BR112014022649B1 - Métodos de produção de uma planta transgênica, métodos de identificação de um alelo fraco de fea3, métodos de produção de uma planta e método de identificação de uma primeira planta de milho - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE UM ALELO FRACO DE FEA3, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA, MÉTODO DE EXPRESSÃO DE UM POLINUCLEOTÍDEO HETERÓLOGO E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PRIMEIRA PLANTA DE MILHO São fornecidos métodos e composições de modulação do tamanho do meristema apical de brotos. São fornecidos métodos de modulação da expressão de sequência fea3 em plantas hospedeiras ou células vegetais para modular características agronômicas tais como tamanho alterado e número de órgãos, incluindo sementes vegetais.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/610645, depositado em 14 de março de 2012, e do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/751326, depositado em 11 de janeiro de 2013, cujo teor integral é incorporado ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se ao campo de manipulação genética de plantas, particularmente à modulação da atividade genética e do desenvolvimento em plantas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Folhas e os meristemas axilares que geram ramos e flores são iniciados em padrões regulares a partir do meristema apical de brotos (SAM). As células da cúpula do meristema apical dos brotos servem de células haste que se dividem para deslocar continuamente células filhotes para as regiões vizinhas, onde são incorporadas aos primórdios da folha ou flor diferenciada. Os meristemas são, portanto, capazes de regular o seu tamanho durante o desenvolvimento por meio do equilíbrio da proliferação celular com a incorporação de células em novos primórdios. O SAM fornece todas as partes aéreas do corpo da planta. O conceito central de regulagem das células haste é conhecido pelo processo de sinal de genes CLAVATA/WUSCHEL (CLV/WUS). A perda da atividade de CLV1, CVL2 ou CVL3 em Arabidopsis causa acúmulo de células não diferenciadas no ápice do broto, o que indica que genes CLV juntos promovem a transição oportuna de células haste em processos de diferenciação, reprimem a divisão de células haste ou ambos (Fletcher et al. (1999), Science 283: 1911-1914; Taguchi-Shiobara et al. (2001), Genes and Development 15: 2755-5766; Trotochaud et al. (1999), Plant Cell 11: 393-405; Merton et al. (1954), Am. J. Bot. 41: 726-32; Szymkowiak et al. (1992), Plant Cell 4: 1089-100; Yamamoto et al. (2000), Biochim. Biophys. Acta. 1491: 333-40). O ortólogo de milho de CLV1 é TD1 (Bommert et al. (2005), Development 132:1235-1245). O ortólogo de milho de CLV2 é FEA2 (Taguchi-Shiobara et al. (2001), Genes Dev. 65 15: 2755-2766). É desejável poder controlar o tamanho e o surgimento de meristemas florais e de brotos, para gerar rendimentos mais altos de folhas, flores e frutos. Consequentemente, é objeto da presente invenção fornecer métodos e composições inovadoras de modulação do desenvolvimento de meristema.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[004] Em uma realização, a presente invenção fornece um método de produção de plantas transgênicas com expressão reduzida de fea3 endógeno, em que o método compreende as etapas de (a) introdução em células vegetais regeneráveis de uma construção recombinante que compreende uma sequência de polinucleotídeos ligada operacionalmente a um promotor, a expressão da sequência de polinucleotídeos reduz a expressão de fea3 endógena; (b) regeneração de plantas transgênicas a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a); em que a planta transgênica compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de plantas transgênicas de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe redução da expressão de fea3, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

[005] Em outra realização, a presente invenção fornece um método de produção de plantas transgênicas com expressão reduzida de fea3 endógeno, em que o método compreende as etapas de (a) introdução em células vegetais regeneráveis de uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado ligado operacionalmente, em orientação sense ou antisense, a um promotor funcional em plantas, em que o polinucleotídeo compreende: (i) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (ii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência, com base no método de alinhamento Clustal W, em comparação com SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (iii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cem nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (iv) uma sequência de nucleotídeos que pode hibridizar-se em condições estringentes com a sequência de nucleotídeos de (i); ou (v) um precursor de miRNA vegetal modificado, em que o precursor foi modificado para substituir a região codificadora de miRNA com uma sequência projetada para produzir miRNA dirigido a SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (b) regeneração de plantas transgênicas da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de plantas transgênicas de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe redução da expressão de fea3, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

[006] Uma realização da presente invenção é um método de produção de plantas transgênicas com alteração de características agronômicas, em que o método compreende as etapas de (a) introdução em células vegetais regeneráveis de uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado ligado operacionalmente a pelo menos uma sequência reguladora, em que o polinucleotídeo codifica um fragmento ou variante de polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método de alinhamento Clustal W, em comparação com SEQ ID NO: 3 ou 5, em que o fragmento ou a variante confere um fenótipo negativo dominante na célula vegetal regenerável; (b) regeneração de plantas transgênicas da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de plantas transgênicas de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe alteração de pelo menos uma característica agronômica selecionada a partir do grupo que consiste de: tamanho do meristema da espiga, número de fileiras de grãos, número de folhas, número de inflorescências, ramificação dentro da inflorescência, número de flores, número de frutos, número de sementes, ramificação de raízes, biomassa de raiz, tropismo de raiz, biomassa e rendimento, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

[007] Outra realização da presente invenção é o método acima no qual a expressão do polipeptídeo da parte (a) em uma linhagem vegetal que possui o genótipo mutante de fea3 é capaz de restaurar total ou parcialmente o fenótipo do tipo selvagem.

[008] Uma realização da presente invenção é um método de identificação de alelos mais fracos de fea3, em que o método compreende as etapas de (a) realização de seleção genética sobre uma população de plantas de milho mutantes; (b) identificação de uma ou mais plantas de milho mutantes que exibem fenótipo fea3 fraco com relação a uma planta null para fea3; e (c) identificação do alelo fea3 fraco da planta de milho mutante com fenótipo fea3 mais fraco.

[009] Uma realização da presente invenção é um método de identificação de alelos mais fracos de fea3, em que o método compreende as etapas de: (a) embaralhamento genético (gene shuffling) utilizando SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (b) transformação das sequências comutadas da etapa (a) em uma população de células vegetais regeneráveis; (c) regeneração de uma população de plantas transformadas da população de células vegetais regeneráveis transformadas da etapa (b); (d) seleção da população de plantas transformadas da etapa (c) em busca de fenótipo fea3 fraco; e (e) identificação do alelo fea3 fraco da planta transformada que exibe fenótipo fea3 fraco.

[010] Uma realização da presente invenção é uma planta na qual a expressão do gene fea3 endógeno é inibida com relação a uma planta controle. Outra realização da presente invenção é um método de produção da mencionada planta, em que o método compreende as etapas de (a) introdução de mutação no gene fea3 endógeno; e (b) detecção da mutação, em que a mutação é eficaz na inibição da expressão do gene fea3 endógeno. Em uma realização, as etapas (a) e (b) são elaboradas utilizando o método de Lesões Locais Induzidas em Genomas (TILLING). Em uma realização, a mutação é uma mutação sítio-específica.

[011] Uma realização da presente invenção é uma planta que exibe fenótipo fea3 mais fraco com relação a plantas do tipo selvagem. Outra realização é um método de produção da mencionada planta, em que o método compreende as etapas de: (a) introdução de transposon em um germoplasma que contém um gene fea3 endógeno; (b) obtenção de prole do germoplasma da etapa (a); e (c) identificação de plantas da prole da etapa (b) nas quais o transposon tenha sido inserido no gene FEA3 endógeno e seja observada redução da expressão de fea3. A etapa (a) pode compreender adicionalmente a introdução do transposon em uma célula vegetal regenerável do germoplasma por meio de transformação e regeneração de plantas transgênicas a partir da célula vegetal regenerável, em que a planta transgênica compreende no seu genoma o transposon.

[012] Em uma realização, os métodos descritos acima em que o método compreende adicionalmente as etapas de (a) introdução em células vegetais regeneráveis de uma construção recombinante que compreende o alelo fea3 fraco identificado pelos métodos descritos acima; (b) regeneração de plantas transgênicas a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de plantas transgênicas de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe fenótipo fea3 fraco, em comparação com plantas controle que não compreendem a construção de DNA recombinante.

[013] Outra realização é um método de produção de plantas transgênicas com alteração de características agronômicas, em que o método compreende (a) introdução em células vegetais regeneráveis de uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado ligado operacionalmente, em orientação sense ou antisense, a um promotor funcional em plantas, em que o polinucleotídeo compreende: (i) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (ii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência, com base no método de alinhamento Clustal W, em comparação com SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (iii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cem nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (iv) uma sequência de nucleotídeos que pode hibridizar-se sob condições estringentes com a sequência de nucleotídeos de (i); ou (v) um precursor de miRNA vegetal modificado, em que o precursor foi modificado para substituir a região codificadora de miRNA com uma sequência projetada para produzir miRNA dirigido a SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (b) regeneração de plantas transgênicas da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de plantas transgênicas de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe alteração de pelo menos uma característica agronômica selecionada a partir do grupo que consiste de: meristema da espiga aumentado, número de fileiras de grãos, número de sementes, ramificação de raízes, biomassa de raiz, tropismo de raiz, biomassa e rendimento, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante. Outra realização é a planta produzida por meio deste método.

[014] Uma realização é um método de expressão de polinucleotídeos heterólogos em plantas, em que o método compreende (a) transformação de células vegetais regeneráveis com uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo ligado operacionalmente a um segundo polinucleotídeo, em que o segundo polinucleotídeo é um promotor de FEA3; (b) regeneração de plantas transgênicas a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende no seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de plantas transgênicas de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e, adicionalmente, em que o polinucleotídeo heterólogo é expresso na planta transgênica. Outra realização é a planta que compreende no seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo heterólogo ligado operacionalmente a um segundo polinucleotídeo, em que o segundo polinucleotídeo é um promotor de FEA3 e em que o polinucleotídeo heterólogo é expresso na planta.

[015] Outra realização é um método de identificação de uma primeira planta de milho ou um primeiro germoplasma de milho que possui alteração de pelo menos uma característica agronômica, em que o método compreende a detecção na primeira planta de milho ou no primeiro germoplasma de milho de pelo menos um polimorfismo de um locus marcador que é associado ao mencionado fenótipo, em que o locus marcador codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: (a) uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 90% e menos de 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou 5, em que a expressão do mencionado polipeptídeo em plantas ou suas partes resulta em alteração de pelo menos uma característica agronômica selecionada a partir do grupo que consiste de: tamanho do meristema da espiga, número de fileiras de grãos, número de inflorescências, ramificação no interior da inflorescência, número de flores, número de frutos e número de sementes, em comparação com uma planta controle, em que a planta controle compreende SEQ ID NO: 3 ou 5. Outra realização é o método acima no qual o mencionado polipeptídeo compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 23, 25 ou 27.

[016] A presente invenção inclui uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção ligado operacionalmente, em orientação sense ou antisense, a um promotor que é um meristema apical de broto específico ou meristema apical de broto preferido.

[017] A presente invenção inclui um vetor, célula, planta ou semente que compreende qualquer uma das construções de DNA recombinantes descritas na presente invenção.

[018] A presente invenção engloba plantas produzidas por meio dos métodos descritos no presente.

[019] A presente invenção também engloba plantas transgênicas férteis, maduras e regeneradas que compreendem as construções de DNA recombinantes descritas acima, sementes transgênicas produzidas com elas, gerações T1 e subsequentes. As células, tecidos, plantas e sementes de plantas transgênicas podem compreender pelo menos uma construção de DNA recombinante de interesse.

[020] Em uma realização, a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis, tomate, milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milho-painço, cana-de-açúcar e switchgrass.

[021] Em uma realização, a planta que compreende as construções recombinantes descritas na presente invenção é uma planta monocotiledônea. Em uma realização, a planta que compreende as construções recombinantes descritas na presente invenção é uma planta de milho.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS

[022] A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir, das figuras e da Listagem de Sequências anexas que fazem parte do presente pedido. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical Journal 219 (n° 2): 345-373 (1984), que são integralmente incorporados ao presente como referência. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. § 1.822.

[023] A Fig. 1 exibe a abordagem de clonagem com base em mapas utilizada para isolar o alelo de referência fea3.

[024] A Fig. 2A exibe dados de PCR RT que exibem a análise de expressão de fea2 e fea3 em tecidos diferentes. Os diferentes tecidos analisados são RAM: meristema apical de raízes; RE: zona de alongamento de raízes; RAM(l): RAM de raiz lateral; SAM: meristema apical de raízes (incluindo primórdios de folhas); EM: meristema de inflorescência da espiga. A Fig. 2B exibe expressão de fea3 in situ. A Fig. 2C exibe Western Blot com anticorpo anti- RFP de FEA3 marcado com RFP de amostras fracionadas de membranas de plantas transgênicas e do tipo selvagem não transgênicas que expressam proteína FEA3 marcada com RFP. “T” é a “amostra não fracionada total”, “S” é a fração solúvel e “M” é a fração de membrana.

[025] As Figs. 3B-3E exibem o fenótipo fea3 fasciado em desenvolvimento de espigas em comparação com uma planta do tipo selvagem (wt) (Fig. 3A).

[026] As Figs. 4A-4C exibem a análise fenotípica de mutantes duplos de fea3/fea2. A Fig. 4A exibe a comparação entre as borlas de mutantes duplos em comparação com mutantes isolados e plantas do tipo selvagem. A Fig. 4B exibe a comparação de densidade de espiguetas entre mutantes duplos, mutantes isolados e plantas do tipo selvagem. A Fig. 4C exibe a comparação entre fenótipos de espigas mutantes duplas em comparação com mutantes isolados e plantas do tipo selvagem.

[027] A Fig. 5A e a Fig. 5B exibem uma comparação entre plantas do tipo selvagem, plantas fea2 e fea3 no teste de raízes de peptídeos CLV3. A Fig. 5B exibe a análise quantitativa.

[028] A Fig. 6 exibe uma análise quantitativa da comparação entre plantas do tipo selvagem, plantas fea2 e fea3 no teste de raízes de peptídeos similares a CLV3.

[029] A Fig. 7A e a Fig. 7B exibe embriões do tipo selvagem e fea3 cultivados na presença de FCP1 e peptídeo alterado. A Fig. 7A exibe o crescimento de SAM de embrião do tipo selvagem e fea3 e a Fig. 7B exibe sua análise quantitativa.

[030] As Figs. 8A-8C exibem a análise fenotípica de mutantes duplos de fea3/td1.

[031] As descrições de sequências (Tabela 1) e a Listagem de Sequências anexas ao presente atendem às normas que regem descrições de sequências de aminoácidos e/ou nucleotídeos em pedidos de patente conforme estabelecido em 37 C. F. R. §1.821-1.825. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical J. 219 (2): 345-373 (1984), que são incorporados ao presente como referência. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. §1.822.

[032] SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleotídeos do gene do tipo selvagem fea3.

[033] SEQ ID NO: 2 é a sequência de codificação de fea3 do tipo selvagem.

[034] SEQ ID NO: 3 é a sequência de codificação de fea3 do tipo selvagem.

[035] SEQ ID NO: 4 é a sequência de codificação de fea3 mais curto alternativamente dividido.

[036] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos de fea3 mais curto alternativamente dividido.

[037] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente ao locus At1g68780 (Arabidopsis thaliana).

[038] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente ao locus At1g13230 (Arabidopsis thaliana).

[039] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente ao locus At3g25670 (Arabidopsis thaliana).

[040] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos correspondente ao locus LOC_Os05g43140.1, uma proteína prevista de arroz (japonica) do Projeto de Anotação do Genoma de Arroz da Universidade do Estado de Michigan Osa1 versão 6 (janeiro de 2009).

[041] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos correspondente a Sb03g008380, uma proteína prevista de sorgo (Sorghum bicolor) da sequência genômica de sorgo JGI versão 1.4 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[042] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos correspondente a Sb03g008360, uma proteína prevista de sorgo (Sorghum bicolor) da sequência genômica de sorgo JGI versão 1.4 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[043] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos correspondente a Glyma20g32610, uma proteína prevista de soja (Glycine max) de sequências de codificação previstas da sequência genômica de soja JGI Glyma1.01 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[044] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos correspondente a Glyma10g34950, uma proteína prevista de soja (Glycine max) de sequências de codificação previstas da sequência genômica de soja JGI Glyma1.01 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[045] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos correspondente a Glyma02g11350, uma proteína prevista de soja (Glycine max) de sequências de codificação previstas da sequência genômica de soja JGI Glyma1.01 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[046] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos correspondente a Glyma01g22730, uma proteína prevista de soja (Glycine max) de sequências de codificação previstas da sequência genômica de soja JGI Glyma1.01 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[047] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos correspondente a Glyma05g07800, uma proteína prevista de soja (Glycine max) de sequências de codificação previstas da sequência genômica de soja JGI Glyma1.01 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[048] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos correspondente a Glyma17g13210, uma proteína prevista de soja (Glycine max) de sequências de codificação previstas da sequência genômica de soja JGI Glyma1.01 do Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos Estados Unidos.

[049] SEQ ID NO: 18 é a sequência de nucleotídeos de um homólogo de fea3 de Ascelpias syriaca.

[050] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 18.

[051] SEQ ID NO: 20 é a sequência de nucleotídeos do alelo de referência fea3-0.

[052] SEQ ID NO: 21 é a sequência de proteínas de alelo de referência fea3-0 codificada por SEQ ID N° 20.

[053] SEQ ID NO: 22 é a sequência de nucleotídeos do mutante de EMS fea3-1.

[054] SEQ ID NO: 23 é a sequência de proteínas do alelo mutante EMS fea3-1, codificada pela sequência de nucleotídeos fornecida em SEQ ID N° 22.

[055] SEQ ID NO: 24 é a sequência de nucleotídeos do mutante de EMS fea3-2.

[056] SEQ ID NO: 25 é a sequência de proteínas do alelo mutante EMS fea3-2, codificada pela sequência de nucleotídeos fornecida em SEQ ID N° 24.

[057] SEQ ID NO: 26 é a sequência de nucleotídeos do mutante de EMS fea3-3.

[058] SEQ ID NO: 27 é a sequência de proteínas do alelo mutante EMS fea3-3, codificada pela sequência de nucleotídeos fornecida em SEQ ID N° 26.

[059] SEQ ID NO: 28 é a sequência de nucleotídeos do promotor de FEA3.

[060] SEQ ID NO: 29 é a sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo de sinal da proteína FEA3.

[061] SEQ ID NO: 30 é a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão RFP-FEA3.

[062] SEQ ID NO: 31 é a sequência de nucleotídeos da 3’-UTR de FEA3.

[063] SEQ ID NO: 32-38 são as sequências dos peptídeos (ZCL3, FCP1, CLV3, CLE20, CLE40, ZCL21 e ZCL23, respectivamente) utilizados para o teste de peptídeos CVL3/similares a CVL3 descrito no Exemplo 10.

[064] As descrições de sequências e a Listagem de Sequências anexas ao presente atendem às normas que regem descrições de sequências de aminoácidos e/ou nucleotídeos em pedidos de patente conforme estabelecido em 37 C. F. R. §1.821-1.825.

[065] A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical J. 219 (n° 2): 345-373 (1984), que são incorporados ao presente como referência. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. §1.822.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[066] O relatório descritivo de cada referência detalhada no presente é integralmente incorporado ao presente como referência.

[067] Da forma utilizada no presente e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Desta forma, por exemplo, referência a “uma planta” inclui uma série dessas plantas, referência a “uma célula” inclui uma ou mais células e seus equivalentes conhecidos dos técnicos no assunto e assim por diante.

[068] Da forma utilizada no presente:

[069] As expressões “monocotiledônea” e “planta monocotiledônea” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Uma monocotiledônea de acordo com a presente invenção inclui as gramíneas.

[070] As expressões “dicotiledônea” e “planta dicotiledônea” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Uma dicotiledônea de acordo com a presente invenção inclui as famílias a seguir: Brassicaceae, Leguminosae e Solanaceae.

[071] As expressões “complemento total” e “complemento com comprimento total” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam um complemento de uma dada sequência de nucleotídeos, em que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem na mesma quantidade de nucleotídeos e são 100% complementares.

[072] “Transgênico” designa qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta, cujo genoma foi alterado pela presença de um ácido nucleico heterólogo, tal como uma construção de DNA recombinante, incluindo os eventos transgênicos iniciais bem como os criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do evento transgênico inicial. O termo “transgênico”, da forma utilizada no presente, não engloba a alteração do genoma (cromossômico ou extracromossômico) por meio de métodos de cultivo de plantas convencionais ou de eventos de ocorrência natural tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[073] “Genoma”, da forma aplicável a células vegetais, engloba não apenas DNA cromossômico encontrado no núcleo, mas DNA de organelas encontrado em componentes subcelulares (tais como mitocôndrias, plastídeos) da célula.

[074] “Planta” inclui referência a plantas inteiras, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes, células de plantas e sua prole. Células vegetais incluem, sem limitações, células de sementes, cultivos em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesferas.

[075] “Prole” compreende qualquer geração subsequente de uma planta.

[076] “Planta transgênica” inclui referência a uma planta que compreende no seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Preferencialmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de forma estável ao genoma, de tal forma que o polinucleotídeo seja transmitido para as gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado ao genoma isoladamente ou como parte de uma construção de DNA recombinante.

[077] “Característica” designa uma característica fisiológica, morfológica, bioquímica ou física de uma planta ou célula ou material vegetal específico. Em alguns casos, esta característica é visível para o olho humano, tal como tamanho de sementes ou plantas, ou pode ser medida por meio de métodos bioquímicos, tais como detecção da proteína, amido ou teor de óleo de sementes ou folhas, ou por meio da observação de um processo metabólico ou fisiológico, por exemplo, medindo-se a tolerância à escassez de água ou concentrações específicas de sal ou açúcar, ou por meio da observação do nível de expressão de um ou mais genes ou de observações agrícolas tais como tolerância à tensão osmótica ou rendimento.

[078] “Característica agronômica” é um parâmetro mensurável que inclui, mas sem limitações, tamanho de meristemas de espigas, tamanho da borla, viço, rendimento, velocidade de crescimento, biomassa, peso fresco no amadurecimento, peso seco no amadurecimento, rendimento de frutos, rendimento de sementes, teor total de nitrogênio da planta, teor de nitrogênio dos frutos, teor de nitrogênio das sementes, teor de nitrogênio em um tecido vegetal, teor total de aminoácidos livres na planta, teor de aminoácidos livres em frutos, teor de aminoácidos livres em sementes, teor de aminoácidos livres em um tecido vegetal, teor total de proteína da planta, teor de proteína dos frutos, teor de proteína das sementes, teor de proteína em um tecido vegetal, tolerância à seca, absorção de nitrogênio, ramificação de raízes, biomassa de raiz, tropismo de raiz, índice de colheita, tropismo de caule, altura da planta, altura da espiga, comprimento da espiga, tolerância a sal, vigor inicial da muda e emergência das mudas sob tensão em baixa temperatura.

[079] “Heterólogo”, com relação a sequência, indica uma sequência que se origina de uma espécie exógena ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada da sua forma nativa em sua composição e/ou locus genômico por meio de intervenção humana deliberada.

[080] “Polinucleotídeo”, “sequência de ácidos nucleicos”, “sequência de nucleotídeos” e “fragmento de ácido nucleico” são utilizados de forma intercambiável e designam um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla e contém opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Nucleotídeos (normalmente encontrados na sua forma de 5’-monofosfato) são indicados pela sua designação de letra única conforme segue: “A” para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou desoxicitidilato, “G” para guanilato ou desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A, C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.

[081] “Polipeptídeo”, “peptídeo”, “sequência de aminoácidos” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável no presente para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são uma substância artificial análoga a um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “sequência de aminoácidos” e “proteína” também incluem modificações que incluem, mas sem limitações, glicosilação, ligação de lipídios, sulfatação, gamacarboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[082] “RNA mensageiro (mRNA)” indica o RNA que não contém introns e que pode ser traduzido em proteína pela célula.

[083] “cDNA” designa um DNA que é complementar a um modelo de mRNA que utiliza a enzima transcriptase reversa e é sintetizado a partir dele. O cDNA pode possuir fita simples ou ser convertido na forma de fita dupla utilizando o fragmento Klenow de DNA polimerase I.

[084] “Região codificadora” designa uma sequência de polinucleotídeos que, quando transcrita, processada e/ou traduzida, resulta na produção de uma sequência de polipeptídeos.

[085] Uma “Marca de Sequência Expressa” (“EST”) é uma sequência de DNA derivada de uma biblioteca de cDNA e, portanto, é uma sequência que foi transcrita. Um EST é tipicamente obtido por meio de uma única passagem de sequenciamento de um inserto de cDNA. A sequência de um inserto de cDNA completo é denominada “Sequência de Inserto Completo” (“FIS”). Uma sequência “contígua” é uma sequência montada com duas ou mais sequências que podem ser selecionadas, mas sem limitações, a partir do grupo que consiste em uma sequência EST, FIS e PCR. Uma sequência que codifica uma proteína inteira ou funcional é denominada “Sequência Genética Completa” (“CGS”) e pode ser derivada de um FIS ou contíguo.

[086] Proteína “madura” indica um polipeptídeo processado após a tradução; ou seja, do qual quaisquer pré ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primária tenham sido removidos.

[087] Proteína “precursora” designa o produto primário de tradução de mRNA; ou seja, com pré e pró-peptídeos ainda presentes. Pré e pró- peptídeos podem ser e não se limitam a sinais de localização intracelular.

[088] “Isolado” indica materiais, tais como moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas, que são substancialmente livres ou tenham sido removidos de outra forma de componentes que normalmente acompanham os materiais em um ambiente de ocorrência natural ou interagem com eles. Polinucleotídeos isolados podem ser purificados a partir de uma célula hospedeira na qual ocorrem naturalmente. Métodos convencionais de purificação de ácidos nucleicos conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para a obtenção de polinucleotídeos isolados. A expressão também engloba polinucleotídeos recombinantes e polinucleotídeos sintetizados quimicamente.

[089] “Recombinante” designa uma combinação artificial de dois segmentos de sequências separados de outra forma, tal como por meio de síntese química ou da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de métodos de engenharia genética. “Recombinante” também inclui referência a uma célula ou vetor que tenha sido modificada por meio da introdução de um ácido nucleico heterólogo ou uma célula derivada de uma célula modificada desta forma, mas não engloba a alteração da célula ou vetor por eventos de ocorrência natural (tais como mutação espontânea, transformação, transdução ou transposição natural) tais como os que ocorrem sem intervenção humana deliberada.

[090] “Construção de DNA recombinante” designa uma combinação de fragmentos de ácido nucleico que normalmente não são encontrados juntos na natureza. Consequentemente, uma construção de DNA recombinante pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de forma diferente da normalmente encontrada na natureza.

[091] As expressões “clone de entrada” e “vetor de entrada” são utilizadas de forma intercambiável no presente.

[092] “Sequências reguladoras” e “elementos reguladores” são utilizados de forma intercambiável e designam sequências de nucleotídeos localizadas acima no fluxo (sequências não codificadoras 5’), no interior ou abaixo no fluxo (sequências não codificadoras 3’) de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir, mas sem limitações, promotores, sequências líderes de tradução, introns e sequências de reconhecimento de poliadenilação. As expressões “sequência reguladora e "elemento regulador" são utilizadas de forma intercambiável no presente.

[093] “Promotor” designa um fragmento de ácido nucleico capaz de controlar a transcrição de outro fragmento de ácido nucleico.

[094] “Promotor funcional em uma planta” é um promotor capaz de controlar a transcrição em células vegetais, seja a sua origem ou não uma célula vegetal.

[095] “Promotor específico de tecido” e “promotor preferido por tecido” são utilizados de forma intercambiável e designam um promotor que é expresso predominante, mas não necessariamente de forma exclusiva em um tecido ou órgão, mas que pode também ser expresso em uma célula específica.

[096] “Promotor regulado por desenvolvimento” designa um promotor cuja atividade é determinada por eventos de desenvolvimento.

[097] “Ligado operacionalmente” designa a associação de fragmentos de ácidos nucleicos em um único fragmento, de tal forma que a função de um seja regulada pelo outro. Um promotor é ligado operacionalmente, por exemplo, a um fragmento de ácido nucleico quando for capaz de regular a transcrição daquele fragmento de ácido nucleico.

[098] “Expressão” designa a produção de um produto funcional. A expressão de um fragmento de ácido nucleico pode designar, por exemplo, a transcrição do fragmento de ácido nucleico (tal como a transcrição resultante em mRNA ou RNA funcional) e/ou a tradução de mRNA em uma proteína precursora ou madura.

[099] “Sobre-expressão” indica a produção de um produto genético em organismos transgênicos que excede os níveis de produção em organismos com segregação nula (ou não transgênicos) do mesmo experimento.

[100] “Fenótipo” indica as características detectáveis de uma célula ou organismo. a. “Introduzido”, no contexto da inserção de um fragmento de ácido nucleico (tal como uma construção de DNA recombinante) em uma célula, indica “transfecção”, “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado ao genoma da célula (tal como DNA de cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou mitocôndria), convertido em uma réplica autônoma ou expresso de forma transitória (tal como mRNA transfectado).

[101] “Célula transformada” é qualquer célula na qual foi introduzido um fragmento de ácido nucleico (tal como uma construção de DNA recombinante).

[102] “Transformação”, da forma utilizada no presente, designa transformação estável e transformação transitória.

[103] “Transformação estável” designa a introdução de um fragmento de ácido nucleico no genoma de um organismo hospedeiro que resulta em herança geneticamente estável. Uma vez transformado de forma estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado de forma estável ao genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente.

[104] “Transformação transitória” designa a introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro que resulte em expressão genética sem herança geneticamente estável.

[105] O termo “cruzado” ou “cruzamento” indica a fusão de gametas por meio de polinização para produzir prole (tais como células, sementes ou plantas). O termo engloba cruzamentos sexuados (polinização de uma planta por outra) e autocruzamento (autopolinização, tal como quando o pólen e o óvulo são da mesma planta). O termo “cruzamento” designa o ato de fundir gametas por meio de polinização para produzir prole.

[106] “Alelo favorável” é o alelo em um sítio específico que confere ou contribui com um fenótipo desejável, tal como aumento da capacidade de digestão da parede celular ou, alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas com redução da capacidade de digestão da parede celular que pode ser removido de um programa de cultivo ou plantio (“contrasseleção”). Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que é segregado com o fenótipo favorável ou, alternativamente, segrega com o fenótipo vegetal desfavorável, de forma a fornecer o benefício de identificação de plantas.

[107] O termo “introduzido” indica o fornecimento de ácidos nucleicos (tais como construção de expressão) ou proteínas em células. Introduzido inclui referência à incorporação de ácidos nucleicos em uma célula eucariótica ou procariótica em que o ácido nucleico pode ser incorporado ao genoma da célula e inclui referência ao fornecimento transitório de um ácido nucleico ou proteína à célula. Introduzido inclui referência a métodos de transformação transitória ou estável, bem como cruzamento sexual. “Introduzido”, no contexto da inserção de um fragmento de ácido nucleico (tal como uma construção de expressão/construção de DNA recombinante) em uma célula, indica, portanto, “transfecção”, “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado ao genoma da célula (tal como DNA de cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou mitocôndria), convertido em uma réplica autônoma ou expresso de forma transitória (tal como mRNA transfectado).

[108] “Construção de DNA de supressão” é uma construção de DNA recombinante que, quando transformada ou integrada de forma estável ao genoma da planta, resulta no “silenciamento” de um gene alvo na planta. O gene alvo pode ser endógeno ou transgênico para a planta. “Silenciamento”, da forma utilizada no presente com relação ao gene alvo, designa geralmente a supressão de níveis de mRNA ou proteína/enzima expressos pelo gene alvo e/ou do nível da atividade enzimática ou funcionalidade de proteína. Os termos “supressão” e “silenciamento”, utilizados de forma intercambiável no presente, incluem redução, diminuição, declínio, decréscimo, inibição, eliminação ou prevenção. “Silenciamento” ou “silenciamento genético” não especifica mecanismos e inclui, mas sem limitações, sem sentido, cossupressão, supressão viral, supressão de grampo de cabelo, supressão de haste e circuito, abordagens com base em RNAi e abordagens com base em RNA pequeno. O silenciamento pode ser dirigido a regiões de codificação ou regiões sem codificação, tais como introns, 5'-UTRs e 3'-UTRs, ou ambas.

[109] Uma construção de DNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene alvo de interesse e pode compreender, no todo ou em parte, a sequência de ácidos nucleicos da fita com sentido (ou fita sem sentido) do gene alvo de interesse. Dependendo da abordagem a ser utilizada, a região pode ser 100% idêntica ou menos de 100% idêntica (tal como pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica) à fita com sentido (ou fita sem sentido) do gene de interesse, no todo ou em parte.

[110] Construções de DNA de supressão são bem conhecidas na técnica, facilmente construídas ao selecionar-se o gene alvo de interesse e incluem, sem limitações, construções de cossupressão, construções sem sentido, construções de supressão viral, construções de supressão de grampo de cabelo, construções de supressão de haste e circuito, construções de produção de RNA com fita dupla e, de forma mais geral, construções de RNAi (interferência de RNA) e construções de RNA pequeno, tais como construções de siRNA (RNA de interferência curta) e construções de miRNA (microRNA).

[111] “Inibição sem sentido” indica a produção de transcritos de RNA sem sentido capazes de suprimir a expressão do gene alvo ou do produto genético. “RNA sem sentido” indica um transcrito de RNA que é complementar a um transcrito primário alvo ou mRNA, no todo ou em parte, e que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucleico isolado alvo (Patente Norte- Americana n° 5.107.065). A complementaridade de um RNA sem sentido pode dar-se com qualquer parte do transcrito genético específico, ou seja, na sequência não codificadora 5’, sequência não codificadora 3’, introns ou a sequência de codificação.

[112] “Cossupressão” indica a produção de transcritos de RNA com sentido capazes de suprimir a expressão do gene alvo ou produto genético. RNA “com sentido” designa o transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. Construções de cossupressão em plantas foram projetadas anteriormente por meio de concentração na sobre-expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que possui homologia para um mRNA nativo, na orientação com sentido, que resulta na redução de todo o RNA que possui homologia para a sequência sobre- expressa (vide Vaucheret et al., Plant J. 16: 651-659 (1998); e Gura, Nature 404: 804-808 (2000)). Construções de cossupressão podem conter sequências de regiões de codificação ou regiões sem codificação, tais como introns, 5’-UTRs e 3’-UTRs ou ambos.

[113] Outra variação descreve o uso de sequências virais de plantas para dirigir a supressão de sequências de codificação de mRNA próximas (Patente PCT n° WO 98/36083, publicada em vinte de agosto de 1998).

[114] Interferência de RNA designa o processo de silenciamento genético pós-tradução específico de sequências em animais mediado por RNAs interferentes curtos (siRNAs) (Fire et al., Nature 391: 806 (1998)). O processo correspondente em plantas é comumente denominado silenciamento genético pós-tradução (PTGS) ou silenciamento de RNA e também é denominado supressão em fungos. Acredita-se que o processo de silenciamento genético pós-transcrição seja um mecanismo de defesa celular conservado por evolução utilizado para evitar a expressão de genes exógenos e é comumente compartilhado por flora e filos diversos (Fire et al., Trends Genet. 15:358 (1999)).

[115] RNAs pequenos desempenham um papel importante no controle da expressão genética. A regulagem de muitos processos de desenvolvimento, incluindo a floração, é controlada por RNAs pequenos. Agora é possível elaborar alterações na expressão genética de genes de plantas utilizando construções transgênicas que produzem RNAs pequenos na planta.

[116] RNAs pequenos aparentemente funcionam por meio de emparelhamento de bases com sequências alvo de RNA ou DNA complementares. Quando ligados a RNA, RNAs pequenos acionam a divisão de RNA ou a inibição de tradução da sequência alvo. Quando ligados a sequências alvo de DNA, acredita-se que RNAs pequenos possam mediar a metilação de DNA da sequência alvo. A consequência desses eventos, independentemente do mecanismo específico, é a inibição da expressão genética.

[117] MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificadores com cerca de 19 a cerca de 24 nucleotídeos (nt) de comprimento que foram identificados em animais e plantas (Lagos-Quintana et al., Science 294: 853-858 (2001), Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12: 735-739 (2002); Lau et al., Science 294: 858-862 (2001); Lee e Ambros, Science 294: 862-864 (2001); Llave et al., Plant Cell 14: 1605-1619 (2002); Mourelatos et al., Genes Dev. 16: 720-728 (2002); Park et al., Curr. Biol. 12: 1484-1495 (2002); Reinhart et al., Genes Dev. 16: 1616-1626 (2002)). Eles são processados a partir de transcritos precursores mais longos que variam de tamanho de cerca de 70 a 200 nt e esses transcritos precursores possuem a capacidade de formar estruturas de grampos de cabelo estáveis.

[118] MicroRNAs (miRNAs) aparentemente regulam genes alvo por meio de ligação a sequências complementares localizadas nos transcritos produzidos por esses genes. Parece provável que miRNAs possam iniciar pelo menos dois trajetos de regulagem de genes alvo: (1) inibição da tradução; e (2) divisão de RNA. MicroRNAs que iniciam o processo de divisão de RNA são análogos aos RNAs interferentes curtos (siRNAs) de 21 a 25 nt gerados durante interferência de RNA (RNAi) em animais e silenciamento genético pós-tradução (PTGS) em plantas e provavelmente são incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que é similar ou idêntico ao observado para RNAi.

[119] O termo “locus” designa, de forma geral, uma região geneticamente definida de um cromossomo que conduz um gene ou, possivelmente, dois ou mais genes ligados tão de perto que geneticamente comportam-se como um único locus responsável por um fenótipo. Quando utilizado no presente com relação a Fea3, “locus Fea3” deverá designar a região definida do cromossomo que conduz o gene Fea3 e inclui as suas sequências reguladoras associadas.

[120] “Gene” deverá designar uma região codificadora genética específica dentro de um locus, incluindo as suas sequências reguladoras associadas. Os técnicos comuns no assunto compreenderiam que as sequências reguladoras associadas estarão dentro de uma distância de cerca de 4 kb da sequência de codificação Fea3, com o promotor localizado acima no fluxo.

[121] “Germoplasma” designa o material genético de um indivíduo (tal como uma planta), um grupo de indivíduos (tal como uma linhagem, variedade ou família de plantas) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultivo. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, ou pode ser separado do organismo ou célula. Geralmente, o germoplasma fornece material genético com composição molecular específica que fornece uma base física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultivo celular. Da forma utilizada no presente, germoplasma inclui células, sementes ou tecidos dos quais podem ser cultivadas novas plantas ou partes de plantas, tais como folhas, hastes, pólen ou células que podem ser cultivadas em uma planta inteira.

[122] Cálculos de percentual de identidade e alinhamentos de sequências podem ser determinados utilizando uma série de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas, incluindo, mas sem limitações, o programa Megalign® da suíte de computação bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison WI). A menos que indicado em contrário, o alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente foi realizado utilizando o método de alinhamento Clustal W.

[123] O método de alinhamento Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign® v6.1 da suíte de computação bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis.). Os parâmetros padrão de alinhamento múltiplo correspondem a PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 0,2, Sequências Divergentes de Atraso (%) = 30, Peso de Transição de DNA = 0,5, Matriz em Peso de Proteína = Série Gonnet, Matriz em Peso de DNA = IUB. Para alinhamentos em pares, os parâmetros padrão são Alinhamento = Lento- Preciso, Penalidade do Intervalo = 10,0, Penalidade do Comprimento do Intervalo = 0,10, Matriz em Peso de Proteínas = Gonnet 250 e Matriz em Peso de DNA = IUB.

[124] Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal W, é possível obter valores de “percentual de identidade” e “divergência” observando-se a tabela “distâncias de sequências” no mesmo programa; a menos que indicado em contrário, os percentuais de identidade e divergências fornecidos e reivindicados no presente foram calculados desta forma.

[125] A presente invenção inclui os polinucleotídeos e polipeptídeos isolados a seguir: a. Polinucleotídeo isolado que compreende: (i) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência de pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, com base no método de alinhamento Clustal W, em comparação com SEQ ID NO: 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27; ou (ii) um complemento total da sequência de ácidos nucleicos de (i), em que o complemento completo e a sequência de ácidos nucleicos de (i) consistem da mesma quantidade de nucleotídeos e são 100% complementares. Qualquer um dos polinucleotídeos isolados acima pode ser utilizado em qualquer construção de DNA recombinante (incluindo construções de DNA de supressão) de acordo com a presente invenção. O polipeptídeo é preferencialmente um polipeptídeo FEA3. O polipeptídeo possui preferencialmente atividade de FEA3. b. Polipeptídeo isolado que contém uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência de pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, com base no método de alinhamento Clustal W, em comparação com SEQ ID NO: 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27. O polipeptídeo é preferencialmente um polipeptídeo FEA3. O polipeptídeo possui preferencialmente atividade de FEA3. c. Polinucleotídeo isolado que compreende (i) uma sequência de ácidos nucleicos com identidade de sequência de pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, com base no método de alinhamento Clustal W, em comparação com SEQ ID NO:° 1,2, 4, 18, 20, 22, 24 ou 26; ou (ii) um complemento total da sequência de ácidos nucleicos de (i). Qualquer um dos polinucleotídeos isolados acima pode ser utilizado em qualquer construção de DNA recombinante (incluindo construções de DNA de supressão) de acordo com a presente invenção. O polipeptídeo é preferencialmente um polipeptídeo FEA3. O polipeptídeo possui preferencialmente atividade de FEA3. d. Polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos, em que a sequência de nucleotídeos pode ser hibridizada sob condições estringentes com uma molécula de DNA que compreende o complemento completo de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 18, 20, 22, 24 ou 26. O polipeptídeo é preferencialmente um polipeptídeo FEA3. O polipeptídeo possui preferencialmente atividade de FEA3. e. Polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos, em que a sequência de nucleotídeos é derivada de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 18, 20, 22, 24 ou 26 por meio de alteração de um ou mais nucleotídeos em pelo menos um método selecionado a partir do grupo que consiste em: exclusão, substituição, adição e inserção. O polipeptídeo é preferencialmente um polipeptídeo FEA3. O polipeptídeo possui preferencialmente atividade de FEA3. f. Polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos, em que a sequência de nucleotídeos corresponde a um alelo de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 18, 20, 22, 24 ou 26.

[126] Em uma realização, a presente invenção inclui construções de DNA recombinantes (incluindo construções de DNA de supressão). A construção de DNA recombinante (incluindo construções de DNA de supressão) pode compreender um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção ligado operacionalmente, em orientação sense ou antisense, a pelo menos uma sequência reguladora (tal como um promotor funcional em uma planta). O polinucleotídeo pode compreender 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 18, 20, 22, 24 ou 26. O polinucleotídeo pode codificar um polipeptídeo de acordo com a presente invenção.

[127] Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a seguir, “Sambrook”).

[128] Os técnicos no assunto compreendem bem que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais.

[129] Promotores que podem ser utilizados para a presente invenção incluem, mas sem limitações, promotores específicos de meristema apical de brotos e promotores preferidos de meristema apical de brotos. O promotor knotted1 de milho e promotores de genes que são conhecidamente expressos em SAM de milho podem ser utilizados para expressar os polinucleotídeos descritos na presente invenção. Exemplos destes incluem, mas sem limitações, Zm phabulosa, terminal ear1, cobertura bruta2, folha enrolada1, zyb14, cobertura estreita (Ohtsu, K. et al. (2007), Plant Journal 52, 391-404). Promotores de ortólogos desses genes de outras espécies podem também ser utilizados para a presente invenção.

[130] Exemplos de promotores de Arabidopsis de genes com expressão preferida de SAM incluem, mas sem limitações, clv3, similar a tegumento ain (ail5, ail6 e ail7) e similar a espiga terminal1, clavata1, wus, sem meristema de brotos, flor terminal1 (Yadav et al. (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 24 de março).

[131] A Patente PCT n° WO 2004/071467 e a Patente Norte- Americana n° 7.129.089 descrevem a síntese de diversas combinações de conjuntos promotores/genes/terminais por meio da ligação de promotores individuais, genes e terminais de transcrição entre si em combinações exclusivas. Geralmente, um locus NotI ladeado pelo promotor apropriado é utilizado para clonar o gene desejado. Locus NotI podem ser adicionados a um gene de interesse utilizando amplificação de PCR com oligonucleotídeos projetados para introduzir locus NotI nas extremidades 5’ e 3’ do gene. O produto de PCR resultante é digerido em seguida com NotI e clonado em um conjunto promotor/NotI/terminal apropriado. Embora a clonagem genética em conjuntos de expressão seja frequentemente realizada utilizando a enzima de restrição NotI, os técnicos no assunto podem apreciar que diversas enzimas de restrição podem ser utilizadas para atingir o conjunto desejado. Além disso, os técnicos no assunto apreciarão que outros métodos de clonagem, incluindo, mas sem limitações, métodos com base em PCR ou com base em recombinação podem ser utilizados para gerar conjuntos de expressão apropriados.

[132] Além disso, WO 2004/071467 e a Patente Norte-Americana n° 7.129.089 descrevem a ligação adicional entre si de conjuntos promotores/genes/términos de transcrição individuais em combinações e orientações exclusivas, além de conjuntos marcadores selecionáveis apropriados, a fim de obter a expressão fenotípica desejada. Embora isso seja realizado principalmente utilizando diferentes locus de enzimas de restrição, os técnicos no assunto podem apreciar que diversos métodos podem ser utilizados para atingir as orientações ou combinação de promotor/gene/término de transcrição desejadas. Ao fazê-lo, pode ser atingida qualquer combinação e orientação de conjuntos de promotores/genes/términos de transcrição específicos de meristema apical de brotos. Os técnicos no assunto podem também apreciar que esses conjuntos podem ser localizados sobre fragmentos de DNA individuais ou sobre diversos fragmentos nos quais a coexpressão de genes é o resultado de cotransformação de diversos fragmentos de DNA.

[133] A expressão “arquitetura de raízes” designa a disposição das diferentes partes que compreendem a raiz. As expressões “arquitetura de raízes”, “estrutura de raízes”, “sistema de raízes” ou “arquitetura de sistema de raízes” são utilizadas de forma intercambiável no presente.

[134] Da forma indicada no presente, alterações de “tropismo de raiz”, “ramificação de raízes” e “biomassa de raiz” são exemplos de alterações da “arquitetura de raízes”.

[135] Geralmente, a primeira raiz de uma planta que se desenvolve a partir do embrião é denominada raiz primária. Na maior parte das dicotiledôneas, a raiz primária é denominada raiz mestra. Essa raiz principal cresce para baixo e gera raízes em ramos (laterais). Em monocotiledôneas, a raiz primária da planta ramifica-se, gerando um sistema de raízes fibrosas.

[136] A expressão “arquitetura de raízes alterada” designa aspectos de alterações das diferentes partes que compõem o sistema de raízes em diferentes estágios do seu desenvolvimento em comparação com uma planta controle ou de referência. Compreende-se que a arquitetura de raízes alterada engloba alterações em um ou mais parâmetros mensuráveis, que incluem, mas sem limitações, o diâmetro, comprimento, número, ângulo ou superfície de uma ou mais das partes do sistema de raízes, incluindo, mas sem limitações, a raiz primária, raiz lateral ou ramo, raiz acidental e pelos de raízes, todos os quais se encontram dentro do escopo da presente invenção. Essas mudanças podem gerar uma alteração geral na área ou volume ocupado pela raiz.

[137] Os técnicos comuns no assunto são familiares com protocolos de determinação de alterações da arquitetura de raízes de plantas. Plantas de milho do tipo selvagem e mutante, por exemplo, podem ser testadas para determinar alterações na arquitetura de raízes na etapa de mudas, tempo de floração ou maturidade.

[138] Alterações na arquitetura de raízes podem ser determinadas por meio de contagem dos números de raízes de nós nos três ou quatro nós superiores das plantas cultivadas em estufa ou da largura da faixa de raízes.

[139] “Faixa de raízes” designa a largura da esteira de raízes no fundo de um vaso na maturidade da planta. Outras medidas de alterações na arquitetura de raízes incluem, mas sem limitações, o número de raízes laterais, diâmetro médio de raízes de nós, diâmetro médio de raízes laterais, número e comprimento dos pelos de raízes.

[140] A extensão da ramificação de raízes laterais (tais como número de raízes laterais e comprimento de raízes laterais) pode ser determinada por meio de subamostragem de um sistema de raízes completo, formação de imagens com um scanner de leito plano ou uma câmera digital e análise com software WinRHIZO® (Regent Instruments Inc.).

[141] Tropismo de raiz é a medida de plantas que não sofrem tropismo de raiz; plantas que se inclinam do eixo vertical em um ângulo de cerca de trinta graus ou mais seriam contadas como plantas que sofreram tropismo de raiz.

[142] Pode-se também avaliar alterações do tropismo de raiz, biomassa de raiz e ramificação de raízes pela capacidade da planta de aumentar o rendimento em testes de campo em comparação, sob as mesmas condições, com uma planta controle ou de referência.

[143] Os dados tomados sobre fenótipo de raízes são submetidos a análises estatísticas, normalmente um teste t para comparar as raízes transgênicas com as de plantas de prole não transgênicas. ANOVA de uma via pode também ser utilizado em casos em que diversos eventos e/ou construções são envolvidos na análise.

[144] Pode-se também avaliar alterações de tropismo de raiz, biomassa de raiz e ramificação de raízes pela capacidade da planta de manter rendimento substancial (preferencialmente rendimento de pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) em testes de campo sob condições de tensão (tais como abundância ou limitação de nutrientes, abundância ou limitação de água, presença de doença) em comparação com o rendimento de uma planta controle ou de referência sob condições sem tensão. O gene FEA3 ou “espiga fasciada3” do tipo selvagem codifica uma proteína similar a receptor de repetição rico em leucina (LRR-RLP) previsto que consiste de 506 aminoácidos. As expressões “gene FEA3 do tipo selvagem”, “gene wt FEA3”, “gene Fea3” e “gene FEA3” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Arabidopsis contém três ortólogos de FEA3 At3g25670, At1g13230 e At1g68780.

[145] LRR-RLPs constituem uma grande classe de proteínas que contêm LRR (Wang, G. et al. (2010), Critical Reviews in Plant Science, 29: 285299). Estruturalmente, LRR-RLPs podem ser divididos nos sete domínios distintos a seguir: um peptídeo de sinal, um domínio rico em cisteína, o domínio LRR extracelular (eLRR), um domínio variável, um domínio ácido, um domínio transmembrana e uma região citoplasmática curta (Jones e Jones (1997), Adv. Bot. Res. 24: 89-167). O domínio C que contém LRR é composto de três subdomínios com um subdomínio de ilha não LRR (C2) que interrompe subdomínios eLRR C1 e C3, embora nem todos os RLPs contenham uma ilha C2 (Wang, G. et al. (2008), Plant Physiol. 147: 503-517).

[146] Nossa análise de mutantes duplos fea2/fea3 indicam que fea2 e fea3 agem em processos independentes.

[147] Nossa análise de mutantes duplas td1/fea3 indicam que td1 e fea3 agem em processos independentes.

[148] O termo fasciação, do latim fascis, que significa feixe, descreve variações na forma da planta resultantes do crescimento proliferativo.

[149] Plantas com mutações fea3, em que a mutação resulta em perda da função de FEA3 ou perda de expressão de FEA3 também são denominadas “plantas fea3" ou "plantas null para fea3". “Plantas null para fea3” exibem o “fenótipo fea3” ou o “fenótipo nulo para fea3”. Plantas fea3 desenvolvem meristemas maiores durante a inflorescência e o desenvolvimento de brotos florais e meristemas de inflorescência de espigas exibem fasciação severa, o que sugere que fea3 normalmente age para limitar o crescimento desses meristemas.

[150] Plantas com mutações fea3 fracas, em que a mutação resulta em perda parcial da função de fea3 ou perda parcial de expressão de fea3 também são denominadas “plantas fea3 com fenótipo de fea3 fraco". “Plantas fea3 fracas” exibem o “fenótipo fea3 fraco”. Plantas fea3 com alelos fea3 fracos exibem fenótipo similar às plantas null para fea3, mas em menor quantidade. Plantas fea3 com alelos de fea3 fracos podem também exibir fenótipo nulo para fea3 parcial, ou seja, pode não exibir todas as características null para fea3. “Alelos de fea3 fracos”, da forma indicada no presente, são variantes fea3 ou variantes de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4, que conferem fenótipo fea3 fraco sobre a planta.

[151] Plantas com mutações fea3 que exibem “fenótipo fea3 nulo” ou “fenótipo fea3 fraco” são denominadas no presente plantas com “fenótipo fea3 mutante”.

[152] A expressão “mutação negativa dominante”, da forma utilizada no presente, designa uma mutação que possui um produto genético alterado que age de forma antagônica ao alelo do tipo selvagem. Estas mutações normalmente resultam em função molecular alterada (frequentemente inativa) e são caracterizadas por um fenótipo “negativo dominante”. Uma variante genética, um gene que sofreu mutação ou um alelo que confere “fenótipo negativo dominante” conferiria um fenótipo “nulo” ou “que sofreu mutação” sobre a célula hospedeira mesmo na presença de um alelo do tipo selvagem.

[153] Da forma utilizada no presente, um polipeptídeo (ou polinucleotídeo) com “atividade de FEA3” designa um polipeptídeo (ou polinucleotídeo) que, quando expresso em uma “linhagem mutante fea3" que exibe o “fenótipo mutante fea3”, é capaz de resgatar total ou parcialmente o fenótipo mutante fea3.

[154] As expressões “embaralhamento genético” e “evolução dirigida” são utilizadas de forma intercambiável no presente. O método de “embaralhamento genético” consiste em iterações de comutação de DNA seguidas por classificação e/ou seleção apropriada para gerar variantes de ácidos nucleicos FEA3 ou suas partes que possuem atividade biológica modificada (Castle et al. (2004), Science 304 (5674): 1151-4; Patentes Norte- Americanas n° 5.811.238 e 6.395.547).

[155] “TILLING” ou “Lesões Locais Induzidas em Genomas” designa uma tecnologia de mutagênese útil para gerar e/ou identificar e eventualmente isolar variantes mutagenizadas de um ácido nucleico específico com atividade e/ou expressão modulada (McCallum et al. (2000), Plant Physiology 123: 439-442; McCallum et al. (2000), Nature Biotechnology 18: 455457; e Colbert et al. (2001), Plant Physiology 126: 480-484).

[156] TILLING combina mutações pontuais de alta densidade com rápida detecção sensível das mutações. Tipicamente, metanossulfonato de etila (EMS) é utilizado para mutagenizar sementes vegetais. EMS alquila guanina, que tipicamente gera desemparelhamento. Sementes são embebidas, por exemplo em uma solução de cerca de 10-20 mM de EMS por cerca de dez a vinte horas; as sementes são lavadas e cultivadas em seguida. As plantas desta geração são conhecidas como M1. Plantas M1 são autofertilizadas em seguida. Mutações que estão presentes em células que formam os tecidos reprodutivos são herdadas pela geração seguinte (M2). Tipicamente, plantas M2 são selecionadas para determinar a mutação no gene desejado e/ou fenótipos específicos.

[157] TILLING também permite a seleção de plantas que conduzem variantes mutantes. Essas variantes mutantes podem exibir expressão modificada, seja em resistência ou no local ou no tempo (caso, por exemplo, as mutações afetem o promotor). Essas variantes mutantes podem também exibir atividade de EA3 mais baixa que a exibida pelo gene na sua forma natural. TILLING combina mutagênese de alta densidade com métodos de seleção de alto rendimento. As etapas seguidas tipicamente em TILLING são: (a) mutagênese de EMS (Redei, G. P. e Koncz, C. (1992) em Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C., Chua, N. H., Schell, J., eds., Cingapura, World Scientific Publishing Co., págs. 16-82; Feldmann et al. (1994) em Meyerowitz, E. M., Somerville, C. R., eds., Arabidopsis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, págs. 137-172; Lightner, J. e Caspar, T. (1998) em J. Martinez-Zapater, J. Salinas, eds., Methods on Molecular Biology, Vol. 82, Humana Press, Totowa NJ, págs. 91-104); (b) preparação de DNA e reunião de indivíduos; (c) amplificação por PCR de uma região de interesse; (d) desnaturação e combinação para permitir a formação de heteroduplex; (e) DHPLC, em que a presença de um heteroduplex em um conjunto é detectada como pico adicional no cromatograma; (f) identificação do indivíduo mutante; e (g) sequenciamento do produto de PCR mutante. Métodos de TILLING são bem conhecidos na técnica (Patente Norte-Americana n° 8.071.840).

[158] Outros métodos mutagênicos podem também ser empregados para introduzir mutações no gene FEA3. São bem conhecidos os métodos de introdução de mutações genéticas em genes vegetais e seleção de plantas com características desejadas. Sementes ou outro material vegetal podem, por exemplo, ser tratadas com uma substância química mutagênica, de acordo com métodos padrão. Essas substâncias químicas incluem, mas sem limitações, as seguintes: sulfato de dietila, etileno imina e N-nitroso-N-etilureia. Alternativamente, pode-se utilizar radiação ionizante de fontes tais como raios X ou raios gama.

[159] Outros métodos de detecção para detectar mutações no gene FEA3 podem ser empregados, tais como eletroforese capilar (por exemplo, eletroforese capilar desnaturante constante e polimorfismo de conformação de fita simples). Em outro exemplo, heteroduplex podem ser detectados utilizando enzimologia de reparo sem coincidência (tal como endonuclease CELI de aipo). CELI reconhece uma falta de coincidência e é dividido no lado 3’ da falta de coincidência. A posição base precisa da falta de coincidência pode ser determinada por meio de corte com a enzima de reparo de falta de coincidência seguido, por exemplo, por eletroforese de gel de desnaturação. Vide, por exemplo, Oleykowski et al. (1998), Mutation Detection Using a Novel Plant Endonuclease, Nucleic Acid Res. 26: 4597-4602; e Colbert et al. (2001), High- Throughput Screening for Induced Point Mutations, Plant Physiology 126: 480484.

[160] A planta que contém o gene fea3 que sofreu mutação pode ser cruzada com outras plantas para introduzir a mutação em outra planta. Isso pode ser realizado utilizando métodos de cultivo padrão.

[161] A recombinação homóloga permite a introdução em um genoma de um ácido nucleico selecionado em posição selecionada definida. Demonstrou-se recombinação homóloga em plantas. Vide, por exemplo, Puchta et al. (1994), Experientia 50: 277-284; Swoboda et al. (1994), EMBO J. 13: 484489; Offringa et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 7346-7350; Kempin et al. (1997), Nature 389: 802-803; e Terada et al. (2002), Nature Biotechnology, 20 (10): 1030-1034).

[162] Métodos de realização de recombinação homóloga em plantas foram descritos não apenas para plantas modelo (Offringa et al. (1990), EMBO J., outubro; 9 (10): 3077-84), mas também para plantas de safra, tais como arroz (Terada, R., Urawa, H., Inagaki, Y., Tsugane, K., Iida, S., Nat. Biotechnol. 2002; Iida e Terada: Curr. Opin. Biotechnol., abril de 2004; 15 (2): 1328). O ácido nucleico a ser dirigido (que pode ser ácido nucleico FEA3 ou uma de suas variantes conforme definido acima) não necessita ser dirigido ao locus do gene FEA3, respectivamente, mas pode ser introduzido, por exemplo, em regiões de alta expressão. O ácido nucleico a ser dirigido pode ser alelo fea3 fraco ou um alelo negativo dominante utilizado para substituir o gene endógeno ou pode ser introduzido adicionalmente ao gene endógeno.

[163] Elementos transponíveis podem ser divididos em duas classes amplas com base no seu modo de transporte. Estas são denominadas Classe I e Classe II; ambas possuem aplicação como mutagenes e vetores de fornecimento. Elementos transponíveis classe I são transpostos por um intermediário de RNA e utilizam transcriptases reversas, ou seja, eles são retroelementos. Existem pelo menos três tipos de elementos transponíveis da Classe I, tais como retrotransposons, retropossons e elementos similares a SINE. Retrotransposons tipicamente contêm LTRs e genes que codificam proteínas de revestimento viral (gag) e genes de transcriptase reversa, RnaseH, integrase e polimerase (pol). Numerosos retrotransposons foram descritos em espécies vegetais. Esses retrotransposons mobilizam e translocam-se por meio de um intermediário de RNA em uma reação catalisada por transcriptase reversa e RNase H codificado pelo transposon. Exemplos enquadram-se nos grupos TyI- cópia e Ty3-gypsy bem como nas classificações similares a SINE e similares a LINE (Kumar e Bennetzen (1999), Annual Review of Genetics 33: 479). Além disso, elementos transponíveis de DNA tais como Ac, TamI e En/Spm também são encontrados em uma ampla variedade de espécies vegetais e podem ser utilizados na presente invenção. Transposons (e elementos IS) são ferramentas comuns de introdução de mutações em células vegetais.

[164] O meristema apical de brotos (SAM) regula o seu tamanho durante o desenvolvimento por meio de equilíbrio entre a proliferação de células haste e a incorporação de células filhas em primórdios. Diversos mutantes “fasciados” com meristemas ampliados foram identificados em milho e podem ser utilizados para estudar a base genética de regulagem do tamanho de meristemas. Dois genes de milho, anão de borla espessa1 (td1; Bommert et al. (2005), Development 132: 1235-1245) e espiga fasciada2 (fea2; Taguchi- Shiobara et al. (2001), Genes Dev. 65 15: 2755-2766), são homólogos aos genes receptores de repetição rica em leucina de Arabidopsis (LRR) CLAVATA1 (CLV1) e CLAVATA2 (CLV2), respectivamente. Previu-se que CLV1 e CLV2 formam um complexo receptor que é ativado pelo ligante CLV3 e reprime o fator de transcrição promotor de células haste WUSCHEL. Análise de mutantes duplos fea2/td1 sugeriu, entretanto, que o modelo correceptor CLV1-CLV2 básico é provavelmente mais complexo, pois o mutante duplo fea2/td1 exibiu fenótipo mais severo que qualquer mutante isolado. Análise recente em Arabidopsis revelou que a ação separada de três complexos receptores principais (CLV1-BAM1 (QUASE NENHUM MERISTEMA1), CLV2-CRN (CORINA) e RPK2/TOAD2 (QUINASE DE PROTEÍNA SIMILAR A RECEPTOR 2/FERRAMENTA TOAD2)) é necessária para controle adequado do tamanho de meristema em Arabidopsis.

[165] Apresentamos no presente uma caracterização fenotípica e molecular do mutante de milho fea3 que causa a proliferação excessiva do meristema de inflorescência, gerando meristemas ampliados ou fasciados. Clonamos o gene fea3 utilizando uma abordagem de clonagem com base em mapas e o mutante resulta de uma inserção de um retrotransposon parcial em um éxon do locus fea3. Confirmamos esta identidade por meio de isolamento de três alelos adicionais de fea3 derivados de mutagênese de EMS dirigida. O gene FEA3 codifica uma proteína similar a receptor de repetição rica em leucina prevista, relativa a fea2. Hibridização in situ e plantas transgênicas marcadas com Proteína Fluorescente Vermelha demonstram que FEA3 é expresso no centro organizador de SAM e também é expresso no meristema apical de raízes. FEA3 está localizado na membrana de plasma. Para determinar se FEA3 reage a um peptídeo relativo a CLV3 (CLE), testamos a sua sensibilidade a diferentes peptídeos. Os mutantes fea3 exibiram redução da sensibilidade a peptídeos, mas, de forma interessante, eles reagiram a um peptídeo CLE diferente em comparação com FEA2. Mutantes duplas de fea2/fea3 e td1/fea3 possuem fenótipos fasciados aditivos e sinérgicos em espiga e borla, o que indica que eles agem em processos independentes que convergem sobre o mesmo alvo abaixo no fluxo para controlar o tamanho de meristema. Consequentemente, a função de FEA3 como proteína receptora encontra-se em um novo caminho distinto de TD1 e FEA2.

REALIZAÇÕES:

[166] Em uma realização, a variante fea3 que pode ser utilizada nos métodos de acordo com a presente invenção é uma ou mais das variantes de ácidos nucleicos fea3 a seguir: (i) uma parte de uma sequência de ácidos nucleicos fea3 (SEQ ID NO: 1, 2 ou 4); (ii) uma sequência de ácidos nucleicos capaz de hibridizar-se com uma sequência de ácidos nucleicos fea3 (SEQ ID NO: 1, 2 ou 4); (iii) uma variante dividida de uma sequência de ácidos nucleicos fea3 (SEQ ID NO: 1, 2 ou 4); (iv) uma variante alélica de ocorrência natural de uma sequência de ácidos nucleicos fea3 (SEQ ID NO: 1, 2 ou 4); (v) uma sequência de ácidos nucleicos fea3 obtida por meio de embaralhamento genético; (vi) uma sequência de ácidos nucleicos fea3 obtida por meio de mutagênese sítio-dirigida; e (vii) uma variante fea3 obtida e identificada por meio do método TILLING.

[167] Em uma realização, os níveis de expressão de FEA3 endógeno podem ser reduzidos em uma célula vegetal por construções sem sentido, construções com sentido, construções de silenciamento de RNA, interferência de RNA, microRNAs artificiais e rompimentos genômicos. Exemplos de rompimento genômico incluem, mas sem limitações, rompimentos induzidos por transposons, Tilling e recombinação homóloga.

[168] Em uma realização, pode ser utilizado um precursor de miRNA vegetal modificado, em que o precursor foi modificado para substituir a região de codificação de miRNA por uma sequência projetada para produzir miRNA dirigido a FEA3. O precursor também é modificado na sequência de fita estrela para corresponder a mudanças na região de codificação de miRNA.

[169] Em uma realização, uma variante de ácido nucleico de FEA3 útil nos métodos de acordo com a presente invenção é uma variante de ácido nucleico obtida por meio de embaralhamento genético.

[170] Em uma realização, uma modificação genética pode também ser introduzida no locus de um gene FEA3 de milho utilizando o método TILLING (Lesões Locais Induzidas em Genomas).

[171] Em uma realização, pode-se utilizar mutagênese sítio- dirigida para gerar variantes de ácidos nucleicos fea3. Diversos métodos são disponíveis para atingir mutagênese sítio-dirigida, em que os mais comuns são métodos com base em PCR (Patente Norte-Americana n° 7956240).

[172] Em uma realização, pode-se também utilizar recombinação homóloga para desativar ou reduzir a expressão de gene FEA3 endógeno em plantas.

[173] Pode-se utilizar recombinação homóloga para induzir modificações genéticas dirigidas voltadas especificamente para o gene FEA3 in vivo. Mutações em partes selecionadas da sequência genética FEA3 (incluindo 5’ acima no fluxo, 3’ abaixo no fluxo e regiões intragênicas) tais como as fornecidas no presente são elaboradas in vitro e introduzidas na planta desejada utilizando métodos padrão. Recombinação homóloga entre o gene fea3 que sofreu mutação introduzido e o gene FEA3 endógeno alvo geraria substituição dirigida do gene de tipo selvagem em plantas transgênicas, o que resulta na supressão da expressão ou atividade de FEA3.

[174] Em uma realização, moléculas de RNA catalíticas ou ribozimas podem também ser utilizadas para inibir a expressão de gene FEA3. É possível projetar ribozimas que se emparelham especificamente com virtualmente qualquer RNA alvo e dividem a estrutura de fosfodiéster em um locus específico, de forma a desativar funcionalmente o RNA alvo. Ao conduzir essa divisão, a ribozima não é alterada por si própria e, portanto, é capaz de reciclar e dividir outras moléculas. A inclusão de sequências de ribozima em RNAs sem sentido confere atividade de divisão de RNA a elas, de forma a aumentar a atividade das construções. Foram identificadas diversas classes de ribozimas. Uma classe de ribozimas, por exemplo, é derivada de uma série de pequenos RNAs circulares que são capazes de autodivisão e reprodução em plantas. Os RNAs podem reproduzir-se sozinhos (RNAs viroides) ou com um vírus auxiliar (RNAs satélite). Exemplos de RNAs incluem RNAs de viroide da mancha do sol do abacate e os RNAs satélite de vírus da mancha anelar do fumo, vírus de faixas transitórias da alfafa, vírus mosaico do fumo de veludo, vírus mosaico de Solanum nodiflorum e vírus mosaico de trevo subterrâneo. O projeto e o uso de ribozimas específicas de RNA alvo foram descritos. Vide, por exemplo, Haseloff et al. (1988) Nature, 334: 585-591.

[175] Outro método de desativação do gene FEA3 é a inibição da expressão por meio de supressão com sentido. Demonstrou-se que a introdução de conjuntos de expressão nos quais um ácido nucleico é configurado na orientação com sentido com relação ao promotor é um meio eficaz de bloqueio da transcrição de um gene alvo desejado (Napoli et al. (1990), The Plant Cell 2: 279-289 e Patentes Norte-Americanas n° 5.034.323, 5.231.020 e 5.283.184).

[176] Em uma realização, o gene FEA3 pode também ser desativado, por exemplo, por meio de desativação genética com base em transposons.

[177] Em uma realização, a etapa de desativação compreende a produção de uma ou mais mutações na sequência genética FEA3, em que uma ou mais mutações na sequência genética FEA3 compreendem uma ou mais inserções de transposons, de forma a desativar o gene FEA3 em comparação com uma planta controle correspondente. A mutação pode compreender, por exemplo, um rompimento homozigótico no gene FEA3 ou uma ou mais mutações compreendem um rompimento heterozigótico no gene FEA3.

[178] Estes elementos genéticos móveis são fornecidos para as células, por exemplo, por meio de cruzamento sexual, a transposição é selecionada e os mutantes de inserção resultantes são selecionados, por exemplo, de acordo com um fenótipo de interesse. Plantas que compreendem genes fea3 rompidos podem ser cruzadas com uma planta do tipo selvagem. Pode-se utilizar qualquer um dentre uma série de métodos de cultivo padrão, dependendo da espécie a sofrer cruzamento. A localização de um TN (transposon) dentro do genoma de uma planta isolada ou recombinante pode ser determinada por meio de métodos conhecidos, tais como sequenciamento de regiões laterais conforme descrito no presente. Pode-se utilizar, por exemplo, uma reação de PCR da planta para amplificar a sequência, que pode ser sequenciada em forma de diagnóstico em seguida para confirmar a sua origem. Opcionalmente, os mutantes de inserção são selecionados em busca de um fenótipo desejado, tal como a inibição da expressão ou atividade de fea3 ou alteração de uma característica agronômica.

EXEMPLOS

[179] A presente invenção é adicionalmente ilustrada nos Exemplos a seguir, nos quais as partes e percentuais são em peso e os graus são Celsius, a menos que indicado em contrário. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem realizações da presente invenção, são fornecidos apenas como forma de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, os técnicos no assunto podem determinar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la aos vários usos e condições. Além disso, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, serão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima. Essas modificações também se destinam a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1 CLONAGEM DE GENE FEA3 DE MILHO:

[180] Utilizou-se uma abordagem de clonagem com base em mapa para isolar o alelo de referência fea3-0 (SEQ ID NO: 20), que foi originalmente mapeado sobre o cromossomo 3 (Fig. 1). Uma inserção de retrotransposon parcial dentro de um gene que codifica uma proteína similar a receptor de repetição rico em leucina foi identificada por meio de mapeamento fino. Para confirmar que essa inserção foi a mutação causadora, foi realizada uma seleção de EMS dirigida, que nos permitiu identificar três alelos adicionais de fea3, denominados fea3-1, 2 e 3 (SEQ ID NO: 22, 24 e 26, respectivamente).

[181] fea3 foi mapeado inicialmente utilizando mapeamento segregador a granel. Utilizou-se uma população de mapeamento de 947 indivíduos para colocar o locus entre os BACs c0267MO3 e c0566I18, uma região de cerca de 6 BACs contendo cerca de 25 genes previstos. Sequenciamento e análise de expressão revelaram um candidato, uma proteína similar a receptor de LRR que continha uma inserção pequena no alelo fea3-0. Foram identificados três alelos adicionais utilizando uma seleção de EMS dirigida de cerca de 10.000 plantas M1. O sequenciamento de cada alelo revelou uma alteração de aminoácidos com relação ao progenitor, o que confirma que o gene correto foi isolado.

EXEMPLO 2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE GENES FEA2 E FEA3:

[182] Realizou-se PCR RT para FEA2 e FEA3 em diferentes tecidos. As Figs. 2A exibe a expressão de FEA22 e FEA3 em tecidos diferentes. FEA2 e FEA3 exibem a expressão mais forte do meristema apical de brotos. A Fig. 2B exibe a expressão de FEA3 in situ, que demonstra que a expressão é detectada organizando o centro do meristema. Esta região sobrepõe-se à região de expressão WUS. Este padrão é muito diferente de outros mutantes de espigas fasciadas conhecidos (estágio de transição de inflorescência).

EXEMPLO 3 FENÓTIPO DE FEA3 MUTANTE DE MILHO:

[183] Durante o desenvolvimento vegetal, plantas com fea3 mutante parecem normais. Após a transição para a floração, entretanto, durante o desenvolvimento de inflorescências inicial, espigas com fea3 mutante (Fig. 3B) exibem um meristema de inflorescência (IM) achatado e ampliado em comparação com o tipo selvagem (Fig. 3A). Em estágios de desenvolvimento posteriores, a ampliação do IM causa fasciação no mutante (Fig. 3C). Na maturidade, espigas do tipo selvagem exibem fileiras de grãos organizadas em espaços regulares (Fig. 3D), enquanto espigas com fea3 mutante exibem ampliação progressiva da extremidade da espiga, fileiras de grãos adicionais e disposição irregular geral de fileiras (Fig. 3E).

EXEMPLO 4 ANÁLISE DE MUTANTES DUPLOS FEA3/FEA2:

[184] As borlas de mutantes duplos de fea3/fea2 de milho são mais espessas e mais curtas em comparação com mutantes isolados (Fig. 4A). A densidade de espiguetas foi analisada contando-se as espiguetas por centímetro ao longo da ráquis principal. Mutantes duplos exibem aumento significativo da densidade das espiguetas, indicando efeitos aditivos entre fea2 e fea3 (Fig. 4B). De forma similar, fenótipos de espigas mutantes duplos exibem fasciação aditiva (Fig. 4C). Estes resultados sugerem que FEA2 e FEA3 agem em processos diferentes.

EXEMPLO 5 TESTE DE RAÍZES DE PEPTÍDEOS CLAVATA3:

[185] Em Arabidopsis, a atividade de CLAVATA2 pode ser detectada por meio de reação do crescimento de raízes ao peptídeo CLAVATA3 (CLV3). Para analisar se FEA3 e FEA2 reagem a CLV3 e determinar se eles agem em um processo comum, foi realizado um teste de peptídeos CLV3. B73 e mudas mutantes de fea2 e fea3 homozigóticas germinaram e foram cultivadas sobre placas agar contendo o peptídeo CLV3. Como controle, mudas também foram cultivadas sobre placas contendo uma versão que sofreu mutação do peptídeo e sobre placas sem nenhum peptídeo. Após sete dias, foi medido o comprimento da raiz primária. Plantas do tipo selvagem B73 exibem forte inibição do crescimento de raízes como resultado da reação ao peptídeo CLV3, mas mutantes fea2 não reagem ao peptídeo CLV3. De forma interessante, mutantes fea3 reagem ao peptídeo CLV3, muito embora FEA3 seja expresso em raízes (Fig. 5).

EXEMPLO 6 EXPRESSÃO DE PROTEÍNA FLUORESCENTE VERMELHA DO PROMOTOR DE FEA3:

[186] Foi elaborada uma construção de DNA recombinante para permitir a localização in vivo de FEA3 que foi marcado com Proteína Fluorescente Vermelha (RFP). A construção continha os elementos a seguir na orientação 5’ para 3’: 1) promotor de FEA3; 2) região de codificação de peptídeo de sinal FEA3; 3) região de codificação de proteína de fusão RFP-FEA3; e 4) 3'-UTR de FEA3. Foram produzidas plantas de milho transgênico que contêm essa construção de DNA recombinante. Análise das plantas transgênicas revelou que a proteína de fusão RFP-FEA3 foi expressa na zona central de meristema de inflorescência da espiga e da borla.

[187] Para observar se FEA3 está localizado na membrana ou na fração solúvel, realizou-se Western Blot após o fracionamento da membrana. O tecido utilizado foi borla jovem (borla com cerca de 0,5~3 cm) da planta transgênica que expressa proteína FEA3 marcada com RFP, conforme descrito acima. A Fig. 2C demonstra que FEA3 marcado com RFP está localizado na membrana de plasma, em que a seta indica tamanho de faixa de cerca de 83 kD que é o tamanho de fusão esperado de FEA3 marcado com RFP.

EXEMPLO 7 TESTE DE RAÍZES DE PEPTÍDEOS SIMILARES A CLAVATA3:

[188] Para analisar se FEA3 reage a peptídeos similares a CLV3 e determinar se eles agem em um processo comum, foi realizado um teste de peptídeos CLV3. Os peptídeos utilizados foram ZCL3 (similar a CLE 3 de Zea mays; SEQ ID NO: 32), FCP1 (SEQ ID NO: 33), CLV3 (SEQ ID NO: 34), CLE20 (SEQ ID NO: 35), CLE40 (SEQ ID NO: 36), ZCL21 (similar a CLE 3 de Zea mays; SEQ ID NO: 37) e ZCL23 (similar a CLE 23 de Zea mays; SEQ ID NO: 38).

[189] Os peptídeos ZCL foram encontrados em sequências de milho no banco de dados NCBI por meio de pesquisa de homologia utilizando CLV3, CLE e peptídeos relativos a arroz (Fiers et al., Plant Cell (2005), 17: 2542-2553; Suzaki et al. (2008), Plant Cell 20: 2049-2058).

[190] B73 e mudas mutantes de fea3 germinaram e foram cultivadas sobre placas agar contendo 5 µM ou 10 µM de peptídeo.

[191] Como controle, mudas foram também cultivadas sobre placas contendo alteração do peptídeo. Após sete dias, foi medido o comprimento da raiz primária. Plantas do tipo selvagem B73 exibem forte inibição do crescimento de raízes como resultado de reação aos peptídeos ZCL3 (SEQ ID NO: 32), FCP1 (SEQ ID NO: 33) e CLV3 (SEQ ID NO: 34). De forma interessante, mutantes fea3 exibem menos sensibilidade ao peptídeo FCP1 (Fig. 6).

EXEMPLO 8 TESTE DE CULTIVO DE EMBRIÕES NA PRESENÇA DE PEPTÍDEO FCP1:

[192] Embriões do tipo selvagem e fea3 foram cultivados na presença de 20 µM de peptídeo FCP1 (SEQ ID NO: 33) ou 20 µM de peptídeo alterado. Para medição de crescimento de SAM de embriões, cerca de dez dias após a polinização, embriões foram esterilizados (milho inteiro foi esterilizado, não sementes jovens individuais), dissecados, colocados para baixo sobre o meio e a medição do tamanho de SAM foi realizada em duas semanas após o plantio (cultivo de embriões). Descobriu-se que o crescimento de SAM de embriões do tipo selvagem é fortemente inibido por FCP1, mas embriões fea3 exibiram resistência (a Fig. 7A exibe uma imagem que compara o crescimento SAM de embrião do tipo selvagem e fea3 e a Fig. 7B exibe sua análise quantitativa). Para o histograma exibido na Fig. 7B; p < 0,0001

EXEMPLO 9 ANÁLISE DE MUTANTES DUPLOS FEA3/TD1:

[193] As borlas de mutantes duplos de fea3/td1 de milho são mais espessas e mais curtas em comparação com mutantes isolados (Fig. 4A). A densidade de espiguetas foi analisada contando-se as espiguetas por centímetro ao longo da ráquis principal. Mutantes duplos exibem aumento significativo da densidade das espiguetas, indicando efeitos aditivos entre fea2 e fea3 (Fig. 4B). De forma similar, fenótipos de espigas mutantes duplos exibem fasciação aditiva (Fig. 4C). Estes resultados sugerem que FEA2 e FEA3 agem em processos diferentes.

EXEMPLO 10 ANÁLISE DE ORTÓLOGOS DE FEA3 EM OUTRAS ESPÉCIES VEGETAIS:

[194] Ortólogos de FEA3 de Arabidopsis, arroz, sorgo e soja podem também ser analisados realizando-se experimentos descritos nos Exemplos 1-9 para FEA3 de milho.

Claims (15)

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA com expressão reduzida de fea3 endógeno, caracterizado por compreender: (a) introdução em uma célula vegetal regenerável de uma construção recombinante que compreende um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4, ou as sequências degeneradas das mesmas, ligado operacionalmente a um promotor, que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 5, em que a expressão da sequência de polinucleotídeos reduz a expressão de fea3 endógeno; (b) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção da planta transgênica de (b), em que a planta transgênica compreende a construção recombinante e exibe uma redução da expressão de fea3 em comparação a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

2. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA com expressão reduzida de fea3 endógeno, caracterizado por compreender: (a) introdução em uma célula vegetal regenerável de uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado ligado operacionalmente, em orientação sense ou antisense, a um promotor funcional em uma planta, em que o polinucleotídeo compreende: (i) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (ii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; ou (iii) um precursor de miRNA vegetal modificado, em que o precursor foi modificado para substituir a região codificadora de miRNA por uma sequência projetada para produzir um miRNA dirigido a SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (b) regeneração de uma célula vegetal transgênica após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe uma redução da expressão de FEA3 em comparação a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

3. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA com alteração de uma característica agronômica, caracterizado por compreender: (a) introdução em uma célula vegetal regenerável de uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado ligado operacionalmente a pelo menos uma sequência reguladora, em que o polinucleotídeo codifica um fragmento ou uma variante de um polipeptídeo que contém uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ou 5, em que o fragmento ou a variante confere um fenótipo negativo dominante na célula vegetal regenerável; (b) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe uma alteração de pelo menos uma característica agronômica selecionada a partir do grupo que consiste em: tamanho do meristema da espiga, número de fileiras de grãos, número de folhas, número de inflorescências, ramificação dentro da inflorescência, número de flores, número de frutos, número de sementes, ramificação de raízes, biomassa de raiz, tropismo de raiz, biomassa e rendimento em comparação a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

4. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM ALELO FRACO DE fea3, caracterizado por compreender as etapas de: (a) realização de uma seleção genética em uma população de plantas de milho mutantes; (b) identificação de uma ou mais plantas de milho mutantes que exibem um fenótipo fea3 mais fraco do que uma planta null para fea3, em que o gene fea3 endógeno de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4, ou as sequências degeneradas das mesmas, codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 5; e (c) identificação do alelo fea3 fraco a partir da planta de milho mutante com fenótipo fea3 mais fraco.

5. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM ALELO FRACO DE fea3, caracterizado por compreender as etapas de: (a) embaralhamento gênico (gene shuffling) utilizando uma ou mais sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4, ou as sequências degeneradas das mesmas, que codificam SEQ ID NO: 3 ou 5, ou um de seus fragmentos; (b) transformação das sequências embaralhadas da etapa (a) em uma população de células vegetais regeneráveis; (c) regeneração de uma população de plantas transformadas a partir da população de células vegetais regeneráveis transformadas da etapa (b); (d) seleção da população de plantas transformadas da etapa (c) por fenótipo fea3 fraco; e (e) identificação do alelo fea3 fraco a partir da planta transformada que exibe fenótipo fea3 fraco.

6. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA, em que a expressão do gene FEA3 endógeno é reduzida em relação a uma planta controle, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução de uma mutação no gene FEA3 endógeno, em que o gene FEA3 endógeno codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 5; e (b) detecção da mutação.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas etapas (a) e (b) serem realizadas utilizando um método de Lesões Locais Induzidas em Genomas (TILLING) e a mutação ser eficaz na redução da expressão do gene FEA3 endógeno ou de sua atividade.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pela mutação ser uma mutação sítio-específica.

9. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA, em que a expressão do gene FEA3 endógeno é reduzida em relação a uma planta controle, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução de um transposon em um germoplasma que contém um gene fea3 endógeno, em que o gene fea3 endógeno de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4, ou as sequências degeneradas das mesmas, codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 5; (b) obtenção de prole do germoplasma da etapa (a); e (c) identificação de uma planta da prole da etapa (b) na qual o transposon foi inserido no gene FEA3 endógeno e uma redução da expressão de fea3 é observada.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela etapa (a) compreender adicionalmente a introdução do transposon em uma célula vegetal regenerável do germoplasma por meio de transformação e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável, em que a planta transgênica compreende em seu genoma o transposon.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de: (i) introdução em uma célula vegetal regenerável de uma construção recombinante que compreende o alelo fea3 fraco identificado por meio do método, conforme definido em uma das reivindicações 4 a 5; (ii) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (i), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (iii) seleção de uma planta transgênica de (ii), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe um fenótipo fea3 fraco em comparação a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado pela expressão do polipeptídeo da parte (a) em uma linhagem vegetal que possui o genótipo mutante de fea3 ser capaz de restaurar total ou parcialmente o fenótipo do tipo selvagem.

13. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA com uma alteração em característica agronômica, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução em uma célula vegetal regenerável de uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado ligado operacionalmente, em orientação sense ou antisense, a um promotor funcional em uma planta, em que o polinucleotídeo compreende: (i) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (ii) uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 100 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; ou (iii) um precursor de miRNA vegetal modificado, em que o precursor foi modificado para substituir a região codificadora de miRNA por uma sequência projetada para produzir um miRNA dirigido a SEQ ID NO: 1, 2 ou 4; (b) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica de (b), em que a planta transgênica compreende a construção de DNA recombinante e exibe uma alteração em pelo menos uma característica agronômica selecionada a partir do grupo que consiste em: meristema da espiga aumentado, número de fileiras de grãos, número de sementes, ramificação de raízes, biomassa de raiz, tropismo de raiz, biomassa e rendimento em comparação a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por mencionada planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis, tomate, milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milho-painço, cana-de-açúcar e switchgrass.

15. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PRIMEIRA PLANTA DE MILHO ou um primeiro germoplasma de milho que possui uma alteração em pelo menos uma característica agronômica, caracterizado por compreender a detecção na primeira planta de milho ou no primeiro germoplasma de milho de pelo menos um polimorfismo de um locus marcador que é associado ao mencionado fenótipo, em que o locus marcador de SEQ ID NO: 22, 24 ou 26, ou as sequências degeneradas das mesmas, codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 23, 25 ou 27, em que a expressão do mencionado polipeptídeo em uma planta ou parte de planta da mesma resulta em uma alteração em pelo menos uma característica agronômica selecionada a partir do grupo que consiste em: tamanho do meristema da espiga, número de fileiras de grãos, número de inflorescências, ramificação dentro da inflorescência, número de flores, número de frutos e número de sementes em comparação a uma planta controle, em que a planta controle compreende SEQ ID NO: 3 ou 5.

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