CN113121658B

CN113121658B - 根瘤菌中含有sh3结构域的蛋白的基因及其相关生物材料和应用

Info

Publication number: CN113121658B
Application number: CN202010041296.7A
Authority: CN
Inventors: 陈文峰; 季英芮; 金于皓; 隋新华; 王磊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Anhui Xinximeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN113121658A

Abstract

本发明公开了根瘤菌中含有SH3结构域的蛋白的基因及其相关生物材料和应用。本发明首先公开了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质在调控植物生长、结瘤固氮能力、根瘤鲜重、叶绿素含量和/或地上部分干重中的应用。本发明进一步公开了重组根瘤菌及促进植物生长、提高植物的共生固氮能力、调控植物的根瘤个数、提高植物的根瘤鲜重、提高植物的地上部分干重和/或提高植物的叶绿素含量的方法。本发明将SH3基因删除根瘤菌突变体作用于豆科植物，使得豆科植物共生固氮效率提高，表现为根瘤鲜重、地上部分干重和叶绿素含量增加，这对于发挥共生固氮作用，提高豆科植物产量，减少化学氮肥施用，促进可持续农业发展有着潜在的应用价值。

Description

根瘤菌中含有SH3结构域的蛋白的基因及其相关生物材料和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及根瘤菌中的含有SH3结构域的蛋白的基因及其相关生物材料和应用。

背景技术

SH3结构域是Sarcoma homology 3 domain(即禽类肉瘤同源物第3个结构域)的缩写，它是蛋白质中的一个没有催化功能结构域，通常由50～100个氨基酸组成。该结构域既可以单独存在，又可以多个串联，存于某个蛋白质中。SH3结构域最初是从病毒的接头蛋白v-Crk(v是病毒virus的缩写；Crk是CT10 regulator of kinase，即编号为CT10的禽类肉瘤病毒激酶调控子)中发现的。除病毒外，现在已知许多原核细胞、真核细胞中都发现含有类似于SH3结构域的蛋白质，它们参与并调控许多信号传导途径，并与细胞骨架、运动蛋白、内吞作用、细胞增殖、细胞分化、细胞生长等功能的发挥有关，是蛋白质与蛋白质互作中关键配件之一。在侵染真核生物的一些病原细菌中，含有SH3结构域的蛋白还是该致病菌的毒力因子之一。

典型的SH3结构域含有5个β折叠(β1～β5)、3个环、1个短的α螺旋组成，且有固定的顺序：N-末端、β1折叠、RT环、β2折叠、n-Src环、β3折叠、末端环(the distal loop)、β4折叠、3₁₀-α螺旋、β5折叠、C-末端组成。RT分别是精氨酸、苏氨酸的缩写，对于原癌基因(src)来说，它所编码的这两个氨基酸是关键的氨基酸。

SH3结构域可以通过结合靶标蛋白中富含脯氨酸区域，特别是含有典型的“PxxP”区域(P为脯氨酸，x为任意氨基酸，下同)，介导蛋白质之间的相互作用，传递信号。除能结合典型的PxxP结构域外，其它能与SH3结构域互作的靶标蛋白中，还会含有非典型的结构域，如RKxxYxxY结构域(R为精氨酸，K为赖氨酸，Y为酪氨酸)、WxxxFxxLE结构域(W为色氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，E为谷氨酸)等。这些与SH3结构域互作的非典型结构域的发现进一步表明通过SH3结构域介导的蛋白质-蛋白质互作的存在更大的多样性，所调控的生理过程也更为复杂。

根瘤菌是一类能与真核的豆科植物建立共生固氮关系的原核生物，属于革兰氏染色阴性细菌。如何提高根瘤菌与豆科植物的共生固氮效率是生物固氮研究领域的核心和热点问题，也是最终想要实现的目标。通过基因突变改造根瘤菌的遗传特性，获得共生固氮效率更高的稳定的突变体是重要技术手段。但通常情况下，根瘤菌中的基因突变却常常导致共生固氮效率的下降，要想筛选到共生固氮效率提高的稳定的正突变体，较为困难，且报道的不多。根瘤菌中也有含有SH3结构域的蛋白，但将该蛋白的基因删除后，获得的突变体，以及突变体接种到豆科植物上时，对共生固氮效率的影响还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何删除根瘤菌中的一个编码SH3结构域的基因，获得突变体，以及将该突变体接种于豆类时能否提高突变体与豆类的共生固氮能力。

为解决上述问题，本发明提供了一种含有SH3结构域的蛋白质的基因，来源于费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株CCBAU 45436，所述基因为如下A1)或A2)或A3)所示：

A1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

A2)编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

A3)在严格条件下与A1)或A2)限定的DNA分子杂交，且编码SEQ ID NO.2所示的蛋白质的DNA分子。

上述基因中，所述SEQ ID NO.1由552个核苷酸组成。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

本发明还提供了含有SH3结构域的蛋白质。

本发明所述含有SH3结构域的蛋白质为如下B1)或B2)或B3)所示：

B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

B2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

B3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，SEQ ID NO.2由183个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质的相关生物材料，也在本发明的保护范围之内。

本发明所述蛋白质的相关生物材料为下述C1)-C8)中的任一种：

C1)编码上述蛋白质的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C5)降低上述蛋白质的基因的表达量和/或抑制上述蛋白质的活性和/或降低上述蛋白质的含量的核酸分子；

C6)含有C5)所述核酸分子的表达盒；

C7)含有C5)所述核酸分子的重组载体、或含有C6)所述表达盒的重组载体；

C8)含有C5)所述核酸分子的重组微生物、或含有C6)所述表达盒的重组微生物、或含有C7)所述重组载体的重组微生物。

上述相关生物材料中，C1)所述核酸分子即为含有SH3结构域的蛋白质的基因，为如下A1)或A2)或A3)所示：

A1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

A2)编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

上述相关生物材料中，C3)所述重组载体可含有SEQ ID NO.1所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子。

上述相关生物材料中，C5)所述核酸分子为由上述蛋白质的基因(即SEQ ID NO.1所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子)的上游同源臂和下游同源臂组成的重组DNA分子。

上述相关生物材料中，C7)所述重组载体为基因删除载体pJQ200SK-ΔSH3。该载体具体为在质粒pJQ200SK的SmaI酶切位点间插入由上述蛋白质的基因(即SEQ ID NO.1所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子)的上游同源臂和下游同源臂组成的重组DNA分子，且保持其它序列不变得到的重组载体。

本发明还提供上述蛋白质或上述蛋白质的基因或相关生物材料的下述任一种D1)到D12)中的应用：

D1)调控植物生长；

D2)制备调控植物生长的产品；

D3)调控植物的结瘤固氮能力；

D4)制备调控植物的结瘤固氮能力的产品；

D5)调控植物的根瘤个数；

D6)制备调控植物的根瘤个数的产品；

D7)调控植物的根瘤鲜重；

D8)制备调控植物的提高根瘤鲜重的产品；

D9)调控植物的叶绿素含量；

D10)制备调控植物的叶绿素含量的产品；

D11)调控植物的地上部分干重；

D12)制备调控植物的地上部分干重的产品。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本发明进一步还提供了一种重组根瘤菌。

本发明所述重组根瘤菌与受体根瘤菌相比，所述重组根瘤菌中上述蛋白质的基因的表达量降低和/或上述蛋白质的含量降低和/或上述蛋白质的活性降低。

上述重组根瘤菌中，所述受体根瘤菌为费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株CCBAU 45436。

本发明还提供了上述重组根瘤菌的构建方法。

本发明重组根瘤菌的构建方法包括降低受体根瘤菌中上述蛋白质的基因的表达量和/或上述蛋白质的含量和/或上述蛋白质的活性。

上述构建方法中，所述降低所述受体根瘤菌中上述蛋白质的基因的表达量和/或上述蛋白质的含量和/或上述蛋白质的活性的方法为将受体根瘤菌中上述蛋白质的基因(即SEQ ID NO.1所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子)的上游同源臂和下游同源臂组成的重组DNA分子构建得到的重组载体导入到受体根瘤菌。

上述构建方法中，所述受体根瘤菌为费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株CCBAU 45436。

在本发明具体的实施方式中，所述构建方法包括：

1)得到上述蛋白质的基因的上游同源臂SH3U和下游同源臂SH3D；

2)将质粒pJQ200SK酶切后与上游同源臂SH3U和下游同源臂SH3D进行无缝克隆方法连接，得到基因删除载体pJQ200SK-ΔSH3；

3)将基因删除载体pJQ200SK-ΔSH3通过三亲本结合导入到受体根瘤菌中，筛选获得重组根瘤菌。

本发明进一步还提供了促进植物生长、调控植物的根瘤个数、提高植物的根瘤鲜重、提高植物的地上部分干重和/或植物的叶绿素含量的方法。

本发明促进植物生长、调控植物的根瘤个数、提高植物的根瘤鲜重、提高植物的地上部分干重和/或提高植物的叶绿素含量的方法，包括将上述重组根瘤菌作用于植物，以促进植物生长、调控植物的根瘤个数、提高植物的根瘤鲜重、提高植物的地上部分干重和/或提高植物的叶绿素含量。

上文中，所述植物为如下任一种：

E1)豆科植物；

E2)大豆；

本发明中将与大豆共生的费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株CCBAU45436中含有SH3结构域的蛋白的基因删除后，获得的SH3基因删除根瘤菌突变体(即重组根瘤菌)作用于豆科植物(如大豆)，使得豆科植物结瘤固氮效率提高，表现为植物的根瘤鲜重增加、地上部分干重增加和叶绿素含量增加，表明根瘤菌中的含有SH3结构域的基因影响到根瘤菌与豆科植物的共生固氮效率。突变体具备提高豆科植物固氮量，从而具有提高豆类产量，减少化学氮肥施用的潜力，这对于保护粮食安全，避免人类遭受赖以生存的空气、土壤、水体受过量化学氮肥施用带来的潜在污染的风险，对可持续农业生产有着潜在的利用价值。另外，本发明还为未来深入研究SH3结构域与其他蛋白的分子互作，调控根瘤菌自生、共生状态的生理，特别是研究共生固氮调控机制打下了基础。

附图说明

图1为菌落PCR的电泳检测结果；其中，M为Marker；泳道1和17为CCBAU45436菌株的SH3基因被删除后的突变体(△SH3)的菌落PCR扩增SH3基因两侧序列电泳结果，相比其它，片段大小已变小，说明SH3基因已被删除；其它泳道为野生型根瘤菌CCBAU 45436的菌落PCR扩增SH3基因完整序列的电泳结果。

图2为菌落PCR的电泳检测结果；其中，M为Marker；泳道4、9、11、13为回补突变体的菌落PCR的电泳结果，比其它片段大小要大，说明SH3基因被回补成功；其它泳道为根瘤菌CCBAU 45436ΔSH3的电泳结果，片段较小。

图3为不同菌株接种于大豆上的各种表型结果；其中，A：大豆叶片的叶绿素含量，B：根瘤个数，C：大豆根瘤鲜重，D：大豆地上部分干重。

图中，各处理的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，有相同字母的表示差异不显著或没有差异。每个处理种植20棵苗。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明下述实施例中涉及到的溶液或培养基的配制方法：

抗生素(贮藏液)：

萘啶酮酸(Nalidixic acid，NA)：30mg/mL；甲氧苄啶(Trimethoprim，Tmp)：10mg/mL；卡那霉素(Kanamycin，Km)：50mg/mL；庆大霉素(Gentamicin，Gen)：30mg/mL。所有的抗生素需要用无菌过滤器及0.2μm的过滤膜过滤除菌，分装，–20℃避光保存。这些抗生素用于筛选具有抗性的菌株，抑制没有抗性的菌株，从而直到筛选的作用。最终的使用浓度为按稀释1000倍的浓度。

生理盐水：

称取0.8g NaCl，溶于100mL的去离子水中,121℃湿热灭菌20min。用于种子消毒过程中的消毒液的清洗，或用于根瘤菌菌株浓度的调节，或清洗。

3％次氯酸钠(NaClO)：

20mL NaClO试剂(15％)与80mL灭菌的去离子水混合均匀,现用现配。用于大豆种子表面消毒。

0.6％水琼脂培养基：

6g琼脂粉，加水定容至1L，灭菌后，加入到合适大小的培养皿内。用于大豆种子的生根萌发。

5×TBE电泳缓冲液：

Tris 54.0g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH 8.0)20mL,加去离子水定容到1L，充分溶解后备用。用做核酸电泳检测时的缓冲液。使用时稀释为1×。

TY(Tryptone-yeast medium)培养基(1L)：

胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl₂ 0.6g，调节pH为6.8-7.2。(如配制固体培养基，则加入15g琼脂粉/升)。121℃湿热灭菌35min。用于培养根瘤菌。

LB(Luria-Bertani medium)培养基(1L)：

胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g，调节pH为6.8-7.2。(如配制固体培养基，则加入15g琼脂粉/升)。121℃湿热灭菌35min。用于培养大肠杆菌(E.coli)。

YEM(Yeast extract mannitol medium)培养基(1L)：

酵母粉0.8g,甘露醇20g,K₂HPO₄ 0.5g,MgSO₄·7H₂O 0.2g,NaCl 0.1g,pH7.0,121℃湿热灭菌35min。用于液体培养根瘤菌。

20×植物低氮营养液(1L)：

CaSO₄ 0.46g,Ca(NO₃)₂ 0.03g,KCl 0.075g,MgSO₄·7H₂O 0.06g,K₂HPO₄ 0.136g,柠檬酸铁0.075g,微量元素1mL,121℃湿热灭菌35min。用于满足大豆等豆类对矿质营养的需要，同时，只含微量的氮素，以防止对根瘤菌结瘤固氮时的抑制作用。使用时稀释到1×使用。

上述的微量元素液(1L)：

ZnSO₄ 0.22g,H₃BO₃ 2.86g,H₂MoO₄0.02 g,CuSO₄·5H₂O 0.8g,MnSO₄1.81 g,加入去离子水1L,121℃湿热灭菌35min。用于添加到上述植物低氮营养液中，满足大豆等豆类在共生固氮时对微量元素的需要。

本发明下述实施例中涉及到的常规的实验方法如下：

1、基因组提取

根瘤菌的基因组DNA的提取方法按照DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP302)说明书的提取。用Nanodrop核酸检测仪测定核酸浓度和纯度后，–20℃保存。

2、质粒提取

采用质粒小提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP103)提取质粒DNA。按照试剂盒说明书进行操作。用Nanodrop核酸检测仪测定核酸浓度和纯度后，–20℃保存。

3、DNA片段的回收

采用DNA片段回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号：DP204)回收纯化PCR产物以及酶切反应产物。

4、无缝克隆

1)确定目的基因在载体上的插入位点。

2)引物设计：目的片段的上游引物的N-端和下游引物的C-端对应添加插入位点N-端和C-端20bp左右的载体序列。

3)扩增目的基因，纯化回收片段。

4)在插入位点选择合适的限制性内切酶，酶切载体，纯化回收片段。

5)连接：根据无缝克隆试剂盒(庄盟生物，货号：ZC232-1)说明书配制连接体系，反应。

5、三亲本接合实验

1)在含有相应抗生素的TY固体培养基上活化受体根瘤菌CCBAU 45436(记载于非专利文献：Liu et al.Molecular Plant-Microbe Interaction,2018,31(2):224-232)，28℃倒置培养3-4天，待长出单菌落，并挑取单菌落接种于5mL TY液体培养基中(含萘啶酮酸)，28℃，180rpm培养至对数生长期。

2)分别在含相应抗生素的LB固体培养基上活化供体菌(含有基因删除质粒pJQ200SK-ΔSH3的E.coli)和含有辅助质粒pRK2013的辅助菌E.coli(记载于非专利文献：Liu et al.Molecular Plant-Microbe Interaction,2018,31(2):224-232)，各挑取单菌落接种于含有相应抗生素(供体菌：庆大霉素；含pRK2013质粒的辅助菌E.coli：卡那霉素)的5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养10-12h。

3)分别取受体根瘤菌(野生型CCBAU 45436)、供体菌(含有基因删除质粒pJQ200SK-ΔSH3的E.coli)和辅助菌(含有辅助质粒pRK2013的辅助菌E.coli)培养物3mL、1mL、1mL，离心力为8000g室温离心5min收集菌体，用TY液体培养基悬浮洗涤菌体两次，弃上清。

4)分别用1mL TY液体重悬三种菌体，分别吸取1mL受体菌、300μL供体菌和200μL辅助菌置于1.5mL Eppendorf管中混匀，离心力为8000g室温离心5min，弃上清，加入约30-50μL的TY液体，轻轻悬浮沉淀使之混匀。

5)将菌悬液点接于无抗性的TY平板上，待菌液吸干后，28℃倒置培养24～40h。

6)收集TY平板上的菌苔置于1.5mL Eppendorf管中，并用1mL无菌水悬浮，用枪吹打混匀，梯度稀释菌悬液，一般为原液、10^-1、10^-2。分别取200μL不同稀释梯度的菌悬液，涂布于筛选抗性(同时含供体菌和受体菌的抗性)TY平板上，28℃倒置培养一周。

7)待长出单菌落后，挑取单菌落划线于筛选平板中，28℃培养3-5天，挑取长出来的菌进行菌落PCR验证筛选阳性克隆，并将产物送测序，最后将测序无误的阳性克隆纯化两次后保存突变菌株。

6、PCR扩增

1)高保真PCR扩增

用高保真酶Q5(购自NEB公司，货号：M0491)进行PCR扩增。50μL扩增体系配置如下：

采用扩增程序如下：98℃预变性30s；98℃变性8s，58℃退火20s，72℃延伸20s；后三个步骤(即变性、退火、延伸)重复30-35个循环。

扩增完成后取5μl扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测。

2)菌落PCR扩增

使用普通Taq酶(GENSTAR，货号A012-101)。25μL扩增体系如下：

扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s；72℃延伸30s；后三个步骤(即变性、退火、延伸)重复30-35个循环。

扩增完成后取5μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,挑取2-3个阳性克隆送擎科公司进行序列验证。

7、DNA片段纯化回收

根据北京天根生化科技有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(货号：DP204)中的说明书进行操作。

8、酶切连接及转化

限制性内切酶(货号：R0141V)和T4连接酶(货号：M0202V)均购买自NEB公司，根据相应的产品说明书以及不同产物和载体的特性构建不同的酶切体系和连接体系。

将连接产物进行热激转化，使用康润公司DH5α化学感受态细胞(产品货号：S101-02)，且在无菌环境中按照说明书进行操作。

本发明发明人从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株CCBAU 45436(记载于非专利原始文献：Zhang et al.Appl Environ Microbiol.2011,77:6331-6342)发现了与共生固氮相关的含有SH3结构域的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由552个核苷酸组成，编码SEQ ID NO.2所示的蛋白。将与大豆共生的快生根瘤菌(即本发明的费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株CCBAU 45436)中删除含有SH3结构域的基因后，发现得到的SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)接种到大豆上的共生固氮效率提高了。因此，获得SH3基因删除根瘤菌突变体对于农业生产中提高共生固氮效率有着潜在的意义。

实施例1 SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)(即重组根瘤菌)构建

一、基因删除载体pJQ200SK-ΔSH3的构建

提取根瘤菌菌株CCBAU 45436的基因组DNA，以根瘤菌菌株CCBAU 45436的基因组DNA为模板，利用高保真Q5酶(购自NEB公司，货号：M0491)和表1中引物△SH3 U-F和△SH3U-R进行PCR扩增，获得待删除基因编码序列(SH3)的上游同源臂SH3U；利用高保真Q5酶(购自NEB公司，货号：M0491)和表1中引物△SH3 D-F和△SH3 D-R进行PCR扩增，获得待删除基因编码序列(SH3)的下游同源臂SH3D；获得的上游同源臂SH3U大小为783bp，下游同源臂SH3D大小为770bp。经1％琼脂糖凝胶电泳检测条带单一、片段大小一致后，进行片段回收。

利用SmaI酶切限制性内切酶(购自NEB公司，货号：R0141V)切割质粒pJQ200SK(Addgene公司，货号：Plasmid#78497)，酶切后获得产物与上游同源臂SH3U和下游同源臂SH3D以摩尔比为1:3:3利用无缝克隆方法连接，获得连接产物，即得基因删除载体pJQ200SK-△SH3。序列测序验证时，使用的引物为表1中的M13F和M13R。

二、SH3基因删除根瘤菌突变体构建

使用热激转化将基因删除载体pJQ200SK-ΔSH3转化至E.coli DH5α化学感受态细胞(康润公司，货号：S101-02)，长出单菌落后用牙签划线法转接到新的LB抗性(庆大霉素，终浓度30μg/mL)平板上继续培养，利用引物M13F、M13R进行菌落PCR，电泳检测及测序成功后获得含基因删除载体pJQ200SK-ΔSH3的供体菌，然后以根瘤菌CCBAU 45436菌株为受体根瘤菌，供体菌、受体根瘤菌和含有辅助质粒pRK2013的辅助菌DH5α进行三亲本结合试验，获得突变体菌落，进行菌落PCR(引物△SH3DE-F和△SH3DE-R，见表1)和电泳检测，结果如图1所示，第1和第17泳道代表了突变体菌落的电泳结果，两个泳道中箭头所示的片段大小约1500bp，而其它泳道代表根瘤菌CCBAU 45436的电泳结果，其片段大小为2000bp左右，由于SH3基因被删除，扩增得到的片段大小减小，因此，表明获得了SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)。

经筛选鉴定后，将获得的SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)用灭菌的20％甘油–20℃保藏菌种。

表1.用于基因删除的引物序列及酶切位点

注：引物序列中的下划线为SmaI的酶切位点。

实施例2 SH3基因回补根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436Rev SH3)的构建

一、基因回补载体pJQ200SK-SH3的构建

提取根瘤菌菌株CCBAU 45436的基因组DNA，以根瘤菌菌株CCBAU 45436的基因组DNA为模板，利用高保真Q5酶(购自NEB公司，货号：M0491)和表2中引物(Rev F和Rev R)进行PCR扩增，获得包含SEQ ID NO.1所示的根瘤菌菌株CCBAU45436的SH3编码基因的PCR产物；利用SmaI酶切pJQ200SK质粒，酶切后的产物与PCR产物利用无缝克隆方法连接，获得连接产物，即基因回补载体pJQ200SK-SH3。

二、SH3基因回补根瘤菌突变体构建

使用热激转化将基因回补载体pJQ200SK-SH3转化至E.coli DH5α化学感受态细胞(康润公司，货号：S101-02)，长出单菌落后用灭菌牙签划线法转接到新的LB抗性(庆大霉素，终浓度30μg/mL)平板上继续培养，利用表1中的M13F、M13R通用引物进行菌落PCR，电泳检测及测序成功后获得供体菌，然后以SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)为受体根瘤菌，供体菌、受体根瘤菌和含有辅助质粒pRK2013的辅助菌进行三亲本结合试验，获得突变体菌落，进行菌落PCR和电泳检测，以SH3基因两端序列设计引物(Rev DE-F和Rev DE-R，见表2)，进行菌落PCR后，与受体根瘤菌相比突变体菌落的产物片段大小变大，则说明获得了SH3基因回补根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436Rev SH3)。

结果如图2所示，第4、9、11、13泳道代表了突变体菌落的电泳结果，大小为2000bp左右，其它泳道代表了受体根瘤菌S.fredii CCBAU 45436ΔSH3的电泳结果，大小为1500bp左右，与图1所示的结果一致，即删除后，片段变小，回补后片段与根瘤菌CCBAU 45436一致，因此，表明获得了SH3基因回补根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436Rev SH3)。

经筛选鉴定后，将获得的SH3基因回补根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436RevSH3)用灭菌的20％甘油–20℃保藏菌种。

表2.用于回补菌株扩增的引物及酶切位点

注：下划线为SmaI的酶切位点。

实施例3共生表型实验

本实施例中共设置四个处理，即野生型根瘤菌组(WT)、SH3基因删除根瘤菌突变体组(△SH3)、SH3基因回补根瘤菌突变体(Res)、不接菌处理的对照组(con)，每个处理20棵大豆，且进行三次独立的生物学重复实验。

一、菌株培养及接种浓度

活化待接种野生型根瘤菌菌株(CCBAU 45436)，用含有萘啶酮酸抗生素(50ng/mL)的TY液体培养基，28℃，180rpm，振荡培养24h，使得野生型根瘤菌菌株(CCBAU45436)在大豆种子萌发完成时生长至OD₆₀₀为2.0左右。然后低速4℃离心收集菌体，并重悬于0.8％生理盐水中，得到野生型根瘤菌的菌悬液，调整菌悬液浓度OD₆₀₀为0.2。

活化待接种SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)，用含有萘啶酮酸抗生素(50ng/mL)的TY液体培养基，28℃，180rpm，振荡培养24h，使得SH3基因删除根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436ΔSH3)在大豆种子萌发完成时生长至OD₆₀₀为2.0左右。然后低速4℃离心收集菌体，并重悬于0.8％生理盐水中，得到SH3基因删除根瘤菌突变体的菌悬液，调整菌悬液浓度OD₆₀₀为0.2。

活化待接种SH3基因回补根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436Rev SH3)，用含有萘啶酸抗生素的TY液体培养基，28℃，180rpm，振荡培养24h，使得SH3基因回补根瘤菌突变体(S.fredii CCBAU 45436Rev SH3)在大豆种子萌发完成时生长至OD₆₀₀为2.0左右。然后低速4℃离心收集菌体，并重悬于0.8％生理盐水中，得到SH3基因回补根瘤菌突变体的菌悬液，调整菌悬液浓度OD₆₀₀为0.2。

二、种子消毒及萌发

挑取饱满无破损的大豆种子(品种：东农252，购自黑龙江普兰农业发展有限公司)，对种子进行消毒：95％乙醇表面清洗种子30s，弃乙醇，然后加入(1:5，体积/体积)的NaClO(终浓度为3％)溶液浸泡3-5min，弃NaClO，用无菌水清洗6-7次，最后将处理好的种子均匀摆放至0.6％水琼脂平皿上，放28℃培养箱，避光培养36-48h。

三、双层钵法种苗

使用1×植物低氮营养液将蛭石拌匀，121℃湿热灭菌90min，并分装在上层的塑料杯中，塑料杯底部有孔，并用纱布穿过，另外将装有去离子水的玻璃瓶进行121℃湿热灭菌35min处理，作为下层，与上层塑料杯组成双层钵。种苗过程需要在超净工作台中进行，避免污染。

四、接种根瘤菌及大豆的培养

挑取步骤二得到的正常生根的大豆种子放于步骤三得到的双层钵上层蛭石中，将分别接种步骤一得到的1mL野生型根瘤菌的菌悬液(WT)、1mL SH3基因删除根瘤菌突变体的菌悬液(△SH3)、1mL SH3基因回补根瘤菌突变体的菌悬液(Res)。对照组不接种任何根瘤菌，只接种等量的灭菌的去离子水(Con)。上层塑料杯用透气封口膜封口，置于人工光照间培养(24℃，12/12h昼夜周期)，在生长第4天时剪口。培养期间需要根据大豆生长情况，定期补充灭菌的去离子水，以使大豆植物能够健康生长。

五、收获及数据统计

收获生长35天的大豆植株，记录每株植物的叶绿素含量、根瘤数、根瘤鲜重和地上干重等指标，对植株拍照，并采用Excel进行作图和分析。

结果如图3所示，结果显示接种SH3基因删除根瘤菌突变体(图中以“ΔSH3”表示)的大豆叶片的叶绿素含量最高(图3中A所示)；接种SH3基因删除根瘤菌突变体(图中以“ΔSH3”表示)的大豆根瘤数量高于接种野生型根瘤菌(图中以“WT”表示)的根瘤数量(图3中B所示)；接种SH3基因删除根瘤菌突变体(图中以“ΔSH3”表示)的大豆根瘤鲜重高于野生型根瘤菌(图中以“WT”表示)接种于大豆的根瘤鲜重(图3中C所示)；接种SH3基因删除根瘤菌突变体(图中以“ΔSH3”表示)的大豆地上部干重高于野生型根瘤菌(图中以“WT”表示)接种于大豆的地上部鲜重(图3中D所示)；接种SH3基因删除根瘤菌突变体(图中以“ΔSH3”表示)的大豆地上部的长势明显优于SH3基因删除根瘤菌突变体(图中以“ΔSH3”表示)接种于大豆的地上部。而野生型根瘤菌(图中以“WT”表示)和SH3基因回补根瘤菌突变体(图中以“Res”表示)在叶绿素含量、根瘤鲜重和地上干重上无显著性的差异。不接种根瘤菌的对照处理用“Con”表示。与其它处理相比，对照处理的大豆叶绿素明显低于其它处理(图3A)；对照处理植株根系不结根瘤(图3B和C)，在生长期内，地上部干重比接种SH3基因删除突变体的要低(图3D，不显著)。

由图3可知，SH3基因删除根瘤菌突变体促进了大豆的结瘤和叶片叶绿素含量，提高了共生固氮效率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 根瘤菌中含有SH3结构域的蛋白的基因及其相关生物材料和应用

<130> GNCFY200072

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii) 菌株CCBAU 45436

<400> 1

atgggcttcg tcatgcgtca catcatttcc aaagcctcta tatggttgct ggctatgttc 60

ctcggaaccg ccatcatgaa ttccacggcc tttgcccaag cggccaaggg cccgagcggt 120

ctgccgctcc cccgcttcgt cagtctcaag tccaggagcg tcaacctgag gatcgggccg 180

agcctcgatt acgcggtggc cttccgctat ctgaaaaccg gcgttcccgt cgagatcatc 240

caggagtacg acaactggcg ccgcatccgc gacgccgacg gaacggaggg ctgggtcaac 300

caggcgctgc tctccggcga tcgcaccgcc gttgccgcac cgtggatgcg cggcaagggc 360

gaaggcatct tcgtcaatct gagacgcgac ccacagagta cggcaccgat cgttgcccgc 420

atgcagccgg gcgtgctgct gcatatcggc gaatgcaatg gcgactggtg ccatgccgag 480

acgcaaggcg tcgaaggctg gatcgcccag agcgaaatct ggggcgccta tccgggcgaa 540

gccttcaaat ag 552

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii) 菌株CCBAU 45436

<400> 2

Met Gly Phe Val Met Arg His Ile Ile Ser Lys Ala Ser Ile Trp Leu

1 5 10 15

Leu Ala Met Phe Leu Gly Thr Ala Ile Met Asn Ser Thr Ala Phe Ala

20 25 30

Gln Ala Ala Lys Gly Pro Ser Gly Leu Pro Leu Pro Arg Phe Val Ser

35 40 45

Leu Lys Ser Arg Ser Val Asn Leu Arg Ile Gly Pro Ser Leu Asp Tyr

50 55 60

Ala Val Ala Phe Arg Tyr Leu Lys Thr Gly Val Pro Val Glu Ile Ile

65 70 75 80

Gln Glu Tyr Asp Asn Trp Arg Arg Ile Arg Asp Ala Asp Gly Thr Glu

85 90 95

Gly Trp Val Asn Gln Ala Leu Leu Ser Gly Asp Arg Thr Ala Val Ala

100 105 110

Ala Pro Trp Met Arg Gly Lys Gly Glu Gly Ile Phe Val Asn Leu Arg

115 120 125

Arg Asp Pro Gln Ser Thr Ala Pro Ile Val Ala Arg Met Gln Pro Gly

130 135 140

Val Leu Leu His Ile Gly Glu Cys Asn Gly Asp Trp Cys His Ala Glu

145 150 155 160

Thr Gln Gly Val Glu Gly Trp Ile Ala Gln Ser Glu Ile Trp Gly Ala

165 170 175

Tyr Pro Gly Glu Ala Phe Lys

180

Claims

1.蛋白质在如下D1）-D8）任一种中的应用：

D1）调控植物的结瘤固氮能力；

D2）制备调控植物的结瘤固氮能力的产品；

D3）调控植物的根瘤个数；

D4）制备调控植物的根瘤个数的产品；

D5）调控植物的根瘤鲜重；

D6）制备调控植物的提高根瘤鲜重的产品；

D7）调控植物的叶绿素含量；

D8）制备调控植物的叶绿素含量的产品；

所述蛋白质为如下B1）或B2）：

B1）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

B2）在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

所述植物为豆科植物。

2.权利要求1所述蛋白质的相关生物材料在权利要求1中所述D1）-D8）任一种中的应用，所述相关生物材料为下述C1）-C8）中的任一种：

C1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；

C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；

C5）降低权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量和/或抑制权利要求1中所述蛋白质的活性和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量的核酸分子；

C6）含有C5）所述核酸分子的表达盒；

C7）含有C5）所述核酸分子的重组载体、或含有C6）所述表达盒的重组载体；

C8）含有C5）所述核酸分子的重组微生物、或含有C6）所述表达盒的重组微生物、或含有C7）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：C1）所述核酸分子为如下A1）或A2）所示：

A1）SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

A2）编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：C5）所述核酸分子为由权利要求1中所述蛋白质的基因的上游同源臂和下游同源臂组成的重组DNA分子。

5.一种重组根瘤菌，其特征在于：所述重组根瘤菌与受体根瘤菌相比，所述重组根瘤菌中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量降低和/或权利要求1中所述蛋白质的含量降低和/或权利要求1中所述蛋白质的活性降低。

6.重组根瘤菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括降低受体根瘤菌中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量和/或权利要求1中所述蛋白质的含量和/或权利要求1中所述蛋白质的活性。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述降低所述受体根瘤菌中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量和/或权利要求1中所述蛋白质的含量和/或权利要求1中所述蛋白质的活性的方法为将受体根瘤菌中权利要求1中所述蛋白质的基因的上游同源臂和下游同源臂组成的重组DNA分子构建得到的重组载体导入到受体根瘤菌。

8.根据权利要求5所述的重组根瘤菌或权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于：所述受体根瘤菌均为费氏中华根瘤菌菌株CCBAU 45436。

9.一种提高植物的结瘤固氮能力、调控植物的根瘤个数、提高植物的根瘤鲜重和/或提高植物的叶绿素含量的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求5或8所述的重组根瘤菌作用于植物，以提高植物的结瘤固氮能力、调控植物的根瘤个数、提高植物的根瘤鲜重和/或提高植物的叶绿素含量；所述植物为豆科植物。

10.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述豆科植物为豆。