CN102559703A - 一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用，具体涉及一种利用功能互补法从来自葡萄园中对葡萄冠瘿病具有拮抗作用的水生拉恩氏菌(rahnella aquatilis)编码的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因，以及该基因转化到植物后在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。

Description

一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用

技术领域

本发明属微生物领域，涉及一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其应用，具体涉及一种利用功能互补法从来自葡萄园中对葡萄冠瘿病具有拮抗作用的水生拉恩氏菌(rahnella aquatilis)编码的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因(AroA-Ra)，以及该基因转化到植物后在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。

背景技术

除草剂消灭杂草而不伤害作物的选择性是很难获得的特性，因为除草剂所影响的植物生理生化过程，如光合作用和氨基酸的生物合成，对作物和杂草是共同的。作物栽培种和近缘种通常不具有抗除草剂的特性，通过常规育种方法选育抗性作物品种有很大的困难。利用现代分子生物学技术，将其它物种中控制耐受和分解除草剂的基因分离出来，然后遗传转化到作物，便有可能获得抗除草剂的作物品种。

目前至少有两类功能不同的抗除草剂基因应用于转基因作物上。第一类是通过降低植物酶对除草剂的敏感性减少除草剂对植物的杀伤能力。例如aroA的突变基因合成的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)的脯氨酸被丝氨酸所取代，酶活力不受影响，但是对非选择性除草剂草甘膦的结合力只有原来的25％，从而使植物对除草剂表现不敏感。第二类则是通过解除除草剂对植物酶的抑制实现对除草剂抗性。例如Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂草胺膦对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。常用的抗除草剂基因包括EPSP合酶基因(产生5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷)、GOX基因(产生草甘膦氧化酶，降解草甘膦)、bar基因(产生草胺膦乙酰转移酶，抗草胺膦)、BXN基因(产生溴苯腈水解酶，抗溴苯腈)等。

草甘膦的杀草原理是它能抑制芳族氨基酸的合成，从而导致杂草死亡。草甘膦阻止芳族氨基酸合成的具体部位是抑制EPSP合酶。常规作物的EPSP合酶对草甘膦很敏感，如果直接接触，草甘膦会杀死常规作物。将编码降解草甘膦的蛋白或草甘膦低敏感的EPSPS转化到作物中，明显提高作物抗草甘膦除草剂的能力，2005年统计显示美国87％大豆，61％棉花和26％玉米为抗草甘膦转基因植物。

EPSP合酶广泛存在于自然界中，目前从不同植物中和微生物中筛选到很多类型的EPSP合成酶基因，但是大多数EPSP合酶对草甘膦敏感，通过突变可以使EPSP合成酶对草甘膦敏感性降低，然而它与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的亲和力也随之降低，从而导致酶活力下降，如来源于大肠杆菌的EPSP合酶基因，通过T42M、G96A、T97I、P101L、P101T和A183T位点突变，均能降低该酶对草甘膦敏感性，但相对酶活力也随之下降，因而尚不能商业化。主要的耐草甘膦作物(商品名叫Roundup Ready作物)含有从微生物转化到作物中的CP4EPSPS基因。该基因来源于农杆菌CP4菌株(Agrobacterium sp.strain CP4)。CP4EPSPS属于II型EPSPS，有不同于植物EPSPS基因的核苷酸顺序，转录翻译后的EPSP合成酶对草甘膦不再敏感，因而具有对草甘膦的耐药性，其催化活性介于植物和大肠杆菌之间。研究表明，第100位的丙氨酸在该酶感受草甘膦中起很大作用，将该位点突变为谷氨酸，对草甘膦敏感性恢复。有些耐草甘膦玉米含有被改变了的并来自玉米的EPSPS基因，由这个改变了的基因转录翻译后的EPSPS合成酶对草甘膦也不敏感，所以对草甘膦也有耐药性，但是这些基因表达的蛋白活性不强，必须通过超量表达来弥补。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，该基因来源于葡萄冠瘿病拮抗菌中筛选获得的一株能在200mM草甘磷中生长的水生拉恩氏菌。

本发明所要解决的技术问题之二，在于提供所述抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra在转化到植物后在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。

本发明所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，源自于水生拉恩氏菌，编码一个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo 2所示。

所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的获取方法为：利用含高浓度草甘磷(200mM)的M9培养基，从犯冠瘿病的葡萄根际微生物中，选择生长良好的菌株；再将选择出来的菌株置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的总DNA，时间20-60分钟，并将酶切片段连接到表达载体pG251(CN1338515NCBI)中，将连接物转化到EPSP合酶缺失的大肠杆菌菌株ER2799中，筛选抗草甘磷的菌株。

所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的获取方法，具体包括如下步骤：

1、菌种分离

称取草甘瞵频繁使用葡萄园中犯有冠缨病的葡萄根样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布与含有60mM草甘瞵的LB固体培养基中培养24h。将筛选获得的菌株在LB培养基中，28℃培养48h，在培养皿盖上加入3mL三氯甲烷，培养皿倒置12-15小时后，将培养好的根癌农杆菌菌株配成悬液，菌浓度为10⁸-10⁹/mL，吸取50μl的培养液加入5mL融化后冷却到50℃的YEB培养基混匀后，立即倒入三氯甲烷杀死的筛选菌落培养皿中，铺成均匀的薄层，28℃培养24h，观察并调取具有抑菌圈的菌株，即得到所述的水生拉恩氏菌株。

2、总DNA提取

将分离获得的细菌单株在液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1h，之后使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0)清洗一次，然后悬浮于浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水中，37℃摇床培养1h。

接着向培养液中加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入浓度为20mg/mL蛋白激酶K，37℃培养1h。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA；水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于4℃保存。

3、抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的获取与筛选(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)

用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的成团泛菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-7kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。选择pG251(CN1338515ANCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI酶切并进行胶回收。

先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为5-7kb的水生拉恩氏菌DNA片段)连接。反应温度16℃，连接时间为10-12h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

将大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)涂布与含有50mM草甘瞵的M9平板上培养48h，发现有多个菌落生长良好。将这些菌落分别接种到含有100mM、150mM草甘瞵的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含150mM草甘瞵的M9平板上生长，将其所含的质粒命名为pAroA-Ra。从该克隆抽提的质粒pAroA-Ra再次转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)中，将转化子用无菌牙签点与含150mM草甘瞵的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入pAroA-Ra引起的。

对插入的片断进行序列分析，从测序结果中寻找阅读编码框，其中包含了一个1284bp的阅读框。在阅读框的左右两侧设计引物：

PArR1：5’-GGATCCATGGAATCCCTGACATTACAAC-3’和

PArR2：5’-GAGCTCCTATGCCAGTGTGCTGATTGCC-3’为扩增引物，以pAroA-Ra质粒DNA为模版，对1284bp的阅读框进行PCR扩增。将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接，将连接产物转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)涂布与含有50mM草甘瞵的M9平板上培养48h，确定1284bp阅读框(水生拉恩氏菌EPSP)表达质粒的正确性。

利用PCR进行β-胡萝卜素合成操纵子全长扩增，在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，使用多个扩增引物和2个外侧引物完成。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃延长10min，共25个循环。PCR结束后，0.8％(w/v)琼脂糖胶回收。

所述抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra与表达载体相连接后转入微生物细胞中，能在高浓度草甘瞵150mM生长。

通过T4DNA连接酶将AroA-Ra片段与含有双35S启动子的pCAMBIA1301质粒连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因AroA-Ra的植物表达载体pCAMAroA-Ra。该表达载体还包含GUS报告基因和潮霉素抗性标记基因。将表达载体pCAMAroA-Ra经电击法导人到农杆菌菌株(根癌农杆菌EHA105，LBA4404，GV3101，AGL-1)，然后通过农杆菌介导法转化到植物中。转基因植物喷施5-10mM草甘膦除草剂，隔7天喷施一次，共三次，喷施完成后，继续培养10-30天，导致植物的抗草甘膦除草剂能力提高。

本发明的有益效果：

来自长期施用草甘膦除草剂葡萄园中水生拉恩氏菌是一类能够在高浓度草甘膦中生长的细菌，克隆编码此类细菌中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，有利于将来基因工程培育抗草甘膦除草剂转基因植物。通过培养、提取总DNA和PCR扩增后得到的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra及其表达载体可以应用于抗草甘膦除草剂植物的培育。

本发明所述的术语与其一般概念相同。

所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。

所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。

所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌；真核微生物为真菌或藻类，真菌主要指酵母菌。

附图说明

图1为水生拉恩氏菌对农杆菌的拮抗筛选结果。

图2为含有抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的大肠杆菌对草甘膦耐受性实验结果(草甘膦浓度＝0)。

图3为含有抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的大肠杆菌对草甘膦耐受性实验结果(草甘膦浓度＝150mM)。

图4为抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra植物表达载体构建结果，其中TSP为烟草叶绿体转运肽序列。

图5为抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra转化到植物中后提高对草甘膦的抗性结果，其中a为AroA-Ra转基因植物，b为非转基因植物，c为大肠杆菌EPSP转基因植物。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994】。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。

实施例1菌种分离

称取草甘瞵频繁使用葡萄园中犯有冠缨病的葡萄根样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布与含有60mM草甘瞵的LB固体培养基中培养24h。将长出来的单菌落接种与加入1.6ml LB液体培养基的试管中，28℃培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有200mM草甘瞵的LB固体培养基中培养24h，最后将生长良好的菌落选出来进行进一步研究。

将筛选获得的菌株在LB培养基中，28℃培养48h，将菌液稀释到108-109/mL，取10μl菌液涂布在LB固体培养基中28℃培养48h，在培养皿盖上加入3mL三氯甲烷，培养皿倒置12-15小时后，将培养好的根癌农杆菌菌株配成悬液，菌浓度为108-109/mL，吸取50μl的培养液加入5mL融化后冷却到50℃的YEB培养基(蔗糖5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏1g/L，琼脂7g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L pH7.0)混匀后，立即倒入三氯甲烷杀死的筛选菌落培养皿中，铺成均匀的薄层，28℃培养24h，观察并调取具有抑菌圈的菌株，即得到所述的水生拉恩氏菌株(参见图1)。

实施例2总DNA的提取及菌种鉴定

将实施例1中分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时，菌体培养液以6,000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1h，之后使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，然后加入20μl溶菌酶(Sigma-Aldrich)浓度为10mg/mL的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1h。

接着加入50μL浓度为0.5M EDTA，50μl浓度为10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1h。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。

以抽提的总DNA为模板，利用细菌的16s rRNA特异性引物进行扩增。扩增的引物为P16SF：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’和P16SF：5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’。以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，72℃延伸300秒，扩增片段长1500bp(如下，请补充序列)。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。

先将该载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与水生拉恩氏菌中的16s rRNA有99％的同源性。

实施例3抗草甘膦的DNA片断分离和序列分析

用不同浓度(0.02-0.5u/μL)限制性核酸内切酶Sau3A(宝生物工程(大连)有限公司)酶切实施例2提取所得的水生拉恩氏菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-7kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。

选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI(宝生物工程(大连)有限公司)酶切并进行胶回收。

先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为5-7kb的成团泛菌DNA片段)连接。连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。

连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。

将大量提取的质粒转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)涂布与含有50mM草甘瞵的M9平板上培养48h，发现有多个菌落生长良好。将这些菌落分别接种到含有100mM、150mM草甘瞵的M9平板上培养，发现只有1个克隆能在含150mM草甘瞵的M9平板上生长，其所含的质粒命名为pAroA-Ra。从该克隆抽提的质粒pAroA-Ra再次转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)中，将转化子用无菌牙签点与含150mM草甘瞵的M9固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入pAroA-Ra引起的。

利用逐步序列测定方法对筛选获得的重组子pAroA-Ra进行DNA测序。测序的引物分别为：

Par1：5’-GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3’

Par2：5’-CTGACAGCGTTATTGATGACA-3’

Par3：5’-GATCACCGCATGGCGATGTGT-3’

Par4：5’-AACGCCAGTCCACCAGCACG-3’

分析结果表明，插入的片断大小为2300bp，从测序结果中寻找阅读编码框，其中包含了一个1284bp的阅读框。在阅读框的左右两侧设计引物：

PArR1：5’-GGATCCATGGAATCCCTGACATTACAAC-3’和

PArR2：5’-GAGCTCCTATGCCAGTGTGCTGATTGCC-3’为扩增引物，以pAroA-Ra质粒DNA为模版，对1284bp的阅读框进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃2分钟，30个循环。然后加入2单位rtaq(宝生物工程(大连)有限公司)，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为1284bp的如SEQ ID No1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，确定1284bp阅读框表达质粒的正确性。

采用同样的方法用引物P3：(5’-CGGGATCCGTTAATGCCGAAATTTT GCTTAATC-3’)和P4：(5’-CGGAGCTCAGGTCCGAAAAAAAACGCCG AC-3’)扩增大肠杆菌的EPSP合酶基因AroA-E coli(Genbank P07638)，同样连接到pG251得到E.coli EPSP表达质粒。

将大肠杆菌ER2799(携带水生拉恩氏菌EPSP表达质粒)和ER2799(携带E.coli EPSP表达质粒)接种到含0-150mM草甘瞵的M9液体培养基中，经过37℃、36h的摇床培养后，测定培养物的OD660进行耐受性试验，同时以无插入片断质粒的大肠杆菌ER2799为阴性对照。结果发现：将大肠杆菌ER2799(携带水生拉恩氏菌EPSP表达质粒)和ER2799(携带E.coli EPSP质粒)接种到含0-150mM草甘瞵的M9液体培养基中，经过37℃、36h的摇床培养后，发现阴性对照在M9中几乎不能生长；而ER2799(携带E.coli EPSP表达质粒)在50mM草甘瞵的M9液体培养基中严重受到抑制；而ER2799(携带水生拉恩氏菌EPSP表达质粒)在含有150mM草甘瞵的M9液体培养基中还能生长(参见图2、3)。

实施例4水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra的筛选

通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆并筛选实施例3所得的水生拉恩氏菌得到抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，所用的引物如下：

1.AraII-1：

GTGGAATCCC TGACATTACA ACCCGTTGCG CTGGTTAACG GCAGCATCAA TTTACCTGGC

2.AraII-2：

AAAAGCAGCC AGTAAAAGTG CGCGGTTAGA AACACTTTTT GAGCCAGGTA AATTGATGCT

3.AraII-3：

CTTTTACTGG CTGCTTTTGC ACAGGGTACT ACCCGCCTGA CTAACCTGCT CGACAGCGAT

4.AraII-4：

GACACCCAGT TGAGTGAGTG CTGTCAACAT ATGACGCACA TCATCGCTGT CGAGCAGGTT

5.AraII-5：

CTCACTCAAC TGGGTGTCAC GCATCGTTTA TCTGCATCCC GCACCGAGTG TGAAATCGAT

6.AraII-6：

AAACAGTTCC AGACCTTTAG CATTGGAAAA AGCCGTGCCC AGACCATCGA TTTCACACTC

7.AraII-7：

AAAGGTCTGG AACTGTTTCT TGGGAATGCA GGAACCGCAA TGCGTCCGCT GGCGGCAGCA

8.AraII-8：

CGGCTCTCCG GTCAGTACAA CATCCTGTTC GCCCAGGCAT AATGCTGCCG CCAGCGGACG

9.AraII-9：

GTACTGACCG GAGAGCCGCG CATGAAAGAG CGCCCGATCG GGCATCTGGT TGATGCGCTT

10.AraII-10：

GTTTTCCTGC TCCAGATAAT CAATCTGCGC ACCGCCCTGA CGAAGCGCAT CAACCAGATG

11.AraII-11：

TATCTGGAGC AGGAAAACTA TCCGCCTTTG CGCCTGCAGG GTGGATTTAG TGGCGGTGAC

12.AraII-12：

CGCTGTCAGA AACTGGCTGG AAACACTGCC ATCAACACTG ACGTCACCGC CACTAAATCC

13.AraII-13：

AGCCAGTTTC TGACAGCGTT ATTGATGACA GCTCCGCTGG CAGATAACGA TACAACCATT

14.AraII-14：

GATATCGATA TAAGGTTTGG AAACCAGATC ACCTTTAATC TGAATGGTTG TATCGTTATC

15.AraII-15：

AAACCTTATA TCGATATCAC GCTGAACCTG ATGAAAACCT TTGGTATTGA AGTGGAAAAC

16.AraII-16：

ATAATGCTGA CGTCCTTGGA TGCTAAATCT  CTGGTACTCG TGGTTTTCCA CTTCAATACC

17.AraII-17：

CAAGGACGTC AGCATTATGT GTCTCCGGGG GCATATCTGG TCGAAGGTGA TGCCTCTTCA

18.AraII-18：

CGTACCGCCC TTGATCGCCG CAGCGGCCAG GAAGTAGGAC GCTGAAGAGG CATCACCTTC

19.AraII-19：

GCGATCAAGG GCGGTACGGT TCGTGTGACC GGAATCGGCA AAAACAGCAT GCAGGGCGAT

20.AraII-20：

AATAGTAGCA CCCATTTTTT CCAGCACGTC TGCAAAACGA ATATCGCCCT GCATGCTGTT

21.AraII-21：

GAAAAAATGG GTGCTACTAT TCACTGGGCT GATGATTATA TCGAATGTAC CCGCGGTGAA

22.AraII-22：

TGCATCAGGA ATATGGTTCA TGTCCATGTC AATGCCGTTC AGTTCACCGC GGGTACATTC

23.AraII-23：

AACCATATTC CTGATGCAGC AATGACCATT GCTACCGCTG CCTTGTTTGC TGAAGGCCCG

24.AraII-24：

GGTCTCTTTA ACACGCCAGT TGTAAATATT ACGCAACGTT GTCGGGCCTT CAGCAAACAA

25.AraII-25：

TGGCGTGTTA AAGAGACCGA TCGCCTGACG GCGATGGCGA CTGAGCTGCG TAAAGTCGGT

26.AraII-26：

CGGATCAATA CGAATGTAAT CTTCGCCCTC TTCCACTGTT GCACCGACTT TACGCAGCTC

27.AraII-27：

GATTACATTC GTATTGATCC GCCTCAATCG CTGAAATTTG CCGAGATTGG CACCTATAAT

28.AraII-28：

GGATAACGCC ACCAGCGAGA AACACATCGC CATGCGGTGA TCATTATAGG TGCCAATCTC

29.AraII-29：

TTCTCGCTGG TGGCGTTATC CGATACGCCG GTGACCATTC TTGATCCGAA GTGTACCGCA

30.AraII-30：

GCCGCCAGAC GGTCAAAATA GTCCGGGAAC GTTTTTGCGG TACACTTCGG ATCA

31.AraII-31：

CTATGCCAGT GTGCTGATTG CCGCCAGACG GTCAAAATA

利用PCR进行AroA-Ra全长基因扩增，在100μl反应体系中，AraII-2-AraII-30共29个引物的添加量为2ng，外侧引物AraII-1和AraII-31添加量为30ng。以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)为Taq DNA聚合酶。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃10min，使用的，共25个循环。

PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆。

实施例5水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra植物表达载体构建

参看图4，首先通过PCR方法扩增来自烟草中的叶绿体转运肽(TSP GenBank M61904)，引物为(5′-CGCCTGCAGTGGCACAGATTAGCAGCATG-3′)和TSPF(5′-CAGAGGATCCTCTGTG CAGTGACCACTGAT-3′)，在TSP序列前增加SalI和BamHI酶切位点，将AroA-Ra基因扩增，并在基因的两端加入BamHI和SacI酶切位点，将两个PCR片段回收后一同连接到pGEM3Z(Promega，Madison，WI，USA)载体中，进行序列测定，获得含有TSP和AroA-Ra的质粒。抽提质粒DNA，分别用SalI和SacI进行双酶切，回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将TSP和AroA-Ra片段与含有双35S启动子的pCAMBIA1301质粒连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因AroA-Ra的重组质粒pCAMAroA-Ra。该表达载体还包含GUS报告基因和潮霉素抗性标记基因。

实施例6农杆菌培养和植物转化

农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105，LBA4404，GV3101，AGL-1菌株。质粒经电击法导人农杆菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基(50mg/l利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到100ml YEB培养基(50mg/l利福平)，培养至OD₆₀₀＝0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl 10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒pCAMAP22。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

1、拟南芥粘花法转化

含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5毫升含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体LB培养基中28℃培养16-24小时(OD＝1.5-2.0)，液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积5％的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02％的Silwet-77混匀后转移到烧杯中。每个菌株用300毫升转化，转2-3钵。隔7天后再转化1次。将拟南芥倒置后浸入菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株菌液空干3-5秒。用保鲜膜将转化植株圈好，平放16-24小时。转化后不要放置在高温和强光下。揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月后收种子。利用50μg/mL潮霉素进行转化植株筛选。

2、烟草和番茄转化

挑选比较饱满的种子，用75％的酒精清洗1分钟，次氯酸钠加1滴土温灭菌10分钟，种子铺在MS0培养基上，28度培养待发芽。将烟草幼叶，番茄子叶或下胚轴剪成1cm²，放入MSO+NAA1(1ug/ml)+BA2(4ug/ml)的培养基中，22℃培养1天。农杆菌培养OD_0.8-1.0后离心5000g离心8分钟，DDH₂O清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MSO+NAA1+BA2的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基MSO+IAA1(0.1ug/ml)+ZT(2ug/ml)+Cb(500ug/ml)+Km(50ug/ml)培养2-3周，再转入分化培养基MSO+IAA1(0.1ug/ml)+ZT(2ug/ml)+Cb(500ug/ml)+Km(100ug/ml)培养2-3周，最后转入生根培养基1/2MS+IAA1(0.1ug/ml)培养。

实施例7转AroA-Ra基因植物的抗除草剂分析

将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，幼苗生长30-60天，喷施5-10mM草甘膦除草剂，隔7天喷施一次，共三次，喷施完成后，继续培养10-30天，观察植物的抗草甘膦除草剂效果，结果参看图5。

Claims (4)

1.一种来自葡萄冠瘿病拮抗菌水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，其核苷酸序列表如SEQ ID No 1所示。

2.根据权利要求1所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo 2所示。

3.权利要求1所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra在植物转化中的应用。

4.权利要求1所述的抗草甘磷除草剂基因AroA-Ra在提高植物对草甘膦除草剂抗性中的应用。

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