CN114540408B - 调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents
调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114540408B CN114540408B CN202210118136.7A CN202210118136A CN114540408B CN 114540408 B CN114540408 B CN 114540408B CN 202210118136 A CN202210118136 A CN 202210118136A CN 114540408 B CN114540408 B CN 114540408B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gcsg
- gene
- poplar
- protein
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 139
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title abstract description 21
- 241000219000 Populus Species 0.000 claims abstract description 88
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 35
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 22
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 92
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 23
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 abstract description 15
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 abstract description 14
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 abstract description 14
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 abstract description 14
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 abstract description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 17
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 16
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 10
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 6
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000095444 Populus davidiana Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000014793 stomatal movement Effects 0.000 description 5
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241000012946 Populus alba var. pyramidalis Species 0.000 description 3
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 2
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000012877 elongation medium Substances 0.000 description 2
- 108010045262 enhanced cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 2
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 210000003339 pole cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000025469 response to water deprivation Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000015378 stomatal closure Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 description 1
- WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NJWJSLCQEDMGNC-MBLNEYKQSA-N Ala-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C)N)O NJWJSLCQEDMGNC-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N Ala-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFXXUWGNVRJTNQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NYGILGUOUOXGMJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O NYGILGUOUOXGMJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XFJKRRCWLTZIQA-XIRDDKMYSA-N Asn-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XFJKRRCWLTZIQA-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- YHXNKGKUDJCAHB-PBCZWWQYSA-N Asn-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O YHXNKGKUDJCAHB-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- CGYKCTPUGXFPMG-IHPCNDPISA-N Asn-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O CGYKCTPUGXFPMG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000974809 Boleana Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- MUZAUPFGPMMZSS-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MUZAUPFGPMMZSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IZJLAQMWJHCHTN-BPUTZDHNSA-N Cys-Trp-Arg Chemical compound N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)O IZJLAQMWJHCHTN-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000221079 Euphorbia <genus> Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N Gln-Asn-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RMOCFPBLHAOTDU-ACZMJKKPSA-N Gln-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMOCFPBLHAOTDU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- IYAUFWMUCGBFMQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)CN=C(N)N IYAUFWMUCGBFMQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XXCDTYBVGMPIOA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JVACNFOPSUPDTK-QWRGUYRKSA-N Gly-Asn-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVACNFOPSUPDTK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GNNJKUYDWFIBTK-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GNNJKUYDWFIBTK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- NELVFWFDOKRTOR-SDDRHHMPSA-N His-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O NELVFWFDOKRTOR-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- LEDRIAHEWDJRMF-CFMVVWHZSA-N Ile-Asn-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LEDRIAHEWDJRMF-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- CSQNHSGHAPRGPQ-YTFOTSKYSA-N Ile-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N CSQNHSGHAPRGPQ-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N Leu-Arg-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N Leu-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PRZVBIAOPFGAQF-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PRZVBIAOPFGAQF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OYQUOLRTJHWVSQ-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OYQUOLRTJHWVSQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SEMUSFOBZGKBGW-YTFOTSKYSA-N Leu-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SEMUSFOBZGKBGW-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IAJFFZORSWOZPQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SQXUUGUCGJSWCK-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N SQXUUGUCGJSWCK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N Lys-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JHNOXVASMSXSNB-WEDXCCLWSA-N Lys-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O JHNOXVASMSXSNB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- MDHZEOMXGNBSIL-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N MDHZEOMXGNBSIL-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 241000168036 Populus alba Species 0.000 description 1
- 241001278112 Populus euphratica Species 0.000 description 1
- AJLVKXCNXIJHDV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ala-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O AJLVKXCNXIJHDV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KIGGUSRFHJCIEJ-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O KIGGUSRFHJCIEJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000218998 Salicaceae Species 0.000 description 1
- BLPYXIXXCFVIIF-FXQIFTODSA-N Ser-Cys-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N)CN=C(N)N BLPYXIXXCFVIIF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ZHYMUFQVKGJNRM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O ZHYMUFQVKGJNRM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- IAORETPTUDBBGV-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IAORETPTUDBBGV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HEUVHBXOVZONPU-BJDJZHNGSA-N Ser-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HEUVHBXOVZONPU-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- FBLNYDYPCLFTSP-IXOXFDKPSA-N Ser-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FBLNYDYPCLFTSP-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O XQAPEISNMXNKGE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- BDMWLJLPPUCLNV-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BDMWLJLPPUCLNV-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N Ser-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N Thr-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N Thr-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N Thr-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IRLYZKKNBFPQBW-XGEHTFHBSA-N Val-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O IRLYZKKNBFPQBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- DJQIUOKSNRBTSV-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N DJQIUOKSNRBTSV-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N Val-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006851 antioxidant defense Effects 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000021040 cytoplasmic transport Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 108010077158 leucinyl-arginyl-tryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- WJCNZQLZVWNLKY-UHFFFAOYSA-N thiabendazole Chemical compound S1C=NC(C=2NC3=CC=CC=C3N=2)=C1 WJCNZQLZVWNLKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GCSG及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明通过对杨树GCSG基因进行基因敲除，得到了杨树gcsg突变体株系。实验证明，在杨树中对GCSG基因进行敲除后，保卫细胞壁极点区域去甲酯化果胶含量增加，硬度增强，气孔响应ABA、Mannitol、干旱缺水胁迫和CO2浓度的变化的能力增强，气孔运动幅度增加，表明GCSG基因在气孔运动中具有重要的功能。与野生型杨树相比，杨树gcsg突变体株系显示出了优良的抗旱性，表明通过抑制GCSG蛋白及其编码基因的表达可以显著提高植物的抗旱性能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
植物的抗旱性是植物在干旱环境中生长、繁殖或生存，以及在干旱解除后迅速恢复生长的能力。干旱胁迫对植物的影响体现在对细胞活性，器官和组织功能的影响上。受到干旱胁迫后，植物体活性氧增加，细胞渗透调节物质变化，个体及群体光合作用受到抑制，水分利用效率受到影响，最终植物个体或群体生长受抑、形态发生变化、生物量或产量受到影响。为了在干旱胁迫条件下保证生存或保持生物量，植物会相应的做出一系列响应如气孔调控，渗透调节和抗氧化防御等抵抗干旱响应，以减轻干旱所造成的伤害。
气孔是植物与外界环境气体交换的门户，控制水分蒸腾和CO2吸入。气孔开放是植物的重要生命活动之一，是植物光合作用和呼吸作用的关键组成部分，与植物水利用效率和农业生产效率密切相关。有效调控气孔开关，在全球气候变暖和水资源危机干旱持续发生的今天显得尤为重要。尽管气孔开关运动受保卫细胞内部信号转导和水势控制，但保卫细胞细胞壁的特性是保证气孔有效开关的决定因素之一。气孔的开关运动是通过保卫细胞大小和形状的改变来实现的。当保卫细胞中溶质快速增加后吸水膨胀，保卫细胞体积增加，形状改变，气孔开放，反之，保卫细胞失水收缩，气孔关闭。在气孔开放时，保卫细胞的体积可增加70％，细胞内部压力可达5MPa，相当于大气压的50倍。保卫细胞形状改变程度与细胞壁的机械性能密切相关，要求保卫细胞细胞壁不但能承受很高的物理张力，同时要具有良好的柔韧性。保卫细胞壁的物理特性与气孔正常功能的行使密切相关。
杨树(Populus spp.)生长迅速、生物产量高，是营造生态公益林和短周期工业原料林的重要树种。在理想条件下，杨树大约4年即可成材，具有适应性强、繁殖速度快、容易杂交、容易改良遗传性、容易无性繁殖等特点，同时还可作为可再生能源的原料。当前，环境恶化严重威胁人类的生存与发展，干旱作为最大的环境压力之一，尤其受到世人的重视。在限制植物产量的诸多环境因子中，以供水条件最为重要。在干旱半干旱地区，水的短缺始终是制约农林业生产的关键因素。因此，开发创制更优良的可商品化的转基因抗干旱、节水型杨树品种，在不断恶劣的环境条件下确保农林业生产效率，改善生态环境，对促进林木分子育种发展及林业生态文明建设具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是何调控植物的抗旱性，和/或，如何提高植物抗旱性。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗旱性中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗旱性的产品中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗旱植物中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗旱植物的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
D6)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物气孔运动中的应用；
所述蛋白质名称为GCSG，可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GCSG的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GCSG的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GCSG且具有蛋白质GCSG功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GCSG。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
所述调控基因表达的物质具体可为B1)-B3)中任一所述的生物材料。
上述应用中，所述蛋白质GCSG可来源于杨树(Populus spp.)。
进一步地，所述蛋白质GCSG具体来源于山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)。
本发明还提供了与所述蛋白质GCSG相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
E1)与所述蛋白质GCSG相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；
E2)与所述蛋白质GCSG相关的生物材料在制备调控植物抗旱性的产品中的应用；
E3)与所述蛋白质GCSG相关的生物材料在培育抗旱植物中的应用；
E4)与所述蛋白质GCSG相关的生物材料在制备培育抗旱植物的产品中的应用；
E5)与所述蛋白质GCSG相关的生物材料在植物育种中的应用；
E6)与所述蛋白质GCSG相关的生物材料在调控植物气孔运动中的应用；
所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质GCSG的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：
C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物抗旱性的基因GCSG)编码氨基酸序列是SEQID No.1的蛋白质GCSG。
SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质GCSG的基因的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质GCSG的基因可以为任意能够编码蛋白质GCSG的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体包括sgRNA载体pYLsgRNA-AtU3d和/或目的载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为农杆菌GV3101和/或大肠杆菌Trans1-T1。
所述重组载体具体可为重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-1和/或pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-2。
重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-1是以SEQ ID No.2的第138-147位为靶点构建的重组载体(基因编辑载体)，其表达靶向GCSG基因(SEQ ID No.2的第138-147位)的sgRNA。
重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-2是以SEQ ID No.2的第727-746位为靶点构建的重组载体(基因编辑载体)，其表达靶向GCSG基因(SEQ ID No.2的第727-746位)的sgRNA。
本发明还提供了一种提高植物抗旱性的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白质GCSG的含量和/或活性来提高所述目的植物的抗旱性。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质GCSG的含量和/或活性可通过降低目的植物中所述蛋白质GCSG的编码基因的表达量和/或活性实现。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质GCSG的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质GCSG的编码基因活性下降或失活。
上述方法中，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中所述蛋白质GCSG的编码基因活性下降或失活可为利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列分别为SEQ ID No.2的第138-147位或第727-746位。
在本发明的一个实施方案中，所述提高植物抗旱性的方法包括如下步骤：
(1)构建靶向编辑SEQ ID No.2的第138-147位的CRISPR/Cas9重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-1；
(2)将步骤(1)构建的重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-1导入目的植物山新杨中；
(3)经筛选和鉴定获得抗旱性高于所述目的植物的抗旱植物(杨树gcsg突变体株系gcsg-1)。
在本发明的一个实施方案中，所述提高植物抗旱性的方法包括如下步骤：
(1)构建靶向编辑SEQ ID No.2的第727-746位的CRISPR/Cas9重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-2；
(2)将步骤(1)构建的重组载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-2导入目的植物山新杨中；
(3)经筛选和鉴定获得抗旱性高于所述目的植物的抗旱植物(杨树gcsg突变体株系gcsg-2)。
本文中，将重组表达载体或基因编辑载体导入所述受体植物(如杨树)，包括但不限于：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本文中，所述植物可为G1)或G2)或G3)：
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)杨柳科植物；
G3)杨树。
所述杨树具体可为山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)。
所述蛋白质GCSG，和/或，所述生物材料，和/或，所述核酸分子也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了所述提高植物抗旱性的方法在创制抗旱性植物和/或植物育种中的应用。
所述植物育种可为杨树抗旱性转基因育种。
本文所述调控植物抗旱性可为提高植物抗旱性或降低植物抗旱性。
所述GCSG蛋白或其编码基因GCSG在目的植物中的表达量和/或活性降低，植物的抗旱性提高。
本文中，所述抗旱性植物理解为不仅包含将所述GCSG基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。所述抗旱性植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了培育抗旱性提高的转基因植物(抗旱性植物)的方法，可包括如下步骤：对受体植物(目的植物)中能够表达GCSG蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高。
其中，所述对受体植物中能够表达GCSG蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而敲除其在所述受体植株中的表达。
杨树作为阔叶树种，在我国广泛栽培，需水量大的矛盾在水资源危机的当今社会显得尤为突出。本发明通过分子遗传学、分子生物学、生物化学等方法，鉴定了杨树GCSG转录因子能够调节保卫细胞壁果胶的甲酯化程度，进而改变细胞壁硬度。杨树GCSG突变体株系气孔运动能力增强，植物抗旱能力显著提高了。本发明所提供的基因、转化载体、和基因突变策略可用于改良植物气孔运动特性，创制抗干旱、节水型杨树和其它农作物新品种，在不断恶劣的环境条件下确保农业生产效率，改善生态环境。
本发明通过转基因技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，获得转录因子GCSG(Guard Cell Specific Gene)基因敲除的转基因杨树。杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁的两个极点处去甲酯化果胶的含量和细胞壁强度显著增加，导致突变体株系气孔响应ABA、Mannitol、干旱缺水胁迫和CO2浓度的变化的能力增强，气孔运动幅度增加。杨树gcsg突变体株系气孔运动能力增强，显著提高了植物的抗旱能力。
本发明通过对山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)中的GCSG蛋白(GuardCell Specific Gene)基因(GCSG基因)进行基因敲除，得到了GCSG基因相应靶点位置碱基发生突变的基因编辑杨树(杨树gcsg突变体株系gcsg-1和gcsg-2)。实验证明，与没有进行GCSG基因敲除的野生型杨树(WT)相比，GCSG基因敲除杨树显示出了优良的抗旱性，表现在：①气孔导度测定实验表明gcsg突变体株系保卫细胞的能力增强，气孔运动范围增加，适应环境的能力增强；②ABA和甘露醇处理后，gcsg突变体株系的气孔开度均显著低于野生型，气孔关闭程度大于野生型，突变体株系的运动能力增强，特别是关闭能力较野生型增强；③离体叶片失水实验结果表明gcsg突变体株系叶片失水速率均慢于WT，突变体两小时的失水为42％左右，而野生型达到55％，说明突变体株系的气孔开度较小；④干旱处理后突变体株系的叶片表面温度显著高于WT，表明突变体株系响应干旱条件，气孔关闭程度强于野生型，导致散热能力降低，叶表面温度升高；⑤在干旱胁迫条件下对表型进行观察，结果表明野生型叶片出现萎蔫症状，而两个突变体株系均未出现萎蔫表型。特别是gcsg-2突变株系，其在接近大气二氧化碳浓度的环境条件下气孔导度与野生型接近，但干旱处理后，仍表现出抗旱表型，说明气孔响应干旱胁迫后，关闭程度加强。⑥杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁极点区域去甲酯化果胶含量检测结果表明gcsg突变体保卫细胞壁中的两个极点处去甲酯化果胶的含量显著增加；⑦杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁极点区域硬度检测结果表明与野生型相比，gcsg突变体极点细胞壁强度显著增加。表明去甲酯果胶的增加，有利于增加细胞壁的强度。
综上，GCSG蛋白及其编码基因可以调控植物的抗旱性，通过抑制GCSG蛋白及其编码基因的表达可以显著增强植物对干旱的耐受性，显著提高植物的抗旱性能。在杨树中对GCSG基因进行敲除突变后，保卫细胞壁极点区域去甲酯化果胶含量增加，硬度增强，气孔响应ABA、Mannitol、干旱缺水胁迫和CO2浓度的变化的能力增强，气孔运动幅度增加，表明GCSG基因在气孔运动中具有重要的功能。本发明首次将GCSG基因用于杨树的抗旱性育种，为杨树的抗旱性育种提供了一个良好的基因资源，可以加快耐干旱型杨树的育种进程，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG重组载体模式图。
图2为杨树gcsg突变体材料鉴定。
图3为杨树gcsg突变体株系气孔导度检测。
图4为杨树gcsg突变体株系响应ABA和甘露醇信号气孔开度变化情况。
图5为杨树gcsg突变体株系叶片失水速率检测。
图6为杨树gcsg突变体株系叶表面温度检测。
图7为杨树gcsg突变体株系抗干旱胁迫能力表型图。
图8为杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁极点区域去甲酯化果胶含量检测。
图9为杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁极点区域硬度检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)来源于张红霞教授馈赠(Wang H,Wang C,Liu H,Tang R,Zhang H.An efficient agrobacterium mediatedtransformation and regeneration system for leaf explants of two elite aspenhybrid clones Populus alba×P.berolinensis and Populus davidiana×P.bolleana.Plant Cell Rep.2011；30(11):2037–44.)。
实施例1、基因编辑杨树(gcsg突变体杨树)的构建及鉴定
本申请的发明人，从山新杨中分离克隆出一个植物抗旱性相关蛋白基因，将其命名为GCSG基因。GCSG基因的编码序列(CDS)是SEQ ID No.2，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GCSG。
1、基因编辑载体(pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG，图1)的构建
基因编辑载体构建的方法，构建过程中用到的pYLsgRNA-AtU3d和pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体均来自刘耀光实验室(记载于如下文献中：Ma X L,Zhang Q Y,Zhu Q L,etal.2015.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency MultiplexGenome Editing in Monocot and Dicot Plants[J].Mol Plant,8(8):1274-1284.)
1)引物设计。将GCSG基因编号(Potri.009G134000)输入至CRISPR靶点设计网站http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR，选取SEQ ID No.2的第138-147位和第727-746位为靶点，分别合成如下引物：
gRT-GCSG-1F：TTACGACCTGACCTTAAACGgttttagagctagaaat；
gRT-GCSG-1R：CGTTTAAGGTCAGGTCGTAACaatctcttagtcgact；
gRT-GCSG-2F：GGCAGCACTAGCACAAAGAAgttttagagctagaaat；
gRT-GCSG-2R：TTCTTTGTGCTAGTGCTGCCTgaccaatggtgctttg。
2)gDNA表达盒扩增。第一轮PCR反应，15μL的体系中依次加入：5ng模板载体pYLsgRNA-AtU3d，1.5μmol引物gRT-GCSG-F，1.5μmol引物gRT-GCSG-R，3μmol引物U-F(CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG)，3μmol引物gR-R(CGGAGGAAAATTCCATCCAC)，7.5μL 2ⅹKODmix，用ddH2O补至15μL。
PCR程序为：95℃1min；30循环：95℃10sec，60℃15sec，68℃30sec；68℃3min；10℃恒温。
第二轮PCR反应，30μL的体系中依次加入：稀释10倍的第一轮PCR产物，4.5μmol引物Pps-GGL(TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG)，4.5μmol引物Pgs-GGR(AGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC)，15μL 2ⅹKOD mix，用水补至30μL。
PCR程序为：95℃1min；30循环：95℃10sec，58℃15sec，68℃30sec；68℃3min；10℃恒温。
3)gDNA表达盒回收。使用Axygen公司AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR扩增目的片段回收，具体实验步骤如下：第二轮PCR扩增产物中加入5μL6×Loading，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描后切下目的片段凝胶，取至1.5mL离心管中；加入300μL溶液A(溶胶液)，65℃加热溶胶，期间上下反转加速凝胶溶解，取出冷却至室温，加入150μL溶液B，上述溶液吸取至回收柱中，将回收柱装至试剂盒中提供2mL离心管中，离心13000g，30sec；弃滤液，加入500μL溶液W1，离心13000g，30sec；弃滤液，加入700μL溶液W2，离心13000g，30sec；弃滤液后再加入700μL溶液W2洗一次；弃滤液，离心13000g，2min；将回收柱装至试剂盒中提供1.5mL离心管，加入30μL 65℃预热ddH2O，静置2min；离心13000g，2min，得到目的片段。
4)gDNA表达盒连接pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体
利用边切边连的方式将回收的gDNA表达盒连接至目的载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N。
15μL的体系中依次加入：15ng回收的表达盒，80ng pYLCRISPR/Cas9P35S-N，1.5μLCutSmart Buffer，10U BsaI(购自NEB)，用水补至15μL。37℃酶切10min后加入0.5μL 10xNEB T4 DNA ligase Buffer，36U T4 DNA ligase。用变温循环酶切连接15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min，得到连接产物。
5)转化大肠杆菌及及鉴定
将大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(购自全式金)化置于冰上解冻，加入5μL连接产物，冰上静置30min；42℃热激45sec，冰上静置2min；在超净台中加入1mL LB液体培养基，37℃恢复培养1h；将菌液颠倒晃匀后涂在筛选固体培养基上，待干燥后，倒置于37℃恒温箱培养16～24h。
挑取单克隆，摇菌送公司测序，鉴定阳性菌株。
6)质粒提取
试剂盒提取用Axygen公司AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，参考试剂盒说明书。实验方法如下：在超净台中挑选阳性单克隆菌落接种于含有2mL LB液体培养基(含硫酸卡那抗生素)摇菌管中，放入37℃恒温摇床培养12～16h，转速为220R(转/min)；将菌液倒入1.5mL离心管，离心13000g，2min；弃上清，加入250μL Buffer S1，涡旋震荡至菌体完全悬浮；加入250μL Buffer S2，颠倒混匀，细胞被裂解，溶液变澄清且呈粘稠状；加入350μL Buffer S3，出现白色絮状沉淀，颠倒混匀，离心13000g，10min；将吸附柱放入2mL离心管中(试剂盒带)，吸取上清至制备管中，离心13000g，1min；弃废液，500μL Buffer W1，13000g离心30sec；弃废液，700μL Buffer W2，13000g离心30sec；弃废液，500μL Buffer W2，13000g离心30sec；弃废液，13000g离心2min；将吸附柱放入到一个新的1.5mL离心管中(试剂盒带)，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-80μL ddH2O，室温放置2min，离心13000g，2min，得到质粒(即基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG)。
以SEQ ID No.2的第138-147位为靶点构建的重组载体(基因编辑载体)命名为pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-1，其表达靶向GCSG基因(SEQ ID No.2的第138-147位)的sgRNA。
以SEQ ID No.2的第727-746位为靶点构建的重组载体(基因编辑载体)命名为pYLCRISPR/Cas9P35S-N-GCSG-2，其表达靶向GCSG基因(SEQ ID No.2的第727-746位)的sgRNA。
2、gcsg突变体杨树的构建
1)电击转化农杆菌。取制备的农杆菌感受态GV3101(购买自上海唯地物技术有限公司)于冰上解冻，加入1μL质粒(步骤1制备的基因编辑载体)；吸取上述菌液至电转杯中，放至电转仪，设定为Agr程序，电击转化；加入1mL不含抗生素的YEB液体培养基，反复吹吸，吸取至1.5mL离心管中，置于28℃恒温培养箱恢复1～2h；在超净台中吸取200μL菌液并涂至YEB固体培养基(含庆大霉素、硫酸卡那霉素和利福平抗生素)，倒置于28℃恒温培养箱2～3天；鉴定阳性克隆并划线至YEB固体培养基。
2)农杆菌活化。挑取单菌落，接种在30mL YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，直至对数生长OD600为0.6～0.8；将活化过夜的农杆菌按1：50的比例接种在相同的20-50mL YEP液体培养基中，继续培养至OD600为0.2～0.4；将二活的农杆菌菌液加入50mL离心管中5000rpm离心8min，去上清，加入10mL MS重悬液，用移液枪混匀，然后加入30ml MS重悬液，移入圆口瓶中，在28℃，200rpm振荡培养1h。
3)外植体的侵染及共培养。取杨树无菌叶片，切成4～6mm的叶盘到无菌瓶中；加入重悬菌液，感染10min，期间间隔3～5min轻微振荡。取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液，接种在分化培养基上，暗培养2天。
4)诱导愈伤组织。将共培养的外植体转移到愈伤选择培养基上，25℃，暗培养。每隔7～10天更换培养基一次,待转化后的外植体长出愈伤组织。
5)诱导丛生芽。将边缘长出愈伤组织的外植体转移到生芽培养基上，25℃，光照培养。每隔7～10天更换培养基一次，待转化后的外植体长出丛生芽。
6)伸长培养。丛生芽长出较多时，转移至伸长培养基。每隔10～15d更换培养基一次，至丛生芽生长。
7)生根培养。培养筛选的抗性芽长1～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。
所用试剂及培养基配制：
100×FV：称取0.05g烟酸，0.05g维生素B6，0.05g泛酸钙，0.05g维生素B1，0.5mg生物素，定容至500mL。
YEP培养基：称取5g氯化钠，10g Yeast Extract，10g Bacto-Tryptone，定容至1L，调节pH至7，120℃灭菌后添加相应的抗生素。
MS重悬液(1L)：称取2.15g MS基础培养基M519(购自Phytotech)，0.25gMES，0.2g谷氨酰胺，10mL 100×FV，1.8g半乳糖，终浓度为0.05mol/L的乙酰丁香酮，定容至1L，调节pH至5后滤灭。
共培养培养基：称取2.15g MS基础培养基M519，0.25g MES，30g蔗糖，7.2g琼脂，终浓度为0.5mg/L的NAA，调节pH至5.8，120℃灭菌后添加以下激素和抗生素(0.05mol/L乙酰丁香酮，1mg/L 2,4-D，0.02mg/L 6-BA，0.01mg/L TDZ)。
愈伤选择培养基(1L)：称取4.3g MS基础培养基M519，30g蔗糖，7.2g琼脂，终浓度为0.5mg/L的NAA，调节pH至5.8，120℃灭菌后添加以下激素和抗生素(1mg/L 2,4-D，0.02mg/L 6-BA，0.01mg/L TDZ，50mg/L Cef，200mg/L Tim，30mg/L卡那霉素)。
愈伤分化生芽培养基(1L)：称取4.3g MS基础培养基M519，30g蔗糖，7.2g琼脂，终浓度为0.5mg/L的NAA，调节pH至5.8，120℃灭菌后添加以下激素和抗生素(0.02mg/L 6-BA，0.01mg/L TDZ，50mg/L Cef，200mg/L Tim，30mg/L卡那霉素)。
伸长培养基(1L)：称取4.3g MS基础培养基M519，30g蔗糖，7.2g琼脂，终浓度为0.5mg/L的NAA，调节pH至5.8，120℃灭菌后添加以下激素和抗生素(0.02mg/L 6-BA，50mg/LCef，200mg/L Tim，30mg/L卡那霉素)。
生根培养基：称取4.3g MS基础培养基M519，30g蔗糖，7.2g琼脂，终浓度为0.5mg/L的NAA，调节pH至5.8，120℃灭菌后添加以下抗生素(50mg/L Cef，30mg/L卡那霉素)。
3、gcsg突变体杨树的鉴定
1)SDS法提取突变体杨树DNA。取杨树叶片至2mL离心管中，加入一颗钢珠，置于液氮速冻，进行下一步或-80℃保存；加入500μL DNA提取液，用高通量动植物组织研磨机将样品充分磨碎，再加入70μL 10％SDS溶液，65℃加热15min；加入150μL 5M醋酸钾，冰上放置5min；离心13400g，25min；取600μL上清至新的1.5mL离心管，加入600μL异丙醇，60μL 3M醋酸钠，颠倒混匀，-20℃静置20min，离心13400g，20min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，颠倒混匀，离心3500g，5min；弃上清，离心轻甩，吸弃剩余液体，干燥；加入40μL ddH2O溶解DNA沉淀。直接使用或-20℃保存。
所需溶液配制：
DNA提取液：称取6.05g Tris，18.625g EDTA，2.925g氯化钠，700μLβ-巯基乙醇，HCl调节pH至8.0，ddH2O定容至1L。
10％SDS：称取5g SDS，ddH2O定容至50mL。
5M醋酸钾：称取20.412g醋酸钾，ddH2O定容至50mL。
3M醋酸钠：称取20.503g醋酸钾，ddH2O定容至50mL。
2)突变序列鉴定。PCR扩增GCSG的Genomic DNA序列，50μL的体系中依次加入：50ng杨树DNA为模板，0.4μmol引物GCSG-SF(ACAAGGGTGCGTGGACCAA)，0.4μmol引物GCSG-SR(AAACTTCTATAATCCAAAACACCAC)，25μL 2ⅹKOD mix，用ddH2O补至50μL。
PCR程序为：95℃1min；30循环：95℃10sec，60℃15sec，68℃50sec；68℃3min；10℃恒温。
PCR产物送公司测序，利用DNAMAN软件进行序列比对，鉴定GCSG两个等位基因发生突变的情况。
为了确认杨树GCSG基因在保卫细胞中的功能，利用CRISPR/Cas9技术构建了杨树gcsg突变体。从266个转基因株系中鉴定到了两个双等位基因突变体gcsg-1和gcsg-2。基因序列突变测序结果如图2所示，gcsg-1突变体中一条染色体(Allele 1)中缺失1个碱基，另外一条同源染色体(Allele 2)增加了21个碱基，同时引入了终止密码子TGA；gcsg-2突变体中一条染色体(Allele 1)中增加了1个碱基，另外一条同源染色体缺失1个碱基(Allele2)。两个等位基因发生不同突变，从而将GCSG基因敲除。
4、杨树扩繁
组培苗扩繁：剪取组培苗顶端于新的培养瓶中进行组培苗扩繁。将杨树顶端剪取后，待新生侧枝长出。同样剪取侧枝顶端至新的培养瓶中。
温室种植：将灭菌后的进口营养土、东北花卉土和蛭石按体积比2:1:1混匀；将2周后生根的的组培苗进行种植。
实施例2、gcsg突变体杨树气孔运动能力和抗旱性能鉴定
1、杨树gcsg突变体气孔导度测定
气孔导度测定结果可以直接在活体叶片检测气孔的开度，实时检测气孔响应外界环境的能力。气孔是植物与外界环境进行气体交换的主要通道，环境中CO2浓度是气孔开放和关闭的关键刺激因子之一。当CO2浓度较低时，叶片气孔迅速打开，增加CO2的利用；当外界环境CO2浓度较高时，气孔开度则随之减小。为此利用LI-6400XT-光合仪检测了野生型杨树(WT)和杨树gcsg突变体株系(gcsg-1和gcsg-2)的气孔导度及响应CO2浓度的能力。测定结果如图3所示：当活体植株叶片置于接近大气CO2浓度(500ppm)的条件下30min，之后CO2浓度升高至1000ppm，野生型杨树(WT)气孔导度缓慢下降，80分钟后，降低到0.14mol·m-2·s-1左右；而杨树gcsg突变体的气孔导度在上述条件迅速下降，80分钟后，gcsg突变体株系的气孔导度显著低于野生型对照。当CO2浓度由1000ppm降低到100ppm后，和野生型相比，突变体材料气孔导度增加迅速，40分钟后，气孔导度与野生型持平。气孔导度测定实验充分证明，响应外界环境中CO2浓度变化，gcsg突变体株系保卫细胞的能力增强，气孔运动范围增加。推测gcsg突变体株系适应环境的能力增强。
2、ABA和甘露醇对突变体植株气孔开度影响
用能够促进气孔关闭的植物激素脱落酸(ABA)(图4中a)和渗透胁迫物质甘露醇(Mannitol)(图4中b)处理叶片，观察突变体株系的气孔运动情况变化。取温室正常生长50天杨树的第6位叶进行实验。首先将叶片置于MES-KOH缓冲液中光照2.5h，诱导气孔完全开放。对于ABA处理，将叶片移至加有20μM ABA的MES-KOH缓冲液中处理2h，对照同时移至不加ABA的MES-KOH缓冲液；对于Mannitol处理，将叶片移至加有0.4μM Mannitol的MES-KOH缓冲液处理过夜，对照同时移至不加Mannitol的MES-KOH缓冲液中。撕取叶片下表皮在显微镜下观察并拍照，利用ImageJ软件统计气孔宽度。在对照处理中，gcsg-1突变体株系的气孔开度小于野生型，gcsg-2突变体株系的气孔开度与野生型无显著区别；ABA和甘露醇处理后，gcsg-1突变体株系和gcsg-2突变体株系的气孔开度均显著低于野生型，气孔关闭程度大于野生型(图4)。以上结果进一步表明，突变体株系的运动能力增强，特别是关闭能力较野生型增强。
3、杨树gcsg突变体株系叶片失水速率降低
温室生长2个月杨树幼苗。实验操作在杨树培养温室进行，取杨树成熟叶片(LPI＝5、6)，背面朝上置于称量纸上，用电子天平实时称重。时间点为0、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5.5h、7h，最后将叶片烘干，称干重。记录数据并统计。每个株系至少6个平行。计算：叶片含水量Pn％＝(mn-mdry)/(m0-mdry)×100
杨树gcsg突变体离体叶片失水实验结果显示gcsg-1和gcsg-2突变体叶片失水速率均慢于WT，突变体两小时的失水为42％左右，而野生型达到55％，说明突变体株系的气孔开度较小(图5)。
4、杨树gcsg突变体株系叶表面温度升高
称取营养土100g，浇水后用镊子小心将杨树幼苗移栽营养土中，生长80天；选取生长状态一致的杨树幼苗，浇水至完全吸水，倒掉多余水，开始干旱处理。对照正常浇水。
利用红外相机对干旱处理8天的野生型杨树(WT)和杨树gcsg突变体株系(gcsg-1和gcsg-2)的叶片拍照，利用Testo IRSoft Software统计数据结果分别如图6所示。正常生长条件下，野生型和突变体株系的叶片表面温度均在24.5℃左右，无显著差别；干旱处理后，野生型叶片表面温度升高到25.5℃左右，而突变体株系叶片表面温度升高至26℃左右。干旱处理后突变体叶片表面温度显著高于WT，说明突变体株系响应干旱条件，气孔关闭程度强于野生型，导致散热能力降低，叶表面温度升高。
5、杨树gcsg突变体株系抗干旱胁迫能力增强
植物的抗旱性与气孔的开放与关闭密切相关。杨树gcsg突变体株系气孔运动能力增强，对WT和突变体株系在干旱胁迫条件下表型进行观察。温室生长80天的野生型杨树(WT)和杨树gcsg突变体株系(gcsg-1和gcsg-2)材料，每个株系42株，其中一半21株为对照，正常浇水，另外21株先浇上足够的水，待土壤吸足水分后，去除去多余的水，之后不再浇水开始干旱处理。停止浇水后9天后，野生型叶片出现萎蔫症状，而两个突变体株系均未出现萎蔫表型(见图7中a)。特别是gcsg-2突变株系，其在接近大气二氧化碳浓度的环境条件下气孔导度与野生型接近(见图3，500ppm CO2处理开始时)，但干旱处理后，仍表现出抗旱表型，说明气孔响应干旱胁迫后，关闭程度加强(图7中b)。
以上实验结果表明在杨树中GCSG基因突变后，气孔响应ABA、Mannitol、干旱缺水胁迫和CO2浓度的变化的能力增强，气孔运动幅度增加，表明GCSG基因在气孔运动中具有重要的功能。
6、杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁极点区域去甲酯化果胶含量增加
COS488是一种壳聚糖探针，可直接检测新鲜样品的去甲酯化程度，孵育15分钟后通过激光共聚焦显微镜直接观察，激发波长为488纳米，接收波长为510纳米。
取gcsg突变体和野生型杨树的第六位叶与COS488探针染色，观察如图8中a，c，e，按照图8中g图示所示，对气孔复合体周围的信号强度进行定量，每个株系检测30个保卫细胞，结果表明：与野生型相比，gcsg突变体保卫细胞壁中的两个极点区域去甲酯化果胶的峰值较高(见图8中b，d，f)；保卫细胞壁极点区域信号强度统计结果显示，gcsg突变体极点区域的信号强度高于野生型，即极点区域去甲酯化果胶的含量高于对照材料(图8中h)。
7、杨树gcsg突变体株系保卫细胞壁极点区域硬度增加
去甲酯化果胶可与钙离子结合，硬度随之增加。0.5摩尔甘露醇处理30分钟，接着用原子力显微镜检测质壁分离的保卫细胞的细胞壁强度，每个株系检测10个保卫细胞，结果如图9所示，与野生型相比gcsg突变体极点细胞壁强度显著增加。表明去甲酯果胶的增加，有利于增加细胞壁的强度。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市农林科学院
<120> 调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 杨树（Populus spp.）
<400> 1
Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ala His Thr Asn Lys Gly Ala
1 5 10 15
Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Arg Leu Val Ala Tyr Ile Arg Ala His
20 25 30
Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp
50 55 60
Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys
65 70 75 80
Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile
100 105 110
Arg Arg Lys Leu Leu Asn Arg Gly Ile Asp Pro Ala Thr His Arg Pro
115 120 125
Leu Asn Glu Pro Ala Gln Glu Ala Thr Thr Thr Ile Ser Phe Thr Thr
130 135 140
Thr Thr Thr Ser Val Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ser Ile Ile Lys Glu
145 150 155 160
Glu Ile Lys Glu Lys Leu Ile Ser Ala Thr Ala Phe Val Cys Thr Glu
165 170 175
Ala Lys Thr Gln Val Gln Glu Arg Cys Pro Asp Leu Asn Leu Glu Leu
180 185 190
Gly Ile Ser Leu Pro Ser Gln Asn Gln Pro Asp His His Gln Pro Phe
195 200 205
Lys Thr Gly Gly Ser Arg Ser Leu Cys Phe Ala Cys Ser Leu Gly Leu
210 215 220
Gln Asn Ser Lys Asp Cys Ser Cys Asn Val Ile Val Ser Thr Val Gly
225 230 235 240
Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Lys Asn Gly Tyr Asp Phe Leu Gly Met
245 250 255
Lys Ser Gly Val Leu Asp Tyr Arg Ser Leu Glu Met Lys
260 265
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> 杨树（Populus spp.）
<400> 2
atgggaaggt ctccttgctg tgaaaaagcc catacaaaca agggtgcgtg gaccaaggag 60
gaagacgatc gccttgttgc ttacattaga gctcatggtg aaggttgctg gcgttcactt 120
cctaaagccg ctggccttct tagatgtggc aagagttgca gacttcgctg gatcaactac 180
ttacgacctg accttaaacg tggcaatttc accgaagcag aagatgagct cattatcaaa 240
ctccatagcc tccttggaaa caaatggtca ctcatagctg gaagattacc agggagaaca 300
gataatgaga taaagaatta ttggaacaca catataagaa ggaagctttt gaacagaggc 360
atagatcccg caactcatag gccactcaac gaaccggcac aggaagccac aacaacaata 420
tctttcacca caaccaccac ttcagttgaa gaagagtctc ggggttctat aattaaagag 480
gaaattaaag agaagttaat tagcgcgact gctttcgtat gcacagaagc gaaaacccaa 540
gttcaagaaa ggtgtccaga cttgaatctc gaacttggaa ttagccttcc ttcccaaaac 600
cagcctgatc atcaccagcc attcaagacc ggaggaagta gaagtctttg ttttgcttgc 660
agtttggggc tacaaaacag caaggattgc agctgcaatg ttattgtgag cactgttggg 720
agcagtggca gcactagcac aaagaatggt tatgacttct tgggcatgaa aagtggtgtt 780
ttggattata gaagtttaga gatgaaataa 810
Claims (3)
1.如SEQ ID No.1所示的蛋白质在增加保卫细胞壁极点区域去甲酯化果胶含量、增加保卫细胞壁极点区域硬度和提升气孔关闭能力中的用途，所述用途包括利用基因编辑技术使目的杨树基因组中蛋白质的编码基因缺失，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述利用基因编辑技术使目的杨树基因组中蛋白质的编码基因缺失是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2的第138-147位或第727-746位。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述蛋白质的编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210118136.7A CN114540408B (zh) | 2022-02-08 | 2022-02-08 | 调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210118136.7A CN114540408B (zh) | 2022-02-08 | 2022-02-08 | 调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114540408A CN114540408A (zh) | 2022-05-27 |
| CN114540408B true CN114540408B (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=81672999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210118136.7A Active CN114540408B (zh) | 2022-02-08 | 2022-02-08 | 调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114540408B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102936605A (zh) * | 2007-10-29 | 2013-02-20 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10597667B2 (en) * | 1998-09-22 | 2020-03-24 | Mendel Biotechnology, Inc. | Stress tolerance in plants |
-
2022
- 2022-02-08 CN CN202210118136.7A patent/CN114540408B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102936605A (zh) * | 2007-10-29 | 2013-02-20 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Comprehensive analysis of the R2R3-MYB transcription factor gene family in Populus trichocarpa;Xiaoyu Yang et al.;《Industrial Crops and Products》;第168卷(第15期);第1-15页 * |
| MYB transcription factor R2R3 type [Populus tremula x Populus tremuloides];无;《GENBANK DATABASE》;CDS和ORIGIN * |
| myb-related protein 308-like [Populus alba];无;《GENBANK DATABASE》;CDS和ORIGIN * |
| Plant MYB Transcription Factors: Their Role in Drought Response Mechanisms;Elena Baldoni et al.;《Int J Mol Sci.》;第16卷(第7期);第15811–15851页 * |
| 无.MYB transcription factor R2R3 type [Populus tremula x Populus tremuloides].《GENBANK DATABASE》.2005,CDS和ORIGIN. * |
| 无.myb-related protein 308-like [Populus alba].《GENBANK DATABASE》.2020,CDS和ORIGIN. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114540408A (zh) | 2022-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112626080B (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
| CN109553671B (zh) | 枳抗寒基因PtrTZF1及其在植物抗寒遗传改良中的应用 | |
| CN110643616A (zh) | 一种烟草降烟碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用 | |
| CN109207484A (zh) | 一种烟草尼古丁含量调控基因iaa27及其克隆方法与应用 | |
| CN113444734B (zh) | 耐盐型转基因杨树的制备方法及应用 | |
| CN116120416A (zh) | SlWRKY57基因及其编码蛋白在调控番茄耐盐性中的应用 | |
| CN113388017B (zh) | 一种耐旱蛋白及其编码基因在培育耐旱植物中的应用 | |
| CN111394365A (zh) | OsDUF6基因在提高水稻耐旱性中的应用 | |
| CN114540408B (zh) | 调控植物抗旱性的基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN111424037A (zh) | 一种春兰CgWRKY70基因及其应用 | |
| CN113481176B (zh) | GA3ox1蛋白在调控苜蓿株型中的应用 | |
| CN114853860A (zh) | 与缩短落叶松育种周期相关的蛋白及其应用 | |
| CN102242134A (zh) | 大豆GmSGT基因和其5"UTR的克隆及其应用 | |
| CN112898391B (zh) | 枳抗寒基因PtrERF9在植物抗寒遗传改良中的应用 | |
| CN105585621B (zh) | 大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因与应用 | |
| CN111560055B (zh) | 水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用 | |
| CN110066810B (zh) | 一种柽柳质膜Na+/H+ antiporter基因及其应用 | |
| CN113957085A (zh) | 圆锥铁线莲异戊烯基转移酶pt1基因的应用及其过表达拟南芥株系和构建方法 | |
| CN1323168C (zh) | 一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN114875043B (zh) | 一种参与不定根发育的白桦BpPIF4基因及其应用 | |
| CN114752611B (zh) | 植物烟酸甲基转移酶基因nanmt及其在植物广谱抗病性中的应用 | |
| CN114540367B (zh) | 大豆GmPRR3b基因在调控大豆抗旱性中的应用 | |
| CN117925701B (zh) | GhTPS47基因在调控棉花黄萎病抗性中的应用 | |
| CN113121658B (zh) | 根瘤菌中含有sh3结构域的蛋白的基因及其相关生物材料和应用 | |
| CN112442494B (zh) | 拟南芥与大豆中两个tk1类受体激酶基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |