CN103003429B - 棉花植物事件a2‑6以及用于其检测的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗棉铃虫的棉花转化事件及其特征序列以及用于其检测的引物和方法。携带A2‑6转化事件的棉花植物在第一组染色体上包含所述事件即外源插入DNA序列和棉花基因组DNA序列的接合。利用外源插入DNA序列及其侧翼棉花基因组上接合区的DNA序列，可设计检测引物，用于针对A2‑6事件的特异性检测。针对A2‑6事件的检测方法可为利用该植物事件进行育种的应用提供便捷的追踪该特定基因插入事件的手段，该特定基因插入事件可作为分子标记使用以提高育种工作效率。

Description

棉花植物事件A2-6以及用于其检测的引物和方法
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域，特别是涉及具有棉铃虫抗性的棉花转化事件A2-6，以及检测该转化事件的特有方法。
背景技术
在世界范围内，虫害给农业生产带来了较大的损失。传统采用化学杀虫剂的防治技术，在传统农业实践中发挥了巨大的作用。但是，这种虫害防治技术存在很大的弊端，一方面，大量有毒化学农药的使用，不仅污染环境，而且易残留，严重威胁人们健康；另一方面，化学农药长期大量使用还能够造成害虫的抗药性，导致虫害的爆发。例如，上世纪90年代初，由于棉铃虫抗药性的发展，导致我国棉铃虫的大爆发，使我国各大棉区大幅度减产甚至绝产。
目前，转基因技术为解决虫害给棉花生产造成严重危害这一世界性难题提供了可行方案。人们也通过选择种植转基因抗虫作物防治某类虫害。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthurigiensis,下文简称为Bt)是一种能形成芽孢的革兰氏阳性芽孢杆菌,已知其可产生对多种昆虫,如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质(Aronson,Microbiol.Rev.50:1-14,1968)。由于Bt毒素杀虫的专一性和高度选择性,所以对植物和包括人在内的动物没有毒害,而且是环境可以接受的。因此,目前商业化应用的抗虫转基因农作物所使用的抗虫基因主要是Bt杀虫蛋白基因。
1995年，郭三堆等人采用植物优化密码子，人工合成了GFM CryIA杀虫基因(ZL95119563.8)，随后导入到数个中国主产棉区的主栽品种中，获得抗虫棉，并在1997年进行了产业化应用。孟山都公司获得的Mon531抗虫棉花转化事件在1996年进行了商业化；随后孟山都公司又获得的Mon15985双Bt抗虫棉花转化事件(中国专利申请号02802047.2，审中)，已经在全球进行了商业化。通过转化事件专利对转基因农作物进行知识产权保护是目前国际上的一个新趋势，因为一个进入商业化的转化事件是发明人通过筛选鉴定而获得的生物类的独特创造，外源基因与受体作物基因组特定位置的整合，不仅使转化事件具备独特的分子特征，而且具有独特的外源基因表达规律，区别于研究过程中获得的其它转化事件，具有相比较更适合商业化应用的特征特性，因此具有明显的新颖性、实用性和创造性。目前，国际上已有商业化的转化事件获得了知识产权保护，均为跨国公司所拥有，部分在中国也申请了专利。
在我国早期的抗虫棉研究中，由于转化手段的限制，所获得的抗虫棉存在整合拷贝数和整合位置不确定的情况，在育种中转基因性状不容易把握，不同育种家选育的抗虫棉品种抗虫性差异较大。同时，由于不能获得转化事件基因整合侧翼序列的分子特征，不便于进一步新的转基因性状聚合，使其进一步应用出现局限性。因此，本发明创造出GFMCry1A杀虫基因新型棉花转化事件，不仅抗虫性强，遗传稳定，单拷贝整合，而且整合侧翼序列分子特征清楚，该转基因材料不但本身在抗虫棉育种中具有重要应用价值，而且由于具有独特的检测方法，可方便地通过杂交聚合的方式聚合不同的商业化转化事件。
发明内容
本发明人通过转基因方法获得了棉花转化事件A2-6。该转化事件具有稳定的高抗棉铃虫性状。其代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5965。
本发明第一方面提供棉花转化事件A2-6，其特征DNA序列如SEQ ID No：22所示，其由第576-6164bp的T-DNA插入序列、第1-575bp上游侧翼棉花基因组序列和第6165～6586bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的棉花转化事件的特征DNA序列的片段，所述片段至少包含部分所述T-DNA插入序列和部分所述侧翼棉花基因组序列。
本发明第三方面提供一种重组载体，其含有本发明第一方面所述的T-DNA插入序列。在一个实施方案中，所述载体为附图1中的T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300载体。
本发明第四方面提供一种重组细胞，其含有本发明第三方面所述的重组载体。在一个实施方案中，所述重组细胞为含有本发明第三方面所述的载体的重组农杆菌细胞。
本发明第五方面提供用于检测本发明第一方面所述的棉花转化事件的引物对，其由特异性识别本发明第一方面所述的任一侧的侧翼序列的第一引物和特异性识别本发明第一方面所述的T-DNA插入序列的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物的序列为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14。在另一些实施方案中，其中所述第一引物的序列为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15。
本发明第六方面提供一种鉴定棉花生物样品中A2-6转化事件的方法，其包括:
(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；
(b)以提取的DNA样品为模板,使用本发明第五方面所述的引物对进行PCR扩增；
(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQ ID NO：22上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中A2-6转化事件的存在。
本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的棉花转化事件向不同棉花育种材料中转移的方法，包括：利用含有本发明第一方面所述的转化事件材料的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明第一方面所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用本发明第六方面的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认本发明第一方面所述的转化事件的存在。
本发明第八方面提供本发明第一方面所述的转化事件、本发明第二方面所述的片段、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的重组细胞、本发明第六和第七方面所述方法用于提高棉花抗棉铃虫性状、进行棉花育种或用作分子标记的用途。
附图说明
图1示出了植物表达载体T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300的构建流程。
图2示出了Southern印迹分析技术与互补于Bt基因编码序列的地高辛标记的DNA进行杂交的结果。
图3示出了利用Southern杂交技术对转化事件A2-6拷贝数进行检测的实验结果。M，marker,λDNA/HindIII+EcoRI；1，CK+,T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300/EcoRI+HindIII；2,CK-,J14/EcoRI；3,A2-6/EcoRI；4,A2-6/HindIII；5,A2-6/EcoRI+HindIII。
图4是右边界(RB)旁侧序列示意图。
图5是左边界(LB)旁侧序列示意图。
图6示出了以受体材料冀棉14DNA为模板，使用序列分别为SEQ ID No:18和SEQIDNo:19的引物对，扩增得到大小为800bp左右的扩增产物，测序后与A2-6的旁侧序列比对的结果。
图7是A2-6事件的插入序列及鉴定引物的示意图。
图8示出了利用引物对GSP1-Hind III/A2-6-1以及GSP1-Hind III/A2-6-2分别扩增A26-5事件、A2-6事件、冀棉14-1、冀棉14-2的棉花样品的结果。M，marker,λDNA/HindIII+EcoRI；1-4：GSP1-Hind III/A2-6-1扩增A26-5，A2-6，冀棉14-1，冀棉14-2，阳性扩增条带3.5Kb左右；5-8：GSP1-Hind III/A2-6-2扩增A26-5，A2-6，冀棉14-1，冀棉14-2，阳性扩增条带3.5Kb左右。
具体实施方式
在本发明中，“转化事件”是指将外源目的基因通过农杆菌介导遗传转化方法(本领域技术人员公知)，转化到棉花细胞中，并进一步获得的转基因棉花植株中外源DNA序列在棉花基因组中的特定位置插入并整合的事件；“转化事件”并不是一种植物细胞或植株，植物细胞或植株是转化事件存在的载体；转化事件的核心特征是外源基因在植物基因组中特定位点的插入所形成的外源插入序列和特定棉花基因组序列连接的一段特征DNA序列。
实施例
下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1.植物表达载体构建
从载体pCambia2300扩增含双增强子的35S启动子，两端分别带Xba I和BamH I，引物序列如SEQ ID No:1及SEQ ID No:2所示，PCR产物经酶切后克隆到pMD-18T中，得到pMD-35S重组载体。为了增加表达框的重组率，克隆来自棉花基因具有大量拓扑异构酶II识别位点的SSR序列TMB0066，构建以TMB0066为MAR序列的植物表达载体，增加插入序列的整合效率。TMB0066序列如SEQ ID No:3所示。其两端分别引入Hind III和Xba I位点，克隆到pMD-35S，得到重组载体pMD-TMB0066-35S。
将含OK(Omega&Kozak)-Bt-PS(Processing&Splicing sequence)片段(三者序列已在专利号为95119563.8的中国专利中公开，该专利公开以引用的方式全文纳入本文)组合的质粒，利用BamH I和Sac I酶切OK-Bt-PS片段，将其克隆到pMD-18T中，获得重组质粒pMD-OK-Bt-PS。将终止子Tnos序列通过Sac I+EcoR I克隆到PS下游。利用Hind III+BamH I将TMB0066-35S克隆到35S上游，得到重组质粒pMD-TMB0066-35S-OK-Bt-PS-Tnos。利用HindIII和EcoR I，将TMB0066-35S-OK-Bt-PS-Tnos克隆到载体pCambia2300中，获得重组植物表达载体T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300，构建流程见图1。
实施例2.陆地棉(Gossypium hirsutum)的遗传转化：
利用农杆菌介导的遗传转化方法，用T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300载体转化冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270)下胚轴。
挑取含有T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300载体的农杆菌LBA4404，接种至含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)50mg/L及链霉素(streptomycin，S/Sm)50mg/L的LB液体培养基中，28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。以菌液：培养基1：50～1：100的比例用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4～6h，将菌液稀释至OD600值0.8～1.0。
转基因受体材料为冀棉14，取生长3～4天的无菌苗下胚轴，切成0.6～0.8cm的段，浸染10～15min，取出下胚轴段，置共培养培养基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D0.1mg/L)，22℃～25℃共培养2天。转至愈伤诱导培养基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D0.1mg/L+Kan50mg/L)20～30天继代一次，90天后转接至愈伤增殖培养基(MSB+KT 0.1mg/L+2,4-D0.05mg/L+Kan50mg/L)，20～30天继代一次，待长出胚性愈伤后，将胚性愈伤继代至萌发培养基(MSB+KT 0.1mg/L+Kan50mg/L)，40天左右挑取萌发的绿芽至生根培养基(SH+Kan50mg/L)进行筛选，进而获得小苗和可嫁接抗性植株268株。抗性植株经过PCR鉴定后嫁接并移栽，获得A系列棉花共210株。
实施例3.T0代转基因材料的筛选鉴定：
分别对苗期、花期、蕾期及铃期进行抗虫蛋白的Elisa检测及抗虫试验。根据苗期Elisa检测，抗虫蛋白高表达的转基因棉花有125株。经过抗虫试验，对棉铃虫有抗性的有94株，其中对棉铃虫抗性较强的有25株。
P+：PCR阳性植株。
抗虫性分析：N：无抗性；R：有抗性；HR/HR-：较强抗性
结合Elisa结果及抗虫试验结果选择22个抗虫性较强的材料进行Southern分析。对于Southern分析，并结合植株育性情况，从棉花组织提取DNA，用EcoRI进行消化，并利用Southern印迹分析技术与互补于Bt基因编码序列的地高辛标记的DNA进行杂交，结果如图2所示，筛选出13个单拷贝棉花事件进行进一步筛选。
实施例4.F1代或T1代转基因材料的筛选鉴定：
收取A19-2、A2-6、A3-6、A3-7、A6-7、A7-6、A9-7、A10-5、A11-1、A19-5、A19-7、A19-8、A20-8、A26-5共14个棉花事件分别自交并与其它棉花栽培种(LG6035、LG6036、LG6101、LG6118、LG6162)杂交，分别收获自交种及杂交种。将收获的种子播种，对T1代(或F1代)棉花植株，于4叶期选择顶部第二片真叶，以2000ppm卡那霉素溶液进行叶片涂抹筛选，保留卡那霉素处理7天后叶片不变色的植株，分别于苗期、蕾期、花期进行Elisa检测及抗虫试验。抗虫试验分别摘取倒二叶，接虫12头，每样品设置一个重复，于5日后观察结果，与对照进行比较，计算校正死亡率。计算公式如下：
植株编号说明：
F1代杂交编号格式为“A×B-m”。“A”为作为母本的棉花材料，“B”为作为父本的棉花材料，“m”为单株编号；
T1自交编号格式为“A-m”，“A”为自交的棉花材料，“m”为自交后代单株编号，“(1)”表示没有进行试验重复，否则为三次重复的平均数据；
结果如下：
(1)苗期结果：
(2)根据苗期抗虫结果，选取抗虫表现好的植株进行蕾期抗虫试验，结果如下：
(3)根据蕾期抗虫结果，选取抗虫表现好的植株进行花期抗虫试验，结果如下：
根据T1/F1代抗虫试验及Elisa检测的结果，筛选出A2-6及A26-5两个转化事件的抗虫表现最佳。继续进一步的实验分析。
实施例5.回交后代材料的鉴定
在前述实施例4中进行杂交的目的是将转化事件转移到其它的棉花育种材料中，后续将进一步进行连续回交，获得农艺性状与回交亲本一致并含有该转化事件的新材料，以加速育种应用的进程。在杂交或回交过程中，利用前述的卡那霉素溶液涂抹叶片鉴定的方法或者本发明实施例8的检测方法(较前者更准确)在后代群体中进行筛选鉴定，确认该转化事件的存在。如发现转化事件丢失，则将之淘汰。
植株编号说明：
回交后代编号格式为“A×B BCmF1-x-y…”。“A”为F1代作为母本的棉花材料，“B”为F1代作父本的棉花材料，其中LG开头的编号材料是回交亲本；“BC”表示回交(Backcross)，“m”为回交代次；“-x-y…”为单株编号；
目前，利用不同生态区的若干棉花回交转育亲本材料，已经获得了这两个转化事件的回交四代材料。
下表列举了A2-6和A26-5两个转化事件与LG6101、LG6036、LG6035三个骨干育种资源材料回交后代材料不同生长阶段的抗虫性鉴定数据，与其它转化事件(数据未列出)相比，抗虫性好，且在不同发育阶段比较稳定，十分理想：
实施例6.转化事件A2-6拷贝数检测
利用Southern杂交技术对转转化事件A2-6拷贝数进行检测。
样品制备：取转化事件A2-6T0代幼嫩植物组织4.0g左右，提取植物基因组DNA，具体步骤如下：于液氮中研磨成粉末状。在65℃水浴中预热提取缓冲液15ml，将研磨成均匀粉状后加入提取缓冲液中，振荡混匀，65℃水浴45min，期间摇匀2-3次，充分裂解。加入1/3体积5mol/L KAc上下颠倒混匀，冰浴约2-h3，4℃，12000rpm，离心10min；取上清，加入1/5体积的5％CTAB Buffer，上下颠倒充分混匀，65℃水浴约20min；待冷却置窒温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提3次，室温12000rpm离心5min，如界面浑浊再抽提一至两次；取上清，加入2/3体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10min，室温，12000rpm，离心10min；弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次。抽干沉淀，加500ul灭菌水溶解；加1/10体积RNase处理DNA样品，37℃30min；加1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置10min，4℃，12 000rpm，离心5min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加适量ddH2O溶解，使用紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度，取100～200μg DNA分别用限制性内切酶EcoR I，Hind III，EcoR I+Hind III消化过夜后酒精沉淀，用适量ddH2O溶解后加入0.8％琼脂糖凝胶中，以1V/cm电压电泳过夜。真空转移至尼龙膜上，紫外交联固定。
探针制备：以含OK-Bt基因的质粒为模板，以OKF和BtR引物(序列如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示)，利用PCR法制备地高锌标记的特异性探针，PCR体系如下：
PCR程序：94.0℃5min；30个循环:94.0℃30s，53.0℃30s，72.0℃30s；72.0℃5min。
杂交检测：将尼龙膜放入杂交管中，加一定体积的杂交液(10ml/100cm2)，65℃，预杂交3～4h；95℃变性DIG标记探针(25ng/ml)10min，迅速置于冰水中冷却10min彻底变；将变性探针迅速加到杂交管(3.5ml/100cm2membrane)，混匀，65℃杂交过夜(>10h)。取出尼龙膜，进行洗膜。在室温下，30ml 2×SSC/0.1％SDS振荡洗涤2×5min。在50℃下，0.1×SSC/0.1％SDS振荡洗涤2×15min，将膜转入装有20ml洗涤缓冲液中振荡洗涤5min。在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润1～5min；20～30ml封闭液中孵育30min；在10ml抗体液孵育30min；用20～30ml洗涤液洗涤2×15min；15ml检测液中平衡2～5min；现配20ml显色底物(NBT/BCIP)暗处静置显色；50ml灭菌水或TE洗膜5min终止显色，拍照保存。检测结果如图3如示，两组单酶切结果均只出现一条杂交信号带，表明A2-6为单拷贝插入，经Hind III+EcoR I的酶切A2-6DNA和T66-35S-OK-Bt-PS-Tnos-2300的杂交带型基本一致，表明A2-6事件为单拷贝、并且是完整TDNA区的插入。
实施例7.旁侧序列分析
样品制备：用本领域技术人员公知的植物DNA提取方法提取含有A26-5转化事件的棉花材料的基因组DNA，取2.5μg DNA，分别用EcoR I，Hind III消化6～8小时，酒精沉淀纯化后加适量水溶解。
连接接头：根据载体酶切位点分析，分别设计合成两对接头：
GenomeWalker Adaptor+EcoR I，GenomeWalker Adaptor–EcoR I(序列如SEQ IDNo:6，SEQ ID No:7所示)和GenomeWalker Adaptor+Hind III，GenomeWalker Adaptor–Hind III(序列如SEQ ID No:8，SEQ ID No:9所示)，其中对SEQ ID No:7和SEQ ID No:9的5’端进行了磷酸化，3’端加氨基。
分别等量混合GenomeWalker Adaptor+EcoR I和GenomeWalker Adaptor–EcoR I，GenomeWalker Adaptor+Hind III和GenomeWalker Adaptor–Hind III，70℃保温10分钟，后缓慢降到室温。取4μl消化纯化的DNA加到含1.9μl GenomeWalker Adaptor(25μM)，1.6μl10X连接缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶(6units/μl)，在16℃下过夜培养，停止反应，在70℃下培养5min，在每个管中，加入72μl TE(10/1,pH 7.5)，在低速下振荡5-10sec。
使用Clontech GenomeWalkerTM Universal试剂盒，利用引物AP1和GSP1-EcoR I，GSP1-Hind III(序列如SEQ ID No:10，SEQ ID No:11，SEQ ID No:12所示)，以连接产物为模板，进行第一轮扩增：7个循环:94℃25S,72℃6min；32个循环:94℃25S，67℃6min；最后一个循环后再于67℃保温7分钟。PCR产物稀释50倍后，用AP2和GSP2-EcoR I，GSP2-Hind III(序列如SEQ ID No:13，SEQ ID No:14，SEQ ID No:15所示)进行第二轮PCR扩增，PCR程序如下：5循环:94℃25S,72℃5min；20循环:94℃25S,67℃5min；最后一个循环后再于67℃保温10分钟。产物回收测序。
对A2-6事件的右边界(RB)端序列分析如图4所示，共获得1773bp的核苷酸序列(序列如SEQ ID No:16)，包括1bp～575bp的棉花基因组序列，第578bp～709bp为RB与TMB0066之间的载体序列，第710bp～1038bp为T0066序列，第1039bp～1773bp为CaMV 35S序列。
序列说明：
1-575 棉花DNA
578-709 RB与T0066之间的载体序列
710-1038 T0066
1039-1773 CaMV 35S
对A2-6事件的左边界(LB)端序列分析如图5所示，共获得1345bp的核苷酸序列(序列如SEQ ID No:17)，包括1bp～798bp的NPTII序列，第798bp～933bp的CaMV 35SpolyA序列和第934bp～1345bp的棉花基因组序列。
序列说明：
1-798 NPTII
798-933 CaMV 35SpolyA
934-1345 棉花DNA(412bp)
以受体材料冀棉14DNA为模板，分别在A2-6插入序列的RB和LB端侧翼棉花基因组序列设计引物(序列如SEQ ID No:18，SEQ ID No:19所示)，扩增得到大小为800bp左右的扩增产物，测序后与A2-6的旁侧序列比对发现，A2-6事件是通过插入序列替换原基因组序列上116bp碱基获得的。比对结果见图6。
根据以上结果，本领域技术人员可容易得出A2-6事件的特征DNA序列(SEQ ID NO:22)，如下所示，加下划线部分示出的是T-DNA插入序列，未加下划线部分示出的是插入序列的侧翼棉花基因组DNA序列。
实施例8.转化事件检测
使用DNA引物对进行PCR扩增以检测A2-6事件，所述引物对由特异性识别所述插入序列任一侧翼序列的第一引物和特异性识别本发明T-DNA插入序列的第二引物组成。A2-6事件的插入序列及鉴定引物的示意图如图7所示。例如，当第一引物为A2-6-3(SEQ ID NO:20)或A2-6-4(SEQ ID NO:18)时，第二引物可为GSP1-EcoR I(SEQ ID NO:11)或GSP2-EcoRI(SEQ ID NO:14)；当第一引物为A2-6-1(SEQ ID NO:21)或A2-6-2(SEQ ID NO:19)时，第二引物可为GSP1-HindIII(SEQ ID NO:12)或GSP2-HindIII(SEQ ID NO:15)。
利用上述引物进行PCR鉴定的方法是本领域技术人员所熟知的。利用引物对GSP1-Hind III/A2-6-1以及GSP1-Hind III/A2-6-2分别扩增A26-5事件、A2-6事件、冀棉14-1、冀棉14-2的棉花样品的结果如图8所示。
实施例9.染色体定位
根据所获得的棉花侧翼序列，利用公布的二倍体棉花(Gossypium raimondii)D染色体组基因组序列(http://www.phytozome.net/cotton.php)进行对比分析，可知A2-6事件中，与插入序列接合的棉花侧翼DNA序列与D1染色体上的序列高度同源，因此可知，A2-6事件中外源DNA插入序列的整合位点位于受体四倍体棉花的第1组染色体上。

Claims (7)

1. 棉花转化事件A2-6，其特征DNA序列如SEQ ID No：22所示，其由第576-6164 bp的T-DNA插入序列、第1-575 bp的上游侧翼棉花基因组序列和第6165～6586 bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。
2.权利要求1所述的棉花转化事件的特征DNA序列的片段，所述特征DNA序列的片段的序列如SEQ ID No：16或SEQ ID No：17所示。
3.用于检测权利要求1所述的棉花转化事件的引物对，其由特异性识别权利要求1所述的任一侧的侧翼棉花基因组序列的第一引物和特异性识别权利要求1所述的T-DNA插入序列的第二引物组成，其中所述第一引物的序列为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14；或者其中所述第一引物的序列为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21，所述第二引物的序列为SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15。
4.一种鉴定棉花生物样品中A2-6转化事件的方法，其包括:
（a）从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；
（b）以提取的DNA样品为模板,使用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增;
（c）检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQ ID NO：22上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中A2-6转化事件的存在。
5.一种获得转基因抗虫棉花材料的方法，包括：利用含有权利要求1转化事件的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有权利要求1所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用权利要求4所述的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认权利要求1所述的转化事件的存在。
6.权利要求1所述的转化事件或权利要求2所述的片段用于提高棉花抗棉铃虫性状、进行棉花育种或用作分子标记的用途。
7.权利要求4所述的方法或权利要求5所述的方法用于提高棉花抗棉铃虫性状、进行棉花育种的用途。
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