CN105368869B - 陆地棉转化事件icr201501及其特异性鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了陆地棉转化事件ICR201501及其特异性鉴定方法。转基因棉花ICR201501为将序列表中序列1所示的外源DNA分子插入陆地棉CCRI24基因组第A05号染色体的第8415359‑8415371位间，替换掉第A05号染色体的第8415359‑8415371位间11bp的碱基序列，得到的棉花。通过试验证明：转基因棉花ICR201501不仅纤维长度、马克隆值、比强度和整齐度高于受体材料，而且株高、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、叶柄宽度、果枝数、单铃数、成铃数和衣分等方面也均高于受体材料，为培育具有优良纤维品质的转基因棉花的研究奠定基础。

Description

陆地棉转化事件ICR201501及其特异性鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及陆地棉转化事件ICR201501及其特异性鉴定方法。
背景技术
转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。
棉花作为天然可再生纤维原料，在纺织工业中发挥着重要，优质纤维是纺织工业所期望的。可将转基因技术的方法用于棉花以产生具有纤维改良性状。例如可通过表达能够使纤维细胞伸长的转基因在转基因棉花中获得长纤维棉。转基因在棉花中的表达可受多个因素影响，例如T-DNA插入区中所使用的调控元件、转基因在染色体上的插入位点及接近整合位置的任何内源调控元件的相似性的组合都会影响转基因的表达。例如，采用相同的转化方法获得的相似的转化事件之间的基因表达水平呈现出差异性，转化事件表现出差异性。因此，必须获得足够量的转化事件，并进行田间筛选以获得生产上有价值的转化事件。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种转基因棉花的培育方法。
本发明提供的转基因棉花的培育方法为将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A05号染色体的第8415359-8415371位间，替换掉第A05号染色体的第8415359-8415371位间11bp的碱基序列，得到转基因棉花；
所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花；
所述外源DNA片段为含有GhKCS6基因的DNA分子。
上述方法中，
所述外源DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段为所述目的棉花基因组第A05号染色体的自第8415359位核苷酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段；
所述外源DNA片段在所述转基因棉花的下游侧翼片段为所述目的棉花基因组第A05号染色体的自第8415371位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段。
上述方法中，
所述上游侧翼片段为序列表中序列2所示的核苷酸；
所述下游侧翼片段为序列表中序列3所示的核苷酸；
所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花体现在如下B1)-B12)：
B1)转基因棉花纤维的长度高于所述目的棉花；
B2)转基因棉花纤维的马克隆值高于所述目的棉花；
B3)转基因棉花纤维的比强度高于所述目的棉花；
B4)转基因棉花纤维的整齐度高于所述目的棉花；
B5)转基因棉花的籽棉产量高于所述目的棉花；
B6)转基因棉花的株高高于所述目的棉花；
B7)转基因棉花的叶片长度高于所述目的棉花；
B8)转基因棉花的叶片宽度高于所述目的棉花；
B9)转基因棉花的叶柄长度高于所述目的棉花；
B10)转基因棉花的叶柄宽度高于所述目的棉花；
B11)转基因棉花的单铃重高于所述目的棉花；
B12)转基因棉花的成铃数目高于所述目的棉花；
所述外源DNA片段通过含有所述外源DNA片段的重组载体导入所述目的棉花；
所述目的棉花为陆地棉。
上述方法中，所述转基因棉花为转基因棉花ICR201501。
本发明的另一个目的是提供用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述转基因棉花ICR201501或其后代的方法。
本发明提供的用于检测或辅助检测植物样品是否来源于上述转基因棉花ICR201501或其后代的方法包括如下步骤：
检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，
所述DNA片段A由上述外源DNA片段在所述转基因棉花ICR201501的上游侧翼片段、上述外源DNA片段和上述外源DNA片段在所述转基因棉花ICR201501的下游侧翼片段组成；
若所述植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述植物样品为或候选 为所述转基因棉花ICR201501或其后代；
若所述植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述植物样品不为或候选不为所述转基因棉花ICR201501或其后代。
上述方法中，
所述方法为如下1)或2)或3)：
1)直接测序；
2)用引物对1和/或引物对2对植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代；
所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其的所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；
所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其的所述下游侧翼序列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙；
3)用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述待测植物样品DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代。
上述方法中，
2)中，所述引物对1由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成。
本发明还有一个目的是提供用于检测样品是否来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代的试剂盒。
本发明提供的用于检测样品是否来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代的试剂盒包括上述引物对1和/或上述引物对2。
上述转基因棉花ICR201501在育种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还有一个目的是提供一种获得纤维品质提高的棉花的方法。
本发明提供的获得纤维品质提高的棉花的方法包括如下步骤：
(1)按照上述方法获得转基因棉花；
(2)将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照上述方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株；
所述转基因棉花的保藏编号为CCTCC No.P201517。
本发明的最后一个目的是提供用于转基因棉花的培育的产品。
本发明提供的用于转基因棉花的培育的产品为如下a)-c)：
a)上述上游侧翼片段和上述下游侧翼片段；
b)上述外源DNA片段；
c)与上述外源DNA片段相关的生物材料；
所述生物材料为下述A1)至A11)中的任一种：
A1)含有上述外源DNA片段的表达盒；
A2)含有上述外源DNA片段的重组载体；
A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A4)含有上述外源DNA片段的重组微生物；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有上述外源DNA片段的转基因植物细胞系；
A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
上述产品在调控植物纤维的长度和/或马克隆值和/或比强度和/或整齐度中的应用也属于本发明的保护范围。
上述产品在调控植物株高和/或叶片长度和/或叶片宽度和/或叶柄长度和/或叶柄宽度和/或果枝数和/或单铃数和/或成铃数中和/或衣分中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明将GhKCS6基因导入陆地棉CCRI24中，使GhKCS6基因在陆地棉CCRI24中过表达，得到转基因棉花ICR201501，转基因棉花ICR201501为将序列表中序列1所示的外源DNA分子插入陆地棉CCRI24基因组第A05号染色体的第8415359-8415371位间，替换掉第A05号染色体的第8415359-8415371位间11bp的碱基序列，得到的棉花。通过试验证明：转基因棉花ICR201501不仅纤维长度、马克隆值、比强度和整齐度和籽棉产量高于受体材料，而且株高、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、叶柄宽度、果枝数、单铃数、成铃数和衣分等方面也均高于受体材料，为培育具有优良纤维品质的转基因棉花的研究奠定基础。
附图说明
图1为转化事件ICR201501的图解表示。其中，[A]：5’接合区域；[B]3’接合区域；[C]对应于插入的转基因DNA的5’端和与其相连接的基因组侧翼区域；[D]：对应于插 入的转基因DNA的3’端和与其相连接的基因组侧翼区域；[E]：转基因表达盒；[F]：陆地棉基因组侧翼序列和转基因表达盒的连续序列。
图2为转基因棉花ICR201501和受体材料CCR124的籽棉产量数据。
图3为转基因棉花ICR201501和受体材料CCR124的纤维长度比较。
图4为开花后不同天数的转基因棉花ICR201501(E6-KCS6)与受体材料CCR124的棉铃的比较。
图5为转基因棉花ICR201501繁育后代和受体材料CCR124的籽棉产量比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的陆地棉CCRI24在文献“PAG1,a cotton brassinosteroidcatabolism gene,modulates fiber elongation”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
下述实施例中的农杆菌LBA4404在文献“Constitutive expression of thevirulence genes improves the efficiency of plant transformation byAgrobacterium”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。
实施例1、转GhKCS6棉花的获得及农艺性状分析
一、转GhKCS6棉花的获得
1、重组载体的构建
将表达盒A插入pCambia2300载体(该质粒购于NTCC典型培养物保藏中心下属的BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号为：Biovectorpcambia2300)的EcoRI和HindIII酶切位点间，且保持pCambia2300载体的其他序列不变，得到重组载体(序列4)。上述表达盒A的核苷酸序列如序列表1中的第2160-5319位核苷酸所示。表达盒A从上游依次包括E6启动子、GhKCS6基因和NOS终止子；其中，E6启动子的核苷酸序列如序列表1中的第3841-5319位核苷酸所示；GhKCS6基因的核苷酸序列如序列表1中的第2429-3832位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如序列表1中的第2160-2398位核苷酸所示。
pCambia2300载体自身包括表达盒B，表达盒B从上游起依次包括花椰菜花叶病毒的CAMV35S的启动子、新霉素磷酸转移酶(NPTII)和Ploy A终止子。
2、重组菌的获得
将步骤1获得的重组载体导入农杆菌LBA4404中，得到重组菌。
3、转GhKCS6棉花的获得
采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化陆地棉CCRI24的外植体(2000个)，在含有硫酸卡那霉素的培养基上培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在硫酸卡那霉素筛选培养基上形成胚性愈伤组织，挑选存活的胚性愈伤转化形成再生成棉花，最后共获得80个T0代转GhKCS6棉花，并将其用于筛选。
4、转GhKCS6棉花的鉴定
(1)对收获的T1代转GhKCS6棉花种子在温室种植，进行温室功效分析和分子分析。提取T1代转GhKCS6棉花叶片的DNA，采用引物CACAATCATCACCATTCACCAC和GCCACCCGAACGAAACAAACAAT进行PCR扩增，检测目的基因是否存在，并统计材料的分离比，根据孟德尔遗传定律，获得21个单拷贝的T1代转GhKCS6棉花；
(2)采用Taqman PCR和Southern blot对上述步骤(1)获得的21个单拷贝的T1代转GhKCS6棉花进一步验证。具体步骤如下：在花铃期对获得的21个单拷贝的T1代转GhKCS6棉花进行GhKCS6基因表达分析的测定，分别在开花后0天(开花当天记为0天)、5天、15天，对21个单拷贝的T1代转GhKCS6棉花和受体材料CCRI24的GhKCS6表达量进行分析，表明21个单拷贝的T1代转GhKCS6棉花中有10个T1代转GhKCS6棉花的表达量较受体材料CCRI24大幅提高；
(3)在絮期测定上述步骤(2)获得的10个T1代转GhKCS6棉花的纤维品质：结果表明10个T1代转GhKCS6棉花中8个T1代转GhKCS6棉花的棉花纤维长度较受体材料CCRI24改良或伸长。
(4)在第一年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估8个T2代转GhKCS6棉花的农艺学性状(纤维品质、单铃重、衣分、籽指、株高、始节高、果枝数、生育期，其中纤维品质包括长度、比强度、马克隆值、伸长率、整齐度)及转基因插入对棉花生长发育、棉花产量的影响。结果表明：8个T2代转GhKCS6棉花中共有2个T2代转GhKCS6棉花的农艺学性状好于受体材料CCRI24。
(5)在第二年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(4)获得的2个T2代转GhKCS6棉花的农艺学性状(纤维品质、单铃重、衣分、籽指、株高、始节高、果枝数、生育期，其中纤维品质包括长度、比强度、马克隆值、伸长率、整齐度)及转基因插入对棉花生长发育、棉花产量的影响。结果表明：2个T2代转GhKCS6棉花中共有1个T2代转GhKCS6棉花的农艺学性状好于受体材料CCRI24，将该T2代转GhKCS6棉花命名为ICR201501，并于2015年11月4日将T2代转GhKCS6棉花种子(Gossypium hirsutum L.)ICR201501保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，分类命名为棉花种子(Gossypiumhirsutum L.)，保藏编号为CCTCC No.P201517。
将T2代转GhKCS6棉花ICR201501进行自交，直至获得T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501。
二、转GhKCS6棉花的农艺性状分析
1、纤维品质与籽棉产量
将T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501与受体材料CCRI24进行田间产量试验。在河南安阳设计小区试验，设置3个小区，3个小区设置完全相同，小区行长8m，每行种植30株，行间距80cm，每个材料种植3行，小区共6行。采用Students’test对T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501与受体材料CCRI24纤维的纤维长度、马克隆值、整齐度、比强度和籽棉产量进行统计分析。
统计结果如表1和图2所示：与受体材料CCRI24相比，T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501的纤维长度、马克隆值、整齐度、比强度和籽棉产量均有提高，其中，纤维长度与受体材料CCRI24之间呈极显极著性差异，籽棉产量呈显著。图3为转基因棉花ICR201501与受体材料CCRI24的成熟纤维长度比较。
表1、转基因棉花ICR201501的棉花和受体材料CCR124的纤维品质数据
2、其他方面的影响
由于启动子不只是在纤维中表达，其他组织也会受到影响，为了研究除了改良纤维品质尤其是纤维长度外，GhKCS6基因对其他组织是否产生影响，对T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501与受体材料CCRI24的叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、叶柄宽度、株高、果枝数目、成铃数、铃重和衣分进行了检测。
结果如表2-表4所示：从表中可以看出，T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501的株高、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、叶柄宽度均高于受体材料CCRI24。说明GhKCS6基因的表达对植物的株高、叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、叶柄宽度产生了一定程度的影响。T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501的单铃重显著高于受体材料CCRI24，成铃数也均高于受体材料CCRI24。图4为开花后不同天数的T5代转GhKCS6棉花纯合株系ICR201501(E6-KCS6)与受体材料CCRI24的铃的外形。
表2、转基因棉花ICR201501的棉花和受体材料CCR124的叶片长度及宽、叶柄长度及宽度的数据
表3、转基因棉花ICR201501的棉花和受体材料CCR124的株高比较数据
表4、转基因棉花ICR201501的棉花和受体材料CCR124的果枝数目、成铃数、铃重、衣分
三、ICR201501的DNA序列的表征分析
采用分子生物学的方法分析ICR201501基因组的插入物和与插入物相连接侧翼连接的基因组序列。具体步骤如下：
1、提取棉花的基因组。温室或大田条件下，取ICR201501的棉花的幼嫩叶片约100mg置于2.0ml的EP管中，采用液氮冷冻EP管，然后采用冷冻研磨仪研磨，采用Qiagen公司DNeasy Plant Mini Kit(50)(货号69104)中提供的方案提取基因组DNA。该方法可经本领域技术人员改进以从任何组织(包括但不限于种子)提取DNA。
2、根据Clontech公司的Universal Genome WalkerTM 2.0 User Manual试剂盒(Cat.No.634923中的说明书，采用4种不同的限制性内切酶(DraI、EcoRV、PvuII、StuI)进行基因组的消化，过夜消化，得到消化产物。采用试剂盒内置的NucleoSpin Gel and PCRClean-Up kit盒子对消化产物回收，然后在回收产物两端采用T4DNA连接酶加上试剂盒内置的接头，至此4个加接头的DNA文库构建完毕。
3、根据已知的转基因插入物序列，在其5’端和3’端分别设计两条巢式引物(5’端的两条巢式引物如序列9和序列10所示，3’端的两条巢式引物如序列11和序列12所示)，然后采用试剂盒中提供的方案进行扩增。利用琼脂糖凝胶电泳分离从反应产生的扩增子，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号：D104A)试剂盒中提供 的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，阳性克隆进行单克隆测序。
测序结果表明：转基因棉花ICR201501为将序列表中序列1所示的外源DNA分子插入陆地棉CCRI24基因组第A05号染色体的第8415359-8415371位间，替换掉第A05号染色体的第8415359-8415371位间11bp的碱基序列，得到的转基因棉花，且自第8415359位上游且紧邻第8415359位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列为序列2，自第8415371位下游且紧邻第8415371位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列为序列3(图1)。
实施例2、ICR201501繁育后代的获得和鉴定及其农艺性状分析
一、ICR201501繁育后代
1、杂交
在开花前1天下午通过人手工或者人为行动除去第一棉花的花粉，并且采用蜡管套住花的柱头，防止外来花粉与柱头接触，第二天上午待第二棉花的花粉散粉时，通过人手工收集第二种棉花的花粉，并将该花粉与第一种植物的花柱或柱头接触，即完成杂交过程。其中，第一棉花为实施例中的ICR201501时，第二棉花为其他棉花，或者第二棉花为ICR201501，第一棉花为其他棉花。
吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸拖绒，即获得杂交种子。种植，获得杂种后代，即为ICR201501繁育后代。
2、自交
在开花前1天，采用嫁接夹直接夹住ICR201501的花蕾或者采用细线捆绑花蕾，防止开花时外来花粉与ICR201501的柱头接触；或者通过网袋将整个棉花植株套住，可以有效的防止通过昆虫等传粉，能够实现棉花的自花授粉。通过上述步骤可以完成自交。
吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸拖绒，即获得自交种子，种植，得到自交后代，即为ICR201501繁育后代。
二、ICR201501繁育后代性状的鉴定
(一)ICR201501繁育后代性状的鉴定方法
以ICR201501繁育后代的基因组DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，若PCR扩增产物含有ICR201501的扩增子(扩增子是指一条或者一段采用PCR扩增技术合成的DNA分子)，说明ICR201501繁育后代具有和ICR201501相同的性状，若PCR扩增产物不含ICR201501的扩增子，说明ICR201501繁育后代不具有和ICR201501相同的性状。具体鉴定方法如下：
1、鉴定方法1
(1)引物的设计
本实施例基于上游侧翼序列和外源DNA分子设计如下鉴定引物：
GSP1：TGCTTGTGACTTCGGAATCGTTGA(序列5)；
GSP2：GAGCATATAAGAAACCCTTAGTATG(序列6)。
(2)以ICR201501繁育后代的基因组DNA为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增体系如下：2×MASTRE PCR MIX 10μl、上游引物GSP1(10μM)0.5μl、下游引物GSP1(10μM)0.5μl、模板DNA(50ng/μl)1μl、超纯水8μl，总体积20μl。
PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s,55℃30s,72℃45s,32个循环；72℃5min。
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对其进行测序。若PCR扩增产物的大小为900bp，则说明ICR201501繁育后代含有ICR201501的扩增子，ICR201501繁育后代具有ICR201501性状，否则不具有ICR201501性状。
2、鉴定方法2
(1)引物的设计
本实施例基于下游侧翼序列和外源DNA分子设计如下鉴定引物：
GSP3：TATAAAACTCTTGGACCCCC GAATT(序列7)；
GSP4：CGTTGGCCGATTCATTAATG CAGCT(序列8)。
(2)以ICR201501繁育后代的基因组DNA为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增体系如下：2×MASTRE PCR MIX 10μl、上游引物GSP3(10μM)0.5μl、下游引物GSP4(10μM)0.5μl、模板DNA(50ng/μl)1μl、超纯水8μl，总体积20μl。
PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s,55℃30s,72℃45s,32个循环；72℃5min。
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对其进行测序。若PCR扩增产物的大小为881bp，则说明ICR201501繁育后代含有ICR201501的扩增子，ICR201501繁育后代具有ICR201501性状，否则不具有ICR201501性状。
(二)ICR201501繁育后代性状的农艺性状分析
按照实施例1中的步骤二中的方法检测上述步骤(一)中获得的具有ICR201501扩增子的ICR201501繁育后代(ICR201501)和受体材料CCRI24的纤维品质和籽棉产量。
1、ICR201501繁育后代性状的籽棉产量
ICR201501繁育后代(ICR201501)的籽棉产量的检测结果如图5所示：从图中可以看出，与受体材料CCRI24的籽棉产量相比，ICR201501繁育后代(ICR201501)的 籽棉产量提高了46.14％，说明ICR201501繁育后代(ICR201501)具有高籽棉产量。
2、ICR201501繁育后代性状的纤维品质
ICR201501繁育后代(ICR201501)的籽棉产量的检测结果如表5所示：从表中可以看出，与受体材料CCRI24相比，ICR201501繁育后代(ICR201501)的纤维长度、比强度、马克隆值和整齐度均有所提高，说明ICR201501繁育后代(ICR201501)的棉花纤维品质有所提高。
表5、ICR201501繁育后代(ICR201501)的纤维品质的检测结果
因此可以按照如下方法检测或辅助检测植物样品是否来源于转基因棉花ICR201501或其后代：
用引物对1或引物对2对植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物中是否含有DNA片段A，
若含有DNA片段A，则植物样品为或候选为转基因棉花ICR201501或其后代；
若不含有DNA片段A，则植物样品不为或候选不为转基因棉花ICR201501或其后代。
引物对1由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
引物对2由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
DNA片段A由上游侧翼片段(序列2)、外源DNA片段(序列1)和下游侧翼片段(序列3)组成。

Claims (9)

1.一种转基因棉花的培育方法，为将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A05号染色体的第8415359-8415371位间，替换掉第A05号染色体的第8415359-8415371位间11bp的碱基序列，得到转基因棉花；
所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花；
所述外源DNA片段为含有GhKCS6基因的DNA分子；
所述外源DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花体现在如下B1）-B12）：
B1）转基因棉花纤维的长度高于所述目的棉花；
B2）转基因棉花纤维的马克隆值高于所述目的棉花；
B3）转基因棉花纤维的比强度高于所述目的棉花；
B4）转基因棉花纤维的整齐度高于所述目的棉花；
B5）转基因棉花的籽棉产量高于所述目的棉花；
B6）转基因棉花的株高高于所述目的棉花；
B7）转基因棉花的叶片长度高于所述目的棉花；
B8）转基因棉花的叶片宽度高于所述目的棉花；
B9）转基因棉花的叶柄长度高于所述目的棉花；
B10）转基因棉花的叶柄宽度高于所述目的棉花；
B11）转基因棉花的单铃重高于所述目的棉花；
B12）转基因棉花的成铃数目高于所述目的棉花；
所述目的棉花为陆地棉CCRI24。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述外源DNA片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段为所述目的棉花基因组第A05号染色体的自第8415359位核苷酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至5 Kb的任意一个DNA片段；
所述外源DNA片段在所述转基因棉花的下游侧翼片段为所述目的棉花基因组第A05号染色体的自第8415371位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5 Kb的任意一个DNA片段。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：
所述上游侧翼片段为序列表中序列3所示的核苷酸；
所述下游侧翼片段为序列表中序列4所示的核苷酸；
所述外源DNA片段通过含有所述外源DNA片段的重组载体导入所述目的棉花。
4.根据权利要求1-3中任一所述方法，其特征在于：所述转基因棉花为转基因棉花ICR201501，其保藏编号为CCTCC No.P201517。
5.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求4中所述转基因棉花ICR201501或其后代的方法，包括如下步骤：
检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，
所述DNA片段A由权利要求2中的所述外源DNA片段在所述转基因棉花ICR201501的上游侧翼片段、权利要求2中的所述外源DNA片段和权利要求2中的所述外源DNA片段在所述转基因棉花ICR201501的下游侧翼片段组成；
若所述植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述植物样品为或候选为所述转基因棉花ICR201501或其后代；
若所述植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述植物样品不为或候选不为所述转基因棉花ICR201501或其后代。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述方法为如下1）或2）或3）：
1）直接测序；
2）用引物对1和/或引物对2对植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代；
所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其的所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；
所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其的所述下游侧翼序列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙；
所述引物对1具体由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2具体由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
3）用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述待测植物样品DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代。
7.用于检测样品是否来源于所述转基因棉花ICR201501或其后代的试剂盒，其包括：权利要求6中的所述引物对1和/或权利要求6中的所述引物对2。
8.权利要求4中所述的转基因棉花ICR201501在育种中的应用。
9.一种获得纤维品质提高的棉花的方法，包括如下步骤：
（1）按照权利要求1-4中任一所述方法获得转基因棉花；
（2）将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照权利要求5或6所述的方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株；
所述转基因棉花的保藏编号为CCTCC No.P201517。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007009181A1 (en) * 2005-07-20 2007-01-25 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Modification of flavonoid biosynthesis in plants
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007009181A1 (en) * 2005-07-20 2007-01-25 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Modification of flavonoid biosynthesis in plants
CN101962658A (zh) * 2010-10-21 2011-02-02 中国农业大学 高效率转基因棉花表达载体与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
How cotton fibers elongate :a tale of linear cell-growth mode;QIN YM ET AL;《curr opin plant biol》;20111231;第14卷(第1期);摘要 *
两个棉花逆境相关锌指蛋白基因的转基因材料创制;郭琪;《中国优秀硕士论文全文数据库》;20140815(第8期);全文 *
棉花纤维发育相关基因GhKcs13的克隆与功能验证;杜雪琼;《中国优秀硕士论文全文数据库》;20150815(第8期);全文 *
超长链脂肪酸合成相关基因的转基因功能验证;钱玉源;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20140215(第2期);摘要,11页2.2节，25页表10，32页表11 *

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