KR20190051565A - 후대교배 복합해충저항성 벼 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 후대교배 복합해충저항성 벼 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 혹명나방에 내충성을 가지는 벼 mcry1Ac1 계통을 모본으로, 벼물바구미에 내충성을 가지는 벼 Btt12R 계통을 부본으로 하여 후대 교배를 통해 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼를 육종하는 방법을 제공하는 효과가 있다. 상기 방법으로부터 생산된 벼는 벼 해충에 대해 복합 방제가 가능하여 유기합성 농약의 사용 경감을 통한 환경오염 및 농약잔류에 따른 소비자의 불안감 감소에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 후대교배 복합해충저항성 벼 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
국제생명공학응용정보서비스(ISAAA)에 따르면, 2016년 전 세계의 생명공학 작물(GM crop)은 26개국에서 1억 8,510만 ha가 재배되었고, 이는 1996년 170만 ha로 상업적 재배를 시작한 후 20년 연속으로 매년 지속적으로 증가하고 있다고 보고하였다.
이중 후대교배종(stacked traits) 생명공학작물이 2016년 전 세계 재배면적의 41%를 차지하고 있고, 많은 이점에 의해 점차 증가하고 있는 추세에 있다. 후대교배종은 병충해저항성, 제초제내성 및 기타 특성의 복합형질 품종으로 제초제내성+제초제내성, 해충저항성+해충저항성 및 제초제내성+해충저항성 등의 품종이 대부분을 차지하고 있다. 또한, 이들 재배면적은 2015년 5,840만 ha에서 2016년 7,540만 ha로 29%가 증가하였다.
살충성 독소단백질은 토양미생물인 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주에 의해 생성되어 특정 해충에 대하여 특이적으로 살충성을 나타내고 있고 환경 친화적이며, 인체에 해가 없는 미생물 살충단백질이라는 점에서 많은 관심이 집중되어 왔고, 오래전부터 미생물 생물농약으로 이용되고 있다. 최근 여러 B.t 독소단백질의 유전자들을 이용한 살충성 작물 연구로 많은 해충저항성 작물들이 개발되고 있다.
전 세계적으로 기후온난화와 기상이변으로 병충해 발생 빈도가 상승하고 매년 약 2억 톤 이상의 벼들이 손실되고 있고 국내도 기후변화에 따른 병해충이 만연해지고 있다. 특히 비래 해충인 나비목과의 혹명나방은 전국적으로 많은 피해를 발생시키고 있으며, 2003년의 경우에는 벼 재배면적의 26.5%인 265.457 ha에 발생하여 이전 피해면적보다 10배 높게 기록하기도 했다. 방제에서도 혹명나방 유충(애벌레)의 경우 벼 잎을 원통으로 말고 그 안에서 잎을 갉아먹기 때문에 농약시용의 경우 초기에 방제하지 못할 경우 농약살포의 효과가 미미할 수 있다.
또한, 국내 온난화 현상은 풍뎅이류 해충인 벼물바구미의 발생 빈도를 증가시키고 점차 그 피해가 높아지고 있는 추세에 있다. 피해의 형태를 보면, 성충이 벼 잎을 가해하나 그 피해는 크지 않으나, 유충의 경우 흙 속 뿌리에 붙어 서식하면서 가해하여 뿌리의 양분 흡수 방해 및 벼의 영양 불균형으로 생육에 큰 피해를 주고 있다. 특히, 뿌리에 서식하기 때문에 농약을 살포하여도 유충의 방제는 매우 어려움에 있고, 국내외적으로 적당한 방제 방법이 없는 실정인 것으로 알려져 있다.
해충저항성 생명공학작물의 개발은 현재 해충의 유충에 대하여 효과적인 방제방법이 없는 상황에서 환경 친화적인 방제 효과가 매우 클 것으로 예상된다. 국내에서도 혹명나방저항성 벼(Kim 등., Planta, 230: 397-405, 2009) 및 벼물바구미저항성 벼(Lee 등., Plant Cell Tiss Organ Cult. 115: 243-252, 2013)가 개발되었으나, 아직까지 상업화 또는 실용화가 이루어지지 못하고 있는 실정이다.
벼(Oryza sativa) 는 우리나라에서 재배되는 가장 중요한 농작물로써 농가의 주 소득원을 이루고 있으나, 벼에 막대한 피해를 끼치는 해충으로 인하여 생산량 감소 및 농가소득 경감, 다량의 유기농약 사용에 따른 환경파괴 문제 및 농약 잔류의 염려 등 여러 어려움에 직면하고 있는 상황으로 미생물 유래의 무독성 살충성 유전자를 이용한 해충저항성 벼 개발을 통해 이들 문제해결에 기여할 수 있을 것으로 본다.
국내의 경우 아직까지 복합저항성 작물의 개발은 전무한 실정으로 기온 상승에 따른 환경변화로 점차 증가하고 있는 외래 해충을 동시에 방제할 수 있는 복합해충저항성 작물 개발은 벼 재배 및 해충 방제에 큰 이득일 것이다.
Kim 등., Planta, 230: 397-405, 2009
Lee 등., Plant Cell Tiss Organ Cult. 115: 243-252, 2013
본 발명의 목적은 벼 해충인 혹명나방과 벼물바구미에 모두 내충성을 나타낼 수 있는 복합해충저항성 벼의 육종방법 및 이로부터 제조된 벼 식물체 또는 이의 종자를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID No: 1의 유전자 mcry1Ac1를 포함하는 벡터로 형질전환하여 선발된 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) mcry1Ac1 계통을 모본으로,
SEQ ID No: 2의 유전자 cryIIIa를 포함하는 벡터로 형질전환하여 선발된 벼물바구미(Lissorphoptrus oryzophilus)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) Btt12R 계통을 부본으로 하여 후대 교배하는 단계;
교잡종(F1)의 식물체를 육종 및 세대전개하는 단계; 및
유전자 mcry1Ac1 및 cryIIIa를 동시에 발현하는 개체를 선발하는 단계를 포함하는, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼(Oryza sativa)의 육종방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 제조되어 mcry1Ac1 및 cryIIIa 유전자를 동시에 발현하고, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 벼(Oryza sativa) 식물체 또는 이의 종자를 제공한다.
본 발명은 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) mcry1Ac1 계통을 모본으로, 벼물바구미(Lissorphoptrus oryzophilus)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) Btt12R 계통을 부본으로 하여 후대 교배를 통해 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼를 육종하는 방법 및 후대교배 벼를 제공하는 효과가 있다. 상기 방법으로부터 생산된 벼는 벼 해충에 대해 복합 방제가 가능하여 유기합성 농약의 사용 경감을 통한 환경오염 및 농약잔류에 따른 소비자의 불안감 감소에 기여할 수 있다.
도 1a는 혹명나방저항성 벼 mcry1Ac1 계통(교배 모본)의 삽입유전자 개열지도, 도 1b는 벼물바구미저항성 벼 Btt12R 계통(교배 부본)의 삽입유전자 개열지도를 나타낸 것이다. 도 1a 및 1b에서 기재된 약어는 다음과 같다: BR(right border), BL(left border), Prbcs(rbcS promoter), PMC12(modified rice RCg2 root-preferential promoter), TP(transit peptide), mcry1Ac1(modified cry1Ac gene), cryIIIa(cryIIIa gene), PinII(3' region of the potato protease inhibitor II), P35S(CaMV 35S promotor), Bar(phosphinothricin acetyltransferase), NOS(3' region of nopaline synthase), MAR(Matrix attachment region)
도 2는 해충저항성 후대교배 벼(mcry1Ac1×Btt12R)의 종자 발아 개체를 나타낸 것이다.
도 3은 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R) 교배개체에 대한 PCR 분석을 나타낸 것이다. 사진도에 기재된 약어는 다음과 같다: M, 1kb plus ladder; P, positive control (Btt12R & mcry1Ac1 rice); N, negative control; Lane 1-9, mcry1Ac1×Btt12R 교배계통
도 4는 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 bar 및 cry1Ac 단백질 면역-스트립(immuno-strip) 분석 결과를 나타낸 것이다. 기재된 약어는 다음과 같다: P1, 양성대조구-mcry1Ac1 벼; P2, 양성대조구-cryIIIa 벼; N1, 음성대조구-동진벼; N2, 음성대조구-낙동벼; Lane 1-6, mcry1Ac1×Btt12R 교배개체
도 5는 복합해충저항성 벼 교배계통(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 cryIIIa 유전자 서던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다. 기재된 약어는 다음과 같다: P, 양성대조구(Btt12R 형질전환 벡터); N, 음성대조구(동진벼); Lane 1-6, mcry1Ac1×Btt12R 교배계통
도 6은 혹명나방 채집 및 산란·부화(a), 벼에 대한 컷-리프 검사(Cut-leaf test) 생물검정 방법(b)을 나타낸 것이다.
도 7은 컷-리프 검사를 통한 해충저항성 벼의 혹명나방 유충에 대한 생물검정 결과를 나타낸 것으로, 음성대조구: 동진벼, 양성대조구: Agb0101, 복합해충저항성 벼 비교구: 형질전환체 1 및 2이다.
도 2는 해충저항성 후대교배 벼(mcry1Ac1×Btt12R)의 종자 발아 개체를 나타낸 것이다.
도 3은 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R) 교배개체에 대한 PCR 분석을 나타낸 것이다. 사진도에 기재된 약어는 다음과 같다: M, 1kb plus ladder; P, positive control (Btt12R & mcry1Ac1 rice); N, negative control; Lane 1-9, mcry1Ac1×Btt12R 교배계통
도 4는 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 bar 및 cry1Ac 단백질 면역-스트립(immuno-strip) 분석 결과를 나타낸 것이다. 기재된 약어는 다음과 같다: P1, 양성대조구-mcry1Ac1 벼; P2, 양성대조구-cryIIIa 벼; N1, 음성대조구-동진벼; N2, 음성대조구-낙동벼; Lane 1-6, mcry1Ac1×Btt12R 교배개체
도 5는 복합해충저항성 벼 교배계통(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 cryIIIa 유전자 서던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다. 기재된 약어는 다음과 같다: P, 양성대조구(Btt12R 형질전환 벡터); N, 음성대조구(동진벼); Lane 1-6, mcry1Ac1×Btt12R 교배계통
도 6은 혹명나방 채집 및 산란·부화(a), 벼에 대한 컷-리프 검사(Cut-leaf test) 생물검정 방법(b)을 나타낸 것이다.
도 7은 컷-리프 검사를 통한 해충저항성 벼의 혹명나방 유충에 대한 생물검정 결과를 나타낸 것으로, 음성대조구: 동진벼, 양성대조구: Agb0101, 복합해충저항성 벼 비교구: 형질전환체 1 및 2이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 SEQ ID No: 1의 유전자 mcry1Ac1를 포함하는 벡터로 형질전환하여 선발된 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) mcry1Ac1 계통을 모본으로,
SEQ ID No: 2의 유전자 cryIIIa를 포함하는 벡터로 형질전환하여 선발된 벼물바구미(Lissorphoptrus oryzophilus)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) Btt12R 계통을 부본으로 하여 후대 교배하는 단계;
교잡종(F1)의 식물체를 육종 및 세대전개하는 단계; 및
유전자 mcry1Ac1 및 cryIIIa를 동시에 발현하는 개체를 선발하는 단계를 포함하는, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼(Oryza sativa)의 육종방법에 관한 것이다.
본 발명의 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼의 육종방법은 복합해충저항성 벼를 개발하기 위한 것으로, 형질전환을 통해 내충성 유전자가 삽입된 혹명나방저항성 벼(mcry1Ac1)와 벼물바구미저항성 벼(Btt12R)의 우량계통을 선발하고, 각 단일형질 해충저항성 벼를 동시에 논포장에서 생육시켜 수정·교배하고, 복합해충저항성 교잡종(mcry1Ac1×Btt12R) F1 종자를 생산하고, 온실에서 발아시킨 후 각 도입유전자가 확인된 교배개체를 선발한다.
도입유전자가 확인된 교배개체를 논포장에 이앙하고, 분자생물학적으로 유전자의 안정적인 도입과 목적단백질의 발현이 확인된 교배계통을 선발/육성한다.
상기 교배계통은 혹명나방 유충에 대하여 80%의 매우 높은 살충성을 나타내면서 두 개의 해충저항성 형질을 동시에 갖는 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R) 계통인 것을 특징으로 한다.
상기 혹명나방저항성 벼 계통 선발에 사용되는 유전자 mcry1Ac1를 포함하는 벡터는 유전자 mcry1Ac1를 포함하며, 도 1a의 개열지도를 가질 수 있다. 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 내독소 단백질 유전자 wt-cryⅠAc는 3,537bp로 아미노산 1,178개를 코딩한다. 본 발명은 상기 3,537bp의 wt-cryⅠAc 유전자 중에서 특히 앞부분에 해당하는 1,854bp 부위가 벼의 혹명나방에 대한 저항성을 높일 수 있음을 확인하고 이를 기반으로 하여 변형된 유전자 mcry1Ac1(modified crylAc1: SEQ ID No: 1)를 혹명나방저항성 벼 계통 선발에 사용한다. 도 1a의 개열지도를 참조하여 설명하면, 상기 변형된 cryⅠAc 유전자가 벼의 형질전환에 적합하도록 rbcS 프로모터와 결합되어 있는데, 상기 rbcS 프로모터에는 클로로플라스트-타겟 발현(chloroplast-targeted expression)을 위해 전이 펩타이드 서열(transit peptide sequence)이 뒤에 결합되어 있다(rbcS-TP). 본 발명의 벡터는, 상기와 같은 방법에 의하여 제조된 키메릭 rbcS-Tp::cryⅠAc 유전자, PinII 터미네이터, 35S 프로모터와 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene(bar))의 순으로 구성되었다. 상기 벡터의 선발표식인자로 사용된 포스피노트리신 아세틸 전이효소 유전자(bar)는 제초제인 바스타(Basta)에 대한 저항성 유전자로서 적용되었다.
상기 벼물바구미저항성 벼 계통 선발에 사용되는 유전자 cryIIIa를 포함하는 벡터는 바실러스 투린지엔시스 에스에스피 테네브리오니스(Bacillus thuringiensis ssp. Tenebrionis)(Btt)에서 유래된 SEQ ID No: 2의 유전자 cryIIIa를 포함하며, 도 1b의 개열지도를 가질 수 있다.
도 1b의 개열지도를 참조하여 설명하면, 벡터는 변형된 벼의 RCg2 뿌리특이 프로모터, 35S 프로모터 및 bar 유전자(phosphinothricin acetyl transferase gene)를 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터가 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예컨대, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment or microparticle bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 폴리에틸렌글리콜에 의한 침전법(polyethylenglycol-mediated uptake) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.
본 발명의 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼의 육종방법에 있어서, 유전자 mcry1Ac1 및 cryIIIa를 동시에 발현하는 교배개통의 선발은 SEQ ID Nos: 3 및 4의 프라이머 쌍과 SEQ ID Nos: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 상기의 방법으로 제조되어 mcry1Ac1 및 cryIIIa 유전자를 동시에 발현하고, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 벼(Oryza sativa) 식물체 또는 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 벼 식물체 또는 이의 종자는 상기의 육종방법으로 제조되고, mcry1Ac1 및 cryIIIa 유전자를 동시에 발현하며, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 후대교배 복합해충저항성 벼의 종자로 80%의 높은 혹명나방 유충에 대한 살충성을 나타내는 것을 특징으로 한다(표 1 참조).
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 복합저항성 벼 개발을 위한 단일형질 해충저항성 벼 계통 선발
나비목과 해충에 살충성을 나타내는 유전자, mcry1Ac1(Genebank No. AY126450)를 포함하는 형질전환 벡터(도 1a)로 작물형질전환하여 선발된 해충저항성 벼 mcry1Ac1 계통을 포장에서 육성하고 우수 생육을 나타내는 계통을 선발하였고, 또한, 딱정벌레목에 저항성을 나타내는 유전자 cryIIIa로 형질전환(도 1b)하여 개발된 벼물바구미저항성 벼 Btt12R 계통(Lee 등., Plant Cell Tiss Organ Cult. 115: 243-252, 2013) 중 우수 생육 및 벼물바구미 유충에 대하여 저항성이 높은 후대세대 Btt12R 13 계통을 선발하였다. 이들 선발 단일형질 해충저항성 벼는 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R) 개발을 위한 교배계통으로 사용하였다.
<실시예 2> 벼물바구미저항성 벼(Btt12R)와 혹명나방저항성 벼(mcry1Ac1)를 이용한 복합해충저항성 후대교배 벼 생산
기존 벼물바구미저항성 벼로 개발된 Btt12R 계통 중 우수계통으로 선발된 Btt12R 13 계통과 혹명나방에 저항성을 갖도록 개발된 해충저항성 벼의 선발 계통을 이용하여 후대 교배하였다. 모본으로 혹명나방저항성 벼(mcry1Ac1)와 부본으로 벼물바구미저항성 벼 Btt12R 13 계통의 종자를 온실에서 파종한 후 1개월 정도를 발아와 유묘로 생육시켰으며, 이들 유묘를 격리포장에 나란히 이앙하여 생육시켰다. 이후 8월 중순경 벼가 개화하기 시작하였을 때 하루 중 오전에 모본을 mcry1Ac1벼 계통으로 하고 부본인 Btt12R 13 계통의 화분을 모본에 수정시켜 교배를 수행하였다. 10월 중순 이후 논포장에서 수정시킨 mcry1Ac1×Btt12R 교배벼의 F1 종자 150개를 수확하였고, 이들 종자를 휴면처리하여 교배개체를 선발하기 위해 F1 종자를 온실에 파종하였다. 이중 발아된 mcry1Ac1×Btt12R 교배벼의 유묘 100개체를 확보하였다(도 2).
<실시예 3> 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R)의 PCR 분석
혹명나방저항성 벼(mcry1Ac1)를 모본으로 하고 벼물바구미저항성 벼 Btt12R 13 계통을 부본으로 하여 논포장에서 수정·교배로 얻어진 종자의 발아 개체들에 대하여 교배여부(mcry1Ac1×Btt12R)를 확인하기 위한 PCR을 수행하였다.
먼저, 복합해충저항성 교배개체의 잎을 채취하고 CTAB 버퍼 용액을 이용한 DNA 분리방법으로 게놈 DNA를 추출하였으며, 각 시료는 mCry1Ac1-Btt12R 교배계통과 양성대조구(positive control)로 Btt12R 및 mcry1Ac1 계통에 대하여 실시하였다. 또한 음성대조구(negative control)는 비형질전환체인 동진벼에서 분리한 게놈 DNA를 도입유전자 cryIIIa와 mcry1Ac1의 상기 검출 프라이머 쌍으로 각각 PCR을 수행하였다.
교배 개체에 대하여 모본과 부본의 목적유전자인 mcry1Ac1 및 cryIIIa에 각각 특이적인 프라이머는 다음과 같다:
Cry-SF: 5'-CGTGCCAGGAGCTGGGTTCGT-3', Cry-SR: 5'-CTGTAGACACCCTGTCCTAGT-3';
Btt-SF:5'-CCCGTTTGGTGGAGCGCTTGT-3', Btt-SR: 5'-CAGCGGACGGCCAGACCGCAA-3'
PCR 반응은 주형 DNA 100ng, 센스 및 안티센스 프라이머 각각 100pM/㎕를 Bioneer사의 AccuPower PCR premix를 사용하여 전체 부피 20㎕로 준비하였고, PCR 반응조건으로는 변성 조건, 95℃ 5분 실행 후, 변성 95℃ 30초, 어닐링 63℃ 30초, 중합 72℃ 1분을 총 30사이클로 하여 수행하였다. PCR 반응을 수행한 각 증폭산물은 0.8% 아가로스 젤 상에 전기영동하여 검출 유전자 밴드를 확인하였다.
도 3에 나타난 바와 같이 비형질전환체인 동진벼에서는 유전자 밴드가 전혀 발견되지 않았고, 이와 반대로 양성대조구에서는 반응증폭산물의 밴드를 확인할 수 있었다. 복합해충저항성 교배계통에서 부본으로 이용된 cryIIIa 유전자가 4, 6, 7번 개체를 제외하고 나머지 개체에서 반응산물을 확인할 수 있었으며, 모본으로 사용한 mcry1Ac1 유전자는 모든 개체에서 예상된 DNA 반응밴드를 확인할 수 있었다. 이중 mcry1Ac1 및 cryIIIa의 두 개의 유전자가 모두 확인된 교배개체들을 교배계통으로 선발하였고, 이후 유묘 식물체를 논포장에 이앙하여 육성하였다. 상기 교배된 개체들은 동일 모본과 부본을 사용하여 교배하였기 때문에 각 개체들은 동일한 계통이라 할 수 있다. 따라서 육성 중 우수한 생육상을 나타내는 개체들을 우수선발 계통으로 분리/선발하였다.
<실시예 4> 복합해충저항성 교배계통(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 발현단백질 분석
복합해충저항성 벼 교배계통에 대하여 PCR 분석으로 확인된 개체들의 포장 이앙 후 생육 중 유전자의 안정적인 발현 여부를 확인하기 위해서 도입유전자에 따른 단백질 분석을 수행하였다. 면역-스트립(Immuno-strip)을 이용하여 단백질 분석이 가능한 bar 및 cry1Ac에 대하여 발현 분석을 수행하고자, 포장에 이앙된 6개 교배계통의 신선한 잎을 채취하고, 추출 버퍼를 이용해 단백질을 추출한 후 각 스트립을 이용하여 반응을 실시하였다.
도 4에서 나타난 바와 같이 bar 및 cry1Ac 단백질이 교배체들에서 동시에 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 음성대조구인 동진벼와 낙동벼에서는 모든 반응이 나타나지 않았으며, 양성대조구인 cryIIIa 벼에서는 예상한 대로 cry1Ac 단백질에 대하여 반응을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로 mcry1Ac1 벼가 모본으로 사용되었기에 안정적으로 cry1Ac 단백질 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 본 교배계통은 모두 동일 모본 및 부본으로 교배가 이루어져서 동일 계통으로 판단됨으로 이들 중 생육상태가 우수한 개체를 선발하고 해충저항성 생물검정 수행과 우수계통을 선발/육성하고자 하였다.
<실시예 5> 복합해충저항성 벼 교배계통(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 도입유전자의 서던 블랏 분석
복합해충저항성 벼 교배계통(mcry1Ac1×Btt12R)에 대하여 식물체에 형질전환된 유전자가 교배되어 분자생물학적으로 안정적으로 유지되고 있는가를 확인하기 위해서 서던 블랏 분석을 수행하였다. 서던 블랏 분석은 부본인 Btt12R 계통에 도입된 유전자 cryIIIa를 확인하였다.
먼저, DNA 추출을 위해서 교배계통의 신선한 잎을 액체질소를 이용하여 분쇄한 후 CTAB 추출법(Murray and Thopson et al. Nucleic Acid Res 8:4321-4325, 1980)에 따라 식물체 내 포함되어 있는 게놈 DNA를 추출하였다. 서던 블랏 분석은 먼저 추출한 게놈 DNA 5 ng을 제한효소 EcoRV로 처리하여 절단하고, 이후 이들 DNA 용액을 1% 아가로스 젤에 전기영동하였다. 전기영동 된 아가로스 젤은 나일론 멤브레인(Hybound-N2, GE Healthcare, USA)에 블랏팅하여 DNA를 멤브레인으로 전이시켰으며, 이후 미리 준비한 cryIIIa 유전자 단편을 DIG-AP로 표지하여 프로브로 만들고 DNA가 전이된 나일론 멤브레인과 함께 42℃에서 오버나이트 동안 수행하여 혼성화시켰다. 서던 블랏 확인은 Fusion FX 기기를 이용하였다.
도 5에서 나타낸 바와 같이, 모든 교배 개체들에서 cryIIIa 유전자의 밴드가 확인되었다. 이는 모본인 mcry1Ac1 벼에 수정·교배가 정상적으로 이루어져 부본의 cryIIIa 유전자가 안정적으로 삽입되어 있음을 나타내고 있다. 위의 결과들을 통해서 분자생물학적으로 mcry1Ac1 벼와 Btt12R 벼가 안정적으로 교배가 이루어져 있음을 확인할 수 있었으며, 이후 생육 우수 개체를 선발하여 도입유전자의 발현 확인을 수행하였다.
<실시예 6> 복합해충저항성 후대교배 벼(mcry1Ac1×Btt12R)에 대한 벼해충 살충성 생물검정
복합해충저항성 교배벼의 살충성 발현 확인을 위해서 생물검정을 수행하였다. 본 개발에 사용된 Btt12R 벼 계통은 형질전환된 유전자 cryIIIa가 벼물바구미 유충에 대하여 살충성이 이전 연구발표에서 평균 50∼60% 범위를 갖는 것으로 확인되었다(Lee 등., Plant Cell Tiss Organ Cult. 115: 243-252, 2013). 따라서 모본으로 이용된 mcry1Ac1 벼의 나비목과 해충에 대한 살충성을 확인하고자 하였다.
복합해충저항성 후대교배 벼(mcry1Ac1×Btt12R)의 해충저항성 검증을 위해 벼에 많은 피해를 주고 있는 나비목과 해충 중 대표적인 국내 비래 해충인 혹명나방을 이용하여 살충성을 확인하고자 하였다. 먼저, 2016년 9월과 10월초 사이 전남 강진군 및 신안군에 발생된 혹명나방 성충을 채집하고 준비된 곤충 생육상에 방사하여 알을 산란시키고 부화시켜 유충을 얻었다(도 6a). 부화된 유충은 옥수수 식물체에서 대략 2주 정도 생육시키고 3-4령기의 유충을 모아 생물검정 사육통 당 5마리씩 각 처리구를 3반복으로 접종하여 컷-리프 검사(cut-leaf test)로 수행하였다(도 6b).
후대교배 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R)의 살충성 확인을 위해서 음성대조구로 모본의 원품종인 비형질전환 동진벼를 사용하였고, 양성대조구로 기 개발된 단일형질의 혹명나방저항성 벼 Agb0101 계통(대한민국 특허 제10-0723070호)을 대조구로 하였다. 또한, 동일 유전자로 작물 형질전환된 복합해충저항성 형질전환체 2계통을 동일하게 생물검정하여 후대교배 복합해충저항성 벼와 살충성을 비교하였다. 상세한 생물검정 방법으로 먼저, 100*40mm 크기의 해충 사육통에 3M 필터 페이퍼를 물에 적셔 바닥에 넣어준 후 각 8cm로 자른 벼 잎 샘플을 5개씩 배양병 바닥에 나열하고 벼잎의 양끝을 물에 적신 3M paper로 덮어 수분을 충분히 유지하게 하였다. 이후 각 배양병당 5마리의 3-4령기의 혹명나방 유충을 접종하고 5일 경과 후 혹명나방 유충에 대한 상태 및 생존유무를 조사하였다(도 7).
표 1에 나타낸 바와 같이 유전자가 도입되지 않은 음성대조구인 동진벼에서는 환경영향에 의한 7%의 유충 사망률을 나타냈으며, 기존 개발된 혹명나방저항성 벼 Agb0101의 경우 접종한 전체 유충이 모두 사망하여 100%의 살충성을 나타내었다. 본 발명에서 개발된 후대교배 복합해충저항성 벼의 경우도 80%의 매우 높은 혹명나방 유충의 사망률을 보였으며, 이는 기타 복합해충저항성 형질전환 계통들(67∼73%) 보다 높은 유충 살충성을 갖는 것으로 비교되었다. 본 실험에서 기존 혹명나방저항성 벼로 개발된 Agb0101벼가 100%의 살충성을 나타낸 반면, 후대교배 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R)의 경우 이보다 다소 낮으나 80%의 높은 살충성을 나타냈는데, 이의 결과는 벼 품종의 영향, 삽입벡터 구조 및 구성요소의 작용 등 여러 요인으로 해충에 대한 저항성에 영향을 미쳤을 것으로 판단된다.
이상의 결과에서와 같이, 본 발명에서는 단일형질인 나비목 해충저항성 벼 계통과 딱정벌레 해충저항성 벼 계통을 후대 교배하여 유전적으로 각 도입유전자가 안정적으로 삽입된 교배계통을 선발하였고, 이의 계통에 대하여 벼 해충인 혹명나방 유충에 대한 생물검정을 수행하여 매우 높은 살충성(80%)을 확인하여, 두 가지 해충저항성 형질을 동시에 갖는 복합해충저항성 벼(mcry1Ac1×Btt12R) 계통을 개발·선발하였다.
<110> Republic of Korea
<120> Complex insect-resistant rice and method for producing the same
<130> P17R12C1245
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1865
<212> DNA
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 1
ccatggacaa caacccaaac atcaacgaat gcattccata caactgcttg agtaacccag 60
aagttgaagt acttggtgga gaacgcattg aaaccggtta cactcccatc gacatctcct 120
tgtccttgac acagtttctg ctcagcgagt tcgtgccagg agctgggttc gttctcggac 180
tagttgacat catctggggt atctttggtc catctcaatg ggatgcattc ctggtgcaaa 240
ttgagcagtt gatcaaccag aggatcgaag agttcgccag gaaccaggcc atctctcgtt 300
tggaaggatt gagcaatctc taccaaatct atgcagagag cttcagagag tgggaagccg 360
atcctactaa cccagctctc cgcgaggaaa tgcgtattca attcaacgac atgaacagcg 420
ccttgaccac agctatccca ttgttcgcag tccagaacta ccaagttcct ctcttgtccg 480
tgtacgttca agcagctaat cttcacctca gcgtgcttcg agacgttagc gtgtttgggc 540
aaagatgggg attcgatgct gcaaccatca atagccgtta caacgacctt actaggctga 600
ttggaaacta caccgactac gctgttcgtt ggtacaacac tggcttggag cgtgtctggg 660
gtcctgattc tagagattgg gtgagataca accagttcag gagagaattg accctcacag 720
ttttggacat tgtggctctc ttcccgaact atgactccag acgttaccct atccgtacag 780
tgtcccaact taccagagaa atctacacta acccagttct tgagaacttc gacggtagct 840
tccgtggttc tgcccagggt atcgaaagat ccatcaggag cccacacttg atggacatct 900
tgaacagcat aactatctac accgatgctc acagaggata ctattactgg tctggacacc 960
agatcatggc ctctccagtt ggattctccg gacctgagtt tacctttcct ctctatggaa 1020
ctatgggaaa cgccgctcca caacaacgta tcgttgctca actaggacag ggtgtctaca 1080
gaaccttgtc ttccaccttg tacagaagac ccttcaatat cggtatcaac aaccagcaac 1140
tttccgttct tgacggaaca gagttcgcct atggaacctc ttctaacttg ccatccgctg 1200
tttacagaaa gagcggaacc gttgattcct tggacgaaat cccaccacag aacaacaatg 1260
tgccacccag gcaaggattc tcccacaggc ttagccacgt gtccatgttc cgttccggat 1320
tcagcaacag ttccgtgagc atcatcagag ctcctatgtt ctcttggatt caccgttctg 1380
ccgagttcaa caacatcatc gcatctgata gtattactca aatccctgcc gtgaagggaa 1440
acttcctttt caatggaagc gtaatcagcg gaccaggatt cactggcgga gatcttgtga 1500
gacttaacag ctctggcaac aacattcaga atagaggcta catcgaagtt cctatccact 1560
tcccatccac atctactaga tacagagtta gggttagata cgcctctgtg accccaatcc 1620
accttaacgt gaactggggc aattcatcta tcttctccaa caccgttcca gctactgcta 1680
cctcactcga taatcttcaa tccagcgatt ttggttactt cgaaagtgcc aacgcattca 1740
cttcttcatt gggcaacatc gtgggtgtta ggaatttcag cggtactgca ggagtgatca 1800
ttgacagatt cgagttcatt cctgttactg ccactcttga ggctgagtac aatctttaag 1860
gtacc 1865
<210> 2
<211> 1935
<212> DNA
<213> Bacillus thuringiensis ssp. Tenebrionis
<400> 2
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ccaactaacc atgttcaata tcctttagcg gaaactccaa atccaacact agaagattta 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Btt-SR primer
<400> 6
cagcggacgg ccagaccgca a 21
Claims (5)
- SEQ ID No: 1의 유전자 mcry1Ac1를 포함하는 벡터로 형질전환하여 선발된 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) mcry1Ac1 계통을 모본으로,
SEQ ID No: 2의 유전자 cryIIIa를 포함하는 벡터로 형질전환하여 선발된 벼물바구미(Lissorphoptrus oryzophilus)에 내충성을 가지는 벼(Oryza sativa) Btt12R 계통을 부본으로 하여 후대 교배하는 단계;
교잡종(F1)의 식물체를 육종 및 세대전개하는 단계; 및
유전자 mcry1Ac1 및 cryIIIa를 동시에 발현하는 개체를 선발하는 단계를 포함하는, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼(Oryza sativa)의 육종방법.
- 제1항에 있어서,
유전자 mcry1Ac1 또는 cryIIIa를 포함하는 벡터는 각각 도 1a 및 도 1b의 개열지도를 갖는 것인, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼의 육종방법.
- 제1항에 있어서,
유전자 mcry1Ac1 및 cryIIIa를 동시에 발현하는 개체의 선발은 SEQ ID Nos: 3 및 4의 프라이머 쌍과 SEQ ID Nos: 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭을 통해 수행되는, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 복합해충저항성 벼의 육종방법.
- 제1항의 방법으로 제조되어 mcry1Ac1 및 cryIIIa 유전자를 동시에 발현하고, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 벼(Oryza sativa) 식물체.
- 제1항의 방법으로 제조되어 mcry1Ac1 및 cryIIIa 유전자를 동시에 발현하고, 혹명나방과 벼물바구미에 내충성을 갖는 벼(Oryza sativa) 식물체의 종자.
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| KR (1) | KR20190051565A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114451229A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-10 | 浙江大学 | 一种利用茭白监测稻水象甲越冬后成虫发生动态的方法 |
-
2017
- 2017-11-07 KR KR1020170147381A patent/KR20190051565A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kim 등., Planta, 230: 397-405, 2009 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114451229A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-05-10 | 浙江大学 | 一种利用茭白监测稻水象甲越冬后成虫发生动态的方法 |
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