct ctagaatatg gaacaagtca taggttggga 240

aagatagggg atggaattcg tctttggtca aatattgatc ctgaactttt gttggctgtt 300

ttccttcctg ctcttctttt tgagagttca ttttcaatgg aggtgcacca aataaagagg 360

tgtttggtgc aaatggttct actagctggt ccaggagttt tgatctcaac ctttttactt 420

ggagctgctg tgaagcttgc ttttccatat gactggaatt ggaaaacatc attgctgctt 480

ggaggacttc tcagtgctac tgatcctgtg gctgttgttg ctttactaaa ggagcttggt 540

gcaagcaaaa aactgagtac agttattgaa ggcgaatcct tgatgaatga tgggactgcg 600

attgtggtgt atcagctatt cttacaaatg gcacttggaa agacctttac ctgggatgct 660

gtggtcgcat ttctggctaa ggtctcactt ggagctgtag gcatgggtct tgcttttgga 720

attgcatctg ttttgtggct gggatttatt ttcaacgaca cagtgataga gatttctctg 780

acacttgcag tgagctacat tgcatacttc acagctcagg agggtgctga tatttctgga 840

gttctgacag taatgacctt gggaatgttt tatgccgcat ttgccaggac agcatttaag 900

ggtgaaagcc aagaaagttt gcacaatttt tgggaaatgg ttgcttatat tgcaaacaca 960

ttgattttca ttctgagtgg tgttgttata gcagaaggaa ttctaagcag tgacaatatt 1020

tttaagaacc atgggcatgc atggggttat ttaatcctcc tctacatatt tgtgctagtc 1080

gcacggttga ttgttgttgc aacgttgttt ccctttttgc ggtactttgg ctatggtttg 1140

gatgtgaaag aagctggtat tctcacatgg gcaggtttgc gaggggctgt tgcattgtct 1200

ctttcgctat ctgttaagcg ttccagtggc ggtacatcag acatcacttc agaaacagga 1260

acctggtttg tcttctttac cggtggaatt gtctttttga cactcactgt gaatggtact 1320

actacacagt atgttctaca tatgctagga ttggataaac tatcagcagc aaagaggcgt 1380

attctggatt acacaaagta tgaaatgttg aacaaagcac tagaaacttt tggtgatctt 1440

ggagatgatg aggagttagg acctgctgac tggcctacag ttaaaaaata cattacaagc 1500

ttaaatgatc tggaaggaga aggtactcac cctcataaca cttcagatag tgaaaatatg 1560

gacctcacaa atctaaaaga catacgcata cgccttttaa acggtgtcca agctgcttat 1620

tggggaatgc ttgacgaggg caggataaat cagacttctg ctagtcttct tatgcaatca 1680

gtagatgaag caattgactt ggcacctaca gagcctttat gtgattggaa aggcttaaaa 1740

gcatatgtca atttcccaag ttattacaga ttccttcaaa ctggtctttt tccacgaaaa 1800

ttggttactt atttcactgt ggaaaggttg gaatctgcat gttatatctg tgctgctttc 1860

ctccgtgccc acagaattgc acagcagcag ttgcatgact ttataggaga cagtgctata 1920

gcttctactg ttattgaaga gagccaagca gaaggagaag aagcaagaaa gtttctggaa 1980

gatgttcgtg taacctttcc tcaggttcta agagttgtga aaacaaggca agtaacttat 2040

tcagtgctga atcatttact tgaatatgtc caaaaccttg agaaggttgg gatattagaa 2100

gagaaggaga tgctccatct tcatgatgtt ctccagaggg acttgaagaa gcttcttcga 2160

aatcctcctc tggttaaagt accaaaaata ggtgagtcga tcggtgtcca tcccttcatg 2220

ggggctctcc ccttagatat tcgacaacca cttgaaggtt cgaccaaaga agttatgaaa 2280

cttcgtggta ccacacttta taaggaaggt tccaaggcca ctggtgtctg gcttgtatct 2340

agtggcgttg tcaagtggac aagtaaaagc attaggaaca ggcactcatt gcatccagtc 2400

tttacacatg ggagtacctt gggtttgtat gaagtgctga tcgggaagcc ttacatctgt 2460

gacattgtta cagattctgt tgcactttgt ttctttattg acaaagacaa aatactatca 2520

gcactaagag ctgatccagc gatagaagag ttcctatggc aggaaagtgc tattgtcctt 2580

gccaggctct tactacctca agtatttgag aaaatgacaa tgcaagactt gagagctctt 2640

gttgcagaga ggtccatgat gaccacattc ttaagaggag aaacaataga agtacctcga 2700

cattccattg gctttctgtt ggaaggattt attaaaaccc atgttcaaga agaacttatc 2760

acatcacctg ctgctctgtt tccaggacag ggaaatctaa gctttctaag catggatgca 2820

tctgctataa agtcagttag tttctcgcac caaggatcat gctatcaagt tgagacgaga 2880

gcaagggtga ttatttttga catagcagca tttgaaacag aaaagactct catgagaagg 2940

cagtcttcct taatatcgca ttctggtgat cagccccaca agtctctaag tagagaacat 3000

ggcggcctta tgagttggcc tgaaaatttc ttcctggcaa agcaacataa gcagaaccct 3060

gagggaaaaa cttacgctaa aacaaacagc ttatctgcaa aagcaatgca gctgagcatc 3120

tttggcagca cggatgacag agttcgtccc ggaagtttct caaatggtaa tcaagctggg 3180

gcaggtgttc cctcatattc aagagctcaa tcataccatg gttatccact accaacttct 3240

ggcagaccag aggatgccgg caccaggcct ggagctggtg atggcactgg ggctagggct 3300

gctgctggca gtgcaactgg ttctggggct actaccaaaa ccaagagact tcaatttagc 3360

aagtcggctg ggcaaatgtc tcctcccttg ccaccacgtg ctggtatcaa tgagggtcat 3420

ggacaagaac gtgatcattc aagtgatgag tctggtgatg atgatttcat agtgcgaatt 3480

gattcaccaa gcacgctctc atttcgccag ggctga 3516

Claims

1.一种制备耐盐型杨树的方法，其特征在于：所述方法包括将核苷酸序列为SEQ IDNo.2的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白质的编码基因导入受体杨树中，得到耐盐性、耐碱性和抗氧化能力高于所述受体杨树的耐盐型杨树，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述杨树为84K杨，所述蛋白质来源于西伯利亚白刺。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括提高或增加杨树中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述提高或增加杨树中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性为通过提高权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

4.权利要求1中所述的蛋白质或其编码基因在提高84K杨耐盐性、耐碱性和抗氧化能力中的应用。

5.权利要求1-3中任一所述的方法在创制耐盐型杨树和/或杨树育种中的应用，所述杨树为84K杨。