KR100723070B1 - 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법 - Google Patents

혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100723070B1
KR100723070B1 KR1020050088308A KR20050088308A KR100723070B1 KR 100723070 B1 KR100723070 B1 KR 100723070B1 KR 1020050088308 A KR1020050088308 A KR 1020050088308A KR 20050088308 A KR20050088308 A KR 20050088308A KR 100723070 B1 KR100723070 B1 KR 100723070B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rice
gene
moth
cryiac
modified
Prior art date
Application number
KR1020050088308A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070033782A (ko
Inventor
서석철
박범석
김주곤
신공식
박용환
박형만
이데레사
권순종
이연희
김은혜
노경희
이길복
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020050088308A priority Critical patent/KR100723070B1/ko
Publication of KR20070033782A publication Critical patent/KR20070033782A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100723070B1 publication Critical patent/KR100723070B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for
    • A01G22/20—Cereals
    • A01G22/22—Rice
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명은 바실러스 투린지엔시스에서 분리되어 변형된 cryⅠAc 유전자가 형질전환되어 혹명나방에 대한 높은 저항성을 나타내는 벼 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 혹명나방에 대한 저항성을 나타내는 신품종 벼를 제공하기 위하여 바실러스 투린지엔시스에서 분리된 내독소 단백질 유전자 wt-cryⅠAc를 벼에서 발현효율이 높도록 수정 및 변형하여 형질전환시킨 변형된 cryⅠAc 유전자를 도입한 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 상기 혹명나방 저항성 벼 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다.
혹명나방, 바실러스 투린지엔시스, 벼 형질전화체

Description

혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법{RICE LEAF FOLDER TOLERANT RICE TRANSFORMANTS AND PRODUCING METHOD THEREOF}
도 1은 본 발명의 변형된 cryⅠAc 유전자를 삽입한 재조합벡터의 주요부를 보여주는 그림이다.
도 2는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법에 따라 벼 부정배 캘러스에 아그로박테리움을 감염시켜 형질전환하고 형질전환 벼로 재분화시키는 과정을 보여주는 사진이다(A: 아그로박테리움과 공동배양 사진, B: 형질전환된 캘러스 선별, C: 형질전환 벼로 재분화, D,E: 재분화 식물체의 기내순화, F: 형질전환 식물체의 온실 재배사진).
도 3은 본 발명에 의한 형질전환 식물체(T1)에서 변형된 cryⅠAc와 MAR 프로브를 이용하여 유전자의 도입여부를 보여주는 게놈 서던블롯(genomic southern blot) 분석결과 사진이다.
도 4는 본 발명에 의한 형질전환된 식물체(T1)에서 선발된 개체의 전개 식물체(T2)의 유전자 도입여부를 보여주는 서던블롯 분석결과 사진이다.
도 5는 본 발명에 의한 형질전환된 식물체에서 변형된 cryⅠAc 프로브를 이용하여 유전자의 발현여부를 보여주는 노던블롯 분석결과 사진이다.
도 6은 본 발명에 의한 형질전환 식물체를 폴리클로날 항체를 이용하여 단백 질의 생성 여부를 보여주는 웨스턴블롯 분석결과 사진이다.
도 7은 본 발명에 의한 형질전환 식물체의 cry1Ac 단백질 생성 여부를 이뮤노스트립(immunostrip) 진단키트로 검정한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명에 의한 형질전환 식물체의 bar 저항성 단백질 생성 여부를 GMO 진단키트로 검정한 결과(A)와 배지 내 PPT를 함유시켜 선발 종자의 제초제 저항성 여부를 검정(B)한 사진이다.
도 9는 본 발명에 의한 형질전환 식물체를 야외 포장에서 재배하면서 자연적으로 발생한 혹명나방 유충에 대한 피해로부터 내충성 여부를 보여주는 사진이다.
본 발명은 혹명나방에 대한 저항성을 나타내는 신품종 벼를 제공하기 위하여 바실러스 투린지엔시스에서 분리된 내독소 단백질 유전자 wt-cryⅠAc를 벼에서 발현효율이 높도록 수정 및 변형하여 형질전환시킨 변형된 cryⅠAc 유전자를 도입한 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 상기 혹명나방 저항성 벼 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다.
농작물은 고착생활을 하기 때문에, 끊임없이 수많은 해충 및 병원균(곰팡이, 세균, 바이러스 등)들의 공격을 받게되어, 그로인한 다양한 질병에 따른 생산량의 감소는 일찍이 기록되어져 왔다. 이러한 해충 및 병원균에 의한 농작물의 피해를 줄이고 생산성을 향상시키기 위하여 일반적으로 농약이 사용되어오고 있으나, 농약 의 사용은 환경오염이라는 심각한 문제를 새로이 야기시킴으로써 돌이킬 수 없는 자연환경의 파괴와 회복불능의 환경을 만들어 내고 있다(Sherman JD et al., Arch. Environ. Health., 52, 332-333, 1997). 뿐만 아니라, 농약을 살포하는 농민들의 경우 맹독성의 농약을 인체에 흡입하므로써 인체내의 축적과 불치의 유전병이 생성되게 되고, 잔류농약의 흡수에 의해 소비자들에게도 치명적인 건강상의 손실을 유발시키게 된다(London et al., Scan. J., Work. Environ. Health., 24, 18-29, 1998).
따라서, 식물의 해충 방제와 농약사용으로 인한 환경오염이나 인체 축적에 의한 치명적인 질병 발생 등을 방지할 수 있는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 그 예로서 생물체내에 존재하는 해충 살충 단백질의 탐색과 분리 및 이들을 코딩하는 유전자의 클로닝과 이들을 이용한 내충성 형질전환 식물체에 대한 개발이 이루어지고 있다.
우리나라 벼 육종기술은 세계적 수준이며, 벼에 대한 많은 유전재료를 보유하고 있으나 농업적으로 주요한 유전특성(재해저항성 등)의 유전자 분리개발 및 품종육성은 미흡한 실정이다. 따라서 쌀을 주식으로 하는 우리나라의 경제 및 대외 경쟁력을 고려할 때 기존의 우량품종에 살충성에 관련된 유전자를 도입한 벼 품종 개발로 안정적인 환경친화적 농업개발이 요구된다. 이를 극복하기 위한 적극적인 방법으로는 자연재해에 관련된 새로운 유전자의 개발 및 유용 유전자를 지닌 새로운 작물의 출현이 시급한 실정이다.
그람 양성의 토양 박테리아인 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)는 곤충 해충에는 유독하지만 숙주 식물과 환경에는 무해한 일부 단백질 결정을 생성하는데, 특히 포자형성시 생성되는 살충성 결정단백질(??-endotoxin)은 나비목곤충, 딱정벌레목곤충 및 쌍시류곤충 등의 유충에 특이적으로 작용한다. 이러한 결정단백질은 곤충 유충의 중장 상피세포의 세포막과 결합하고, 삼투압 평형을 방해하여 유충을 죽게 한다. 이와같이 바실러스 투린지엔시스로부터 분리된 유전자(통상 Bt-유전자로 알려져 있음)는 해충 내성 프로그램을 위한 품종 개량에 목화(Gossypium hirsutum) 및 몇몇 타 작물을 형질전환시키는데 사용되어 왔으며, 그러한 유전자 형질전환에 가장 일반적으로 사용되는 것들로는 cryⅠAc, cryⅠAb, cryⅠAa, cryⅡAa 및 cryⅡAb와 같은 유전자가 있다. 이때, cryⅠAc 유전자를 그대로 벼에 형질전환하는 경우에는 발현효율이 낮다는 문제점이 있어, 상기 유전자의 벼에서의 발현효율을 향상시킬 수 있는 새로운 방법이 요구되었다.
본 발명의 발명자는 cryⅠAc 유전자를 그대로 벼에 형질전환하는 경우에는 발현효율이 낮다는 문제는, cryⅠAc 유전자가 정상적인 식물 유전자에는 없는 전사 조절 부분, 폴리아데닐레이션 부분, 인트론 부분 등과 유사한 염기배열을 갖고 있어 완전한 mRNA가 만들어지기 어려우며, cryⅠAc 유전자에서 사용하는 코돈이 식물 유전자에서 사용하는 코돈과 큰 차이가 있어서 이 유전자가 전사되어 mRNA가 만들어졌다고 할지라도 번역되는 과정에서 식물체가 흔히 사용하지 않는 코돈이 문제를 발생시킬 수 있기 때문임을 발견하고, 한국특허공개공보 제2002-0013003호에 기재되어 있는 cryⅠAc 유전자를 식물 유전자, 특히 배추 유전자와 유사하게 수정, 합 성하므로써, 배추 등의 배추과 작물에 형질전환시켰을때의 발현효율을 향상시키는 기술을 통하여 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법을 제시하였다.
혹명나방은 중국에서 날아오는 해충으로 보통 7월 하순부터 출수기에 걸쳐 벼 잎을 세로로 말아 그 속에서 벼 잎을 갉아 먹는데, 혹명나방이 발생한 논의 벼는 낟알이 여물지 않아 일단 발생하면 큰 피해를 준다. 2003년 혹명나방 피해 면적은 29만8천㏊로 전체 벼 재배 면적의 30%를 차지했으며, 특히 혹명나방 애벌레는 벼 잎을 말고 그 안에서 잎을 갉어먹어 초기에 방제하지 않을 경우 농약 방제 효과가 현저히 떨어지는 해충이다. 그러나, 현재 국내외적으로 혹명나방 등을 농약 등의 환경파괴적인 방법에 의존하지 않고, 친환경적인 방법에 의하여 효과적으로 방제할 수 있는 방법에 관한 보고가 거의 없어, 이러한 문제를 해결할 수 있는 새로운 방법이 요구되었다.
본 발명은, 변형된 cryⅠAc 유전자가 도입되어 혹명나방에 대하여 저항성을 갖는 새로운 품종의 벼 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 변형된 cryⅠAc 유전자를 아그로박테리움을 이용하여 벼에 도입함으로써 혹명나방에 대하여 저항성을 갖는 새로운 벼 형질전환체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
바실러스 투린지엔시스의 본래의 내독소 단백질 유전자 wt-cryⅠAc는 3,537bp로 아미노산 1,178개를 코드한다. 본 발명자는 상기 3,537bp의 wt-cryⅠAc 유전자 중에서 특히 앞부분에 해당하는 1,854bp 부위가 벼의 혹명나방에 대한 저항성을 높일 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 된 것이다.
본 발명은 상기 3,537bp의 wt-cryⅠAc를 본 발명자의 상기 한국특허공개공보 제2002-0013003호에 기재된 방법에 따라 수정 합성한 다음, 유전자 중에서 앞부분에 해당하는 1,854bp 부위를 선택적으로 취하여, 벼에서의 발현효율이 높을 뿐만 아니라 혹명나방에 대하여 저항성을 갖는 새로운 내충성 유전자를 만들었으며, 이 유전자를 서열번호1에 나타냈다. 상기와 같이 선발된, 벼에 형질전환 되었을 때 발현효율이 높을 뿐만 아니라, 혹명나방에 대한 저항성을 갖도록 수정, 변형된 wt-cryⅠAc 유전자를, "변형된 cryⅠAc"로 명명하였다.
상기 변형된 cryⅠAc 유전자를 벼에 형질전환하여 혹명나방에 대한 저항성을 갖는 벼 형질전환체를 제조하는 방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(1) 상기 변형된 cryⅠAc 유전자가 삽입된 재조합벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 제조된 재조합벡터를 이용하여 식물 형질전환용 아그로박테리움을 제조하는 단계;
(3) 상기 제조된 아그로박테리움을 이용하여 벼 종자로부터 유기된 부정배 캘러스와 공동배양하는 단계;
(4) 상기 공동배양된 캘러스로부터 재분화 식물체를 유도하는 단계; 및
(5) 상기 유도된 재분화 식물체를 기내순화하고, 토양에 이식하여 벼 형질전환체를 재배하는 단계.
상기 단계(1)에서, 상기 변형된 cryⅠAc 유전자를 삽입한 재조합벡터로는 특히 "pMJ-RTB" 가 바람직하다. pMJ-RTB는 명지대학교 분자생물학 실험실에서 분양 받았다. 상기 pMJ-RTB에는 상기 변형된 cryⅠAc 유전자가 벼의 형질전환에 적합하도록 rbcS프로모터와 결합되어 있는데, 상기 rbcS프로모터에는 클로로플라스트-타겟 발현(chloroplast-targeted expression)을 위해 전이 펩티드서열(transit peptide sequence)이 뒤에 결합되어 있다(rbcS-TP). rbcS-TP는 특이적으로 클로로플라스트(chloroplast)에 위치하면서 형질전환 식물체의 단백질 축적을 강하게 한다고 알려져 있다. 본 발명의 상기 단계(1)에서 제조된 재조합벡터 pMJ-RTB는, 상기와 같은 방법에 의하여 제조된 키메릭 rbcS-Tp::cryⅠAc 유전자, PinII 터미네이터, 35S 프로모터와 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene(bar))의 순으로 구성되었다.
상기 재조합벡터를 제조하는 단계(1)에 있어서, 식물 형질전환용 발현벡터의 선발표식인자로 사용된 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(bar)는 제초제인 바스타(Basta)에 대한 저항성 유전자로서 적용된 것으로, 이에 따라 형질전환시 형질전환 캘러스와 형질전환 식물체의 선발이 용이하게 된다. 또한 바스타에 대한 저항성 유전자를 적용하면, 작물 재배시 제초제 살포에 의한 잡초제거를 용이하게 할 수 있다. 또한, 포스피노트리신이 함유된 바스타는 잔류성에 의한 환경오염이 다른 제초제에 비해 적고, 효능이 우수한 비선택적 제초제이기 때문에 상기 유전자가 선발인자로 바람직하다.
상기 단계(2)에서, 상기 변형된 cryⅠAc 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 변형된 cryⅠAc 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)가 바람직하다.
본 발명자들은 본 발명의 상기 변형된 cryⅠAc 유전자를 포함하는 재조합벡터 pMJ-RTB를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404에 통상의 방법으로 형질전환하여 안정적인 아그로박테리움 형질전환체를 확립하였으며, 이를 아그로박테리움 형질전환체 "LBA4404 pMJ-RTB"로 명명하였다.
상기 아그로박테리움 형질전환체 LBA4404 pMJ-RTB에 관하여 그 제작과정을 상세히 기재하였기에 균주의 기탁을 생략한다.
상기 단계(2)에 있어서, 상기 발현벡터 pMJ-RTB를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
[변형된 cryⅠAc 유전자가 형질전환된 벼의 제작]
[단계1 : 변형된 cryⅠAc 유전자를 삽입한 재조합벡터의 제작]
바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 본래의 내독소 단백질 유전자인 wt-cryⅠAc(3,537bp)을 한국특허공개공보 제2002-0013003호에 기재된 방법에 따라 수정 합성한 다음, 그 앞부분에 해당하는 서열번호1의 변형된 cryⅠAc 유전자(1,854 bp)를 얻었고, 이를 제한효소 EcoRI으로 잘라내어 pBluescript SK(+)의 EcoRI 자리에 삽입하였다. 그 결과 상기 변형된 cryⅠAc 유전자의 삽입 방향에 따라 pBt91과 pBt92를 얻었다(도시 생략).
이 중에서 pBt91의 변형된 cryⅠAc 유전자를 rbcS-TP에 결합시킨 키메릭 rbcS-Tp::cryⅠAc 유전자, PinII 터미네이터, 35S 프로모터 및 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene(bar))를 포함하는 식물발현 벡터 pMJ-RTB를 제작하였다. 상기 pMJ-RTB의 주요 부분의 유전자 배열을 도 1에 나타내었다.
[단계2 : 변형된 cryⅠAc 유전자의 아그로박테리움에의 도입]
아그로박테리움(Agrobacterium) 선발 항생제로 카나마이신(kanamycin)을 사용하였으며, 상기 단계1에서 제작된 형질전환용 바이너리 벡터 DNA인 pMJ-RTB를 동결용해(freeze-thaw) 방법으로 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404에 도입하고, 스펙티노마이신이 50ug/mL 포함된 YEP배지에서 선발하였다. 선발된 아그로박테리움을 배양하여 플라스미드를 분리하고 제한효소 패턴을 분석함으로써 아그로박테리움의 형질전환을 재확인한 후, 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404 pMJ-RTB를 벼 형질전환에 사용하였다.
[단계3 : 부정배 캘러스와 공동배양]
벼 형질전환을 위하여 완숙종자를 이용하였다. 먼저 벼 종자의 종피를 제거하여 70% 에탄올에 1분간 침지한 후 멸균수로 3회 세척하고, 2% 소듐 하이드로클로라이드(상품명 ‘락스’) 용액에 20분간 교반하면서 종자 표면을 살균하였다. 이 후 종자를 멸균수로 5회 세척하고, 멸균 필터페이퍼로 건조시켜 캘러스 유도배지(N6 기본배지, 500mg/L 프롤린(proline), 500mg/L 글루타민, 3% 슈크로스(sucrose), 2mg/L 2,4-D, 0.25% 피타겔(phytagel), pH5.8)에 종자를 치상하였다. 치상한 종자를 28℃ 암조건에서 4주 배양시키고, 생성된 캘러스에서 식물체로 재분화할 수 있는 캘러스(부정배 캘러스, 엠브리오제닉 캘러스(embryogenic callus)) 만을 선별하여 형질전환 캘러스로 사용하였다. pMJ-RTB로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404를 30시간 배양한 후 균액의 농도를 AAM 배지(100mM 아세 토시린곤(acetosyringone) 포함)로 OD600=1.2로 희석하여 상기 부정배 캘러스와 15분간 방치하였다. 캘러스를 멸균된 필터페이퍼로 건조시킨 후 공동배양배지(N6 기본배지, 500mg/L 프롤린, 500mg/L 글루타민, 3% 슈크로스, 2mg/L 2,4-D, 100mM 아세토시린곤, 0.25% 피타겔)에서 24℃ 암조건, 3일간 공동배양(co-culture)하였다.
[단계4 : 재분화 식물체를 유도]
표면에 잔류하는 아그로박테리움을 제거하기 위하여, 단계3에 의하여 공동배양한 캘러스를 세포탁심(cefotaxime) 250mg/L가 첨가된 AAM 배지로 세척한 후 멸균된 여지에 올려 표면의 수분을 제거한 뒤 선별배지(N6 기본배지, 500mg/L 프롤린, 500mg/L 글루타민, 3% 슈크로스, 2mg/L 2,4-D, 0.25% 피타겔, 6mg/L 바스타(phosphinothricin:PPT), 250mg/L 세포탁심, pH5.8)에 옮겨서 형질전환된 캘러스만을 유도되도록 하였다.
[단계5 : 벼 형질전환체 제조]
상기 단계4에서 유도된 캘러스를 2주마다 새로운 선별배지로 계대배양하고, 5주 경과 후 선발된 캘러스를 식물체 재분화배지(MS 기본배지, 3% 슈크로스, 0.5mg/L NAA, 2mg/L 키네틴, 250mg/L 세포탁심, 3mg/L 바스타(phosphinothricin), 0.3% 피타겔, pH5.8)에서 배양 식물체 유도 후에 MS 기본배지에서 기내 순화하였다. 일정 크기로 성장한 개체들을 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후 논토양으로 채워진 플라스틱 통에 이식하여 온실에서 생육하였다. pMJ-RTB에 의해 32 개체의 재분화 식물체를 얻었으며, 0.3% 제초제(바스타)를 처리하여 bar 저항성 식물체를 선별하였다. 그 결과, 32 개체 모두가 바스타 저항성을 나타냈다.
상기의 아그로박테리움을 벼 부정배 캘러스에 감염시켜 형질전환하고, 형질전환된 벼로 재분화시키는 과정의 사진을 도 2에 나타내었다. 도2에서 사진 A는 엠브리오제닉 캘러스와 아그로박테리움을 공동배양하는 모습, B는 형질전환된 캘러스가 비형질전환 캘러스보다 성장이 빠르게 나타나는 모습, C는 재분화배지에서 식물체가 유도되는 모습, D와 E는 유도된 형질전환 식물체를 기내 순화하는 모습, F는 온실에 옮겨져서 생장한 재분화 식물체의 모습을 나타낸다.
상기 단계3 내지 5에서 사용된 배지의 조건을 정리하면 표1과 같다.
(표 1:단계3 내지 5에서 사용된 배지의 조건)
품종 캘러스유도 전배양 아그로박테리움 공동배양 캘러스선별 식물체유도 기내순화
종자 N6 기본배지 2,4-D 2mg/L AAM 배지 N6기본배지 2,4-D 2mg/L, 아세토시린곤 100mM N6기본배지 2,4-D 2mg/L, PPT 6mg/L MS기본배지 NAA 0.5mg/L, 키네틴 2mg/L, PPT 3mg/L MS 기본배지
배양기간 4~5주 2~3일 2~3일 5주 2~4주 1~2주
항생제 조건 없음 세포탁심 250mg/L 세포탁심 250mg/L 세포탁심 250mg/L
[실험1 : 내충성 벼의 분자생물학적 분석]
상기 단계1 내지 5를 거쳐 재배된 본 발명의 벼 형질전환체에 변형된 cry1Ac 내충성 유전자가 염색체 DNA상에 안정적으로 삽입되어 발현되는지 여부를 서던 블럿, 노던 블럿 및 웨스턴 블럿과 같은 분자생물학적 분석을 통해 확인하였다.
서던 혼성화(southern hybridization) 분석을 통한 유전자의 삽입 확인
외래유전자인 변형된 cryⅠAc 유전자 및 MAR 염기서열이 상기 벼 형질전환체들의 게놈 상에 삽입되었는지 여부를 서던 혼성화 방법으로 확인하였다.
형질전환 개체들로부터 벼 게놈 DNA를 추출하여 정량한 다음 제한효소 PstI을 이용하여 절단하였다. 처리된 DNA를 1% 아가로스젤에서 전기영동하고 나일론막에 전이시켜서 변형된 cryⅠAc 및 MAR 유전자 단편을 방사성 동위원소 P32로 표지한 탐침으로 혼성화를 실시하였다. 실험결과 사진을 도 3과 4에 도시하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 모든 형질전환 개체에서 비형질전환체에서는 확인하지 못한 2.1kb 크기의 밴드(화살표)를 확인할 수 있었다(도 3A). 또한 형질전환 개체에서 MAR 염기서열의 삽입을 보여주는 밴드를 확인할 수 있었다(도 3B). 이는 모든 재분화 개체의 게놈 상에 외래 유전자인 변형된 cryⅠAc 및 MAR 유전자가 발현 가능하도록 성공적으로 삽입되었음을 증명하는 것이다. 도 4는 상기 형질전환체 중에서 선발된 개체의 후대 전개 세대에서 외래 유전자인 변형된 cryⅠAc 및 MAR 염기의 발현을 확인한 것으로, 도 3에 나타난 전세대의 발현과 같이 뚜렷한 발현 양상으로 후대에도 삽입 유전자가 안정적으로 발현함을 확인하였다.
내충성 유전자의 발현 분석
상기 형질전환 개체에서 외래 유전자인 변형된 cryⅠAc가 현실적으로 발현되는지 여부를 재확인하였다.
변형된 cryⅠAc 유전자의 RNA 생성 유무를 확인하기 위하여 식물체의 총 RNA를 분리하고, 이를 나일론막에 전이한 다음 변형된 cryⅠAc 유전자의 단편을 이용하여 혼성화를 실시하였다(도 5). 도 5에서 각 기호의 의미는 도 4의 것과 동일하다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 재분화의 개체 모두에서 변형된 cryⅠAc의 RNA 단편이 확인되었다. 따라서 모든 형질전환 개체에서 변형된 cryⅠAc 유전자의 발현(RNA 생성)이 가능함을 알 수 있다.
내충성 유전자의 단백질 발현 분석
외래유전자인 변형된 cryⅠAc 유전자에 의해 형질전환체의 단백질 상에서 변형된 cryⅠAc 내충성 단백질이 생성되었는지 여부를 웨스턴 혼성화(western hybridization) 방법으로 확인하였다.
형질전환 식물개체로부터 벼 전체 단백질을 0.1% SDS가 포함된 Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액으로 추출하여 SDS-폴리아크릴아미드젤(polyacrylamide gel) 전기영동을 수행한 후 PVDF-막에 전이시켰다. 그리고 나서, 변형된 cryⅠAc 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 혼성화를 실시하였다(도 6). 도 6에서 볼 수 있듯이, 형질전환체에서 변형된 cryⅠAc의 단백질 밴드를 확인할 수 있었으며, 반면 비형질전환 대조구에서는 어떠한 밴드도 확인할 수 없었다. 따라서 형질전환체에서 변형된 cryⅠAc의 유전자에 의한 살충성 단백질의 발현(단백질 생성)이 가능함을 확인할 수 있다.
Immunostrip 진단키트를 이용한 cry1Ac 내충성 유전자의 단백질 발현 확인
상기 얻어진 형질전환 식물체에서 cry1Ac 유전자의 최종산물인 내충성 단백질의 생성 여부를 확인하고자, immunostrip 진단키트를 이용하여 검정하였다.
상기 분자생물학적인 방법을 통해 내충성 cry1Ac 단백질을 확인하였으며, 확실한 검증을 위해 cry1Ac 유전자 단백질에 특이적으로 결합하는 Immunostrip 진단키트(Agdia 사의 'Bt-Cry1Ab/1Ac test kit')를 이용하여 식물체의 잎으로부터 추출한 단백질 용액에 대한 내충성 단백질 발현 여부를 재확인하였다. 그 결과 비형질전환체에서는 하나의 밴드만 확인 가능하여 음성반응으로 판별되었으며, 형질전환체에서는 두 개의 밴드가 확인되어 cry1Ac 내충성 단백질에 대한 양성반응을 나타내었다(도 7).
본 발명에 의한 형질전환 식물체들이 immunostrip 진단키트로 단백질 발현 밴드를 형성하는 것으로 확인된 바, 이는 상기 획득된 형질전환 개체들에서 cry1Ac 내충성 단백질이 안정적으로 생성되고 있음을 증명하는 것이다.
GMO 진단키트를 이용한 bar 유전자 단백질 확인 및 bar 저항성 검정
상기 얻어진 식물체에서 bar 유전자의 최종산물인 단백질 즉, 포스피노트리신 아세틸전이효소(phosphinothricin acetyltransferase)가 생성되는 지를 확인하기 위하여, GMO 진단키트를 이용한 실험 및 0.6% 포스피노트리신을 포함한 배지내 에서 종자의 발아 생육 실험을 통해 제초제 저항성을 확인하였다.
(1) 분자생물학적인 방법에 의해 형질전환체를 확인한 후에 bar 유전자 단백질에 특이적으로 결합하는 GMO(Genetically modified Oraganism) 진단키트(Strategic Diafnostics Inc. 사의 'LL corn granin test kit')를 이용하여 형질전환 여부를 다시 검정하였다. 그 결과 비형질전환체에서는 하나의 밴드만 확인 가능하여 음성반응으로 판별하였으며, 형질전환체에서는 두 개의 밴드가 확인되어 제초제 저항성 단백질 즉, 포스피노트리신 아세틸전이효소에 대한 양성반응을 나타내었다(도 8A).
(2) 상기 형질전환개체로부터 선발된 종자를 0.6% 포스피노트리신(PPT)이 포함된 생육배지내에 치상하여 2주일 정도 지난 후 bar 저항성을 확인하였다. 형질전환체 종자는 비형질전환체와 대조적으로 모두 발아하여 정상적인 생육에 지장이 없었다(도 8B).
본 발명에 의한 형질전환 식물체들이 0.6% PPT의 처리하에서도 생존하는 것을 확인한 바, 이는 상기 획득된 재분화 개체들에서 제초제 저항성 단백질이 생성되고 있음을 증명하는 것이다.
[실험2:일본 먹노린재(japanese black rice bug)와 이화명나방(striped stem borer)에 대한 내충성 실험]
변형된 cryⅠAc를 벼에 형질전환하여 실시예1~3의 벼를 얻었고, 본 발명에 따라 형질전환하지 않은 일반벼인 비교예 1~2를 준비하였다. 상기 실시예1~3 및 비 교예1~2에 일본 먹노린재(japanese black rice bug)와 이화명나방(striped stem borer)의 유충 각각 200마리씩에 섭식시킨 다음, 5일 후 식물 조직 내의 톡신 펩티드(toxin peptide)에 의한 살충력을 조사하여, 그 결과를 표2에 나타내었다. 표2에서 알 수 있는 바와 같이 비교예1 및 2의 벼의 줄기를 먹인 나방의 유충은 별다른 이상 없이 모두 잘 자랐으나, 실시예1~3의 벼의 줄기를 먹인 나방 유충의 경우에는 높은 유독 효과를 나타냈다. 특히, 일본 먹노린재의 경우 95~100%의 치사율을 보였으며, 이화명나방의 경우에는 형질전환 식물체에서 50~80%의 치사율을 나타냈다
(표2:일본먹노린재 및 이화명나방에 대한 내충성 시험 결과)
구분 치사율(%)
실시예1 실시예2 실시예3 비교예1 비교예2
일본 먹노린재 96 66 100 56 39
이화명나방 67 56 79 0 5
[실험3:혹명나방(Rice leaf folder)에 대한 항충성 실험]
수원시 권선구 서둔동에 소재하고 있는 1200m2 넓이의 실제 야외 포장 12개소에서 본 발명의 변형된 cryⅠAc 유전자로 형질전환한 벼 및 형질전환하지 않은 벼를 각 개소당 각각 12개체씩 4~5개월 동안 재배하면서, 재배과정 중 발생되는 해충, 특히 재배기간 중 자연적으로 발생한 혹명나방(Rice leaf folder)에 대한 피해여부를 확인하여, 그 결과를 표3 및 도9에 나타내었다. 표3 및 도9로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 변형된 cryⅠAc 유전자로 형질전환된 벼 중, 한 계통의 형질전환체의 경우 혹명나방의 유충 피해를 전혀 나타내지 않았으며, 단지 약간의 일시적 섭식 흔적이 있었을 뿐 모두 유효범위 이하였다. 반면, 비형질전환체는 모 든 잎이 혹명나방 유충의 섭식에 의해 심각한 피해를 나타냈다. 따라서, 형질전환된 여러 계통 중에서 혹명나방 유충에 대하여 특이적으로 저항성을 나타내는 계통을 혹명나방 저항성 벼로 선발하였다. 본 발명에서 개발된 상기 계통은 변형된 cryⅠAc 유전자가 벼 염색체 DNA상의 안정적 위치에 삽입되어 상기 유전자로부터 단백질을 안정적으로 생성하였기 때문에 톡신 펩타이드(toxin peptide)에 의해 혹명나방 유충에 대하여 살충작용과 기피현상이 발생하였음을 나타내고 있다.
(표3:혹명나방에 대한 항충성 실험)
구분 피해정도
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 11 12
비형질전환 벼 ++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++++ ++++ +++ ++++
형질전환 벼 - - - - - - - - - - - -
+혹명나방 피해 정도, -무 피해
[실험4:파밤나방(Beet armyworm)에 대한 항충성 실험]
상기 실험으로부터 선발된 변형된 cryⅠAc 유전자 벼 형질전환체 계통을 섭식시킨 파밤나방(Beet armyworm) 유충(실시예4~34) 및 형질전환하지 않은 벼를 섭식시킨 파밤나방 유충(비교예3에서는 낙농벼를, 비교예4에서는 추정벼를 사용하였다)에 대하여, 벼를 섭식시키고 6일 후 각각의 유충의 생존 상태를 조사하여 표4에 나타내었다. 표4에 기재된 바와 같이, 여러 형질전환 개체에서 파밤나방 유충이 생존하지 못했으며(실시예4, 6, 10, 12, 13, 21 및 31에서 100% 사상), 대부분 50% 이하의 생존율이 확인된 반면 비교예3에서는 80%, 비교예4에서는 100%의 생존률이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 변형된 cryⅠAc 유전자로 형질전환된 혹명나방 저 항성 벼 형질전환체가 파밤나방에 대해서도 항충성을 갖는 것을 확인하였다.
(표4:파밤나방에 대한 항충성 실험)
계통 생존률(%) 계통 생존률(%)
비교예31) 80 실시예19 50
비교예42) 100 실시예20 25
실시예4 0 실시예21 0
실시예5 25 실시예22 50
실시예6 0 실시예23 50
실시예7 25 실시예24 50
실시예8 40 실시예25 50
실시예9 25 실시예26 75
실시예10 0 실시예27 100
실시예11 25 실시예28 100
실시예12 0 실시예29 40
실시예13 0 실시예30 80
실시예14 50 실시예31 0
실시예15 75 실시예32 25
실시예16 25 실시예33 25
실시예17 40 실시예34 60
실시예18 20
*1) 낙동벼
*2) 추정벼
[실험5:혹명나방(Rice leaf folder) 유충에 대한 살충성 실험]
본 실험에서는 상기 실험4에서는 실제 재배 포장에서 자연적으로 발생한 혹명나방 유충에 대하여 실질적인 저항성 효과를 나타낸 형질전환체 계통을 선발하여 혹명나방 유충에 대한 항충성을 재검증하였다. 먼저, 혹명나방 유충을 벼 식물체에 접종하여 섭식시키고 14일 후 생존한 유충의 수를 조사하여 표5에 나타내었다.
표5에 기재된 바와 같이, 모든 형질전환 개체들에서 혹명나방 유충에 대하여 100% 항충성을 나타내어 비교예와 대조를 이루었다.
재접종일 계통 11월 26일 12월 15일 1월 5일 11월 26일 12월 15일 1월 5일
14일후 생충수 14일후 생충수 14일후 생충수 14일후 생충률 14일후 생충률 14일후 생충률
실시예35 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예36 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예37 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예38 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예39 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예40 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예41 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예42 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예43 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예44 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예45 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예46 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예47 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예48 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예49 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예50 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예51 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예52 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예53 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예54 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예55 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
실시예56 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
비교예51 ) 3.67 2.00 3.00 73.40 40.00 60.00
(표5:혹명나방 유충의 살충실험)
*침종일 : 2004년 9월 24일, 파종일 : 2004년 9월 27일
*처리방법 : 유충 5마리가 접종된 옥수수잎을 벼 실험 묘에 접종
*1) 낙동벼
상기 실험을 통해 본 발명의 cry1Ac 유전자 벼 형질전환체가 혹명나방 유충에 대하여 100% 항충성을 나타내어 혹명나방에 대한 실질적이고 확실한 내충성 효과를 나타냄을 검증할 수 있었다.
본 발명에 의하면, 농약과 같은 화학살충제를 사용하지 않더라도 혹명나방에 의한 피해가 전혀 없는 친환경적인 고품질 벼 생산이 가능할 뿐만 아니라, 본 형질전환 식물체에는 제초제 저항성 유전자가 내포되어 있으므로 벼 재배와 관리시에 제초제 살포에 의한 잡초제거가 용이하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (2)

  1. 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 혹명나방에 대한 저항성을 갖는 벼 형질전환체를 제조하는 방법:
    (1) 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 변형된 cryⅠAc 유전자가 삽입된 재조합벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 제조된 재조합벡터를 이용하여 식물 형질전환용 아그로박테리움을 제조하는 단계;
    (3) 상기 제조된 아그로박테리움을 이용하여 벼 종자로부터 유기된 부정배 캘러스와 공동배양하는 단계;
    (4) 상기 공동배양된 캘러스로부터 재분화 식물체를 유도하는 단계; 및
    (5) 상기 유도된 재분화 식물체를 기내순화하고, 토양에 이식하여 벼 형질전환체를 재배하는 단계.
  2. 제1항의 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 혹명나방에 대한 저항성을 갖는 형질전환 벼 캘러스.
KR1020050088308A 2005-09-22 2005-09-22 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법 KR100723070B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050088308A KR100723070B1 (ko) 2005-09-22 2005-09-22 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050088308A KR100723070B1 (ko) 2005-09-22 2005-09-22 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070033782A KR20070033782A (ko) 2007-03-27
KR100723070B1 true KR100723070B1 (ko) 2007-05-30

Family

ID=41634674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050088308A KR100723070B1 (ko) 2005-09-22 2005-09-22 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100723070B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066007A1 (ko) * 2011-11-04 2013-05-10 충북대학교 산학협력단 발아초기 종자 이용 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체
US9512187B2 (en) 2013-03-26 2016-12-06 Snu R&Db Foundation Mutant Bacillus thuringiensis proteins and genes encoding the same with improved insecticidal activity and use thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103355350B (zh) * 2013-07-19 2015-04-29 扬州绿源生物化工有限公司 稻纵卷叶螟颗粒体病毒苏云金杆菌生物杀虫剂及制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020013003A (ko) * 2000-08-10 2002-02-20 김강권 배추과 작물의 형질전환을 위한 합성 곤충 독소 유전자

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020013003A (ko) * 2000-08-10 2002-02-20 김강권 배추과 작물의 형질전환을 위한 합성 곤충 독소 유전자

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066007A1 (ko) * 2011-11-04 2013-05-10 충북대학교 산학협력단 발아초기 종자 이용 단기 형질전환 벼 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체
US9512187B2 (en) 2013-03-26 2016-12-06 Snu R&Db Foundation Mutant Bacillus thuringiensis proteins and genes encoding the same with improved insecticidal activity and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070033782A (ko) 2007-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5608142A (en) Insecticidal cotton plants
Alam et al. Genetic engineering of eggplant (Solanum melongena L.): Progress, controversy and potential
CN105624177A (zh) 一种抗虫融合基因、编码蛋白、载体及其应用
CN115449521B (zh) 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用
JPH02502253A (ja) 綿の再生及び形質転換
CN109971880A (zh) 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法
CN102725414B (zh) 用于通过在转化过程中诱导bbm提供可育植物的方法
CN101580843B (zh) 人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因
CN106399339A (zh) 一种抗除草剂抗虫融合基因、编码蛋白及应用
Jafari et al. Enhanced resistance to a lepidopteran pest in transgenic sugar beet plants expressing synthetic cry1Ab gene
CN103014035B (zh) 茎瘤芥抗逆基因及其植物表达载体和构建方法及应用
CN111088265A (zh) 抗虫融合基因、其编码蛋白、其表达载体及其应用
Perthuis et al. Stable resistance against the leaf miner Leucoptera coffeella expressed by genetically transformed Coffea canephora in a pluriannual field experiment in French Guiana
KR100723070B1 (ko) 혹명나방 저항성 벼 형질전환체 및 그 제조방법
CN105753951A (zh) 一种Bt抗虫基因及其编码的蛋白质和应用
CN102776226B (zh) 利用苜蓿作为生物反应器生产天蚕素抗菌肽的方法
JP2007527694A (ja) ワタアブラムシ耐性遺伝子
CN106701792A (zh) 人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用
CN109912721B (zh) 创建抗虫融合基因的方法及其应用
CN108220332A (zh) 一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法
CA1337280C (en) Production of proteins in plants
Viswakarma et al. Insect resistance of transgenic broccoli (‘Pusa Broccoli KTS-1’) expressing a synthetic cryIA (b) gene
ZHANG et al. Breeding and identification of insect-resistant rice by transferring two insecticidal genes, sbk and sck
KR20190051565A (ko) 후대교배 복합해충저항성 벼 및 이의 제조방법
JP4228072B2 (ja) アビジンをコードする人工合成遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant