BR9711048B1 - construção de dna recombinante, vetor, plasmìdeo, células bacterianas, e, processos para obter plantas com suscetibilidade reduzida a um patógeno e para isolar ácido nucléico. - Google Patents

construção de dna recombinante, vetor, plasmìdeo, células bacterianas, e, processos para obter plantas com suscetibilidade reduzida a um patógeno e para isolar ácido nucléico. Download PDF

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Description

"CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, VETOR, PLASMÍDEO, CÉLULAS BACTERIANAS, E, PROCESSOS PARA OBTER PLANTAS COM SUSCETIBILIDADE REDUZIDA A UM PATÓGENO E PARA ISOLAR UM ÁCIDO NUCLÉICO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a genes de resistência, construções de DNA, microorganismos, células de plantas e a plantas contendo ditos genes de resistência. Ademais, a invenção diz respeito a plantas geneticamente transformadas, que são resistentes contra nematóides e/ou afídios. Além disso, a invenção diz respeito a sondas e iniciadores para a identificação dos genes de resistência e kits de diagnósticos incluindo ditas sondas e/ou iniciadores. Finalmente, a invenção diz respeito a polipeptídeos codificados pelos ditos genes de resistência e ao uso dos referidos polipeptídeos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Os patógenos de plantas são responsáveis pelas perdas substanciais de plantas e produtos vegetais, devido à infecção das plantas. As doenças dos vegetais, como um resultado de infecção por patógenos ou pragas, causam dano às plantas e/ou aos produtos das plantas, reduzem a produção e o rendimento, limitam a espécie de plantas que podem crescer em certas áreas geográficas e, como resultado, causam graves perdas (financeiras) ao plantador.
Os nematóides parasitários das plantas ocorrem em todo o mundo e a maioria deles vivem a maior parte de sua vida na camada superior do solo. Não obstante as perdas causadas pela alimentação direta de nematóides nas raízes das plantas serem de importância secundária, várias espécies, entre elas os nematóides dos nódulos das raízes pertencentes à espécie Meloidogyne, os cisto-nematóides pertencentes à espécie Heterodera e à espécie Globodera, e outros nematóides tais como a espécie Nacobbus, causam graves danos e perdas econômicas das plantações. Os nematóides dos nódulos das raízes ocorrem também no mundo inteiro, mas são encontrados mais freqüentemente e em maiores quantidades em áreas com climas mais quentes e em estufas. As espécies mais importantes de Meloidogyne são as M incógnita, M. arenaria, M. hapla e M. javanica, dentre as quais a M. hapla também ocorre nas zonas climáticas mais temperadas.
Existem diferentes meios para controlar os patógenos das plantas, tais como a preparação mecânica do solo, o tratamento químico com pesticidas, incluindo os nematicidas e os inseticidas, ou a rotação de culturas. No entanto, para certos patógenos das plantas, especialmente nematóides, estes meios de controle são insuficientes para proteger as plantas da infecção e doenças resultantes. O único meio eficaz de controle envolve a resistência da planta ao hospedeiro (Russell, 1978, Plant Breeding for pest and disease resistance, Butterworths edit., 485 pp). O desenvolvimento de cultivares resistentes aos patógenos comuns das plantas e um dos objetivos principais dos produtores de plantas hoje, de modo a reduzir ou finalmente eliminar a ampla necessidade de pesticidas. O gravame ambiental das grandes quantidades de pesticidas injetados no solo ou espalhados nas plantações, nas árvores, etc., no mundo inteiro, a cada ano, se torna muito grave. Além disso, os regulamentos governamentais nos países Ocidentais, restringem o uso ou, mesmo, proibem o uso, de certos pesticidas. Portanto, a necessidade de plantas que sejam resistentes a um ou mais de seus patógenos, ou que tenham uma suscetibilidade reduzida a seus agressores, se torna cada vez mais premente. O desenvolvimento de plantas resistentes é um dos objetivos importantes dos programas de criação de plantas atuais. Os genótipos de vegetais suscetíveis de patógenos específicos são cruzados com genótipos de plantas resistentes, de modo a introduzir o fenótipo resistente na linhagem de cultura.
O dano causado por nematóides dos nódulos das raízes resulta principalmente da invasão das raízes das plantas por larvas que, em um relacionamento compatível com a planta, desenvolvem-se em uma fêmea de reprodução. Após a invação, as larvas fazem as células das raízes se desenvolverem em células gigantes, nas quais elas se alimentam. Após a infecção, são formadas galhas ou nódulos sobre as raízes e estas se tornam diferentemente perturbadas, espessadas e mirradas. O sistema de raízes, assim, funciona mal na absorção de água e dos elementos nutricionais, o que prejudica o cultivo e o desenvolvimento das plantas. Os danos freqüentes às plantas infectadas são aumentados por fungos parasitários que atacam o tecido enfraquecido da raiz. Os vegetais infectados apresentam desenvolvimento reduzido e folhas menores de coloração pálida, com frutas de qualidade pobre e não desenvolvidas ou, mesmo, sem frutas, e tendem a murchar em climas mais quentes (Agrios, 1988, em: Plant Pathology, Academic Press, Inc.). Os prejuízos e/ou a redução do rendimento causados pelos nematóides dos nódulos das raízes, são substanciais na produção agrícola total, em todo o mundo. As perdas individuais do rendimento em grupos de plantas podem ser tão elevadas quanto 25 a 50% ou, mesmo, uma plantação inteira pode ser exterminada.
Os nematóides dos nódulos das raízes em estufas podem ser controlados com esterilização a vapor do solo ou fumigação do solo com nematicidas. Nas condições de campo, o controle pode ser obtido pelo uso de nematicidas. No entanto, em alguns casos muito persistentes, o uso de tais produtos químicos é crescentemente debatido e, em alguns países, o uso de certos nematicidas é até proibido.
Os genótipos de cultivo geneticamente resistentes e o meio mais confiável e eficaz de controle da doença dos nódulos das raízes. Para diversas espécies de plantações, a disponibilidade de resistência dentro do plasma germinativo relacionado foi relatada, por exemplo na batata, no algodão, no tabaco, no trigo, na soja, no tomate, na berinjela, no feijão comum e na alfafa. A criação de resistência é dificultada primeiramente pela ocorrência limitada de genes de resistência (conhecidos) no plasma germinativo disponível, em segundo lugar em algumas espécies de plantas, a existência de barreiras cruzadas entre as espécies de plantações cultivadas e as espécies relacionadas possuindo resistência e, em terceiro lugar, os testes de triagem quanto à resistência versus suscetibilidade a nematóides são laboriosos e freqüentemente não confiáveis. Portanto, a geração de resistência é muito difícil ou impossível de alcançar, ou, se possível, demorada.
A introdução com sucesso dos genes de resistência foi realizada no tomate. O gene de resistência Mi (.Meloidogyne incógnita) foi introduzido no tomate cultivado, Lycopersicon eseulentum, após o cruzamento com as espécies selvagens relacionadas L. peruvianum (PI 128657), usando-se o cultivo do embrião. O gene Mi confere resistência a vários Meloidogyne spp. (Fassuliotis, 1991, em: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). O gene de resistência Mi é relatado como sendo um gene dominante monogênico (Gilbert e McGuire, 1956, Proc. Am. Soe. Hortic. Sei. 68, 437-442) e é localizado no cromossoma 6 do tomate. Postula-se também que a região introgressed, compreendendo o local do Mi, é envolvida em conferir resistência ao afídio da batata (.Macrosiphum euphorbia) (Kaloshian et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 622-625).
As plantas desenvolveram um mecanismo de defesa complexo contra o ataque e a infecção por patógenos. Até hoje, o mecanismo exato de seu sistema de defesa não foi ainda elucidado.
A resistência aos nematóides no tomate é expressa após a penetração. Depois que a larva jovem entra na raiz e se estabelece em um sítio de alimentação, uma reação hipersensível (HR) adjacente à cabeça do nematóide é disparada, o que resulta em morte local das células hospedeiras. O nematóide é também negativamente afetado por esta HR e morre (Fassuliotis, 1991, em: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). Se existe ou não um relacionamento gene-para-gene sensu Flor (1956, Adv. Gen. 8, 29-54), como é freqüentemente o caso em outros relacionamento planta-patógeno, onde a resistência se baseia na incompatibilidade da HR, é desconhecido.
O isolamento dos genes das plantas sem conhecimento de seus produtos do gene, é muito laborioso e difícil, por causa dos enormes tamanhos do genoma das espécies de plantas: por exemplo, o tomate tem um tamanho de genoma de 1000 Mb (10^9 pares de base de DNA nuclear), o milho tem um tamanho de genoma de 3000 Mb e o trigo tem mesmo mais do que 16 χ 10^9 pares de base. A procura de um gene específico entre estes bilhões de pares de base é apenas exeqüível quando (i) existirem bastantes marcadores moleculares firmemente ligados ao gene de interesse e (ii) existir boa disponibilidade de material genético (Tanksley et al., 1995, Trends in Genetics, 11, p. 63-68).
Não obstante o isolamento de uns poucos genes de resistência tenha sido apresentado, nenhum destes genes de resistência são capazes de conferir à planta hospedeira resistência a nematóides ou a afídios. Exemplos de tais genes isolados de resistência são: RPS2 de Arabidopsis (resistência a Pseudomonas Syringae expressando avrRpt2), N do tabaco (resistência ao vírus mosaico do tabaco), Cf-9 do tomate (resistência ao patógeno fungico das folhas Cladosporium fulvum conduzindo avr9) e L6 do linho (resistência à espécie füngica correspondente de ferrugem das folhas) (Dangl, 1995, Cell 80, 363-366).
A presente invenção apresenta o primeiro gene isolado de resistência a nematóides e, outrossim, apresenta o primeiro gene isolado de resistência a afídios. Além disso, a presente invenção diz respeito a um gene de resistência de função conferindo suscetibilidade reduzida a nematóides, bem como a afídios, e de preferência a Meloidogyne incógnita e a Macrosiphum euphorbiae, respectivamente.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a um ácido nucleico compreendendo o gene de resistência Mi, que, quando presente e expresso em uma planta, é capaz de conferir a dita planta resistência contra os nematóides e/ou afídios. Além do mais, a invenção diz respeito ao gene de resistência Mi, cuja seqüência de DNA é aqui apresentada. A invenção também diz respeito a um produto de gene codificado pelo gene de resistência Mi. Além disso, a presente invenção diz respeito a construções de DNA, cosmídios, vetores, cepas bacterianas, células de levedura e células vegetais contendo o gene de resistência Mi. Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma planta geneticamente transformada, que é resistente a um nematóide, dito nematóide sendo capaz de infectar a planta não transformada. Demais, a invenção diz respeito a genes de resistência que são homólogos ao gene de resistência Mi, e que, quando presentes em uma planta, são capazes de conferir dita resistência à planta contra a infecção por patógenos.
Além do mais, a presente invenção diz respeito a um ácido nucleico compreendendo o gene de resistência Meu-1, que, quando presente em uma planta, é capaz de conferir à dita planta suscetibilidade reduzida a afídios. Em particular, o gene de resistência Meu-I corresponde ao gene de resistência Mi. Especialmente, o gene· de resistência Meu-1 tem a mesma seqüência de nucleotídeos do gene de resistência Mi. Assim, a presente invenção também diz respeito a plantas geneticamente transformadas, que são suscetíveis de redução, e preferivelmente resistentes a afídios, em particular aos afídios da batata.
Finalmente, a invenção diz respeito a oligonucleotídeos correspondentes à seqüência do dito gene de resistência ou parte deste, e a kits de detecção contendo ditos oligonucleotídeos.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 apresenta um mapa físico de YAC 1/1172, YAC 2/1256 e YAC 1/1084, com um tamanho de 570, 500 e 470 kb, respectivamente. A posição dos sítios de restrição SfA e ZfasHII e o tamanho dos fragmentos de restrição, são indicados. A localização dos vários marcadores AFLP nos fragmentos de restrição é indicada.
A Figura 2 apresente um desenho esquemático do vetor cosmídio binário pJJ04541, que é usado para construir uma coleção de cosmídeos de YAC 1/546. O plasmídeo pRK290 (extensão de 20 kb) (Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 7347-7351) foi usado como vetor de partida. "Tet" se refere ao gene que confere resistência à tetraciclina. "LB" significa a seqüência de repetição da borda esquerda do T-DNA, e "RB" significa a repetição da borda direita. A seqüência do promotor do vírus mosaico da couve-flor 35S é indicada por "p35S", e "ocs3" indica a extremidade 3' da octopina sintase. "NPT" indica neomicina fosfotransferase, e "cos" se refere ao sítio cos lambda bacteriófago, permitindo adensamento in vitro. "pDBS" indica o poliligador de pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
A Figura 3 A mostra uma representação esquemática da posição detalhada dos marcadores AFLP em YAC 1/1172, YAC 2/1256 e YAC 1/1084. O posicionamento se baseia no cosmídio contig construído para as várias regiões definidas.
A Figura 3B mostra uma representação esquemática do cosmídio contig da região compreendendo o gene de resistência Mi. Os cosmídios Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 e Mi-14 são representados por linhas horizontais. A localização dos marcadores AFLP PM14 e PM25 é indicada.
A Figura 4 mostra um mapa físico preciso dos cosmídios Mi- 32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 e Mi-14, para a enzima de restrição Pst1. O tamanho dos fragmentos de Pstl é indicado (em kb). O fenótipo Mi, como identificado em um ensaio da doença in vitro, das plantas R0, compreendendo os vários comídios, é indicado na parte final direita da figura. O segmento DNA de que a seqüência de nucleotídeos foi determinada, é indicado por uma linha dupla com uma flecha bidirecional.
A Figura 5 mostra a seqüência de nucleotídeos de um segmento de DNA de aproximadamente 9,9 kb ao redor do marcador de AFLP PM14, e uma seqüência deduzida de aminoácidos do gene de resistência Mi. O códon inicial (posição ATG 3263-3265) está sublinhado, e o códon de terminação (posição TAG 7109-7111) é sublinhado duplamente, mostrando uma estrutura de leitura aberta (ORF 1) codificando um polipeptídeo de 1257 aminoácidos (Figura 7A). O gene de resistência Mi compreende duas seqüências intron (apresentada em itálico): uma intron de 1306 nucleotídeos da posição 1936 à posição 3241, e uma intron de 75 nucleotídeos da posição 3305 à posição 3379.
Um segundo códon inicial (posição AGT 3491-3493), que fica na estrutura com o primeiro códon inicial, resulta em uma segunda estrutura de leitura aberta (ORF2) codificando um polipeptídeo truncado de 1206 aminoácidos (Figura 7B).
A posição do marcador de AFLP PM 14 é da posição 6921 do nucleotídeo (5'-TGCAGGA-3') à posição 7034 do nucleotídeo (5'- AGATTA-3').
A Figura 6 mostra um mapa físico de cosmídios Mi-11 e Mi- 18 e a seqüência determinada de nucleotídeos do cosmídio Mi-11. A seqüência é dividida em quatro contigs: con25 (5618 pb), conlO (898 kb), con62 (2495 pb) e Mi (9870 pb).
A parte inferior da figura descreve a presença ("+") ou a ausência ("-") de vários fragmentos de PCR, correspondentes a partes do segmento de DNA da Figura 5, que são representadas como linhas horizontais de diferentes comprimentos no lado direito da tabela, nas várias formações genéticas (clone YAC 2/1256, cosmídio Mi-Il contendo E.coli, cosmídio Mi-11, cosmídio Mi-Il contendo A. tumefaciens, cosmídio Mi-18 contendo E. coli, cosmídio Mi-18 contendo A. tumefaciens, linhagem E22 do tomate resistente, linhagem 52201 do tomate suscetível, plantas Ro transformadas com cosmídio Mi-11 e plantas Ro transformadas com cosmídio Mi-18).
Seqüência de nucleotídeos de cosmídio Mi- lie cosmídio Mi- 18. Análise de diferentes contigs.
A Figura 7A mostra a seqüência deduzida de aminoácidos do polipeptídeo codificado por ORF1.
A Figura 7B mostra a seqüência deduzida de aminoácidos do polipeptídeo truncado codificado por ORF2.
A Figura 8 descreve uma representação esquemática da estrutura do gene de resistência Mi.
A Figura 9 descreve uma representação esquemática da família do gene de resistência Mi.
DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS BIOLÓGICAS
A SEQ ID NO: 1 corresponde a seqüência de nucleotídeos do gene Mi.
A SEQ ID NO:2 corresponde a seqüência da proteína Mi, codificada pela SEQ ID NO:1.
A SEQ ID NO:3 corresponde ao lócus do gene Mi.
A SEQ ID NO:4 corresponde a um produto de amplificação obtido com iniciadores que amplificam o gene Mi. A SEQ ID NO:5 corresponde a um exemplo de iniciador para amplificar o gene Mi.
A SEQ ID NO:6 corresponde a um exemplo de iniciador para amplificar o gene Mi.
A SEQ ID NO:7 corresponde a seqüência de nucleotídeos do promotor à montante do gene Mi.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na descrição e nos exemplos que seguem, vários termos são aqui empregados. De modo a prover um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo que recebe tais termos, as seguintes definições são fornecidas.
- ácido nucleico: uma molécula de DNA de filamento duplo. O ácido nucleico pode ser DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou qualquer outro DNA;
- oligonucleotídeo: uma molécula de DNA de filamento único curto;
- iniciadores: em geral, o termo iniciador se refere a uma molécula de DNA de filamento único, que pode iniciar a síntese do DNA;
- hibridização de ácido nucleico: um processo para detectar as seqüências de DNA relacionadas, mediante hibridização de DNA de filamento único em suportes tais como membrana de náilon ou papéis de filtro de nitrocelulose. Moléculas de ácido nucleico que têm seqüências de base complementares reformarão a estrutura de filamento duplo, se misturadas em solução sob condições apropriadas. A estrutura de filamento duplo será formada entre dois ácidos nucleicos de filamento duplo complementares, mesmo que um seja imobilizado em um suporte. Em um procedimento de hibridização do Sul, esta última situação ocorre; sonda de hibridização: para detectar uma seqüência particular de DNA no procedimento de hibridização do sul, uma molécula rotulada de DNA ou sonda de hibridização é reagida ao DNA fracionado ligado a um suporte, tal como membrana de náilon ou papel de filtro de nitrocelulose. As áreas no filtro que conduzem seqüências de DNA complementares à sonda rotulada de DNA se tornam rotuladas por si próprias como conseqüência da reação de recozimento. As áreas do filtro que apresentam tais rotulagens podem então ser detectadas de acordo com o tipo de rótulo usado. A sonda de hibridização é geralmente produzida por clonagem molecular de uma seqüência específica de DNA ou por sintetização de um oligonucleotídeo sintético;
seqüência homóloga: uma seqüência que tem pelo menos 50%, preferivelmente 60%, mais preferivelmente 70%, o mais preferível 80% ou, mesmo, 90% de identidade da seqüência com a seqüência particular, por meio do que o comprimento de seqüências a ser comparado com os ácidos nucleicos, é geralmente de pelo menos 120 nucleotídeos, preferivelmente de 200 nucleotídeos, e mais preferivelmente 300 nucleotídeos, e o comprimento das seqüências a ser comparado com os polipeptídeos, é geralmente de pelo menos 40 resíduos de aminoácidos, preferivelmente 65 resíduos de aminoácidos e mais preferivelmente 100 resíduos de aminoácidos. Alternativamente, uma seqüência hommóloga se refere a uma seqüência que pode hibridizar sob condições estringentes em uma seqüência particular, e/ou uma seqüência de DNA codificando um polipeptídeo que tenha substancialmente as mesmas propriedades que o polipeptídeo codificado pela seqüência de DNA particular, e/ou uma seqüência de DNA codificando um polipeptídeo tendo a mesma seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência particular de DNA e/ou uma seqüência de aminoácido em que alguns resíduos de aminoácido tenham sido modificados em relação à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo particular sem substancialmente afetar as propriedades principais do dito polipeptídeo;
condições estringentes se referem a condições de hibridização que permitem que uma seqüência de ácido nucleico se hibridize em uma seqüência específica. Em geral, condições de estringência elevada se refere às condições de hibridização que permitem que uma seqüência de ácido nucleico de pelo menos 50 nucleotídeos e, preferivelmente, de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, se hibridize com uma seqüência particular em cerca de 65°C em uma solução compreendendo sal de cerca de 1 M, preferivelmente 6 χ SSC ou qualquer outra solução tendo um comprimento iônico comparável, e lavando-se a 650C em uma solução compreendendo sal de cerca de 0,1 M, ou menos, preferivelmente 0,2 χ SSC ou qualquer outra solução tendo um comprimento iônico comparável. Estas condições permitem a detecção de seqüências tendo cerca de 90% ou mais de identidade de seqüência. Em geral, condições estringentes inferiores se referem às condições de hibridização que permitem que uma seqüência de ácido nucleico de pelo menos 50 nucleotídeos e, preferivelmente cerca de 200 ou mais nucleotídeos, se hibridize a uma seqüência particular em cerca de 45°C em uma solução compreendendo sal de cerca de 1 M, preferivelmente 6 χ SSC, ou qualquer outra solução tendo um comprimento iônico comparável, e lavando-se em temperatura ambiente em uma solução compreendendo sal de cerca de 1 M, preferivelmente 6 χ SSC ou qualquer outra solução tendo um comprimento iônico comparável. Estas condições permitem a detecção de seqüências tendo até 50% de identidade das seqüências. A pessoa experiente na técnica estará capacitada a modificar estas condições de hibridização, de modo a identificar seqüências variando em identidade entre 50% e 90%;
- promotor: uma região de regulação da transcrição a montante da seqüência de codificação contendo as seqüências regulatórias requeridas para a transcrição da seqüência de codificação adjacente, e inclui a região 5' não transladada ou a assim chamada seqüência principal de mRNA;
- terminador: uma região a jusante da seqüência de codificação, que dirige a terminação da transcrição, também chamada a região 3' não transladada, que inclui o sinal de poliadenilação;
- gene de resistência: um ácido nucleico que compreende uma seqüência de codificação como descrito na Figura 5, ou parte dele, ou qualquer seqüência correspondente ou homólogo;
- nematóide(s): Meloidogyne spp., tal como Meloidogyne incógnita, M. arenaria ou M. javanica, ou qualquer outro genótipo que não seja capaz de infectar um hospedeiro que tenha um gene de resistência de acordo com a invenção, tal como, mas a estes não se limitando, outros nematóides do nódulo das raízes como M hapla, cisto-nematóides como Heterodera spp. ou Globodera spp., ou outros nematóides como Nacobbus spp., insetos como os afídios da batata ou qualquer outro patógeno ou praga das plantas;
- produto do gene de resistência: um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos como descrito na Figura 5, ou parte desta, ou qualquer seqüência homóloga de aminoácidos;
- planta R0: regenerador primário de uma experiência de transformação, também denotado como planta transformada ou planta transgênica;
Linhagem R1: a progênie de uma planta R0 uniforme.
Linhagem R : a progênie de uma planta Rj uniforme. Linhagem R1BC: a progênie de um cruzamento reversível entre uma planta R1 e uma planta do genótipo que foi originalmente usado para a experiência de transformação.
Na presente invenção fomos capazes de identificar e isolar o gene de resistência Meloidogyne incógnita (Mi). O gene foi clonado de um genótipo de tomate que era resistente a Meloidogyne incógnita. O gene de resistência Mi isolado de acordo com a invenção pôde ser transferido para uma planta hospedeira suscetível, usando-se a transformação mediada por Agrobacterium ou qualquer outro processo conhecido de transformação, e foi envolvido na transmissão de resistência à planta hospedeira contra os patógenos da planta, especialmente os nematóides. A planta hospedeira pode ser o genótipo de tomate ou de qualquer outra, que seja infectado pelo dito patógeno da planta.
A presente invenção provê também uma seqüência de ácido nucleico compreendendo o gene de resistência Mi, que é descrito na Figura 5.
Com o gene de resistência Mi de acordo com a invenção, tem- se um meio eficaz de controle contra os patógenos e/ou pragas das plantas, uma vez que o gene pode ser usado para transformar os genótipos de plantas suscetíveis, dessa forma produzindo plantas geneticamente transformadas tendo uma suscetibilidade reduzida ou sendo de preferência resistentes a um patógeno ou praga das plantas. Em particular, uma planta que seja geneticamente transformada com o gene de resistência Mi de acordo com a invenção, tem uma suscetibilidade reduzida aos nematóides dos nódulos das raízes.
Em uma modalidade preferida, o gene de resistência Mi compreende a seqüência de codificação fornecida na Figura 5, ou qualquer seqüência correspondente ou homóloga ou seqüência de cDNA, precedida por uma região do promotor, e seguida por uma região do terminador. A região do promotor deve ser funcional nas células vegetais e, preferivelmente, corresponde à região nativa do promotor do gene de resistência Mi. No entanto, deve-se reconhecer que qualquer região heteróloga do promotor pode ser usada em conjunção com as seqüências de codificação, contanto que ela seja funcional nas células vegetais. De preferência, um promotor constitutivo é usado, tal como o promotor CaMV 35 S ou os promotores T-DNA, todos bem conhecidos daqueles versados na técnica. Além disso, uma região do terminador adequada deve ser funcional nas células vegetais, todas bem conhecidas daqueles experientes na técnica.
Além disso, a invenção diz respeito ao produto do gene de resistência Mi, que é codificado pelo gene de resistência Mi, de acordo com a invenção, e que tem uma seqüência deduzida de aminoácidos, apresentada na Figura 5 e na Figura 7A, ou que seja homóloga à seqüência deduzida de aminoácidos ou parte dela. Demais, o produto do gene de resistência Mi ou um polipeptídeo truncado, como apresentado na Figura 7B, pode ser usado para formar anticorpos contra ele, os quais podem ser usados para a detecção da presença do produto do gene de resistência Mi.
Em outro aspecto da invenção, o gene de resistência Mi pode ser usado para designar os oligonucleotídeos que sejam complementares a um filamento da seqüência de DNA, conforme descrito na Figura 5, ou parte desta, que pode ser usada como sondas de hibridização, sendo consequentemente rotuladas para permitir a detecção, para a avaliação do DNA genômico ou das coleções de cDNA quanto aos genes homólogos. As seqüências homólogas que podem hibridizar com a sonda, sob condições de hibridização estringentes, e que codificam umproduto do gene que está envolvido em conferir suscetibilidade reduzida ou resistência a uma planta, contra um patógeno das plantas que normalmente afetam referido vegetal, são compreendidas dentro do escopo da presente invenção.
Em outro aspecto da invenção, os oligonucleotídeos são designados com base na seqüência do gene de resistência Mi, de tal modo que eles possam ser usados como sondas de hibridização em análises do Sul. Estas sondas podem ser usadas como marcadores moleculares para distinguir os genótipos das plantas tendo o gene de resistência e os genótipos das plantas carentes do gene de resistência. Uma tal sonda pode ser usada como uma ferramenta adicional na seleção. Em uma modalidade preferida da invenção, os oligonucleotídeos são designados com base na seqüência do gene de resistência Mi, de modo tal que eles possam ser usados como iniciadores em uma reação de ampliação, tal como a reação da cadeia polimerase (PCR), por meio do que a formação de um produto de ampliação indica a presença do gene de resistência Mi, em um certo genótipo das plantas. Em uma modalidade particular da invenção, referidos iniciadores dirigem a ampliação de fragmentos polimórficos, assim chamados marcadores moleculares, que são intimamente ligados ao gene de resistência Mi. Em uma modalidade preferida, ditos iniciadores são usados na ampliação seletiva do fragmento de restrição, para identificar os marcadores AFLP, que são intimamente ligados ao gene de resistência Mi. A invenção também diz respeito a kits de diagnósticos, compreendendo oligonucleotídeos de acordo com a invenção, para a detecção da presença ou ausência do gene de resistência Mi dentro de um genótipo sob estudo. Um tal kit de diagnóstico evita o uso de um ensaio laborioso da doença oara avaliar quanto aos genótipos tendo ou não o gene de resistência.
Ademais, a invenção diz respeito a construções de DNA compreendendo uma seqüência de DNA correspondente à seqüência de codificação do gene de resistência Mi e seqüências regulatórias funcionais nas células vegetais, dita seqüência de DNA podendo ser DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou DNA de qualquer outra origem. Ditas seqüências regulatórias são ou homólogas ou heterólogas às seqüências de codificação do gene de resistência Mi. De preferência, dita construção de DNA compreende um ácido nucleico, cuja seqüência é apresentada na Figura 5, ou parte desta.
A invenção diz respeito também a construções de DNA compreendendo as seqüência regulatórias, e mais preferivelmente a região do promotor do gene de resistência Mi em conjunção com a seqüência do gene estrutural heteróloga a ditas seqüências regulatórias.
A invenção diz respeito também a um vetor de DNA compreendendo uma construção de DNA de acordo com a invenção. Vetores adequados podem ser vetores de clonagem, vetores de transformação, vetores de expressão, etc., que são bem conhecidos daqueles experientes na técnica.
Outrossim, as células que abrigam um vetor compreendendo uma seqüência de DNA correspondente à seqüência descrita na Figura 5 ou parte desta, ou homólogo a ela, acham-se dentro do escopo da invenção. Além do mais, as células que transportam uma construção de DNA de acordo com a invenção, estão dentro do escopo desta invenção.
Em uma modalidade preferida da invenção, uma planta geneticamente transformada é obtida pela introdução do gene de resistência Mi dentro do genoma da dita planta suscetível aos nematóides, usando-se técnicas padrão de transformação, em que dita planta geneticamente transformada é resistente aos nematóides.
Em outra modalidade da invenção, o gene de resistência Mi pode ser transferido usando-se em geral técnicas de transformação conhecidas, em sistemas heterólogos, tais como, mas a estes não limitados, melão, tabaco, Arabidopsis thaliana, batata, beterraba, colza, pepino, pimenta, berinjela. Um sistema heterólogo se refere a uma espécie de planta que é diferente das espécies de plantas das quais o gene de resistência tenha sido isolado.
Em ainda outra modalidade da invenção, o gene de resistência Mi corresponde ao gene de resistência Macrosiphum euphorbiae (Meu-1) e é envolvido em conferir às plantas, transformadas com o gene de acordo com a invenção, resistência a insetos e, em particular, a afídios.
A seqüência de DNA compreendendo o gene de resistência Mi conforme apresentado na presente invenção, tem numerosas aplicações, das quais algumas são aqui descritas, mas que não limitam o escopo da invenção.
A presente invenção será ainda descrita em detalhes em virtude do isolamento do gene de resistência Mi presente nas linhagens de tomates que são resistentes aos nematóides dos nódulos das raízes. Para o isolamento do gene de resistência Mi, usamos uma estratégia de clonagem com base em mapas (clonagem posicionai), compreendendo as etapas a seguir:
(1) identificação dos marcadores moleculares ligados ao gene de resistência Mi,
(2) construção de uma coleção de YAC genômico de elevado peso molecular,
(3) mapeamento físico dos marcadores moleculares nos clones YAC e na construção contig YAC,
(4) construção de uma coleção de cosmídios dos clones YAC que abrigam os marcadores moleculares ligados,
(5) mapeamento físico preciso e construção contig do cosmídio,
(6) caracterização genética de mutantes do tomate suscetíveis a nematóides dos nódulos das raízes.
(7) transformação de plantas suscetíveis com os cosmídios formando o contig,
(8) análise de complementação.
Para a identificação dos marcadores moleculares, usamos a tecnologia de ampliação do fragmento seletivo de restrição, doravante também denotada como tecnologia de AFLP®, que amplia aleatoriamente um subconjunto de fragmentos de DNA de uma mistura complexa de muitos fragmentos de DNA, e ditos fragmentos ampliados geram impressões digitais que podem ser analisadas. Em geral, os DNA totais de diferentes genótipos da mesma espécie de plantas, são submetidos à tecnologia de AFLP, e as diferentes impressões digitais de AFLP obtidas dos diferentes genótipos são comparadas. Os fragmentos que estão presentes em um genótipo e aumentes em outro genótipo, são fragmentos polimórficos e são denotados como marcadores de AFLP. A seletividade nas reação de AFLP é obtida mediante o uso de nucleotídeos seletivos aleatoriamente escolhidos na extremidade 3' dos iniciadores de PCR imediatamente adjacentes aos nucleotídeos do sítio da enzima de restrição. Em uma triagem de AFLP, o DNA a ser estudado é submetido a combinações diferentes do iniciador. A quantidade total dos diferentes iniciadores que podem ser usados é determinada pelo número de nucleotídeos seletivos que são adicionados à extremidade 3' (4 iniciadores com 1 nucleotídeo seletivo, 16 iniciadores com 2 nucleotídeos seletivos, 64 iniciadores com 3 nucleotídeos seletivos). Se duas diferentes enzimas de restrição forem usados, então existe duas vezes a quantidade de iniciadores.
Aqueles iniciadores podem ser usados em diferentes combinações. Se todas as combinações possíveis forem usadas em uma triagem de AFLP, então todos os fragmentos presentes devem ter sido ampliados com uma das combinações dos iniciadores (Zabeau e Vos, EP 0534858).
Para a identificação dos marcadores de AFLP ligados ao gene de resistência Mi, linhagens diferentes de tomate foram submetidas a uma triagem de AFLP. Em uma primeira etapa, dois conjuntos de linhagens quase isogênicas quanto à resistência aos nematóides versus a suscetibilidade, foram analisados por impressão digital de AFLP usando-se os iniciadores seguintes:
Iniciadores Psth 5 '-GACTGCGTACATGCAGNN-3'
Iniciadores Mseh 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3'
Os N's indicam os nucleotídeos seletivos variáveis. Na triagem de AFLP, todos os iniciadores possíveis para o iniciador Pstl e todos os 64 iniciadores possíveis para o iniciador Mse 1 foram usados nos dois conjuntos de linhagens quase isogênicas, dando um total de 16 χ 64 = 1024 combinações de iniciadores testados. Após análise de todas as impressões digitais de AF LP5 um total de 30 marcadores candidatos de AFLP ligados ao gene de resistência Mi foi identificado. Estes marcadores candidatos foram subseqüentemente analisados em um painel de linhagens de tomates resistentes a nematóides e suscetíveis de nematóides, para confirmação e distância da articulação ao localdo Mi. O gene de resistência Mi foi introgressed no tomate cultivado em 1944 do Lycopersicon peruvianum. As linhagens de tomares resistentes a nematóides foram submetidas a numerosos ciclos de cruzamentos que se esperava resultarem em uma pequena região introgressed do Lycopersicon peruvianum com o gene de resistência Mi.
Esperou-se que o exame dos marcadores de AFLP candidatos nestes genóticos modernos do tomate fosse um bom teste para avaliar a articulação íntima ao local Mi. Um painel de 7 genótipos do tomate resistentes e 11 suscetíveis, foi analisado com os marcadores de AFLP candidatos. Um total de 20 marcadores de AFLP pareceram estar presentes em todas as linhagens resistentes, e ausentes em todas as linhagens suscetíveis, e são referidos como marcadores de AFLP ligados.
A seguir, quatro dos marcadores de AFLP foram avaliados em uma coleção genômica de peso molecular elevado. A clonagem de muito grandes segmentos de DNA como cromossomas artificiais grandes naleveduta, se tornou uma etapa essencial no isolamento dos genes através da clonagem posicionai. A capacidade de clonagem do vetor YAC permite o isolamento dos fragmentos de DNA até um milhão de pares de base de comprimento. A linhagem do tomate Lyeopersieon eseulentum E22, homozygous para o local Mi, foi usada como DNA de origem para construir uma coleção de YAC. Obtivemos uma coleção de YAC contendo 3840 clones com um tamanho médio de insertos de 520 Kb, representando aproximadamente 2,2 equivalentes de genomas do genoma do tomate. Tres clones YAC positivos foram obtidos após a triagem de AFLP com os marcadores de AFLP ligado a Mi: 1/1084, 1/1172 e 2/1256.
Subseqüentemente, a presença de todos os marcadores de AFLP ligados a Mi foi determinada nos 3 clones YAC. Todos os marcadores pareceram presentes em um ou mais dos 3 clones YAC, o que permitiu um primeiro posicionamento dos vários marcadores de AFLP ligados a Mi. Os dados de AFLP indicaram que os 3 clones YAC constituíam uma superposição contig de aproximadamente 1,4 Mb (ver a Figura 1).
Para determinar o tamanho físico do local de Mi compreendendo os marcadores de AFLP ligados a Mi, e contidos nos clones YAC 1/1084, 1/1172 e/ou 2/1256, um mapa de restrição de faixa longa do contig YAC foi construído. Isto definiu um segmento de DNA contendo o local de Mi de cerca de 700 kb, no qual todos os marcadores de AFLP ligados a Mi foram localizados (ver Figura 1).
Uma medida de 700 kb ainda é muito grande para localização direta do gene de resistência Mi. Tais insertos grandes não podem ser transformados em células vegetais diretamente. Portanto, uma coleção de cosmídios foi construída da cepa de levedura contendo YAC 1/1172, e uma coleção de cosmídios foi construída da cepa de levedura contendo YAC 2/1256, usando-se vetores de cosmídios que são adequados para transformação mediada por Agrobacterium. A dimensão deste vetor binário de cosmídios corresponde a 29 kb e é mostrada esquematicamente na Figura 2. A capacidade de clonagem deste vetor binário de cosmídios, usando-se o extrato de adensamento lambda do fago, está dentro da faixa de 9 a 24 kb.
Dois grupos de aproximadamente 250.000 clones de cosmídios cada, foram obtidos do DNA de levedura de tamanho fracionado. Os grupos de cosmídios foram analisados por hibridização de colônias usando-se como fragmentos de restrição rotulados por sondas dos YACs. Os clones de cosmídios positivos foram identificados e, além disso, os cosmídios foram agrupados em sete regiões definidas cobrindo a região do Mi.
Na etapa seguinte, o conjunto de cosmídios das sete regiões definidas foram submetidos a impressão digital usando-se ampliação do fragmento de restrição para determinar sua ordem relativa. Um contig de cosmídio cobrindo um segmento de DNA de aproximadamente 700 kb, pôde ser construído. Subseqüentemente, a presença dos marcadores de AFLP ligados a Mi neste contig do cosmídio foi determinada. Um mapa físico do segmento de DNA compreendendo o gene de resistência Mi com as posições dos vários marcadores de AFLP ligado a Mi, foi obtido (ver Figura 3).
Um total de 96 cosmídios de superposição juntos, constituíram o segmento de DNA compreendendo o gene de resistência Mi. A análise de complementação para identificar o gene de resistência Mi com um tal conjunto grande de cosmídios, é uma tarefa muito laboriosa. Portanto, a posição do gene de resistência Mi no contig do cosmídio foi determinada usando-se as linhagens mutantes do tomate. Estas linhagens de mutantes são membros de uma família que se origina de um predecessor comum e continham um genótipo de Mi do tipo selvagem (resistente a nematóides), mas um fenótipo mutante suscetível de nematóides. Após análise com o conjunto dos marcadores de AFLP ligados a Mi em um grande número destas linhagens de mutantes, três marcadores de AFLP ligados a Mi pareceram estar ausentes na maioria dos mutantes. Estes marcadores de AFLP, portanto, mostraram uma boa correlação entre o genótipo de Mi do AFLP e o fenótipo de Mi, ao contrário de todos os outros 17 marcadores de AFLP. Dois destes marcadores de AFLP, PM14 e PM25 eram adjacentes, e a região em volta destes marcadores foi considerada como sendo a posição mais provável para o gene de resistência Mi. Um conjunto de 6 cosmídios de superposição definindo um segmento de DNA de aproximadamente 50 kb, ao redor dos marcadores de AFLP PM 14 e PM 25, foi selecionado para a análise de complementação (ver Figura 4).
A etapa final na identificação do gene de resistência Mi através da clonagem posicionai é a complementação do fenótipo suscetível correspondente. Os 6 cosmídios da região do Mi candidato foram introduzidos na Agrobacterium tumefaciens através da transferência conjugativa em uma união tri-parental. A presença do cosmídio nas cepas de A. tumefaciens foi determinada comparando-se vários padrões de enzima de restrição, bem como impressões digitais de DNA das cepas de A. tumefaciens coma cepa de E. coli contendo o cosmídio. Apenas aquelas culturas de A. tumefaciens abrigando um cosmídio com o mesmo padrão de DNA como a cultura correspondente de E. coli, foram usadas para transformar uma linhagem de tomate suscetível. Uma linhagem de tomate suscetível foi transformada com os cosmídios Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-Ol e Mi-14 usando-se processos padrão de transformação.
As raízes de plantas R0 transformadas de uma cultura in vitro foram analisadas quanto aos sintomas da doença, a fim de identificar os cosmídios com o gene de resistência. Os explantes das raízes foram transferidos para meio solidificado em pratos de petri e inoculados com dez galhas de uma cultura axênica de nematóides dos nematóides dos nódulos das raízes Meloidogyne incógnita. Os sintomas da doença são classificados seis semanas após a inoculação. Uma planta transgênica é considerada resistente quando nenhuma galha ou uma galha é visível na sua cultura da raiz. Uma planta transgênica é considerada suscetível quando pelo menos duas galhas tenham sido induzidas em sua cultura de raiz. As observações do ensaio da doença in vitro revelaram que 2 cosmídios eram capazes de complementar o fenótipo suscetível. A presença do marcador de AFLP PM14 nas plantas R0 resistentes indicou que o inserto genômico presente nos cosmídios Mi-Il e Mi-18 também está presente nas plantas Ro e está envolvido em conferir às plantas resistência a Meloidogyne incógnita. Os regeneradores primários (plantas R0) das experiências de transformação, foram cultivados na estufa para as sementes determinadas para obter linhagens de Rb que foram analisadas quanto aos sintomas da doença. O ensaio da doença foi realizado em mudas. Por isto, as sementes foram semeadas ou pequenas plantinhas enraizadas foram transferidas para solo infectado com Meloidogyne incógnita, e os sintomas da doença foram classificados 4 a 8 semanas após a inoculação. As plantas foram consideradas resistentes, quando três ou menos galhas eram visíveis nas raízes. As plantas foram consideradas suscetíveis quando mais do que três galhas eram formadas nas raízes. As observações do ensaio da doença in vivo revelaram que as plantas R0 resistentes correspondiam aos transformantes do cosmídio Mi-11.
A fim de confirmar a integração estável do gene de resistência Mi no genoma das plantas R0 transgênicas, as plantas resistentes das linhagens de Ri foram isoladas e cultivadas na estufa quanto ao conjunto de sementes, para obter as linhagens R2. As semeaduras das linhagens R2 foram submetidas a um ensaio in vivo da doença dos nematóides. Os resultados obtidos indicaram a herança estável do gene de resistência Mi.
Finalmente, os insertos nos comídios Mi-Il e Mi-18 foram ainda caracterizados. A análise de sequenciação revelou uma grande estrutura de leitura aberta (ORF2) de 3621 nucleotídeos. A seqüência de DNA acha-se listada na Figura 5.
A seqüência de DNA, compreendendo o gene de resistência Mi foi ainda submetido a estudos de mapeamento de transcritos, a fim de determinar a existência das seqüências intron. Estes estudos de mapeamento de transcritos foram realizados de acordo com os processos de uma forma geral conhecidos, por meio dos quais as seqüências de DNA genômicas foram comparadas com as seqüências de cDNA. A comparação das seqüências de cDNA com as seqüências genômicas revelaram a existência de duas seqüências intron no gene de resistência Mi. Uma intron de 1306 nucleotídeos é localizada a partir da posição dos nucleotídeos 1936 a 3241, e uma segunda intron de 75 nucleotídeos é localizada a partir da posição dos nucleotídeos 3305 a 3379, como se descreve na Figura 5. A posição do sítio inicial de transcrição é postulado ou a montante do nucleotídeo 1880. O primeiro códon inicial de ATG é localizado na posição do nucleotídeo 3263, que fica a 52 nucleotídeos a montante da segunda intron, dando uma grande estrutura de leitura aberta (ORFl) codificando codificando um polipeptídeo de 1257 aminoácidos (Figura 7A).
As pesquisas da homologia mostraram que os polipeptídeos de acordo com a invenção pertencem à classe LRR de proteínas de resistência das plantas (Staskawicz et ai, 1995, Science, 268, 661-667). Além disso, a proteína pode ser dividida em quatro regiões designadas de A a D: a região A compreende uma quantidade elevada de resíduos de leucina, a região B compreende um motivo do sítio de ligação de nucleotídeo, a região C é a região de LRR compreendendo 13 repetições com a seguinte seqüência de consenso: a--aNL--L-a-----a-a/S— (Jones e Jones, 1997, Advances in Botanical Research, 24, 89-167), e a região D não revela qualquer homologia a qualquer proteína conhecida.
Para a identificação e isolamento das seqüências homólogas que se situam dentro do escopo da presente invenção, as coleções genômicas e de cDNA, foram examinadas com a seqüência de codificação do gene de resistência Mi como uma sonda sob condições estringentes de hibridização.
Os clones positivos foram isolados e usados para a análise de complementação. As hibridizações da mancha do Sul no contig YAC foram realizadas com um fragmento Pstl interno da seqüência de codificação do gene de resistência Mi. Três regiões homólogas adicionais puderam ser identificadas: duas emYAC 1/1172 e uma em YAC 1/1084. Cada região compreendia 2 a 3 homólogos de Mi indicativos do fato de que a família do gene Mi é composto de cerca de 10 a 12 membros.
Surpreendentemente, os ensaios da doença de afídios revelaram que as plantas R0, transformadas com o cosmídio Mi-11, eram resistentes a Meloidogyne incógnita, bem como resistentes a Macrosiphum euphorbiae, indicando que o inserto do genoma presente no cosmídio Mi-11 estava envolvido em transmitir resistência às plantas R0 contra os nematóides, bem como em transmitir resistência às plantas Ro contra os afídios. Em particular, uma planta que seja transformada com o gene de resistência em conformidade com a invenção, tem pelo menos uma suscetibilidade reduzida a um ou mais patógenos, especialmente a nematóides e/ou afídios dos nódulos das raízes.
De modo a confirmar a herança da resistência aos afídios, (i) as linhagens de tomate Ri anteriormente obtidas, que derivaram dos transformantes do cosmídio Mi-11 resistentes a nematóides, (ii) as linhagens R2 derivadas das plantas R1 resistentes aos nematóides isoladas e (iii) as linhagens RiBC obtidas de plantas R1 resistentes a nematóides de cruzamento reversível com a linhagem 52201 de tomate suscetível, também foram analisadas quanto à resistência contra M euphorbiae. Os resultados obtidos indicaram a herança da resistência aos afídios.
O cosmídio Mi-11 foi usado para a transformação de genótipos suscetíveis a nematóides do tabaco e da batata, de acordo com processos gerais de transformação conhecidos. As raízes de plantas Ro transformadas das culturas in vitro de tabaco e de batata, foram analisadas quanto aos sintomas da doença, como anteriormente aqui descrito. As observações do ensaio da doença nas culturas das raízes das plantas transformadas indicaram que o cosmídio estava envolvido em conferir às plantas transformadas uma suscetibilidade a nematóides reduzida. O gene de resistência de acordo com a invenção tem um efeito na redução da suscetibilidade de uma espécie de plantas heterólogas, a nematóides, preferivelmente a Meloidogyne spp., especialmente a Meloidogyne incógnita.
Além do mais, os transformantes de tabaco também foram analisados quanto à resistência a afídios, e as plantas R0 resistentes puderam ser identificadas.
O gene de resistência de acordo com a invenção tem uma função dual e tem um efeito nos sistemas heterólogos.
O cosmídio Mi-11 foi depositado em 5 de agosto de 1996 como plasmídio pKGMi-11, no Centraalbureau voor Schimmelcultures em Baarn, nos Países Baixos, sob o número de depósito CBS 822.96.
O cosmídio Mi-18 foi depositado em 5 de agosto de 1996 como plasmídio pKGMi-18, no Centraalbureau voor Schimmelcultures em Baarn, nos Países Baixos, sob o número de depósito CBS 821.96.
Os seguintes exemplos proporcionarão uma outra ilustração da presente invenção, que não é, contudo, limitada a estes exemplos.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: ENSAIO DA DOENÇA
Uma cultura axênica do nematóide Meloidogyne incógnita dos nódulos das raízes é mantida em raízes estéreis do cultivar de tomates Moneymaker. As culturas das raízes se desenvolveram em meio B 5 solidificado (Gamborg et al. 1968, Experimental Cell Research 50: 151-158) com sacarose 2% e sem hormônios.
Os explantes das raízes (1 a 5 cm), derivado das plantas transgênicas do tomate cultivadas in vitro são transferidos para o meio B5 solidificado acima mencionado, para iniciar as culturas das raízes. Ao mesmo tempo, cada explante de raiz é inoculado com dez galhas da cultura axênica de nematóides. As galhas são colocadas uns poucos centímetros do explante das raízes. Os pratos de petri com as raízes e as galhas são incubados no escuro a 25°C. Após quatro a seis semanas, o nível de infecção foi determinado pela contagem do número de galhas formadas nas culturas das raízes. A avaliação quanto à resistência/suscetibilidade a M. incógnita fo/ seguinte:
Uma planta transgênica foi considerada resistente quanto nenhuma ou menos do que duas galhas eram visíveis na sua cultura de raízes. Uma planta trangênica foi considerada suscetível quando pelo menos duas galhas haviam sido induzidas em sua cultura de raízes.
EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES DE AFLP LIGADOS A UM SEGMENTO DE DNA COMPREENDENDO O GENE DE RESISTÊNCIA Mi LINHAGENS DE TOMATE (.Lycopersicon esculentum)
Um total de 9 linhagens de tomate resistentes a Meloidogyne incógnita e 13 linhagens de tomate suscetíveis a M. incógnita foi usado para identificar os marcadores de AFLP. Inicialmente, o controle da AFLP foi realizado em dois conjuntos de linhagens 83M-R quase isogênicas (resistentes) e 83M-S (suscetíveis), e Motelle (resistentes) e Mobox (suscetíveis). Os marcadores candidatos resultantes deste primeiro controle foram confirmados por um segundo controle em 7 linhagens resistentes a M incógnita e 11 linhagens suscetíveis a M incógnita. Dois conjuntos de linhagens quase isogênicas: 1. 83M-R resistente De Ruiter Zonen C.V., Bergschenhoek, Países Baixos (doravante "De Ruiter"
2. 83M-S suscetível De Ruiter
3. Motelle resistente INRA, Montfavet, França
4. Mobox suscetível INRA, Montfavet, França As 7 linhagens resistentes a M incógnita e 11 linhagens suscetíveis a M incógnita para confirmação:
5. DR30 resistente DeRuiter
6. DR17 resistente Deruiter
7. E22 resistente Enza Zaden, de Enkhuizer Zaadhandel B.V., Enkhuizen, Países Baixos (daqui em diante "Enza Zaden")
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ISOLAMENTO E MODIFICAÇÃO DO DNA
O DNA total do tomate das 22 linhagens descritas acima, foi isolado de folhas jovens, como descrito por Bernatzki e Tanksley (Theor. AppL Genet. 72, 314-321). O rendimento típico foi de 50 a 100 μg de DNA por grama de material de folhas frescas. O DNA padrão para a análise de AFLP com a "combinação enzimática Psã-Msel, foi preparado como descrito por Zabeau e Vos (Pedido de Patente Européia EP 0534858), e é descrito resumidamente abaixo:
0,5 μg de DNA de tomate foi incubado por 1 hora a 37°C com 5 unidades de Pstl e 5 unidades de MselX em 40 μl de Tris 10 mM.HAc pH 7,5, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, BSA 50 ng/μl. A seguir, 10 μl de uma solução contendo 5 pMoles de adaptadores de Pstl, 50 pMoles de adaptadores de Mse 1, 1 unidade de DNA T4 ligase, ATP 1 mM em Tris 10 mM.HAc ph 7,5, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, 50 ng/μΐ de BSA, foram adicionados, e a incubação foi continuada durante 3 horas a 37°C. Os adaptadores são descritos abaixo:
A estrutura do adaptador de Pstl era: 5' -CTCGT AG ACTGCGTAC ATGC A-3' 3'-CATCTGACGCATGR-5'
A estrutura do adaptador de Msel era: 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3' 3'-TACTCAGGACTCAT-5'
Os adaptadores foram preparados adicionando-se quantidades equimolares de ambos os filamentos; os adaptadores não eram fosforilados. Após ligação, a mistura de reação foi diluída a 500 μΐ com 10 mM de Tris.HCl, EDTA 0-1 mM pH 8,0, e armazenado a -20°C. A mistura de reação diluída é referida também como gabarito de DNA.
Reações AFLP
Os primers utilizados para a análise de AFLP são representados abaixo:
primers Pstl: 5-'GACTGCGTACATGCAGNN-3' primers Mse 1: 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3' Os N's nos primers indicam que esta parte dos primers apresentava-se variável. Na análise de AFLP utilizou-se todos os 16 primers possíveis para o primer Pstl e todos os 64 primers possíveis foram utilizados para o primer Mse 1. Isto deu um total de 10 χ 64 combinações de primers Pstl e Msel, é [sic] 1024 combinações de primers. Todas as 1024 combinações de primers Pstl e Mse 1 foram utilizadas na análise de AFLP para os marcadores de AFLP ligados com Mi. As reações AFLP foram realizadas da seguinte maneira:
As reações AFLP empregaram um primer Pstl rotulado radiativamente e um primer Mse 1 não-rotulado. Os primers Pst1 foram rotulados na extremidade utilizando-se (γ^33- P)ATP e quinase de polinucleotídeo T4. As reações de rotulação foram realizadas em 50 μl de Tris.HCl 25 mM, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 5 mM de DTT, 0,5 raM espermidina.3HCl utilizando-se 500 g de primer de oligonucleotídeo, 100 μCi de (γ^33- P)ATP e 10 unidades de quinase de polinucleotídeo T4. Para a análise AFLP, foram preparados 20 μl da mistura de reação contendo 5 ng de primer Pstl rotulado (0,5 μl da mistura de reação rotuladora), 30 ng de primer Msel, 5 μl de DNA-gabarito, 0,4 unidades de Taq-polimerase, 10 mM de Tris.HCl pH 8,3, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCl, 0,2 mM de todos os 4 dNTPs. As reações AFLP foram realizadas utilizando-se o seguinte perfil de ciclo: uma etapa de desnaturação de DNA com duração de 30 segundos a 94° C, uma etapa de recombinação de 30 segundos (ver abaixo), e uma etapa de extensão de 1 minuto a 72°C. A temperatura de recombinação no primeiro ciclo foi de 65°C, sendo subseqüentemente reduzida a cada ciclo em 0,7°C para os próximos 12 ciclos, e foi continuada a 56°C para os 23 ciclos restantes. Todas as reações de: amplificação foram realizadas num termociclizador PE-9600 (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA).
Análise de gel de produtos de reação de AFLP
Após a amplificação, os produtos de reação foram misturados com um volume igual (20 μl) de corante de formamida (98 % de formamida, 10 mM de EDTA, pH 8,0, e azul de bromo fenol e xileno cianol como corantes de rastreamento). As misturas resultantes foram aquecidas durante 3 minutos a 90°C e, depois, rapidamente resfriadas sobre gelo. Dois μl de cada amostra foram carregados sobre um gel de poliacrilamida desnaturador (sequenciador) a 5 % (Maxam and. Gilbert Methods in Enzymology 65,499- 560). A matriz de gel foi preparada utilizando-se 5 % de acrilamida, 0,250 de bisacrila de metileno, 7,5 M de uréia em 50 mM de Tris/50 mM de ácido bórico/1 mM de EDTA. A 100 ml de uma solução de gel adicionou-se 500 μΐ de APS a 10 % e 100 μΐ de TEMED, e os géis foram vazados utilizando-se um aparelho de gel SequiGen 38 χ 50 cm (Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Utilizou-se pentes Sharktooth (dente de tubarão) dando 97 pistas nas unidades de gel SequiGen. Utilizou-se 100 mM de Tris/100 mM de ácido bórico/2 mM de EDTA como tamponador corrente. A eletroforese foi realizada com potência constante, 110 Watts, durante aproximadamente 2 horas. Após a eletroforese, os géis foram fixados durante 30 minutos em 10 % de ácido acético secado sobre as placas de vidro e expostos a telas de imagem fosfo Fuji durante 16 horas. Os padrões de fingerprint foram visualizados utilizando-se um sistema de análise de imagem fosfo Fuji BAS- 2000 (Fuji Photo Film Company Ltd., Japan).
Análise de AFLP para marcadores ligados
Realizou-se uma análise de AFLP utilizando todas as possíveis 1024 combinações de primer PstHMse 1 nos dois conjuntos de linhas isogênicas. O objetivo era identificar os marcadores de AFLP presentes tanto nas linhas resistentes e nas ausentes, em ambas as linhas suscetíveis. Os géis de AFLP continham as fingerprints de AFLP de 24 combinações de primer das 4 linhas isogênicas, dando um total de 43 géis. Um total de 30 marcadores de AFLP foram identificados como presentes tanto nas linhas resistentes como nas ausentes, em ambas as linhas suscetíveis. Estes marcadores são referidos como marcadores de AFLP ligados a Mi.
Em seguida, realizou-se as reações de AFLP para determinar a presença dos 30 marcadores candidatos sobre as 7 linhas de tomate resistentes e as 11 suscetíveis. Dos 30 marcadores candidatos, 20 marcadores se mostraram presentes nas 7 linhas resistentes, e se mostraram ausentes nas 11 linhas suscetíveis. Estes 20 marcadores foram utilizados em estudos ulteriores para mapear o gene de resistência Mi. As combinações de primer requeridas para identificar os 20 marcadores Pstl-Mse 1 encontram-se representadas na Tabela 1. Na coluna com as combinações de primer, uPstlji refere-se à seqüência 5-GACTGCGTACATGCAG-3' e nMsel-' refere-se à seqüência 5'-GATGAGTCCTGACTAA-3'. Por exemplo, o marcador PMl4 pode ser identificado utilizando-se o primer Pstl que possui a seguinte seqüência: 5'-GACTGCGTACATGCAGGA-3', e o primer Mse 1 que possui a seguinte seqüência:
5 '-G ATGAGTCCTG AGT AATCT-3'.
TABELA 1
<table>table see original document page 34</column></row><table> EXEMPLO 3: Construção e análise de uma biblioteca YAC do tomate Material
A linha de tomate Lycopersicon esculentum E22 (Enza Zaden) homozogótico com o lócus Mi, foi utilizada como uma fonte de DNA para construir uma biblioteca YAC. Os protoplastas foram isolados das folhas de brotos in vivo com duas a três semanas de idade, como descrito por Van Daelen et al. (Plant Mol. Biol. 12, 341-352).
Protoplastas viáveis (concentração de 50 milhões de protoplastas por ml) foram coletados e misturados com um volume igual de agarose (1 %, Seaplaque, FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA) para formar um plugue. Os protoplastas acamados nos plugues foram lisados com mistura de Iise (0,5 M de EDTA, l % de N-Iaurilsarcosinato e 1 mg/ml de proteinase K, pH = 8,0). Após a lise, os plugues foram armazenados a 4°C em tamponador de armazenagem (mistura de lise fresca) até ser utilizado.
Aproximadamente 3 milhões de protoplastas por plugue, para se obter cerca de 4,5 μg de DNA cromossômico foram utilizados para estudos ulteriores. pYAC4 plasmídeo contendo um único sítio de clonagem de EcoRI foi utilizado como vetor de clonagem, e a cepa de levedura AB13 80 foi utilizada como um hospedeiro (Burke et al., Science 236, 806-812).
Construção da biblioteca YAC
O isolamento de DNA com alto peso molecular, digestão parcial com EeoRi na presença de metilase de EcoRl, ligação de braços de vetor ao DNA genômico, seleção de tamanhos por meio de eletroforese em gel com campo pulsante e transformação do hospedeiro da levedura foram realizados como descrito por Burke; et al., (Science 236, 806-512) e Larin et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 88, 4123-4127).
Todas as manipulações padrão foram realizadas como descrito em Molecular cloning: a laboratorv manual por Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
3840 Clones com um tamanho médio de inserção de 520 kb, que corresponde a 2,2 equivalentes de genoma, foram finalmente obtidos, e os clones individuais foram armazenados em 40 placas de microtitulação de 96 poços contendo 75 μl de solução de YPD (1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona e 2 % de dextrose).
Biblioteca de análise YAC
Para se reduzir o número de amostras manuseadas, as células de uma placa de microtitulação de 96 poços foram combinadas (um combinado de placas) e utilizadas para o isolamento de DNA como descrito por Ross et al. (Nucleic Acids Res., 19, 6053). A biblioteca YAC do tomate de 2,2 equivalentes consiste de 40 poços de microtitulação de 96 poços e, como um resultado, o DNA de 40 combinados de placas foi analisado com os marcadores de AFLP PM10, PM13, PM21 e PM25 utilizando-se o protocolo AFMLP como descrito no Exemplo 2. PM10, PM13, PM21 e PM25 foram selecionados para analisar os combinados de placa YAC porque estes marcadores não interferem com as faixas de fundo da cepa de levedura AB1380. Três combinados de placa positivos, dentre 40, foram identificados com estes quatro marcadores de; AFLP como mostrado na Tabela 2.
Subseqüentemente, uma análise secundária com os quatro marcadores de AFLP (PM 10, PMl3, PM21 e PM25) dos 96 clones YAC individuais de cada placa foi empregado para encontrar o endereço correto dos clones YAC. Foram identificados três clones YAC individuais, designados 1/1084, 1/1172 e 2/1256 (Tabela 2). Subseqüentemente, os três clones YAC individuais foram analisados com os marcadores de AFLP remanescentes. Todos os marcadores identificados PM02 e PM29 estavam presentes em um ou mais destes três clones YAC (Tabela 3). 1O tamanho do clone YAC foi determinado por meio de análise eletroforésica em gel de campo pulsante (PFGE) utilizando-se campo elétrico homogêneo fechado no contorno (CHEF; Chu et al. Science, 235, 1582-1555) e apresentou-se como 470 kb (1/1084), 570 kb (1/1172), e 500 kb (2/1256), respectivamente.
TABELA 2
<table>table see original document page 37</column></row><table>
TABELA 3
<table>table see original document page 37</column></row><table>
EXEMPLO 4: Construção de mm mapa físico de grande alcance do contíguo YAC Mi e localização dos marcadores de AFLP
Os 3 clones YAC 1/1172, 2/1256 e 1/1084 foram submetidos a digestão parcial com concentração crescente das enzimas de restrição Sfil e ifasHll. As amostras foram fracionadas com PFGE, transferidas para uma membrana Gene Screen Plus (DuPont NEN3 Boston, MA, E.U.A analisados por meio de hibridização utilizando-se sondas de seqüência adjacentes à extremidade de acordo com o protocolo para o mapeamento indireto de rótulo de extremidade como descrito por Burke et ai. (Science 236, 806-512). Um mapa físico de YAC 1/1172, 2/1256 e 1/1084 para as enzimas Sfil e Bssh11 poderia ser construído como mostrado na figura 1. A sobreposição entre os diversos clones YAC foi determinada por meio de análise de manchamento Southern utilizando-se os fragmentos de restrição obtidos como uma sonda de digestão dos três clones YAC. Poderia-se construir um contíguo YAC com um tamanho de 1,4 Mb. Com o fim de se isolar os fragmentos YAC as digestões foram realizadas sobre PFGE. A digestão de YAC 1/1172 com S/zl resultou em dois fragmentos (200 Kb e 370 Kb). Digestão de YAC 2/1256 com ZfasHll resultou em quatro fragmentos (40 Kb, 90 Kb, 110 Kb e 260 Kb) conquanto a digestão de YAC 1/1084 com BssH11 deu dois fragmentos com um tamanho de 70 e 400 kb. Como um resultado, o contíguo YAC de 1,4 Mb poderia ser dissecado em 8 regiões correspondentes a 8 fragmentos de restrição obtidos dos três clones YAC, cobrindo a região completa de Mi e as seqüências adjacentes.
Para se posicionar os diversos marcadores de AFLP dentro destas 8 regiões sobre o mapa físico, os marcadores de AFLP foram utilizados como sondas de hibridização nas digestões parciais e completas Sfil e Bssh11 dos clones YAC 1/1172, 2/1256 e 1/1084. Portanto, cada fragmento de marcador de AFLP foi exsicado do gel seco e eluído por meio de difusão em um tamponador contendo 0,5 M de acetato de amônio, 10 mM de acetato de magnésio, 1 mM de EDTA (pH = 8,0), 0,1 % de SDS, re- amplificado com os primers de AFLP não-rotulados correspondentes e, subseqüentemente rotulados com 32P de acordo com o processo de primer randômico de Feinberg e Vogelstein (Anal. Biochem. 132, 6-10). Cada marcador de AFLP poderia ser designado a uma ou mais das oito regiões conforme delineado na Tabela 4 e na Figura 1.
TABELA 4
<table>table see original document page 39</column></row><table>
EXEMPLO 5: Construção de uma biblioteca de cosmídeo de clones YAC 1/1172 e 2/1256
Material
O vetor de cosmídeo binário pJJ04541 é um derivado de pJJl 881 (Jones et al., Transgenic Research 1, 285-297) e baseia-se no plasmídeo pRK290 contendo o gene de resistência à tetraciclina para a seleção em Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens. No sítio único EcoRI de pRK290, seqüências portadoras de T-DNA (LB; repetição de borda esquerda, RB significa a repetição de borda direita) que flanqueia o sítio cos do bacteriófago lambda
o gene de fosfotransferase de neomicina (Beck et al., Gene 19, 327- 336) cuja expressão é promovida pela seqüência do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Odell et al., Mol. Gen. Genet. 223, 369-378), e
a seqüência de poliligante pBluescript (Stratagene, La Jolla, Califórnia, E.U.A.).
O tamanho de pJJ04541 monta a 29 kb e é mostrado esquematicamente na figura 2. A capacidade de clonagem deste vetor de cosmídeo binário, utilizando-se os extratos de empacotamento lambda de fago, encontra-se na faixa de 9 a 24 kb.
Construção da biblioteca
O DNA total da cepa de Saccharomyces eerevisae AB13 80 contendo YAC 1/1172 e o DNA total da cepa de Saccharomyees eerevisae AB1380 contendo YAC 2/1256 foi isolado utilizando-se zimoliase para preparar protoplastas de acordo com Green e Olsen (Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87, 1213-1217).
Uma parcela de ambos os DNAs foi analisada sobre PFGE. Ambos os isolados de DNA apresentaram um tamanho de > 100 kb.
Aproximadamente 15 μg de cada DNA foi parcialmente digerido com SauiA gerando moléculas com um tamanho médio de 15-25 kb. Subseqüentemente, as amostras foram centrifugadas através de um gradiente de sucrose de 10-35 % durante 22 horas, 22.000 rpm a 20°C em um rotor Beckman SW41. Recolheu-se frações de 0,5 ml utilizando-se uma agulha que perfura o fundo do tubo da centrífuga. Uma parcela destas frações foi analisada sobre um gel de agarose a 0,7 %. As frações contendo moléculas de DNA com um tamanho de «20 kb foram combinadas e concentradas por meio de precipitação com etanol.
Subseqüentemente, as extremidades coesivas foram parcialmente preenchidas com dATP e dGTP utilizando-se a estratégia de enchimento parcial de extensões 5' de DNA produzido por meio de endonuclease de restrição do tipo II, conforme descrito por Korch (Nucleic Acids Res. 15, 3199-3220) e Loftus et al (Biotechniques 12, 172-176).
O vetor de cosmídeo binário pJJ04541 foi completamente digerido com Xhol e o fragmento linear foi parcialmente preenchido com dTTP e dCTP, conforme descrito por Korch (Nucleic Acids Res. 15, 3199-3220).
Os fragmentos de 20 kb foram ligados ao vetor de cosmídeo e transduzidos para a cepa de E. coli XLl-Blue MR (Stratagene, La Jolla, Califórnia, E.U.A.) utilizando-se extratos de empacotamento de lambda de fago Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, Califórnia, E.U.A.) conforme recomendado pelos fabricantes. A seleção foi realizada sobre placas de agar LB (1 % de bacteriotriptona, 0,5 % de extrato de bacto-levedura e 1 % de NaCl, pH 7,5) contendo 10 mg/l de tetraciclina. Duas regiões de aproximadamente 250.000 clones de plasmídeo por região foram preparadas de DNA de levedura fracionado com tamanho de 2-3 μg de clones de YAC 1/1172 e 2/1256, respectivamente.
Subseqüentemente, estes transformantes foram armazenados nos poços de placas de microtitulação (96 rebaixos, 100 μΐ de meio LB contendo 10 mg/l de tetraciclina). Réplicas da grade de 96 poços dos clones de cosmídeos em placas de microtitulação foram estampadas sobre filtros de membrana Gene Screen Plus (NEN DuPont) e deixados desenvolver em colônias nos meios. A hibridização das colônias, como descrito por Sambrook et al. (em: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), utilizando-se clones YAC rotulados com P 1/1172 e 2/1256 revelou cosmídeos positivos. Dentre cerca de 10.000 colônias de YAC 1/1172 aproximadamente 200 clones positivos de cosmídeos foram identificados. Dentre cerca de 20.000 colônias de YAC 2/1256, 300 clones positivos de cosmídeos foram identificados.
EXEMPLO 6: Mapeamento fino do segmento do gene de resistência Mi e posicionamento dos marcadores de AFLP
Divisão dos cosmídeos em regiões definidas
Com o fim de se dividir os cosmídeos em sete regiões definidas, os 200 clones positivos de cosmídeos de YAC 1/1172 e os 300 clones positivos de cosmídeos de YAC 2/1256 foram hibridizados com 7 dos 8 segmentos de restrição (fragmentos YAC) conforme delineado no Exemplo 4 (ver Tabela 4 e Figura 1). Os cosmídeos positivos para cada um dos 7 fragmentos YAC foi identificado. Adicionalmente, poderia-se identificar cosmídeos que viessem a reagir positivamente com os fragmentos de restrição de superposição dos dois clones diferentes de YAC.
Construção de um contíguo de cosmídeo do segmento de gene de resistência Mi
Visando-se construir um contíguo de cosmídeo de todos os cosmídeos positivos identificados nas várias regiões, utilizou-se a amplificação do fragmento de restrição. Aproximadamente 500 ng de cada cosmídeo foram utilizados para a preparação do modelo, e os primers na amplificação dos fragmentos de restrição consistiram de um primer EcoRl 5'- GACTGCGTACCAATTC-3' sem nucleotídeos seletivos, e um primer Mse 1 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' sem nucleotídeos seletivos, de acordo com o processo descrito no Exemplo 2. O primer EcoBA foi rotulado na extremidade 5' e todos os 500 cosmídeos foram amplificados utilizando-se o conjunto de primers EcoBl/MseL Os fingerprints de DNA continham cerca de 8 a 20 fragmentos amplificados. Foram selecionados, de cada região, conjuntos de cosmídeos contendo fragmentos amplificados com tamanhos idênticos, sendo novamente executados sobre géis de poliacrilamida conforme descrito no Exemplo 2, até que se pudesse construir um conjunto contíguo de todos os fragmentos amplificados através das regiões definidas.
Adicionalmente, o contíguo do cosmídeo de cada região foi alinhado com as regiões adjacentes com o fim de se construir um contíguo de cosmídeo do lócus Mi. Desta forma, um contíguo de cosmídeo de 96 cosmídeos foi construído abrangendo o lócus Mi de aproximadamente 800 kb.
Posicionamento detalhado dos marcadores de AFLP ligados a Mi no contíguo de cosmídeo Para posicionar os 20 marcadores de AFLP ligados a Mi no contíguo de cosmídeo, os 96 cosmídeos foram digeridos com Pst\, seguido de análise de manchamento Southern, de acordo com Southern, "J. Mol. Biol." 98, 503-515.
Os marcadores de AFLP foram utilizados como sondas de hibridização, conforme descrito no Exemplo 4, no manchamento de Southern dos 96 digests Pstl dos cosmídeos. A posição exata dos marcadores de AFLP ligados com Mi, exceto o marcador PM02, encontra-se delineada na Figura 3
EXEMPLO 7: Análise genética de: mutantes Mi
Uma família de linhas de tomate mutantes foi disponibilizada através de Enza Zaden. Estas linhas foram derivadas de um híbrido F1 heterozigótico do gene de resistência Mi e heterozigótico para o gene Aps-1 (que codifica a fosfatase-1 de ácido), que é muito estreitamente ligado ao Mi (Stevens and Rick, 1986, em: The Tomato Crop, Atherton & Rudich, editores, Chapman and Hall, p.35-109). Diferentes alelos do gene Aps-1 podem ser determinados por meio de análise de isozima (Vallejos, 1983, em: Isozymes in plant geneties and breeding, Tanksley and Orton editores, parte A, Elsevier, Amsterdam, 469-515). O alelo Aps-I1 origina-se de L. peruvianum e foi introgressado em vários genótipos de tomate resistentes a nematóides através da co-segregação com o gene de resistência Mi. Um esquema destas linhas mutantes encontra-se representado abaixo: Fi - híbrido (Aps-1 heterozigótico, fenótipo resistente a Mi)
autopolinizado
F2 - linhas (segregando Aps-I 1:2:1, segregando resistência a Mi 3:1)
autopolinização de plantas F2 heterozigóticas (Aps-J)
F3 - linhas (segregando Aps-I 1:2:1, segregando resistência a Mi 3:1)
autopolinização de plantas F3 heterozigóticas (Aps-I)
F4 - linhas (segregando Aps-I 1:2:1, segregando resistência a Mi 3:1) autopoli nização de pilantas F4 heterozigóticas (Aps-I) F5 - linhas (segregando Aps-1 1:2:1, suscetível a Mi) ↓ autopolinização de plantas F5 heterozigóticas (Aps-1)
F6 - linhas (segregando Aps-1 1:2:1, suscetível a Mi) ↓ autopolinização de plantas F6 homozigóticas (Aps-1^1)
F7- linhas (todas Aps-1^1, suscetíveis a Mi) ↓ autopolinização de plantas F7 homozigóticas (Aps-1^1)
F8 - linhas (todas Aps-1^1, suscetíveis a Mi)
Nas linhas F1, F2, F3 e F4 desta família a presença do alelo Aps- 1^1 correlaciona-se com o fenótipo resistente a Mi, enquanto que a ausência do alelo Aps-1^1 correlaciona-se com o fenótipo suscetível a Mi. Na F5 e progênies subsequentes esta correlação encontra-se perdida: todas as plantas são suscetíveis aos nematóides indiferentemente dos alelos Aps1.
Vinte indivíduos de cada geração F2, F3, F4, F5, F6, F7 e F8 foram testados quanto à resistência aos nematóides, quanto à presença do alelo Aps-1 e à presença dos marcadores de AFLP ligados a Mi. Os testes com nematóides sobre mudas foi realizado em solo contaminado com vesículas radiculares do M. incógnita. Os resultados da resistência aos nematóides foram os indicados no esquema acima: segregação a 3:1 nas plantas F2, F3 e F4, e suscetibilidade em F5 e populações de progênie. A maior parte dos marcadores de AFLP ligados a Mi indicaram um genótipo de Mi idêntico ao marcador de isozima Aps-1. No entanto, 3 dos marcadores de AFLP: PM14, PM16 e PM25 segregaram com o fenótipo Mi. Na maior parte das plantas F5, F6, F7 e Fs a suscetibilidade ao Mi foi indicada pela ausência destes marcadores. Os marcadores de AFLP: PM14, PM16 e PM25 apresentaram uma correlação entre os fenótipo Mi de AFLP e o fenótipo Mi nos mutantes. Os marcadores PM14 e PM25 são adjacentes no mapa físico conforme mostrado na Figura 3B, e, portanto, postulou-se que a região que circunda estes marcadores de AFLI' era um bom candidato para compreender o gene de resistência Mi. EXEMPLO 8: Mapa físico dos clones de cosmídeos de superposição que compreendem o gene de resistência Mi
A identificação dos cosmídeos que hibridizam com os marcadores de AFLP ligados a Mi, PM14 e PM25, foi realizada η Exemplo 6. PM14 identifica cosmídeos Mi-11, Mi-18 e Mi-01, enquanto que PM25 identifica cosmídeos Mi-18 e Mi-01.
Subseqüentemente selecionou-se um pequeno conjunto de cosmídeos em torno dos cosmídeos Mi-11, Mi-18 e Mi-Ol a partir do contíguo de cosmídeos descrito no Exemplo 6. Um contíguo de 6 cosmídeos, compreendendo os 3 cosmídeos identificados e os cosmídeos adjacentes. Estes 6 cosmídeos são: Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-Ol e Mi-14. Visando confeccionar um mapa físico fino destes 6 cosmídeos, as amostras de DNA do contíguo de cosmídeo foram digeridas com Pstl1 seguido de eletroforese sobre um gel de agarosie a 0,8 %. A superposição física entre os vários cosmídeos pôde ser determinada. Combinando-se estes dados com os dados obtidos com relação ao posicionamento detalhado dos marcadores de AFLP ligados a Mi sobre o contíguo de cosmídeo (ver Exemplo 6) pôde-se construir um mapa físico fino com a localização de PM14 e PM25 conforme mostrado na Figura 4. O contíguo de cosmídeo em torno dos marcadores de AFLP, PM14 e PM25, foi calculado como sendo de aproximadamente 50 kb.
EXEMPLO 9: Transformação
Transferência de cosmídeos para o Agrobacterium tumefaciens
Os clones de cosmídeos Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-Ol Mi-14 e o cosmídeo de controle pJJ04541 foram introduzidos no Agrobacterium tumefaciens através de transferência conjugativa em um paramento tri-parental com a cepa auxiliar HBlOl (pRK(2013) essencialmente de acordo com Deblaere et ai. (Methods in Enzvmology 153, 277-292). Desenvolveu-se E. coli em meio LB (1 % de bacto-triptona, 0,5 % de extrato de bacto-levedura e 1 °/o de NaCl, pH 7,5) suplementado com 5 mg/l de tetraciclina, a 37°C. A cepa auxiliar HBlOl (pRK2013) foi desenvolvida em condições idênticas em meio LB suplementado com 100 mg/l de sulfato de canamicina.
A cepa de Agrobacterium tumefaciens AGLl (Lazo et al., Bio/Technology, 9, 963-971, 1991) foi desenvolvida em meio LB suplementado com 100 mg/l de carbenicilina a 28°C. As culturas desenvolvidas de um dia para o outro foram diluídas a 1:100 em meio LB sem quaisquer antibióticos e após 6 horas de crescimento, sendo que 0,1 ml de cada cultura de Agrobacterium, a cultura da cepa auxiliar, e a cultura de cepa de cosmídeo foram misturados e plaqueados sobre placas de agar de LB sem antibióticos. Após uma incubação de um dia para o outro a 28°C, a mistura foi plaqueada sobre placas de agar de meio LB contendo 100 mg/l de carbenicilina e 10 mg/l de tetraciclina, para se analisar quanto a transconjugantes. As placas foram incubadas durante 3-4 dias a 28°C. Foram realizadas duas passagens seriais através de placas de agar seletivo para se selecionar colônias singelas transconjugantes de Agrobacterium.
Caracterização dos transconjugamtes de A. tumefaciens
Desenvolveu-se culturas em escala reduzida a partir de colônias selecionadas, e foram desenvolvidas em meio LB contendo 10 mg/l de tetraciclina. O DNA de plasmídeo foi isolado por meio de Iise alcalina utilizando-se o processo conforme descrito por Ish-Horowicz et al. (Nucl. Acids Res. 9, 2989-2997, 1981), e digerido com Bghli empregando-se técnicas convencionais. Adicionalmente, realizou-se a amplificação de fragmento de restrição sobre DNA miniprep de A. tumefaciens utilizando-se a combinação de enzimas EcoRV'Msel e primers sem nucleotídeo seletivo, conforme descrito no Exemplo 6. Subseqüentemente, comparou-se o padrão de enzima de restrição Bglll e também o fingerprint de DNA do transconjugante de A. tumefaciens com aqueles do DNA de miniprep da cepa de E. coli contendo o cosmídeo. Apenas aqueles transconjugantes de A. tumefaciens que abrigam um cosmídeo com o mesmo padrão de DNA que a cultura correspondente de E. coli foram utilizados para transformar uma linha de tomate suscetível.
Transformação de uma linha de tomate suscetível
Sementes da linha de tomate suscetível 52201 (Rijk Zwaan, De Lier, Holanda) foram submetidas a esterilização de superfície em hipoclorito de sódio a 2 % durante 10 minutos, enxaguadas três vezes em água destilada estéril, e colocadas sobre meio de germinação (consistindo de meio MS de meia intensidade, de acordo com Murashige and Skoog, Phvsiol. Plant. 15, 473-497, com 1 % (peso/vol) de sucrose e 0,8 % de agar) em vasos de vidro ou vasos de cultura de polipropileno. Foram deixadas germinando durante 8 dias. As condições de cultura foram de 25°C, uma densidade de fluxo de fótons de 30 μmol.m"2 .s"1 e um foto-período de 16/24 h. A transformação do tomate foi realizada de acordo com Koornneef et al. (1986), em: Tomato Biotechnology, 169-178, Alan R. Liss, Inc., e encontra-se descrita brevemente abaixo. Explantes cotilédones com oito dias de vida foram pré-cultivados durante 24 horas em discos de Petri contendo uma camada nutritiva de células de Peiunia hybrida em suspensão, plaqueadas sobre meio MS20 (meio de cultura de acordo com Murashige and Skoog, (1962) Physiol Plant. 15, 473-497 com 2 % (peso/volume) de sucrose e 0,8 % de agar) suplementado com 10,7 μΜ de ácido α-naftalenoacético e 4,4 uM de 6-benzilaminopurina. Os explantes foram então infectados com a cultura realizada de um dia para o outro, diluída, de Agrobacterium tumefaciens contendo os clones de cosmídeo Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-Ol e Mi-14 ou o vetor de cosmídeo pJJ04541 durante 5-10 minutos, secados com mata- borrão sobre papel de filtro estéril e co-cultivados durante 48 horas sobre as placas originais de camada nutritiva. As condições de cultura foram as descritas acima. As culturas de Agrobacterium tumefaciens desenvolvidas de um dia para o outro foram diluídas em meio MS20 líquido (meio de acordo com Murashige and Skoog (1962) com 2 % (peso/vol) de sucrose, pH 5 7) para uma O.D.óoo de 0,8.
Após o co-cultivo, os explantes de cotiledônios foram transferidos para discos de Petri com meio seletivo consistindo de MS20 suplementado com 4,56 μΜ de zeatina, 67,3 μΜ de vancomicina, 418,9 μΜ de cefotaxima e 171,6 μΜ de sulfato de canamicina, e cultivados sob as condições de cultura descritas acima. Os explantes foram subculturados a cada 3 semanas sobre meio fresco. Os brotos emergentes foram dissecados do calo subjacente e transferidos para. vasos de vidro com meio seletivo sem zeatina para formar raízes. A formação de raízes em um meio contendo sulfato de canamicina foi encarada como uma indicação da natureza transgênica do broto em questão. Regenerantes verdadeiramente transgênicos foram propagados in vitro subculturando-se o meristema apical e brotos auxiliares em vasos de vidro com meio seletivo fresco sem zeatina.
EXEMPLO 10: Análise de complementação
Identificação de cosmídeos com o gene de resistência Mi por meio de análise quanto à resistência em raízes de plantas transformadas
Raízes de plantas R0 transformadas desenvolvidas in vitro foram submetidas ao ensaio de doença conforme descrito no Exemplo 1. De cada transformante foram testados dois explantes de raízes. Ao todo foram testadas 72 plantas R0 de 7 diferentes transformações de cosmídeos; 6 cosmídeos portando DNA de inserção de tomate e um cosmídeo, pJJ04541, está sem DNA de inserção de tomate. Os resultados encontram-se na Tabela 1. Sessenta e três plantas R0 transgênicas mostraram-se suscetíveis porque haviam-se formado vesículas sobre pelo menos uma das culturas de raízes.
Nove plantas R0 mostraram-se resistentes porque não foram encontradas vesículas nas culturas de raízes. Sete plantas resistentes haviam sido derivadas da transformação com cosmídeo Mi-11, enquanto que duas plantas resistentes haviam sido derivadas com cosmídeo Mi-18, que superpõe-se em grande parte ao cosmídeo Mi-11. Os cosmídeos Mi-Il e Mi-18 foram utilizados para outras análises moleculares.
TABELA 1
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Análise molecular das plantas transformadas com um fenótipo resistente
Para demonstrar que o fenótipo resistente de plantas R0 transgênicas, que haviam estado com os cosmídeos de superposições Mi-11 e Mi-18, é determinado pelo inserto genômico presente em vários cosmídeos, foram realizadas uma análise de AFLP com o marcador de AFLP PM14. A amplificação do fragmento de restrição seletiva foi realizada com cosmídeos Mi-11 and Mi-18. Os fingerprints de DNA mostraram a presença do marcador PMl4 nas plantas resistentes, indicando que o inserto genômico presente nos cosmídeos Mi-11 e Mi-18 também está presente nas plantas R0 e que os dois cosmídeos que se superpõe, Mi-11 e Mi-18 compreendem o gene de resistência Mi.
Os insertos em cosmídeos Mi-11 e Mi-18 e os insertos nos cosmídeos adjacentes Mi-32, Mi-30, de um lado, e cosmídeos Mi-01 e Mi-14, do outro lado, foram mais caracterizados. A região de DNA que compreende o gene de resistência Mi baseada na superposição entre os cosmídeos Mi-11 e Mi-18 foi avaliada em aproximadamente 16-18 kb. Com base na suscetibilidade das plantas R0 que possuem o inserto presente no cosmídeo Mi-30, esta região poderia ser estreitada até aproximadamente 12 kb. XJM segmento de DNA compreendendo o gene de resistência Mi, correspondendo à região flanqueada pelas extremidades direitas dos cosmídeos Mi-30 e Mi- 11, foi sequenciada (ver a Figura 4).
EXEMPLO 11: Seqüência de mucleotídeos e seqüência deduzida de aminoácido do gene de resistência Mi do tomate Subclonagem do segmento de DNA de superposição
Para se determinar a seqüência do segmento de DNA de superposição nos cosmídeos Mi-Il e Mi-18 contendo o gene de resistência Mi, gerou-se um conjunto randômico de subclones com um tamanho de inserto de aproximadamente 2 kb. 7,5 μg de DNA de cosmídeos Mi-11 e Mi- 18 purificado com CsCl foi compartilhado durante 10 segundos a 4°C a 15 % de potência da sonda (em 40 μl de Tris-acetato 10 mM, acetato de Mg 10 mM e acetato de K 50 mM) utilizando-se um sonificador Misonix (Misonix Inc., Farmingdale, NY, E.U.A.) com uma cometa enchida com água (tipo 43 IA). Subseqüentemente, o DNA foi aquecido durante 10 minutos a 60°C e resfriado à temperatura ambiente. As extremidades dos fragmentos de DNA foram reparadas adicionando-se 10 μΐ de uma mistura de reparo (10 mM de Tris-acetato, 10 mM de acetato de Mg, 50 mM de acetato de K, 10 U de polimerase de DNA Klenow, 10 U de polimerase T4DNA e 2 mM de todos os 4 dNTP's), seguindo-se a isto incubação durante 30 minutos a 20°C. O DNA compartilhado foi separado por meio de eletroforese sobre gel de agarose Seakem GTG a 1 % (FMC Bio Products, Rockland, ME, E.U.A.). A fração com um tamanho de 1,8-2,2 kb foi exsicada do gel e, subseqüentemente, a fatia de gel foi digerida com β-agarase I, de acordo com o protocolo do fabricante (New England Biolabs Inc., Beverly, MA, E.U.A.) e o DNA foi precipitado.
Utilizou-se um vetor pUC19 modificado (denominado pStuc) para clonar a fração de 1,8-2,2 kb., Neste vetor, o fragmento BamHl/Sall do pUC19 foi substituído por um fragmento de DNA contendo um sitio de restrição Stul, Spel, e Sall, empregando-se dois primers de oligonucleot(deo e técnicas convencionais de clonagem conforme descrito por Sambrook et al. (em: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). A fração de 1,8-2,2 kb foi ligada a 16°C no a [sic] vetor pStuc digerido com Stul e desfosforilado. A mistura de ligação foi subseqüentemente transformada em células ultracompetentes de Epicurian Coli X12-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.). Foram desenvolvidas colônias individuais e armazenadas em placas de microtitulação de 384 poços (100 μl de meio LB contendo 100 mg/l de carbencilina).
Para isolar os clones que representam a região de superposição do DNA nos cosmídeos Mi-11 e Mi-18 contendo o gene de resistência Mi, o fragmento de PstX de 8,6 kb e 4,5 kb do clone de cosmídeo Mi-18 (ver Figura 4), como também o marcador de AFLP, PM14, foram utilizados como sondas de hibridização em hibridizações de colônias. Portanto, foram estampadas réplicas da grade de 384 poços de clones em placas de microtitulação sobre filtros de membrana Gene Screen Plus (DuPont NEN, Boston, MA, E.U.A.) e deixadas desenvolver a colônias no meio.
Oitenta e quatro clones positivos foram utilizados para isolar o DNA de plasmídeo, utilizando-se o processo de Iise alcalina conforme descrito por Ish-Horowicz et al. 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2989-2997.
Análise da seqüência
Utilizou-se o kit de reação rápida de sequenciamento de ciclo de terminador de corante ABI PRISM para realizar as reações de sequenciamento em um sistema Gerie-Amp PCR modelo 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA. E.U.A.). Utilizou-se primers padrão Ml3 para a frente e reversos. Os produtos de reação foram analisados sobre géis de 48 cm de um ABI Prism 377. A seqüência de DNA dos 84 clones selecionados foi determinada utilizando-se os primers de sequenciamento padrão à frente e reverso. A montagem e a análise da seqüência foram realizadas com o programa de análise de seqüência STADEN versão 1994 (Dear and Staden, 1991, Nucl. Acids Res. 19, 3907-3911). Pôde-se formar uma seqüência contígua de DNA de aproximadamente 9,9 kb de nucleotídeos, como mostrado na Figura 5. Pôde-se deduzir uma grande matriz de leitura aberta de 3621 nucleotídeos (ORF2) codificando um polipeptídeo truncado com 1206 aminoácidos (Figura 7B).
EXEMPLO 12: Infecção com nematóide do nó de raiz: inoculação no solo
Solo infectado com o nematóide de nó de raiz Meloidogyne incógnita fora preparado da seguinte maneira: Os sistemas radiculares de plantas de tomate intensamente infestadas com um alto número de vesículas (ou nós de raiz) foram cortados em pedaços e misturados com solo fresco.
As sementes foram semeadas, ou pequenas mudas enraizadas foram transferidas para o solo infectado. As plantas foram desenvolvidas numa estufa a uma temperatura de 25°C. Após 4 a 8 semanas, as plantas foram cuidadosamente retiradas do solo e as raízes foram enxaguadas com água de modo a se remover o solo aderente. O nível de infecção foi determinado por meio de contagem das vesículas formadas.
As plantas foram consideradas resistentes quando três vesículas ou menos eram visíveis sobre as raízes. As plantas foram consideradas suscetíveis quando mais do que três vesículas haviam se formado sobre o sistema radicular.
EXEMPLO 13: Análise de complementação
Identificação dos cosmídeos com o gene de resistência Mi através da análise quanto à resistência nas progênies autopolinizadas de plantas transformadas.
Os regenerantes primários (regeneração R0) dos experimentos de transformação foram desenvolvidos na estufa para fixação das sementes. Para cada cosmídeo foram desenvolvidos de dez a quinze regenerantes, e foram colhidas sementes R1. Linhas R1 de pelo menos sete plantas R0 de cada cosmídeo foram testadas quanto à resistência contra Meloidogyne incógnita com o fim de se identificar cosmídeos com o gene de resistência. Vinte a 30 mudas ou plantinhas de cada linha R1 foram inoculadas e avaliadas como descrito no Exemplo 12.
Ao todo 63 linhas R1 de 7 diferentes transformações de cosmídeos foram testadas; 6 cosmídeos portanto DNA de inserção de tomate, e um cosmídeo, pJJ04541, sem o DNA de inserção de tomate. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Cinqüenta e quatro plantas R0 transgênicas mostraram ser suscetíveis, porque haviam-se formado vesículas nos sistemas radiculares de todas as plantas R1. Nove plantas Ro foram consideradas resistentes porque pelo menos metade das plantas de cada linha Ri apresentou três ou menos vesículas. Uma linha R1 mostrou ser completamente resistente, seis linhas Ri segregaram numa proporção de 3:1 (resistente a plantinhas suscetíveis), e as progênies de duas plantas Ro segregaram a 1:1. Todas as nove plantas Ro resistentes haviam sido derivadas de transformações com cosmídeo mi-11.
Obteve-se evidência genética adicional quanto à presença do gene de resistência Mi sobre o cosmídeo Mi-11 na geração seguinte. As plantas Ri resistentes foram autopolinizadas. Quatorze das linhas R2 resultantes, que se originaram de quatro diferentes plantas Ro, foram testadas quanto à resistência contra o M incógnita. Vinte a trinta mudas de cada linha R2 foram inoculadas e avaliadas conforme descrito no Exemplo 12. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Cinco linhas R2 mostraram ser completamente resistentes, indicando que as plantas R1 parentais eram homozigóticas quanto ao gene de resistência Mi. Oito linhas R2 segregaram numa proporção de 3:1, indicando que suas plantas parentais R1 eram heterozigóticas quanto ao gene de resistência Mi. Uma linha R2 mostrou- se segregadora numa proporção de cerca de 1:1, e nenhuma das linhas testadas mostrou ser completamente suscetível. Estes resultados provam que as plantas R1 selecionadas, que são derivadas de diversas plantas transformadas com cosmídeo Mi-11, contém o gene de resistência funcional Mi.
TAEELA 2
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TABELA 3
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EXEMPLO 14: Ensaio de infecção com o áfide da batata
Pequenas plantas de tomate (com 4 semanas de idade) foram inoculadas com o áfide da batata (.Macrosiphum euphorbiae) colocando-se de cinco a oito áfides fêmeas sobre as folhas. As plantas foram desenvolvidas na estufa a uma também de 18°C a 20°C. Após de uma a duas semanas determinou-se o nível de resistência contando-se o número de áfides recentemente nascidos.
As plantas foram consideradas resistentes quando nenhum áfide vivo estava presente sobre o caule ou as folhas. As plantas foram consideradas suscetíveis quando estavam presentes áfides recentemente nascidos.
EXEMPLO 15: Análise de complementação
Identificação dos cosmídeos com o gene de resistência Meu-1 por meio de análise quanto à resistência nas progênies autopolinizadas de plantas transformadas.
Um subconjunto de linhas Ri obtidas no Exemplo 13 foi testado quanto à resistência contra Macrosiphum euphorbiae para se identificar cosmídeos com o novo gene de resistência Meu-1. Dez a quinze plantinhas de cada linha Ri foram inoculadas e avaliadas como descrito no Exemplo 14. Ao todo 41 linhas R1 de 7 diferentes transformações de cosmídeos foram testadas; 6 cosmídeos portanto DNA de inserção de tomate e um cosmídeo, pJJ04541, sem o DNA de inserção de tomate. Os resultados encontram-se na Tabela 4. Trinta e seis plantas R0 transgênicas são consideradas suscetíveis porque dúzias de áfides encontravam-se proliferando sobre todas as plantas, ou sobre a maior parte das planta de cada linha R1. Cinco plantas Ro são resistentes porque pelo menos metade das plantas de cada linha Ri mostrou não ter áfides vivos. Todas estas plantas Ro resistentes haviam sido transformadas com o cosmídeo Mi-11.
Os resultados obtidos indicam fortemente que as plantas R0 que se derivam de transformações com cosmídeo Mi-11, contém um gene de resistência funcional Meu-1. TABELA 4
Cosmídeo Número de linhas R j de plantas Ro independentes testadas Total Proporção de segregação R:S (resistente : suscetível)
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Obteve-se na geração seguinte evidência genética adicional quanto à presença do gene resistente Meu-I. Vinte e quatro linhas R2 que haviam sido obtidas de autopolinizações de plantas Ri resistentes a nematóides (ver o Exemplo 13), que se originaram de nove diferentes plantas R0, foram testadas quanto à resistência contra o M euphorbiae. De onze a quinze mudas de cada linha R2 foram inoculadas e avaliadas como descrito no Exemplo 14. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Uma linha R2 segregou numa proporção de 3:1, e oito linhas R2 segregavam numa proporção de cerca de 1:1. Nestas nove linhas o fenótipo de resistência do áfide da batata é claramente visível. Cinco linhas R2 mostraram ser completamente suscetíveis. As demais dez linhas R2 obtiveram uma avaliação intermediária: elas segregaram numa proporção de cerca de 1:3. Estes resultados indicam que várias plantas R1, que são resistentes ao Meloidogyne incógnita e que se derivam de plantas R0 transformadas com o cosmídeo Mi- 11, apresentam um gene de resistência funcional Meu-L
Adicionalmente, oito linhas RiBC que foram obtidas de plantas Ri resistentes a nematóides recruzadas com a linha suscetível de tomate 52201 foram testadas quanto à resistência contra M euphorbiae para se confirmar a herança do gene de resistência Meu-I introgressado. De doze a quinze mudas de cada linha RiBC foram inoculadas e avaliadas como descrito no Exemplo 14. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
As proporções de segregação mostradas na Tabela 5 e na Tabela 6 servem apenas para ilustrar a herança do fenótipo resistente.
TABELA 5
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EXEMPLO 16: Exemplo de transcrição
Foram realizados estudos de mapeamento de transcrição para mapear a ponta 5' e 3' do gene resistente Mi e para determinar se o gene de resistência Mi contém quaisquer íntrons. Utilizou-se, para esta finalidade, a reação em cadeia de polimerase para amplificar partes das transcrições do gene de resistência Mi.
O RNA total do tecido das folhas do cultivar E22 resistente do tomate foi isolado de acordo com o processo de fenol quente, conforme descrito por Sambrook et al. (em: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). RNA poli A + foi isolado utilizando-se oligo(dT) biotinilado ligado a estreptavidina Dynabeads M-280 (DYNAL A.S., Oslo, Noruega) de acordo com as instruções do fabricante.
Construiu-se uma biblioteca de cDNA utilizando-se o kit Superscript Rnase H Reverse Transcriptase cDNA da firma Life technologies, Inc. Gaithersburg, MD, E.U.A. e o protocolo fornecido pelo fabricante. Obteve-se produtos 5' e 3' RACE utilizando-se o kit de amplificação de cDNA Marathon da Clontech (Paolo Alto, CA, E.U.A.). Os primers foram designados com base na seqüência Mi genômica e, especialmente, na ponta 5' da seqüência codificadora de ORF2. Subseqüentemente, os diversos fragmentos de RACE 5' e 3' foram clonados no vetor de clonagem TA pCRll (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, E.U.A.) e sequenciados utilizando-se protocolos convencionais. As seqüências de nucleotídeo obtidas foram alinhadas com a seqüência genômica de 9,9 kb e duas seqüências de íntrons puderam ser deduzidas para a ponta 5' do gene de resistência Mi. Um íntron de 1306 nucleotídeos foi localizado da posição de nucleotídeos 1936 a 3241 e o segundo da posição de nucleotídeos 3305 a 3379 (Figura 5).
A maior transcrição de Mi detectada com o kit de amplificação de cDNA Marathon mapeia na posição de nucleotídeo 1880. Daí, concluímos que o sítio de iniciação transcricional Mi está posicionado no nucleotídeo 1880 ou a montante deste. O primeiro códon ATG que pôde ser detectado dentro do cDNA de 5' encontrava-se na posição de nucleotídeo 3263, 52 nucleotídeos a montante do segundo íntron, e uma ampla matriz de leitura aberta (ORFl) codificando um polipeptídeo de 1257 aminoácidos pôde ser deduzida e é mostrada na Figura 7A. Como um resultado, este segundo íntron está localizado entre o aminoácido 14 e o 15 do produto de gene de resistência Mi.
EXEMPLO 17: Análise de PCR de plantas transformadas com Mi-11 e MI-18
Dados obtidos da análise de complementação em raízes de plantas transformadas (Exemplo 10) indicaram que o gene de resistência Mi estava localizado em um segmento de DNA que se superpõe entre os cosmídeos Mi-11 e Mi-18, excluindo o segmento de DNA que corresponde ao cosmídeo Mi-30, cujos transformantes eram todos suscetíveis. Esta região foi avaliada como sendo de cerca de 12 kb. No entanto, na análise de complementação das progênies autopolinizadas de plantas transformadas, apenas as plantas transformadas com Mi-11 foram avaliadas como resistentes (Exemplos 13 e 15). Para se atacar a questão de porque as plantas transformadas com Mi-18 foram avaliadas como suscetíveis, realizou-se uma análise de PCR na presença ou na ausência de Mi-ORP putativo em plantas transformadas com Mi-11 e Mi-18.
Foram analisadas as seguintes amostras de DNA.
1. Clone YAC 2/1256.
2-3. Cosmídeo Mi-Il em E. coli e em A. tumefaciens, respectivamente.
4-5. Cosmídeo Mi 18 em E. Coli e em A. tumefaciens, respectivamente.
6. Linha de tomate E22 (resistente).
7. Linha de tomate 52201 (suscetível).
8-12. Cinco plantas transformadas com o cosmídeo Mi-11.
13-17. Cinco plantas transformadas com o cosmídeo Mi-18.
O DNA foi digerido com Pstl e adaptadores Pstl onde ligado. Subseqüentemente realizou-se uma análise de PCR com um primer que identifica o sítio Pstl e três nucleotídeos seletivos adicionais ou marcador PM14 e vários primers de PCR localizados a montante de PM14 utilizando a enzima rTh (kit de PCR Gene Amp XL; Perkin Elmer). Os produtos gerados variaram em tamanho desde 443 a 6110 bp e abrangem toda região a montante PM14 da Mi-ORF putativa (ver Figura 6).
Demonstrou-se que todos os modelos geraram produtos de PCR do tamanho esperado, com a exceção de cinco plantas transformadas com cosmídeo Mi-18. Apenas o menor produto de PCR (443 bp) foi formado. Estes dados indicam que quase toda a região a montante PM14 não estava presente em plantas transformadas com o cosmídeo Mi-18. Estas deleções não ocorrem quando o cosmídeo Mi-18 está presente na E. coli ou A. tumefaciens, porém só ocorrem em plantas transformadas. Daí, concluímos que estas deleções são responsáveis pelo fenótipo suscetível a Meloidogyne incógnita e/ou Macrosiphum euphorbiae de plantas transformadas com Mi- 18.
EXEMPLO 18: Seqüência de nucleotídeos do cosmídeo Mi-11
A observação de que apenas plantas transformadas com o cosmídeo Mi-11 apresentaram o fenótipo resistente pode indicar que matrizes adicionais de leitura aberta presentes no Mi-11 poderiam constituir candidatos para codificar a resistência contra nematóides e/ou áfides. Portanto, a seqüência de nucleotídeos da região a montante da ORFl postulada foi determinada identificando matrizes adicionais de leitura aberta. Isolou-se um conjunto de subclones randômicos com um tamanho de inserção de 2 kb utilizando-se o fragmento 2,1, 4,7 e 2,9 kb de Pstl do clone de cosmídeo Mi-11 como sondas de hibridização na hibridização de colônias, essencialmente como descrito no Exemplo 11.
Foram utilizados quarenta e nove clones positivos para determinar a seqüência de DNA utilizando-se os primers de sequenciamento convencional à frente e reverso. A montagem da seqüência e a análise foram realizadas como descrito no Exemplo 11.
Três extensões contíguas de DNA com tamanho de 5618 bp (con25), 898 bp (conlO) e 2495 bp (con62) puderam ser deduzidas. As folgas entre estas extensíveis de DNA e a seqüência de DNA com 9870 bp contendo a Mi-ORF putativa (Figura 6) foi calculada empregando-se PCR e variou entre 5-200 bp.
Os três contíguos determinados (con25, conlO e con62) foram analisados quanto à distribuição de códons de interrupção em todas as seis matrizes possíveis. Não se pôde postular matrizes ORF significativas com um tamanho de, ou maior de que, 120 aminoácidos. Adicionalmente, não se detectou homologia do DNA com a ORFi putativa. Daí, a 'única ORF significativa presente no cosmídeo Mi-II foi a ORF1, conforme descrito na Figura 5. Com base nestes resultados, pode-se concluir que o polinucleotídeo codificado pela ORF1 confere resistência aos nematóides e também aos áfides, e, daí, o gene de resistência Mi e o gene de resistência Meu-1 referem- se à mesma seqüência de codificação conforme representado na figura 5.
EXEMPLO 19: Transformação do tabaco e análises de complementação Transformação do tabaco
O cultivar de tabaco Petit Havana, tipo SR1, foi transformado com o cosmídeo Mi-11 ou o vetor de cosmídeo PJJ04S41 utilizando-se o protocolo como descrito por Horsch et al.
(Science 227, 1229-1231, 1985).
Análise de complementação: Análise da resistência a nematóides em culturas radiculares de plantas de tabaco transformadas
Raízes de plantas R0 transformadas desenvolvidas in vitro foram submetidas ao ensaio com doença conforme descrito no Exemplo 1. De cada um dos 31 transformantes dois ou mais explantes de raízes foram submetidos a ensaio. De cada um dos 31 transformantes dois ou mais explantes de raízes foram analisados por meio de PCR quanto à presença da ORF1 putativa, por meio de análise quanto a um fragmento interno com um tamanho de 823 pares de bases (abrangendo desde a posição de nucleotídeo 4824 até 5646, ver a Figura 5). Primers simples de PCR para o fragmento foram deduzidos a partir da seqüência mostrada na figura 5. Os primers utilizados têm as seguintes seqüências:
primer S21: 5'-CCAAX3GACAGAGGTCTAATCG-3'
primer S22: 5'-TTGAGGTGATGTGGTAAATGG-3'
O primer S21 objetiva a seqüência da posição de nucleotídeos 4824 até 4844 e o primer S22 objetiva a seqüência da posição de nucleotídeos de 5626 até 5646 (ver a Figura 5). Os resultados do ensaio de doença in vitro e da análise de PCR (presença "+" ou ausência do fragmento de PCR interno) são mostrados na Tabela 7. "Mi-11 "representa plantas transformadas compreendendo a Mi ORFl putativa, e "Mi-ΙΙΔ" representa aquelas plantas transformadas que possuem uma deleção na Mi ORFl putativa, conforme determinado pela análise de PCR (descrito acima). Vinte e nove transformantes Ro mostraram-se suscetíveis porque se formaram vesículas em pelo menos uma das culturas de raízes testadas. Geralmente, a taxa de formação de vesículas nas raízes do tabaco é ligeiramente menor do que em raízes de tomate suscetíveis. Duas plantas Ro foram avaliadas como resistentes ao Meloidogyne incógnita porque não se foram encontradas vesículas nas culturas de raízes. Ambas as plantas resistentes foram transformadas com cosmídeo Mi-11 compreendendo o fragmento de PCR interno, indicando a presença do gene de resistência Mi.
TABELA 7
<table>table see original document page 62</column></row><table>
Análise de complementação: Análises quanto à resistência aos áfides em excertos ou plantas de tabaco transformadas
Excertos enraizados de plantas R0 de tabaco transformadas foram inoculados e avaliados conforme descrito no Exemplo 14. De cada um dos 23 transformantes, dois ou três excertos foram analisados quanto à resistência contra o Macrosiphum euphorbiae. Os resultados do ensaio de infecção e da análise de PCR (como descrito acima) são mostrados na Tabela 8. Vinte e uma plantas R0 foram consideradas suscetíveis porque se contou vários áfides sobre pelo menos um dos excertos testados. Em geral, o nível de proliferação dos áfides no tabaco é baixo quando comparado com a proliferação em plantas de tomate suscetíveis. Duas plantas foram avaliadas como resistentes porque todos os excertos destas plantas não apresentaram áfides vivos. As plantas resistentes a áfides foram transformadas com cosmídeo Mi-11, compreendendo o gene de resistência Mi, conforme indicado pela presença do fragmento de PCR interno.
TABELA 8
<table>table see original document page 63</column></row><table>
EXEMPLO 20: Transformação da batata e análises de complementação Transformação da batata
A variedade de batata Diamant (Cebeco Zaden B.V., Vlijmen, Holanda) foi utilizada para transformação. Explantes inter-nós de plantas desenvolvidas in vitro foram transformados com cosmídeo mi-11 ou o vetor de cosmídeo pJJ04541 utilizando-se o protocolo conforme descrito por Ooms et ai. (Theor. Appl. Genet. 73, 744-750).
Analise de complementação: Análise quanto à resistência aos nematóides em culturas de raízes de plantas transformadas
Raízes de plantas de batata R0 transformadas desenvolvidas in vitro foram submetidas ao ensaio de doença conforme descrito no Exemplo 1.
De cada um dos 31 transformantes, pelo menos dois explantes de raízes foram testados. Além disso, todos os 26 transformantes Mi-Il foram analisados por meio de PCR utilizando-se primers S21 e S22 como descrito no Exemplo 19. Os resultados do ensaio de doença in vitro e da análise de PCR (presença "+" ou ausência "-"do fragmento de PCR interno) são mostrados na Tabela 9. "Mi-11 "representa plantas transformadas compreendendo a Mi ORF1 putativa, conforme determinado por análise de PCR (descrito acima). Vinte e oito transformantes R eram suscetíveis porque se formaram vesículas em pelo menos uma das culturas de raízes.
Geralmente, a proporção de formação de vesículas em raízes de batatas é menor que sobre raízes de tomate suscetíveis. Três plantas Ro foram avaliadas como resistentes ao Meloidogyne incógnita porque não se pôde encontrar vesículas na culturas de raízes. Todas estas plantas resistentes foram transformadas com cosmídeo Mi-Il compreendendo o fragmento de PCR interno, indicando a presença do gene de resistência Mi.
TABELA 9
<table>table see original document page 64</column></row><table>
Análise de complementação: Análise quanto à resistência aos nematóides em enxertos de plantas transformadas
Excertos enraizados de plantas R0 transformadas com Mi-II foram submetidos ao ensaio com doença conforme descrito no Exemplo 12.
De cada um dos 19 transformantes, um dos três excertos foi testado quanto à resistência contra o Meloidogyne incógnita. Os resultados são mostrados na Tabela 10. Adicionalmente, 36 excertos enraizados de plantas de batata não- transformadas (variedade Diamant) foram testados (como controles suscetíveis) e mostraram ser todos suscetíveis. Uma planta R0 foi avaliada como resistente ao Meloidogyne incógnita porque não se pôde achar vesículas no sistema de raízes. TABELA 10
<table>table see original document page 65</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> KEYGENE N.V.
<120> RESISTÊNCIA CONTRA NEMATÓDEOS E/OU AFÍDIOS
<130> B03315AAJ - AD/LV/KN
<140> PI9711048-5 <141> 1997-08-08
<150> EP 96401764.4 <151> 1996-08-09
<150> EP 97401101.7 <151> 1997-05-16
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3774
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> gene Mi <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (3774)
<223> Proteína Mi
<400> 1
atg gaa aaa cga aaa gat att gaa gaa gca aac aac tca ttg gtg tta 48
Met Glu Lys Arg Lys Asp Ile Glu Glu Ala Asn Asn Ser Leu Val Leu 1 5 10 15
ttt tct gct ctt age aag gac att gcc aa: gtt cta att ttc cta gag 96
Phe Ser Ala Leu Ser Lys Asp Ile Ala Asn Val Leu Ile Phe Leu Glu 20 25 30
aat gag gaa aat caa aaa gct ctt gac aaa gat caa gtt gaa aag cta 144
Asn Glu Glu Asn Gln Lys Ala Leu Asp Ly.s Asp Gln Val Glu Lys Leu 35 40 45
aaa ttg aaa atg gca ttt att tgt aca tat gtt cag ctt tct tat tcc 192
Lys Leu Lys Met Ala Phe Ile Cys Thr Tyr Val Gln Leu Ser Tyr Ser 50 55 60
gat ttt gag cag ttt gaa gat ata atg act aga aat aga caa gag gtt Asp Phe Glu Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Arg Asn Arg Gln Glu Val 65 70 75 80
240 gag aat ctg ctt caa tca ctt ttg gat gat gat gtc ctt act age ctc 288
Glu Asn Leu Leu Gln Ser Leu Leu Asp Asp Asp Val Leu Thr Ser Leu 85 90 95
acc agt aat atg gat gac tgt ate age ttg tat cat cgt tet tat aaa 336
Thr Ser Asn Met Asp Asp Cys Ile Ser Leu Tyr His Arg Ser Tyr Lys 100 105 110
tca gat gcc ate atg atg gat gag caa ttg gac ttc ctc ctc ttg aat 384
Ser Asp Ala Ile Met Met Asp Glu Gln Leu Asp Phe Leu Leu Leu Asn 115 120 125
ctg tat cat cta tcc aag cat cac gct gaa aag ata ttt cct gga gtg 432
Leu Tyr His Leu Ser Lys His His Ala Glu Lys Ile Phe Pro Gly Val 130 135 140
act caa tat gaa gtt ctt cag aat gta tgt ggc aac ata aga gat ttc 480
Thr Gln Tyr Glu Val Leu Gln Asn Val Cys Gly Asn Ile Arg Asp Phe 145 150 155 160
cat ggg ttg ata ctg aat ggt tgc att aag cat gag atg gtt gag aat 528
His Gly Leu Ile Leu Asn Gly Cys Ile Lys His Glu Met Val Glu Asn 165 170 175
gtc tta cct ctg ttt caa ctc atg gct gaa aga gta gga cac ttc ctt 576
Val Leu Pro Leu Phe Gln Leu Met Ala Glu Arg Val Gly His Phe Leu 180 185 190
tgg gag gat cag act gat gaa gac tet cgg ctc tcc gag cta gat gag 624
Trp Glu Asp Gln Thr Asp Glu Asp Ser Arg Leu Ser Glu Leu Asp Glu 195 200 205
gat gaa cac aat gat aga gac tet cga ctc ttc cag cta aca cat cta 672
Asp Glu His Asn Asp Arg Asp Ser Arg Leu Phe Gln Leu Thr His Leu 210 215 220
ctc ttg aag att gtt cca act gaa ctg gag gtt atg cac ata tgt tat 720
Leu Leu Lys Ile Val Pro Thr Glu Leu Glu Val Met His Ile Cys Tyr 225 230 235 240
aca aat ttg aaa gct tca act tca gea gaa gtt gga cgc ttc att aag 7 68
Thr Asn Leu Lys Ala Ser Thr Ser Ala Glu Val Gly Arg Phe Ile Lys 245 250 255
aag ctc ctg gaa acc tca ccg gat att ctc aga gaa tat ate att caa 816
Lys Leu Leu Glu Thr Ser Pro Asp Ile Leu Arg Glu Tyr Ile Ile Gln 260 265 270
cta caa gag cat atg tta act gtt att ccc cct age act tta ggg gct 864
Leu Gln Glu His Met Leu Thr Val Ile Pro Pro Ser Thr Leu Gly Ala 275 280 285
cga aac att cat gtc atg atg gaa ttc cta tta ctt att ctt tet gat Arg Asn Ile His Val Met Met Glu Phe Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp 290 295 300
912 atg ccc aag gac ttt att cat cat gac aaa ctt ttt gat ctc ttg gct 960
Met Pro Lys Asp Phe Ile His His Asp Lys Leu Phe Asp Leu Leu Ala
305 310 315 320
cat gtt gga aca ctt acc agg gag gta tcg act ctt gta cgt gac ttg 1008
His Val Gly Thr Leu Thr Arg Glu Val Ser Thr Leu Val Arg Asp Leu
325 330 335
gaa gag aaa tta agg aat aaa gag ggt aat aac caa aca aat tgt gca 1056
Glu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asn Asn Gln Thr Asn Cys Ala
340 345 350
acc cta gac ttg ctg gaa aat att gaa ctc: ctc aag aaa gat ctc aaa 1104
Thr Leu Asp Leu Leu Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asp Leu Lys
355 360 365
cat gtt tat ctg aaa gcc cca aat tca tct; caa tgt tgc ttc ccc atg 1152
His Val Tyr Leu Lys Ala Pro Asn Ser Ser Gln Cys Cys Phe Pro Met
370 375 380
agt gat gga cca ctc ttc atg cat ctt cta cac atg cac tta aat gat 1200
Ser Asp Gly Pro Leu Phe Met His Leu Leu His Met His Leu Asn Asp
385 390 395 400
ttg cta gat tct aat gct tat tca att tct: ttg ata aag gaa gaa ate 1248
Leu Leu Asp Ser Asn Ala Tyr Ser Ile Se:: Leu Ile Lys Glu Glu Ile
405 410 415
gag ttg gtg agt caa gaa ctg gaa ttc ata aga tca ttc ttt ggg gat 1296
Glu Leu Val Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Arg Ser Phe Phe Gly Asp
420 425 430
gct gct gag caa gga ttg tat aaa gat ate; tgg gca cgt gtt cta gat 1344
Ala Ala Glu Gln Gly Leu Tyr Lys Asp Ile Trp Ala Arg Val Leu Asp
435 440 445
gtg gct tat gag gca aaa gat gtc ata gat; tca att att gtt cga gat 1392
Val Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Val Ile Asp Ser Ile Ile Val Arg Asp
450 455 460
aat ggt ctc tta cat ctt att ttc tca ctt; ccc att acc ata aag aag 1440
Asn Gly Leu Leu His Leu Ile Phe Ser Leu Pro Ile Thr Ile Lys Lys
465 470 475 480
ate aaa ctt ate aaa gaa gag ate tct gct; tta gat gag aac att ccc 1488
Ile Lys Leu Ile Lys Glu Glu Ile Ser Ala Leu Asp Glu Asn Ile Pro
485 490 495
aag gac aga ggt cta ate gtt gtg aac tct: ccc aag aaa cca gtt gag 1536
Lys Asp Arg Gly Leu Ile Val Val Asn Ser Pro Lys Lys Pro Val Glu
500 505 510
aga aag tca ttg aca act gat aaa ata att: gta ggt ttt gag gag gag 1584 Arg Lys Ser Leu Thr Thr Asp Lys Ile Ile Val Gly Phe Glu Glu Glu 515 520 525 aca aac ttg ata ctt aga aag ctc acc agt gga ccc gca gat tta gat 1632
Thr Asn Leu Ile Leu Arg Lys Leu Thr Ser Gly Pro Ala Asp Leu Asp 530 535 540
gtc att tcg ate acc ggt atg ccg ggt tca ggt aaa act act ttg gca 1680 Val Ile Ser Ile Thr Gly Met Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala 545 550 555 560
tac aaa gta tac aat gat aag tca gtt tet aga cat ttt gac ctt cgt 1728 Tyr Lys Val Tyr Asn Asp Lys Ser Val Ser Arg His Phe Asp Leu Arg 565 570 575
gca tgg tgc acg gtc gat caa gga tat gac gac aag aag ttg ttg gat 1776
Ala Trp Cys Thr Val Asp Gln Gly Tyr Asp Asp Lys Lys Leu Leu Asp 580 585 590
aca att ttc agt caa gtt agt ggc tca gat tca aat ttg agt gag aat 1824
Thr Ile Phe Ser Gln Val Ser Gly Ser Asp Ser Asn Leu Ser Glu Asn 595 600 605
att gat gtt gct gat aaa ttg cgg aaa caa ctg ttt gga aag agg tat 1872
Ile Asp Val Ala Asp Lys Leu Arg Lys Gln Leu Phe Gly Lys Arg Tyr 610 615 620
ctt att gtc tta gat gat gtg tgg gat act act aca ttg gat gag ttg 1920 Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asp Thr Thr Thr Leu Asp Glu Leu 625 630 635 640
aca aga cct ttt cct gaa gct aag aaa gga agt agg att att ttg aca 1968 Thr Arg Pro Phe Pro Glu Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Ile Leu Thr 645 650 655
act cga gaa aag gaa gtg gct ttg cat gga aag ctg aac act gat cct 2016 Thr Arg Glu Lys Glu Val Ala Leu His Gly Lys Leu Asn Thr Asp Pro 660 665 ' 670
ctt gac ctt cga ttg cta aga cca gat gaa agt tgg gaa ctt tta gag 2064 Leu Asp Leu Arg Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ser Trp Glu Leu Leu Glu 675 680 685
aaa agg aca ttt ggt aat gag agt tgc cc: gat gaa cta tta gat gtc 2112 Lys Arg Thr Phe Gly Asn Glu Ser Cys Pro Asp Glu Leu Leu Asp Val 690 695 700
ggt aaa gaa ata gcc gaa aat tgt aaa ggg ctt cct ttg gtg gct gat 2160
Gly Lys Glu Ile Ala Glu Asn Cys Lys Gly Leu Pro Leu Val Ala Asp 705 710 715 720
ctg att gct gga gtc att gct ggg agg gaa aag aaa agg agt gtg tgg 2208 Leu Ile Ala Gly Val Ile Ala Gly Arg Glu Lys Lys Arg Ser Val Trp 725 730 735
ctt gaa gtt caa agt agt ttg agt tet ttt att ttg aac agt gaa gtg 2256 Leu Glu Val Gln Ser Ser Leu Ser Ser Phe Ile Leu Asn Ser Glu Val 740 745 750 gaa gtg atg aaa gtt ata gaa tta agt tal: gac cat tta cca cat cac 2304 Glu Val Met Lys Val Ile Glu Leu Ser Ty:: Asp His Leu Pro His His 755 760 765
ctc aag cca tgc ttg ctt cac ttt gca agt tgg ccg aag gac act cct 2352 Leu Lys Pro Cys Leu Leu His Phe Ala Se:: Trp Pro Lys Asp Thr Pro 770 775 780
ttg aca ate tat ttg ttg act gtt tat ttg ggt gct gaa gga ttt gtg 2400 Leu Thr Ile Tyr Leu Leu Thr Val Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Phe Val 785 790 795 800
gaa aag acg gag atg aag ggt ata gaa gaa gtg gtg aag att tat atg 2448 Glu Lys Thr Glu Met Lys Gly Ile Glu Glu Val Val Lys Ile Tyr Met 805 810 815
gat gat tta att tcc agt age ttg gta att tgt ttc aat gag ata ggt 2496 Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Val Ile Cys Phe Asn Glu Ile Gly 820 825 830
gat ata ctg aat ttc caa att cat gat ctt gtg cat gac ttt tgt ttg 2544 Asp Ile Leu Asn Phe Gln Ile His Asp Leu Val His Asp Phe Cys Leu 835 840 845
ata aaa gca aga aag gaa aat ttg ttt gat cgg ata aga tca agt gct 2592 Ile Lys Ala Arg Lys Glu Asn Leu Phe Asp Arg Ile Arg Ser Ser Ala 850 855 860
cca tca gat ttg ttg cct cgt caa att acc att gat tat gat gag gag 2640 Pro Ser Asp Leu Leu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Asp Tyr Asp Glu Glu 865 870 875 880
gag gag cac ttt ggg ctt aat ttt gtc atg ttc gat tca aat aag aaa 2688 Glu Glu His Phe Gly Leu Asn Phe Val Met Phe Asp Ser Asn Lys Lys 885 890 895
agg cat tet ggt aaa cac ctc tat tet ttg agg ata aat gga gac cag 2736 Arg His Ser Gly Lys His Leu Tyr Ser Leu Arg Ile Asn Gly Asp Gln 900 905 910
ctg gat gac agt gtt tet gat gca ttt cac cta aga cac ttg agg ctt 2784 Leu Asp Asp Ser Val Ser Asp Ala Phe His Leu Arg His Leu Arg Leu 915 920 925
att aga gtg ttg gac ctg gaa ccc tet tta ate atg gtg aat gat tet 2832 Ile Arg Val Leu Asp Leu Glu Pro Ser Leu Ile Met Val Asn Asp Ser 930 935 940
ttg ctg aat gaa ata tgc atg ttg aat cai; ttg agg tac tta aga att 2880
Leu Leu Asn Glu Ile Cys Met Leu Asn His Leu Arg Tyr Leu Arg Ile 945 950 955 960
cgg aca caa gtt aaa tat ctg cct ttc tet ttc tca aac ctc tgg aat 2928 Arg Thr Gln Val Lys Tyr Leu Pro Phe Ser Phe Ser Asn Leu Trp Asn 965 970 975 cta gaa agt ctg ttt gtg tct aac aaa gga tca ate ttg gta cta tta 2976 Leu Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn Lys Glv Ser Ile Leu Val Leu Leu 980 985 990
ccg aga att ttg gat ctt gta aag ttg cga gtg ctg tcc gtg ggt gct 3024 Pro Arg Ile Leu Asp Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Val Gly Ala 995 1000 1005
tgt tct ttc ttt gat atg gat gea gat gaa tca ata ttg ata gea 3069
Cys Ser Phe Phe Asp Met Asp Ala Asp Glu Ser Ile Leu Ile Ala 1010 1015 1020
aag gac aca aag tta gag aac ttg aga ata tta ggg gaa ctg ttg 3114
Lys Asp Thr Lys Leu Glu Asn Leu Arg IIle Leu Gly Glu Leu Leu 1025 1030 1035
att tcc tat tcg aaa gat aca atg aat att ttc aaa agg ttt ccc 3159
Ile Ser Tyr Ser Lys Asp Thr Met Asn "le Phe Lys Arg Phe Pro 1040 1045 1050
aat ctt cag gtg ctt cag ttt gaa ctc aag gag tca tgg gat tat 3204
Asn Leu Gln Val Leu Gln Phe Glu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Tyr 1055 1060 1065
tca aca gag caa cat tgg ttc ccg aaa ttg gat tgc cta act gaa 3249
Ser Thr Glu Gln His Trp Phe Pro Lys Leu Asp Cys Leu Thr Glu 1070 1075 1080
cta gaa aca ctc tgt gta ggt ttt aaa agt tca aac aca aac cac 32 94
Leu Glu Thr Leu Cys Val Gly Phe Lys Ser Ser Asn Thr Asn His 1085 1090 1095
tgt ggg tcc tct gtt gcg aca aat cgg ccg tgg gat ttt cac ttc 3339
Cys Gly Ser Ser Val Ala Thr Asn Arg Pro Trp Asp Phe His Phe 1100 1105 1110
cct tca aat ttg aaa gaa ctg ttg ttg tat gac ttt cct ctg aca 3384
Pro Ser Asn Leu Lys Glu Leu Leu Leu Tyr Asp Phe Pro Leu Thr 1115 1120 1125
tcc gat tca cta tca aca ata gcg aga ctg ccc aac ctt gaa aat 3429
Ser Asp Ser Leu Ser Thr Ile Ala Arg Leu Pro Asn Leu Glu Asn 1130 1135 1140
ttg tcc ctt tat gat aca ate ate cag gga gaa gaa tgg aac atg 3474
Leu Ser Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Gln Gly Glu Glu Trp Asn Met 1145 1150 1155
ggg gag gaa gac act ttt gag aat ctc aaa ttt ttg aac ttg cgt 3519
Gly Glu Glu Asp Thr Phe Glu Asn Leu Lys Phe Leu Asn Leu Arg 1160 1165 1170
cta ctg act ctt tcc aag tgg gag gtt gga gag gaa tcc ttc ccc 3564
Leu Leu Thr Leu Ser Lys Trp Glu Val Gly Glu Glu Ser Phe Pro 1175 1180 1185 aat ctt gag aaa tta aaa ctg cag gaa 1;gt ggt aag ctt gag gag 3609
Asn Leu Glu Lys Leu Lys Leu Gln Glu Cys Gly Lys Leu Glu Glu
1190 1195 1200
att cca cct agt ttt gga gat att tat tca ttg aaa ttt ate aaa 3654
Ile Pro Pro Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Ser Leu Lys Phe Ile Lys
1205 1210 1215
att gta aag agt cct caa ctt gaa gat tet gct ctc aag att aag 3699
Ile Val Lys Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ser Ala Leu Lys Ile Lys
1220 1225 1230
aaa tac gct gaa gat atg aga gga ggg aac gag ctt cag ate ctt 3744
Lys Tyr Ala Glu Asp Met Arg Gly Gly Asn Glu Leu Gln Ile Leu
1235 1240 1245
ggc cag aag aat ate ccc tta ttt aag *:ga 3774 Gly Gln Lys Asn Ile Pro Leu Phe Lys 1250 1255
<210> 2
<211> 1257
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Construção Sintética <400> 2
Met Glu Lys Arg Lys Asp Ile Glu Glu Ala Asn Asn Ser Leu Val Leu 1 5 10 15
Phe Ser Ala Leu Ser Lys Asp Ile Ala Asn Val Leu Ile Phe Leu Glu 20 25 30
Asn Glu Glu Asn Gln Lys Ala Leu Asp Lys Asp Gln Val Glu Lys Leu 35 40 45
Lys Leu Lys Met Ala Phe Ile Cys Thr Tyr Val Gln Leu Ser Tyr Ser
50
55
60
Asp Phe Glu Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Arg Asn Arg Gln Glu Val 65 70 75 80
Glu Asn Leu Leu Gln Ser Leu Leu Asp Asp Asp Val Leu Thr Ser Leu 85 90 95
Thr Ser Asn Met Asp Asp Cys Ile Ser Leu Tyr His Arg Ser Tyr Lys 100
105
110
Ser Asp Ala Ile Met Met Asp Glu Gln Leu Asp Phe Leu Leu Leu Asn 115 120 125
Leu Tyr His Leu Ser Lys His His Ala Glu Lys Ile Phe Pro Gly Val 130 135 140
Thr Gln Tyr Glu Val Leu Gln Asn Val Cys Gly Asn Ile Arg Asp Phe 145 150 155 160
His Gly Leu Ile Leu Asn Gly Cys Ile Lys His Glu Met Val Glu Asn 165 170 175
Val Leu Pro Leu Phe Gln Leu Met Ala Glu Arg Val Gly His Phe Leu 180 185 190
Trp Glu Asp Gln Thr Asp Glu Asp Ser Arg Leu Ser Glu Leu Asp Glu 195 200 205
Asp Glu His Asn Asp Arg Asp Ser Arg Leu Phe Gln Leu Thr His Leu 210 215 220
Leu Leu Lys Ile Val Pro Thr Glu Leu Glu Val Met His Ile Cys Tyr 225 230 235 240
Thr Asn Leu Lys Ala Ser Thr Ser Ala Glu Val Gly Arg Phe Ile Lys 245 250 255
Lys Leu Leu Glu Thr Ser Pro Asp Ile Leu Arg Glu Tyr Ile Ile Gln 260 265 270
Leu Gln Glu His Met Leu Thr Val Ile Pro Pro Ser Thr Leu Gly Ala 275 280 285
Arg Asn Ile His Val Met Met Glu Phe Lea Leu Leu Ile Leu Ser Asp 290 295 300
Met Pro Lys Asp Phe Ile His His Asp Lys Leu Phe Asp Leu Leu Ala 305 310 315 320
His Val Gly Thr Leu Thr Arg Glu Val Ser Thr Leu Val Arg Asp Leu 325 330 335 Glu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asn Asn Gln Thr Asn Cys Ala 340 345 350
Thr Leu Asp Leu Leu Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asp Leu Lys 355 360 365
His Val Tyr Leu Lys Ala Pro Asn Ser Se;: Gln Cys Cys Phe Pro Met 370 375 380
Ser Asp Gly Pro Leu Phe Met His Leu Leu His Met His Leu Asn Asp 385 390 395 400
Leu Leu Asp Ser Asn Ala Tyr Ser Ile Ser Leu Ile Lys Glu Glu Ile 405 410 415
Glu Leu Val Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Arg Ser Phe Phe Gly Asp 420 425 430
Ala Ala Glu Gln Gly Leu Tyr Lys Asp Ile Trp Ala Arg Val Leu Asp 435 440 445
Val Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Val Ile Asp Ser Ile Ile Val Arg Asp 450 455 460
Asn Gly Leu Leu His Leu Ile Phe Ser Leu Pro Ile Thr Ile Lys Lys 465 470 475 480
Ile Lys Leu Ile Lys Glu Glu Ile Ser Ala Leu Asp Glu Asn Ile Pro 485 490 495
Lys Asp Arg Gly Leu Ile Val Val Asn Ser Pro Lys Lys Pro Val Glu 500 505 510
Arg Lys Ser Leu Thr Thr Asp Lys Ile Ile Val Gly Phe Glu Glu Glu 515 520 525
Thr Asn Leu Ile Leu Arg Lys Leu Thr Ser Gly Pro Ala Asp Leu Asp 530 535 540
Val Ile Ser Ile Thr Gly Met Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala 545 550 555 560 Tyr Lys Val Tyr Asn Asp Lys Ser Val Ser Arg His Phe Asp Leu Arg 565 570 575
Ala Trp Cys Thr Val Asp Gln Gly Tyr Asp Asp Lys Lys Leu Leu Asp 580 585 590
Thr Ile Phe Ser Gln Val Ser Gly Ser Asp Ser Asn Leu Ser Glu Asn 595 600 605
Ile Asp Val Ala Asp Lys Leu Arg Lys Gln Leu Phe Gly Lys Arg Tyr 610 615 620
Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asp Thr Thr Thr Leu Asp Glu Leu 625 630 635 640
Thr Arg Pro Phe Pro Glu Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Ile Leu Thr 645 650 655
Thr Arg Glu Lys Glu Val Ala Leu His Gly Lys Leu Asn Thr Asp Pro 660 665 670
Leu Asp Leu Arg Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ser Trp Glu Leu Leu Glu 675 680 685
Lys Arg Thr Phe Gly Asn Glu Ser Cys Pro Asp Glu Leu Leu Asp Val 690 695 700
Gly Lys Glu Ile Ala Glu Asn Cys Lys Gly Leu Pro Leu Val Ala Asp 705 710 715 720
Leu Ile Ala Gly Val Ile Ala Gly Arg Glu Lys Lys Arg Ser Val Trp 725 730 735
Leu Glu Val Gln Ser Ser Leu Ser Ser Phe Ile Leu Asn Ser Glu Val 740 745 750
Glu Val Met Lys Val Ile Glu Leu Ser Tyr Asp His Leu Pro His His 755 760 765
Leu Lys Pro Cys Leu Leu His Phe Ala Ser Trp Pro Lys Asp Thr Pro 770 775 780 Leu Thr Ile Tyr Leu Leu Thr Val Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Phe Val
785 790 795 800
Glu Lys Thr Glu Met Lys Gly Ile Glu Glu Val Val Lys Ile Tyr Met
805 810 815
Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Val Ile Cys Phe Asn Glu Ile Gly 820 825 830
Asp Ile Leu Asn Phe Gln Ile His Asp Leu Val His Asp Phe Cys Leu 835 840 845
Ile Lys Ala Arg Lys Glu Asn Leu Phe Asp Arg Ile Arg Ser Ser Ala 850 855 860
Pro Ser Asp Leu Leu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Asp Tyr Asp Glu Glu 865 870 875 880
Glu Glu His Phe Gly Leu Asn Phe Val Met Phe Asp Ser Asn Lys Lys 885 890 895
Arg His Ser Gly Lys His Leu Tyr Ser Leu Arg Ile Asn Gly Asp Gln 900 905 910
Leu Asp Asp Ser Val Ser Asp Ala Phe His Leu Arg His Leu Arg Leu 915 920 925
Ile Arg Val Leu Asp Leu Glu Pro Ser Leu Ile Met Val Asn Asp Ser 930 935 940
Leu Leu Asn Glu Ile Cys Met Leu Asn His Leu Arg Tyr Leu Arg Ile 945 950 955 960
Arg Thr Gln Val Lys Tyr Leu Pro Phe Se:: Phe Ser Asn Leu Trp Asn 965 970 975
Leu Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn Lys Gly Ser Ile Leu Val Leu Leu 980 985 990
Pro Arg Ile Leu Asp Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Val Gly Ala 995 1000 1005
Cys Ser Phe Phe Asp Met Asp Ala Asp Glu Ser Ile Leu Ile Ala 1010 1015 1020
Lys Asp Thr Lys Leu Glu Asn Leu Arg Ile Leu Gly Glu Leu Leu 1025 1030 1035
Ile Ser Tyr Ser Lys Asp Thr Met Asn Ile Phe Lys Arg Phe Pro 1040 1045 1050
Asn Leu Gln Val Leu Gln Phe Glu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Tyr 1055 1060 1065
Ser Thr Glu Gln His Trp Phe Pro Lys Leu Asp Cys Leu Thr Glu 1070 1075 1080
Leu Glu Thr Leu Cys Val Gly Phe Lys Ser Ser Asn Thr Asn His 1085 1090 1095
Cys Gly Ser Ser Val Ala Thr Asn Arg Pro Trp Asp Phe His Phe 1100 1105 1110
Pro Ser Asn Leu Lys Glu Leu Leu Leu "yr Asp Phe Pro Leu Thr 1115 1120 1125
Ser Asp Ser Leu Ser Thr Ile Ala Arg Leu Pro Asn Leu Glu Asn 1130 1135 1140
Leu Ser Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Gln Gly Glu Glu Trp Asn Met 1145 1150 1155
Gly Glu Glu Asp Thr Phe Glu Asn Leu Lys Phe Leu Asn Leu Arg 1160 1165 1170
Leu Leu Thr Leu Ser Lys Trp Glu Val Gly Glu Glu Ser Phe Pro 1175 1180 1185
Asn Leu Glu Lys Leu Lys Leu Gln Glu Cys Gly Lys Leu Glu Glu 1190 1195 1200
Ile Pro Pro Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Ser Leu Lys Phe Ile Lys 1205 1210 1215
Ile Val Lys Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ser Ala Leu Lys Ile Lys 1220
1225
1230
Lys Tyr Ala Glu Asp Met Arg Gly Gly Asn Glu Leu Gln Ile Leu
1235
1240
1245
Gly Gln Lys Asn Ile Pro Leu Phe Lys
1250
1255
<210> 3 <211> 9818 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Lócus do gene Mi <400> 3
ttttcctctt catataactt tttccttaac ccctctcatg aataatataa ttgatgtgga 60
taaagtatta tcctttatga taaataacga aatttaataa tttaaagggt gcaaatctat 120
aaaatggaga cgcacattga taatgtcctc ttgattatta ttaaagaatt actctagctt 180
cacaaattta aattcattaa tgcttaatta catgataaaa actttagttg ttctttttac 240
atggtttgct aactttaatt ttttttcttc atattcttca tttgtttatt attattttct 300
aattacttat ttaactttta tactcttaat attcataact ctcatctttt catattcata 360
acctccaaat atttaaacta aaactttaag atatcitttg atatttgttc aataataaat 420
tcaacttctt tatcttatga aacccctacc aagatiatta ggctattatt ttttattcta 480
tagtaaaaac aaatgatgaa gattcttgaa tttta:agga tatgaaagaa gtcgataaaa 540
tctcagagag ttatgtacta attttgtact tattt:ttca tctatatata cataaatctt 600
ataagaataa tgtctatatt gtattttttt cttaaatatt atgtttcttt ttaatttttt 660
ttcactctgt tagacttctt aatttagttt tctatgaatg ttttattgcc gtaagtcttt 720
gaattttgta attgttacat tttattattc attacgattt acatatatat ttccatgaga 780
tttggtcatt ctaacgtatc tataaaaatt cacatgaaac acacgtgtga agcgcatcct 840
cagaaaaact agtgtatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 900
tatatatata tatatatata tatatattat tcttattaaa aaagaatgtc cttatttcat 960
ttttaatctg gttaaaaaag aataatctct ttcctttttt gacaatattt taactttaac 1020
tttccacgta acatgtttaa gacaacaaaa ttaaatgaca ttttaatctt gtaacataga 1080
aaagtaacat atgataattg tcgttgtccc taaacatgat agatgtataa ttcaaaagtc 1140 aatgaattgt attttagtat tatattatga atgaaoaaac tgtcaagatg tgtatatata 1200
tatatatttt attcttgtta atttggcctt tcaagtaatt aattcattgt taggcagttg 1260
aattaataat ctcttttagg aatcttccca tgtgaataac aagacttata ataataataa 1320
taaagtccag atcttgtttc aattggatca tttggcaaac aattactctg tttctgaaac 1380
aaggaatagg gcttctaata ttgtagggga tttttttttc ttcattaatt tatacttatg 1440
atattaatta ttgtttttga gtacatattt taaactctgt tgtttatttt tctgcaaagt 1500
ttctccggtt atattgaaca tatacacata tagtacatat atttattgta aaaaaaataa 1560
ttattatact ccatttcaag aaattatgtt ttgatattat atattaaatt ctataatgtg 1620
gaaattgtca atgtctacaa tgtgtttgat gaaatgacaa ccacttgttt ttatctgcaa 1680
cagtataaaa attggctttg cttcttttag attaa::ataa tattttacag gtcacatatt 1740
atatttatat tgtgaaagac aagagatatt gattaaaaaa agacttatgg gtttgtattt 1800
taatatttca ttcttcttca ttactaaaag acttg.atcg tatatttcaa ctactacact 1860
tgttttctta tccaatagct tcaacattat ttctcaaaca aagggttctc tagctaaact 1920
tcagcctgtg taaaggtaac atcttcttta ttcacagcat aataacaatg aatttggtcg 1980
atgtttgaag taagcttgaa attttctctt tctaagtttg tttgatccat ttagattctt 2040
ttaaatactt ttggtattta aaggacttgt gaagtcaatg aattgtattt tagtaatctt 2100
gcaattctag atctagctat ttgttgttct cctttcaacc aaactacttc ttcaatttgt 2160
ctaacaaaaa tatgtcaaaa aggtatgaac atgcttaatc ggagatcttt attgattcta 2220
cttcagctac tctaaaaaaa aatctttttt ccattaagcc caagtcgaga taggagaaaa 2280
atattattag agagattatt aatttaatga cattttactc tagtttttta tcaaaataag 2340
ggaataatat cctgttattt aactaccttt taagcattat gggtggaaag tagaaagaag 2400
aaacataaca gaacagacag taagttatgc tttaatgagt agatctgtat aggattacat 2460
atttgtttga cttttcggtg tttcgattag aaaacttaca agtttttaat acatgtatca 2520
tttgttgatt tgtccgtttg gcacgtcatc tgtggttaca agtcacatat gaagtatgtc 2580
cacgagacac accgaatgtc aagtatagat ttctacttga tcatacacaa ctttatctga 2640
ggttgatgcc aaatttaaat gactacctaa agctgatatt ttaaacatta atcttgtaca 2700
cgaaaacatt attcctatta ctgttttctt tacctttacc ttatagactt ttttggcaga 2760
aaaaagttag acagatacat ttgatgatgt ttaccattct cattctctct ttattttatt 2820
ttctttacat tcacacgcac aataattttc ttgtaggttc cttatatgcc atatgcacat 2880 agacgaatct aggatttgat atttacaagt ttctatgtcg acgtcatatt aatatcaata 2940
ataattagat tgacaatcac atatttataa tattaagtcg ataactttct tctttgtata 3000
ggttggaaaa gtaatggtaa acgagcagga ctcctttttc ttttttttgt aaataattaa 3060
cagttgtgag attttatgtt tgtgacttca tgtcataaac attttgatgt gtgattaaga 3120
ttgacatttc caattgtgcg agtctaaaat tactatatgt gaaaatagtg atattattga 3180
ttattcgtat tttttcatct tctttctcct gttaaagttt tatctacttt ttattcatca 3240
ggtcttgaga aaaagtagaa tcatggaaaa acgaaaagat attgaagaag catagatatg 3300
tggctttaaa atgtattatt ttggcaggtg ttattttctg ctcttagcaa ggacattgcc 3360
aatgttctaa ttttcctaga gaatgaggaa aatcaaaaag ctcttgacaa agatcaagtt 3420
gaaaagctaa aattgaaaat ggcatttatt tgtacatatg ttcagctttc ttattccgat 3480
tttgagcagt ttgaagatat aatgactaga aatagacaag aggttgagaa tctgcttcaa 3540
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ttgtatcatc gttcttataa atcagatgcc atcatgatgg atgagcaatt ggacttcctc 3660
ctcttgaatc tgtatcatct atccaagcat cacgctgaaa agatatttcc tggagtgact 3720
caatatgaag ttcttcagaa tgtatgtggc aacataagag atttccatgg gttgatactg 3780
aatggttgca ttaagcatga gatggttgag aatgtottac ctctgtttca actcatggct 3840
gaaagagtag gacacttcct ttgggaggat cagactgatg aagactctcg gctctccgag 3900
ctagatgagg atgaacacaa tgatagagac tctcgactct tccagctaac acatctactc 3960
ttgaagattg ttccaactga actggaggtt atgcacatat gttatacaaa tttgaaagct 4020
tcaacttcag cagaagttgg acgcttcatt aagaacjctcc tggaaacctc accggatatt 4080
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accagggagg tatcgactct tgtacgtgac ttggaagaga aattaaggaa taaagagggt 4320
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gatctcaaac atgtttatct gaaagcccca aattcatctc aatgttgctt ccccatgagt 4440
gatggaccac tcttcatgca tcttctacac atgcacttaa atgatttgct agattctaat 4500
gcttattcaa tttctttgat aaaggaagaa atcgagttgg tgagtcaaga actggaattc 4560 ataagatcat tctttgggga tgctgctgag caaggattgt ataaagatat ctgggcacgt 4620
gttctagatg tggcttatga ggcaaaagat gtcatagatt caattattgt tcgagataat 4680
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gacgacaaga agttgttgga tacaattttc agtcaagtta gtggctcaga ttcaaatttg 5100
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cttttagaga aaaggacatt tggtaatgag agttgccctg atgaactatt agatgtcggt 5400
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tttattttga acagtgaagt ggaagtgatg aaagtiatag aattaagtta tgaccattta 5580
ccacatcacc tcaagccatg cttgcttcac tttgcaagtt ggccgaagga cactcctttg 5640
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ttttgtttga taaaagcaag aaaggaaaat ttgtttgatc ggataagatc aagtgctcca 5880
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cttaattttg tcatgttcga ttcaaataag aaaaggcatt ctggtaaaca cctctattct 6000
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ctgaatgaaa tatgcatgtt gaatcatttg aggtacttaa gaattcggac acaagttaaa 6180
tatctgcctt tctctttctc aaacctctgg aatctagaaa gtctgtttgt gtctaacaaa 6240
ggatcaatct tggtactatt accgagaatt ttggatcttg taaagttgcg agtgctgtcc 6300 gtgggtgctt gttctttctt acaaagttag agaacttgag atgaatattt tcaaaaggtt tgggattatt caacagagca acactctgtg taggttttaa aatcggccgt gggattttca cctctgacat ccgattcact ctttatgata caatcatcca aatctcaaat ttttgaactt tccttcccca atcttgagaa cctagttttg gagatattta gaagattctg ctctcaagat cagatccttg gccagaagaa ggtgatattg tatatgatta aaaaatataa tttttataag gtcacacatg aggtatgttc aagtgcttat atgatgttgc cattaatctt gtataccaaa tctttatttt ttttctttcc tacatctgta ttgtccgtat aagaatccag gatttgatgt agaaactgag ggattcacat cctttgtgtc taacttcgtc gattcaaaag ctaggctgtg aaagggtcat aaccatcact ttaacataga tcgctatccc tactcaaaca cacgatctgt tacagtgttg cacaatgtcc
tgatatggat gcagatgaat caatattgat agcaaaggac 6360
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aaatatcctg tgatgagatt cctcttagtt tcttttaaca 7140
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ccaaaaccaa catcacacta caaaaaaagg ctcaaattct 7 980 gggggttata attagacggt caataacccc tgcaatttag tgttgtggag gttgaataaa 8040 ctcctccaat taggagtgtc acaattaagt cgcgtgggat tcttggcaca tcccggtaag 8100 gttaactagc gggggttttg aaccccaacc gcatttcaaa ctaggagtcg aaaccccaac 8160 gatttgtgaa ctcgggggag tcaaaaaccc ccgcaataaa tgatttttac attaaaatta 8220 ataggagctt ggacccctgt gatttatgaa atataacttt ttgtagcatt tgccagaaat 8280 attcaatttt agatactaat aataaattaa ttaactaaca tgtgcatcat tattcaaagg 8340 acatattagt attaagaaat aatacaatat tcaacacaaa agtacccaaa ctcaagatag 8400 gatcagttta tggaacttca actagtttca ctataattat tgtcactaac atcagctggc 8460 tgcaaaggag aatacataat aagtgacttt atccaaactc aaaatcatgg ctgaatgtag 8520 taaaacacca aagattataa taatttccat taattatcat atactacaca acaacaaact 8580 taaaacaata tagaaaagga ttaaaccatt tacacaagca atgattctat accatttcaa 8640 aacgacaaca tactgtacta ctaaacaaga caccatcaaa ctgatttgga caaatattaa 8700 caatagttaa aacatgaaca aagaatctca ggtttcttgt cagtagaaaa gagacagact 8760 aggaactgga gtgctatttt tcttataaga gacaattaat gtttacttct ttatattttg 8820 actataagtt gattggttat aatgtttacg aggttgtata taatccgatg ttcaatgata 8880 tgactttcct attgactgaa atgcttgaac gcaaacagta tatctagatt aagaatgagg 8940 acgaattacc tctagaggca tgggtaatgg aagcatiaact ccttgataat ggttgttagc 9000 ccactgcaag tcacaaaaca aaacatccgt aatattaaca tactaaggtt gtaagcacta 9060 aacgacaaca actatgcctc aatcccaact aagttggaat cgactatatg aatactcaca 9120 atttcgattt atagacaaag atactagtag aaatgacgtc tttcctttct atgttaacac 9180 ttggacagag aatgttaaag acttacaaca acagaaaaga gttaaaatca tttaattgag 9240 caaggatttc aaaacgacaa cacaatatac tcaatttttc gacggaaaca actggttgga 9300 caacagtgct atttgtaact ccaatgaaca acactgcaac gtacatgtat ctcattgcac 9360 taaataaatc ccgttgagag taacatatca atagttacga acaatatgat cacgacaaag 9420 gattgtaagt accacaggac aagtcatgct tgcatgaaaa acggatatgt aaagaaccaa 9480 aatcctgctg ctgaaataag cagttatgat tatccaaaaa tcatgaatac acatgcactt 9540 gagtttgttc caagaaaaac acaaccaact actgtcgcaa gtgaagattc aaaagtgact 9600 attgatgtta attcttccac aaggttgaat aattttgtca ctataggatt taagacgaag 9660 aagaaacagg cgacaatttt gtaagcatag accttcttat gcaactatga gctggtatgc 9720 tattcatttt ctttactcgt aaaaatcgtt gatactaaag aatgccaatc cagtcctgct 9780 gaataggcgc caggtgactg gttgctgtta ataatttt 9818
<210> 4
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Produto de Amplificação <400> 4
tgcaggaatg tggtaagctt gaggagattc cacctagttt tggagatatt tattcattga 60
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 5 tgcagga
<210> 6
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 6 taatct
<210> 7
<211> 3262
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Promotor do gene Mi <400> 7
ttttcctctt catataactt tttccttaac ccctcrcatg aataatataa ttgatgtgga 60
taaagtatta tcctttatga taaataacga aatttaataa tttaaagggt gcaaatctat 120 aaaatggaga cgcacattga taatgtcctc ttgattatta ttaaagaatt actctagctt 180
cacaaattta aattcattaa tgcttaatta catgataaaa actttagttg ttctttttac 240
atggtttgct aactttaatt ttttttcttc atattcttca tttgtttatt attattttct 300
aattacttat ttaactttta tactcttaat attcataact ctcatctttt catattcata 360
acctccaaat atttaaacta aaactttaag atatcttttg atatttgttc aataataaat 420
tcaacttctt tatcttatga aacccctacc aagattatta ggctattatt ttttattcta 480
tagtaaaaac aaatgatgaa gattcttgaa ttttatagga tatgaaagaa gtcgataaaa 540
tctcagagag ttatgtacta attttgtact tattttttca tctatatata cataaatctt 600
ataagaataa tgtctatatt gtattttttt cttaaatatt atgtttcttt ttaatttttt 660
ttcactctgt tagacttctt aatttagttt tctatgaatg ttttattgcc gtaagtcttt 720
gaattttgta attgttacat tttattattc attacgattt acatatatat ttccatgaga 780
tttggtcatt ctaacgtatc tataaaaatt cacatgaaac acacgtgtga agcgcatcct 840
cagaaaaact agtgtatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 900
tatatatata tatatatata tatatattat tcttattaaa aaagaatgtc cttatttcat 960
ttttaatctg gttaaaaaag aataatctct ttcctttttt gacaatattt taactttaac 1020
tttccacgta acatgtttaa gacaacaaaa ttaaa^gaca ttttaatctt gtaacataga 1080
aaagtaacat atgataattg tcgttgtccc taaacatgat agatgtataa ttcaaaagtc 1140
aatgaattgt attttagtat tatattatga atgaacaaac tgtcaagatg tgtatatata 1200
tatatatttt attcttgtta atttggcctt tcaag~aatt aattcattgt taggcagttg 1260
aattaataat ctcttttagg aatcttccca tgtgaataac aagacttata ataataataa 1320
taaagtccag atcttgtttc aattggatca tttggcaaac aattactctg tttctgaaac 1380
aaggaatagg gcttctaata ttgtagggga tttttttttc ttcattaatt tatacttatg 1440
atattaatta ttgtttttga gtacatattt taaactctgt tgtttatttt tctgcaaagt 1500
ttctccggtt atattgaaca tatacacata tagtacatat atttattgta aaaaaaataa 1560
ttattatact ccatttcaag aaattatgtt ttgatattat atattaaatt ctataatgtg 1620
gaaattgtca atgtctacaa tgtgtttgat gaaatgacaa ccacttgttt ttatctgcaa 1680
cagtataaaa attggctttg cttcttttag attaatataa tattttacag gtcacatatt 1740
atatttatat tgtgaaagac aagagatatt gattaaaaaa agacttatgg gtttgtattt 1800
taatatttca ttcttcttca ttactaaaag acttgtatcg tatatttcaa ctactacact 1860 tgttttctta tccaatagct tcaacattat ttctcaaaca aagggttctc tagctaaact 1920 tcagcctgtg taaaggtaac atcttcttta ttcacagcat aataacaatg aatttggtcg 1980 atgtttgaag taagcttgaa attttctctt tctaac[tttg tttgatccat ttagattctt 2040 ttaaatactt ttggtattta aaggacttgt gaagtcaatg aattgtattt tagtaatctt 2100 gcaattctag atctagctat ttgttgttct cctttcaacc aaactacttc ttcaatttgt 2160 ctaacaaaaa tatgtcaaaa aggtatgaac atgcttaatc ggagatcttt attgattcta 2220 cttcagctac tctaaaaaaa aatctttttt ccattaagcc caagtcgaga taggagaaaa 2280 atattattag agagattatt aatttaatga cattttactc tagtttttta tcaaaataag 2340 ggaataatat cctgttattt aactaccttt taagcattat gggtggaaag tagaaagaag 2400 aaacataaca gaacagacag taagttatgc tttaatgagt agatctgtat aggattacat 2460 atttgtttga cttttcggtg tttcgattag aaaactitaca agtttttaat acatgtatca 2520 tttgttgatt tgtccgtttg gcacgtcatc tgtggttaca agtcacatat gaagtatgtc 2580 cacgagacac accgaatgtc aagtatagat ttctacttga tcatacacaa ctttatctga 2640 ggttgatgcc aaatttaaat gactacctaa agctgatatt ttaaacatta atcttgtaca 2700 cgaaaacatt attcctatta ctgttttctt tacctttacc ttatagactt ttttggcaga 2760 aaaaagttag acagatacat ttgatgatgt ttaccattct cattctctct ttattttatt 2820 ttctttacat tcacacgcac aataattttc ttgtaggttc cttatatgcc atatgcacat 2880 agacgaatct aggatttgat atttacaagt ttctatgtcg acgtcatatt aatatcaata 2940 ataattagat tgacaatcac atatttataa tattaagtcg ataactttct tctttgtata 3000 ggttggaaaa gtaatggtaa acgagcagga ctcctttttc ttttttttgt aaataattaa 3060 cagttgtgag attttatgtt tgtgacttca tgtcataaac attttgatgt gtgattaaga 3120 ttgacatttc caattgtgcg agtctaaaat tactatatgt gaaaatagtg atattattga 3180 ttattcgtat tttttcatct tctttctcct gttaaagttt tatctacttt ttattcatca 3240 ggtcttgaga aaaagtagaa tc 3262

Claims (11)

1. Construção de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de compreender um promotor que é heterólogo a célula de tomate e um ácido nucléico como definido em SEQ ID NO:l.
2. Construção de I)NA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito promotor é funcional em uma célula vegetal, o dito promotor sendo ou endógeno ou exógeno à dita célula vegetal, e eficaz para controlar a transcrição da dita seqüência de DNA em tais células vegetais.
3. Vetor adequado para transformar células vegetais, caracterizado pelo fato de compreender: - uma construção de DNA recombinante como definida na reivindicação 1 ou 2; - um ácido nucléico como definido em SEQ ID NO :1 precedido por uma região promotora e seguido por uma região terminadora, ambos promotor e terminador sendo heterólogos à célula de tomate e funcionais em células vegetais; ou - um ácido nucléico como definido em SEQ ID NO:3 precedido por uma região promotora e seguido por uma região terminadora, ambos promotor e terminador sendo heterólogos à célula de tomate e funcionais em células vegetais.
4. Plasmídeo pKGMi-11, caracterizado pelo fato de que é depositado sob o número CBS 822.96.
5. Plasmídeo pKGMi-18, caracterizado pelo fato de que é depositado sob o número CBS 821.96.
6. Células bacterianas, caracterizadas pelo fato de compreenderem um vetor ou plasmídeo como definidos em qualquer uma das reivindicações 3 a 5.
7. Processo para obter plantas com suscetibilidade reduzida a um patógeno, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: i) inserir no genoma de uma célula vegetal uma construção de DNA como definida na reivindicação 1; ii) obter células vegetais transformadas, iii) regenerar, a partir das ditas células vegetais transformadas, plantas geneticamente transformadas, e iv) opcionalmente, propagar as ditas plantas.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito patógeno é um nematóide e, preferivelmente, um nematóide dos nódulos das raízes, especialmente Meloidogyne incógnita.
9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito patógeno é um afídio e, preferivelmente, Macrosiphum euphorbiae.
10. Processo para isolar um ácido nucléico que tenha pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 1 como resultado de substituições de nucleotídeos da seqüência de DNA dos ácidos nucléicos como definidos na SEQ ID NO:l, em que os ditos ácidos nucléicos substituídos, quando transferidos para uma planta hospedeira que é susceptível a um patógeno de planta, é capaz de reduzir a susceptibilidade da dita planta ao dito patógeno, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: i) selecionar uma biblioteca genômica ou de cDNA de uma planta com um ácido nucléico como definido em SEQ ID NO:l, ii) identificar os clones positivos que hibridizam com a dita seqüência de DNA, e iii) isolar os ditos clones positivos.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que dita biblioteca se origina de uma primeira planta, e a seqüência de DNA pertence a uma segunda planta.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE279523T1 (de) * 1996-08-09 2004-10-15 Keygene Nv Resistenz gegen nematoden und/oder blattläuse
CN1266457A (zh) * 1997-06-18 2000-09-13 麒麟麦酒株式会社 抗真菌植物和获得抗真菌植物的方法
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
US7897843B2 (en) 1999-03-23 2011-03-01 Mendel Biotechnology, Inc. Transcriptional regulation of plant biomass and abiotic stress tolerance
EP1140021B1 (en) 1998-12-23 2004-08-04 Idea Ag Improved formulation for topical non-invasive application in vivo
FR2849863B1 (fr) * 2003-01-13 2008-02-22 Genoplante Valor Gene de resistance a aphis gossypii
CN1832961B (zh) 2003-08-11 2011-04-06 植物育种农业研究所有限公司 真菌抗性植物和它们的用途
AR060563A1 (es) 2006-04-24 2008-06-25 Mendel Biotechnology Inc Promotores inducibles por enfermedad
ZA200900024B (en) 2006-06-29 2010-04-28 Mendel Biotechnology Inc Improved yield and stress tolerance in transgenic plants
CA2659252A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 Mendel Biotechnology, Inc. Plants with enhanced size and growth rate
US10244691B2 (en) 2013-07-05 2019-04-02 Takii & Company Limited Root-knot nematode resistance marker for tomato plant, root-knot nematode resistant tomato plant, production method for root-knot nematode resistant tomato plant, and screening method for root-knot nematode resistant tomato plant
WO2022176971A1 (ja) * 2021-02-19 2022-08-25 国立大学法人 熊本大学 植物寄生性センチュウ防除剤
CN113444740B (zh) * 2021-06-10 2022-08-09 上海交通大学 一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9104617D0 (en) 1991-03-05 1991-04-17 Nickerson Int Seed Pest control
JP3236295B2 (ja) 1991-09-24 2001-12-10 ケイヘーネ・エヌ・ベー 選択的な制限断片増幅：一般的なｄｎａフィンガプリント法
GB9205474D0 (en) * 1992-03-13 1992-04-29 Cambridge Advanced Tech Root knot nematode resistance
WO1995018230A1 (en) 1993-12-24 1995-07-06 John Innes Centre Innovations Limited Plant pathogen resistance genes and uses thereof
ATE279523T1 (de) * 1996-08-09 2004-10-15 Keygene Nv Resistenz gegen nematoden und/oder blattläuse

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