CN105316319A - 棉花植物事件aD14-2以及用于其检测的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了改良棉花纤维品质的棉花转化事件aD14-2及其序列以及用于其检测的试剂和方法。携带aD14-2事件的棉花植物在D1染色体上包含所述事件即外源插入DNA序列和棉花基因组DNA序列的接合。利用外源插入DNA序列及其侧翼棉花基因组上接合区的DNA序列，可设计检测引物或探针，用于针对aD14-2事件的特异性检测。针对aD14-2事件的检测方法可为利用该植物事件进行育种的应用提供便捷的追踪该特定基因插入事件的手段，该特定基因插入事件可作为分子标记使用以提高育种工作效率。

Description

棉花植物事件aD14-2以及用于其检测的组合物和方法

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域，特别是涉及具有改良棉花纤维品质的棉花转化事件aD14-2，以及检测该转化事件的特有方法。

背景技术

棉花纤维是棉花生产的主要产品，棉花纤维的产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益。因此，提高棉花纤维品质一直是棉花育种的主要目标。但是棉花的产量和品质均为数量性状，受到多种因素的影响并且产量与品质之间存在负相关，严重阻碍着棉花纤维品质和产量的同步改良。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉(纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等。这些优良性状基因的利用，在常规育种中却受到诸多限制，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，以及产量和品质(强度、细度和长度等)直接相关的基因，使导利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。

棉纤维的品质主要由棉花纤维细胞的分化与发育阶段决定，是一个复杂有序的过程，在不同的发育时期均有大量的基因表达，参与纤维细胞发育的调控。棉纤维细胞由胚珠外珠被单个细胞分化而来，是高等植物中伸长最快、合成纤维素最多的模式单细胞。其分化和发育过程可分为纤维细胞分化与突起、纤维细胞的迅速伸长、次生壁的合成和脱水成熟4个时期，是多种基因共同表达调控的复杂过程。其中纤维伸长和次生壁合成两个时期部分重叠，对纤维的发育与品质形成关系密切。棉纤维的品质主要包括纤维长度、强度、伸长率、麦克隆值等性状。纤维的起始与伸长直接影响到纤维的数量与长度，而次生壁加厚期纤维素的合成则影响纤维的强度与麦克隆值等性状。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成的分子机理也知之甚少。这些都极大的阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。

目前通过分子生物学手段改良棉花纤维品质的思路主要是通过植物转基因技术导入能调控棉花体内激素、纤维素及多糖合成的基因。John等(1996)将乙酰CoA还原酶基因(phaB)和PHB合酶基因(phaC)导入到陆地棉栽培种中，转基因棉纤维品质如强度、长度等虽然没明显的改良，但转基因棉花的吸热性和导热性能明显增加。John(1999)将与生长素合成相关的基因iaaM和iaaH导入常规棉花中，虽然转基因棉纤维中IAA的含量显著地增加然而纤维长度、细度和强度与对照相比没有显著差异。Jiang等(2011)将纤维素合酶基因(GhSusA1)转入棉花中，结果表明过度表达GhSusA1基因的棉花株系纤维品质明显高于非转基因株系。

发明内容

本发明人通过转基因方法获得了转基因事件aD14-2的棉花品系。该转化事件具有稳定的改良棉花纤维品质的性状。其代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.8881，分类命名为陆地棉，拉丁文名称是Gossypiumhirsutum，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年5月8日。

本发明的第一方面提供棉花转化事件aD14-2，其特征序列如SEQIDNo：21所示，其由第398-4145bp的T-DNA插入序列，第1-397bp上游侧翼棉花基因组序列和第4146-4489bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。

本发明的第二方面提供一种核酸构建体，其包含所述棉花转化事件aD14-2。

本发明的第三方面提供一种重组载体，其包含本发明第一方面所述的T-DNA插入序列或含有棉花转化事件aD14-2的核酸构建体。在一个实施方案中，所述载体为说明书附图1中的p2300-pE203-mCBD载体。

本发明第四方面提供一种重组细胞，含有本发明第一方面所述的T-DNA插入序列或本发明第二方面所述的核酸构建体或本发明第三方面所述的载体，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第五方面提供用于检测本发明第一方面所述的棉花转化事件的引物对，其由特异性识别本发明第一方面所述的T-DNA插入序列的第一引物和特异性识别本发明第一方面所述的任一侧翼序列的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物选自SEQIDNO：22或23时，所述第二引物选自SEQIDNO：14或17。在另一些实施方案中，所述第一引物选自SEQIDNO：24或25时，所述第二引物选自SEQIDNO：15或18。

本发明第六方面提供一种鉴定棉花生物样品中aD14-2转化事件的方法，其包括：

(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；

(b)以提取的DNA样品为模板使用本发明第五方面所述的引物对进行PCR扩增；

(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQIDNO：21上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则表明所述棉花生物样品中aD14-2转化事件存在。

本发明第七方面提供了一种制备转基因棉花的方法，培养含有本发明第一方面所述的转化事件的棉花种子或其他组织，包括：利用含有本发明第一方面所述的转化事件材料的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明第一方面所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用本发明第六方面的方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认本发明第一方面所述的转化事件的存在。

本发明第八方面提供本发明第一方面所述的转化事件、发明第二方面所述的核酸构建体、发明第三方面所述的重组载体、发明第四方面所述的重组细胞、发明第六方面或发明第七方面所述的方法用于提高棉花纤维品质、进行植物育种以及用作分子标记的用途。

本发明中利用的编码CBD蛋白的cbd基因(GenBank：AAA23218.1)来源于食纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)，该CBD蛋白是1990年由O.Shoseyov从食纤维梭菌中纯化到的纤维素酶复合物的组成成分，该复合物对微晶纤维(crystallinecelluose)有纤维酶的活性。实验表明若将CBDs从纤维素酶或纤维小体的脚手架结构中去除将极大的降低酶活。E.Shpigel对CBDs的功能研究发现，CBDs能在体外增强PrunuspersicaL.花粉管的伸长；增加A.Xylinum纤维素合成酶的活性，促进纤维素的合成。本发明利用纤维特异性启动子EVO203驱动cbd基因，利用农杆菌介导的方法转化棉花，通过筛选获得棉纤维衣份、比强和马克隆值均有明显改善的单拷贝转化事件aD14-2，并利用分子生物学手段获得了该插入事件左右两侧的棉花基因组序列。

本发明创造出的cbd基因的优质棉花转化事件，不仅可以显著改善棉花纤维品质，遗传稳定、单拷贝整合且整合侧翼序列分子特征清楚，在生产育种中具有重要应用价值，而且由于具有独特的检测方法，可方便地通过杂交聚合的方式聚合不同的商业化转化事件。

附图说明

图1示出了植物表达载体p2300-pE203-mCBD的构建流程。

图2示出了利用Southern杂交技术对转基因事件aD14-2拷贝数进行检测的实验结果。1，经HindIII酶切的含mCBD基因的质粒；2，经EcoRI酶切的转化事件aD14-2基因组DNA件；3，经HindIII酶切的转化事件aD14-2基因组DNA；Marker，经EcoRI/HindIII酶切的λDNA。

图3是右边界(RB)旁侧序列示意图。

图4是左边界(LB)旁侧序列示意图。

图5是aD14-2事件的插入序列及鉴定引物的示意图。

图6示出了利用引物对RBcheck51′/GSP2-mCBD32′、RBcheck52′/GSP2-mCBD32′以及LBcheck31′/GSP2-NPTII52′、LBcheck32′/GSP2-NPTII52′分别扩增aD14-2事件和冀棉14的棉花样品结果。M，marker，λDNA/EcoRI+HindIII；1，3：RBcheck51′/GSP2-mCBD32′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带1810bp；2，4：RBcheck52′/GSP2-mCBD32′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带1665bp；5，7：LBcheck31′/GSP2-NPTII52′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带802bp；6，8：LBcheck32′/GSP2-NPTII52′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带773bp。

具体实施方式

在本发明中，″转化事件″是指外源插入DNA序列和特定棉花基因组DNA序列的接合。″转化事件″并不是一种植物细胞或植株，植物细胞或植株是转化事件存在的载体；转化事件的核心特征是外源基因在植物基因组中特定位点的插入所形成的外源插入序列和特定棉花基因组序列连接的一段特征DNA序列。

具有某个转基因事件的植物品系被称为相同名称的品系。例如，具有aD14-2转基因事件的植物品系被称为aD14-2品系。

实施例

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1.植物表达载体构建

因编码纤维素结合域CBD(cellulosebindingdomain)基因来源于食纤维梭菌，其GC含量及密码子偏好性与棉花基因组有所差异，因此根据棉花密码子偏好改变其碱基组成，用人工合成的方法合成SP和CBD基因融合序列(序列为SEQIDNo：1)，其中SP序列来自拟南芥CEL1基因的N端24个碱基，为导肽序列。融合序列委托Takara公司进行全基因人工合成新基因命名为SP+mCBD。选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选取来自棉花纤维中特异表达的启动子EVO203(序列为SEQIDNo：2所示)，驱动融合基因的表达，以Tnos作为终止子。

用引物SEQIDNO：3和SEQIDNO：4以植物表达载体PBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：3和SEQIDNO：4各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切连接到pCAMBIA2300(promega，T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-1。

SEQIDNO：3：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGA

SEQIDNO：4

ATCCGGATCCAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物SEQIDNO：5和SEQIDNO：6以PBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：5和SEQIDNO：6各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过SacI、EcoRI酶切连接到pCAMBIA2300-1(promegaT4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-2

SEQIDNO：5：

AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQIDNO：6：

ATCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATG

用引物SEQIDNO：7和SEQIDNO：8以非洲棉(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-06838)DNA为模板扩增棉花EVO203启动子(参考卢东柏等.改良SDS法提取棉花基因组DNA研究.广东农业科学，2008(5)：14-16中的方法提取棉花DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反应体系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl棉花DNA，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：7和SEQIDNO：8各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过HindIII、SalI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3。利用SmaI、SacI将合成的SP+mCBD基因序列酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-3获得p2300-pE203-mCBD，构建如线如图1。

SEQIDNO：7：

CGTAAGCTTGTTGAGGGAGATTGATTTC

SEQIDNO：8：

GCAGTCGACAAGATTGGAAGATGTGTGA

实施例2.陆地棉(Gossypiumhirsutum)的遗传转化

利用农杆菌介导的遗传转化方法，用含有mCBD基因的载体转化冀棉14下胚轴。

挑取含有p2300-pE203-mCBD载体的农杆菌LBA4404，接种至含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)50mg/L及链霉素(streptomycin，S/Sm)50mg/L的LB液体培养基中，28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。以菌液：培养基1∶50～1∶100的比例用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4～6h，将菌液稀释至OD600值0.8～1.0。

转基因受体材料为冀棉14，取生长3～4天的无菌苗下胚轴，切成0.6～0.8cm的段，浸染10～15min，取出下胚轴段，置共培养培养基(MSB+KT0.1mg/L+2，4-D0.1mg/L)，22℃～25℃共培养2天。转至愈伤诱导培养基(MSB+KT0.1mg/L+2，4-D0.1mg/L+Kan50mg/L)20～30天继代一次，90天后转接至愈伤增殖培养基(MSB+KT0.1mg/L+2，4-D0.05mg/L+Kan50mg/L)，20～30天继代一次，待长出胚性愈伤后，将胚性愈伤继代至萌发培养基(MSB+KT0.1mg/L+Kan50mg/L)，40天左右挑取萌发的绿芽至生根培养基(SH+Kan50mg/L)进行筛选，进而获得小苗和可嫁接抗性植株268株。抗性植株经过PCR鉴定后嫁接并移栽，获得aD系列棉花共210株。

实施例3.T1代转基因材料的筛选鉴定：

收获T1代aD系列棉花41个株系215个单株，对收获的棉花进行衣份测定及纤维检验，并对结果进一步统计分析，筛选得到转化事件aD14-2。与对照相比，转化事件aD14-2的棉纤维衣份值平均增加10.6％，比强增加7.6％，马克隆值下降23％，长度无明显变化，具体结果见表1。

表1

实施例4.转基因事件aD14-2拷贝数检测

利用Southern杂交技术对转基因事件aD14-2拷贝数进行检测。

样品制备：取转化事件aD14-2TO代幼嫩植物组织4.0g左右，提取植物基因组DNA，具体步骤如下：于液氮中研磨成粉末状。在65℃水浴中预热提取缓冲液15ml，将研磨成均匀粉状后加入提取缓冲液中，振荡混匀，65℃水浴45min，期间摇匀2-3次，充分裂解。加入1/3体积5mol/LKAc上下颠倒混匀，冰浴约2-3h，4℃，12000rpm，离心10min；取上清，加入1/5体积的5％CTABBuffer，上下颠倒充分混匀，65℃水浴约20min；待冷却置窒温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提3次，室温12000rpm离心5min，如界面浑浊再抽提一至两次；取上清，加入2/3体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10min，室温，12000rpm，离心10min；弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次。抽干沉淀，加500ul灭菌水溶解；加1/10体积RNase处理DNA样品，37℃30min；加1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置10min，4℃，12000rpm，离心5min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加适量ddH2O溶解，使用紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度，取100～200μgDNA分别用限制性内切酶EcoRI，HindIII，消化过夜后酒精沉淀，用适量ddH₂O溶解后加入0.8％琼脂糖凝胶中，以1V/cm电压电泳过夜。真空转移至尼龙膜上，紫外交联固定。

探针制备：以含mCBD基因的质粒为模板，以SEQIDNo：9和SEQIDNo：10为引物，利用PCR法制备地高锌标记的特异性探针，PCR体系如下：

PCR程序：94.0℃5min；30cycles：94.0℃30s，53.0℃30s，72.0℃30s；72.0℃5min。

杂交检测：将尼龙膜放入杂交管中，加一定体积的杂交液(10ml/100cm²)，65℃，预杂交3～4h；95℃变性DIGlabeledprobe(25ng/ml)10min，迅速置于冰水中冷却10min彻底变；将变性探针迅速加到杂交管(3.5ml/100cm²membrane)，混匀，65℃杂交过夜(＞10h)。取出尼龙膜，进行洗膜。在室温下，30ml2×SSC/0.1％SDS振荡洗涤2×5min。在50℃下，0.1×SSC/0.1％SDS振荡洗涤2×15min，将膜转入装有20ml洗涤缓冲液中振荡洗涤5min。在杂交和严谨洗涤后，将膜置洗涤缓冲液浸润1～5min；20～30ml封闭液中孵育30min；在10ml抗体液孵育30min；用20～30ml洗涤液洗涤2×15min；15ml检测液中平衡2～5min；现配20ml显色底物(NBT/BCIP)暗处静置显色；50ml灭菌水或TE洗膜5min终止显色，拍照保存。检测结果如图2如示，两组单酶切结果均表明，转化事件aD14-2中，外源目的基因为单拷贝插入。

实施例5.旁侧序列分析

样品制备：取2.5μgDNA，分别用HpaI，SspI消化6～8小时，酒精沉淀纯化后加适量水溶解。

连接接头：设计合成一对接头：

GenomeWalkerAdaptor+，GenomeWalkerAdaptor-(序列为SEQIDNo：11，SEQIDNo：12所示)

分别等量混合GenomeWalkerAdaptor+和GenomeWalkerAdaptor-，70℃保温10分钟，后缓慢降到室温。取4μl消化纯化的DNA加到含1.9μlGenomeWalkerAdaptor(25μM)，1.6μl10X连接缓冲液，0.5μlT4DNA连接酶(6units/μl)，在16℃下过夜培养，停止反应，在70℃下培养5min，在每个管中，加入72μlTE(10/1，pH7.5)，在低速下振荡5-10sec。

RB端序列分析，使用ClontechGenomeWalker^TMUniversal试剂盒利用引物AP1和GSP1-mCBD31′(序列分别为SEQIDNo：13、SEQIDNo：14)。，以连接产物为模板，进行第一轮扩增：7个循环：94℃25S，72℃6min；32个循环：94℃25S，67℃6min；最后一个循环后再于67℃保温7分钟。PCR产物稀释50倍后，用AP2和GSP2-mCBD32′(序列如SEQIDNo：16，SEQIDNo：17所示)进行第二轮PCR扩增，PCR程序如下：5循环：94℃25S，72℃5min；20cycles：94℃25S，67℃5min；最后一个循环后再于67℃保温10分钟。产物回收测序。

对aD14-2事件的RB端序列分析图3所示，共获得1813bp的核苷酸序列(序列如SEQIDNo：19)，包括1bp～397bp的棉花基因组序列，第398bp～627bp为RB与EVO203启动子之间的载体序列，第628bp～1692bp为EVO203启动子序列，第1693bp～1813bp为mCBD基因部分序列。

序列说明：

LB端序列分析，使用ClontechGenomeWalker^TMUniversal试剂盒，利用引物AP1和GSP1-NPTII51′(序列分别为SEQIDNo：13、SEQIDNo：15)。，以连接产物为模板，进行第一轮扩增：7个循环：94℃25S，72℃6min；32个循环：94℃25S，67℃6min；最后一个循环后再于67℃保温7分钟。PCR产物稀释50倍后，用AP2和GSP2-NPTII52′(序列如SEQIDNo：16，SEQIDNo：18所示)进行第二轮PCR扩增，PCR程序如下：5循环：94℃25S，72℃5min；20cycles：94℃25S，67℃5min；最后一个循环后再于67℃保温10分钟。产物回收测序。

对aD14-2事件的LB端序列分析如图4所示，共获得994bp的核苷酸序列(序列如SEQIDNo：20)，包括1bp～375bp的NPTII序列，第376bp～584bp的Tnos序列和第585bp～650bp的是Tnos终止子与LB之间的载体序列，651bp～994bp的序列是棉花基因组序列。

序列说明：

根据以上结果，本领域技术人员可容易得出aD14-2事件的特征DNA序列(SEQIDNO：21)，如下所示，加下划线部分示出的是T-DNA插入序列，未加下划线部分示出的是插入序列的侧翼棉花基因组DNA序列。

1AACGTGGCACGTTAAATCATCATTTCAAACAAAAATTTTAGGTTAAATTATACAATTAGT

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601TTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGTTGAGGGAGATTGATTTCTTTGGAAGAAATT

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1681GAGGATCCCCGGGATGGCTAGAAAATCCCTGATTTTCCCTGTGATCTTGCTCGCCGTTCT

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2101TGGATTCGCTAGCGGGGCCGCTACTCTTAAAAAGGGCCAATTTATAACTATTCAAGGAAG

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2281TGGCACAGCACCATAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTT

2341TCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATT

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2461TGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAA

2521ACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTCATACAAA

2581TGGACGAACGGATAAACCTTTTCACGCCCTTTTAAATATCCGATTATTCTAATAAACGCT

2641CTTTTCTCTTAGGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAG

2701GCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGC

2761CGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAG

2821CCACTCAGCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTAT

2881TGCGCGTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATG

2941CTCCACTGACGTTCCATAAATTCCCCTCGGTATCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCA

3001ATCCAAATAATCTGCACCGGATCTGGATCTGTCGATCGACCATGGGGATTGAACAAGATG

3061GATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCAC

3121AACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGG

3181TTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTCCAGGACGAGGCAGCGC

3241GGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTG

3301AAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTC

3361ACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGC

3421TTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTA

3481CTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCG

3541CGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCG

3601TGACACATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGAT

3661TCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCC

3721GTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTA

3781TCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCTTTCTTGACGAGTTCTTCTGAG

3841CGGGACTCTGGGGTTCGGATCGATCCTCTAGCTAGAGTCGATCGACAAGCTCGAGTTTCT

3901CCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCT

3961CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATC

4021AATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAATTA

4081ATTCGGCGTTAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCG

4141TCAATTAGTTTAGGGGGCAATTTTTATATTAATCCTTTTTTAAATAATAAAACGTGTTAC

4201GGGCTAATCATGCCCAACATTTCAACGGTCCGTTATTGTCTTGGACTATAGGTCCATGAA

4261AACTGGGCTATCGTCATATTAAACGTCAGCCGAAACAAGCCCAAAGTAGTACTCTGGTCC

4321GGTCAAAAGAAACTCCTTTTCTTCGTCTTTCCACTGGAATCTCCCTCAGCTCCTTTTGTC

4381TCATAAACCCTAAATCCCTAAATCTGAATCCGGAAAGGGAGGCGCAAGAATTGAATTTTT

4441TAGGAGCTTTTTAAAAAAGGTAACTTCTTTTAACTTATTTTTCTGTAAT

实施例6.转化事件检测

使用DNA引物对进行扩增以检测aD14-2事件，所述引物对由特异性识别本发明T-DNA插入序列的第一引物和特异性识别所述插入序列任一侧翼序列的第二引物组成。aD14-2插入序列及鉴定引物如图5所示。例如，当第一引物为RBcheck51′(SEQIDNO：22)或RBcheck52′(SEQIDNO：23)时，第二引物可为GSP1-mCBD31′(SEQIDNO：14)或GSP2-mCBD32′(SEQIDNO：17)；当第一引物为LBcheck31(SEQIDNO：24)′或LBcheck32′(SEQIDNO：25)时，第二引物为GSP1-NPTII51′(SEQIDNO：15)或GSP2-NPTII52′(SEQIDNO：18)。

利用上述引物对RBcheck51′/GSP2-mCBD32′、RBcheck52′/GSP2-mCBD32′以LBcheck31′/GSP2-NPTII52′、LBcheck32′/GSP2-NPTII52′分别扩增aD14-2品系、冀棉14棉花样品的结果如图6所示。M，marker，λDNA/EcoRI+HindIII；1，3：RBcheck51′/GSP2-mCBD32′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带1810bp；2，4：RBcheck52′/GSP2-mCBD32′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带1665bp；5，7：LBcheck31′/GSP2-NPTII52′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带802bp；6，8：LBcheck32′/GSP2-NPTII52′扩增aD14-2事件和冀棉14，阳性扩增条带773bp。说明，aD14-2植株含有转化事件，而冀棉14不含有转化事件。

实施例9.染色体定位

根据所获得的棉花侧翼序列，利用公布的二倍体棉花(Gossypiumraimondii)D染色体组基因组序列(http://www.phytozome.net/cotton.php)进行对比分析，可知aD14-2事件中，与插入序列接合的棉花侧翼DNA序列与D11染色体上的序列高度同源，因此可知，aD14-2事件中外源DNA插入序列的整合位点位于受体四倍体棉花的第11组染色体上。

Claims (10)

1.棉花转化事件aD14-2，其特征序列如SEQIDNo：21所示，其由第398-4145bp的T-DNA插入序列、第1-397bp的上游侧翼棉花基因组序列和第4146-4489bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。

2.一种核酸构建体，其包含权利要求1所述的序列。

3.一种重组载体，其包含权利要求1所述的T-DNA插入序列或权利要求2所述的核酸构建体。

4.一种重组细胞，含有权利要求1所述的T-DNA插入序列或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的载体，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

5.用于检测权利要求1所述的棉花转化事件的引物对，其由特异性识别权利要求1所述的T-DNA插入序列的第一引物和特异性识别权利要求1所述的任一侧翼序列的第二引物组成。

6.权利要求5所述用于检测权利要求1所述的棉花转化事件的引物对，所述第一引物选自SEQIDNO：22或23，所述第二引物选自SEQIDNO：14或17。

7.权利要求5所述用于检测权利要求1所述的棉花转化事件的引物对，所述第一引物选自SEQIDNO：24或25，所述第二引物选自SEQIDNO：15或18。

8.一种鉴定棉花生物样品中aD14-2转基因事事件的方法，其包括：

(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；

(b)以提取的DNA样品为模板，使用权利要求6或7所述的引物对进行PCR扩增；

(c)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQIDNO：21上所述PCR引物对之间的长度一致，则表明棉花生物样品中aD14-2转基因事件的存在。

9.一种制备转基因棉花的方法，培养含有权利要求1所述的转化事件的棉花种子或其他组织。

10.权利要求1所述的转化事件、权利要求2所述的核酸构建体、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞、权利要求8或权利要求9所述的方法用于提高棉花纤维品质、进行植物育种以及用作分子标记的用途。