ES2231891T3 - Resistencia a los nematodos y/o a los afidos. - Google Patents
Resistencia a los nematodos y/o a los afidos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A GENES CAPACES DE CONFERIR UNA RESISTENCIA CONTRA NEMATODOS Y/O AFIDOS. LOS ACIDOS NUCLEICOS PREFERENTES DE LA INVENCION SON SECUENCIAS DE ADN QUE SON AL MENOS PARTE DE LA SECUENCIA DE ADN REPRESENTADA EN LAS FIGURAS U HOMOLOGOS DE LA MISMA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A VECTORES, CELULAS Y SEMILLAS QUE COMPRENDEN DICHOS ACIDOS NUCLEICOS, ASI COMO A PLANTAS TRANSFORMADAS GENETICAMENTE RESISTENTES A LOS NEMATODOS Y/O AFIDOS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS, PRIMARIOS, KITS DE DIAGNOSTICO Y POLIPEPTIDOS.
Description
Resistencia a los nematodos y/o a los áfidos.
La presente invención se refiere a genes de
resistencia, a construcciones de ADN, a microorganismos, a células
vegetales y a plantas que contienen dichos genes de resistencia.
Además, la invención se refiere a plantas genéticamente
transformadas que son resistentes frente a nematodos y/o áfidos.
Además, la invención se refiere a sondas y cebadores para la
identificación de los genes de resistencia y a kits de diagnóstico
que contienen dichas sondas y/o cebadores. Finalmente, la invención
se refiere a polipéptidos codificados por dichos genes de
resistencia y a la utilización de tales polipéptidos.
Los patógenos de las plantas son responsables de
pérdidas sustanciales de plantas y productos vegetales debido a la
infección de la planta. Las enfermedades de las plantas, como
resultado de la infección por patógenos o plagas de las plantas,
ocasionan daño a las plantas y/o a los productos vegetales, reducen
la producción y el rendimiento, limitan el tipo de plantas que
pueden desarrollarse en ciertas áreas geográficas y como resultado
ocasionan graves pérdidas (financieras) al agricultor.
Los nematodos parásitos de plantas existen en
todo el mundo y la mayoría de ellos vive durante casi toda su vida
en la capa superior de la tierra. Aunque se considera que las
pérdidas ocasionadas por la alimentación directa de los nematodos de
las raíces de las plantas son de pequeña importancia, varias
especies, entre ellas los nematodos de los nudos de las raíces que
pertenecen a la especie Meloidogyne, los nematodos de los
quistes que pertenecen a la especie Heterodera y a la especie
Globodera y otros nematodos tales como la especie
Nacobbus, ocasionan un grave daño y pérdidas económicas en
los cultivos. Los nematodos de los nudos de las raíces existen
también en todo el mundo pero se encuentran más frecuentemente y en
mayor número en áreas con climas más cálidos y en invernaderos. Las
especies más importantes de Meloidogyne son M.
incognita, M. arenaria, M. hapla y M.
javanica, de las cuales M. hapla se da también en zonas
climáticas más templadas.
Existen diferentes medios para controlar los
patógenos de las plantas, tales como cultivo mecánico del suelo, el
tratamiento químico con pesticidas, incluyendo nematicidas e
insecticidas, o la rotación de cultivos. Sin embargo, para ciertos
patógenos de las plantas, especialmente nematodos, estos medios de
control son insuficientes para proteger a las plantas de la
infección y las enfermedades resultantes. El único medio de control
eficaz implica la resistencia de la planta huésped (Russell, 1978,
Plant Breeding for pest and disease resistance, Butterworths edit.,
pág. 485). El desarrollo de cultivos resistentes a los patógenos
comunes de las plantas es uno de los principales objetivos de los
agricultores hoy en día, con el fin de reducir o finalmente eliminar
la considerable necesidad de pesticidas. La carga para el medio
ambiente de grandes cantidades de pesticidas inyectados en el suelo
o pulverizados sobre los cultivos, árboles, etc., resulta cada año
más grave. Además, las normas gubernamentales en los países
occidentales restringen el uso o incluso prohiben la utilización de
ciertos pesticidas. Por lo tanto, la necesidad de plantas que sean
resistentes a uno o más de sus patógenos, o que tengan una
susceptibilidad reducida a sus atacantes resulta cada vez más
urgente. El desarrollo de plantas resistentes es uno de los
objetivos importantes de los programas actuales de cultivo de
plantas. Los genotipos de plantas susceptibles a patógenos
particulares son cruzados con genotipos de plantas resistentes con
el fin de introducir el fenotipo resistente en la línea de
reproducción.
El daño por los nematodos de los nudos de las
raíces resulta principalmente de la invasión de las raíces de la
planta por larvas, las cuales en una relación compatible con la
planta se desarrollan para dar lugar a una hembra reproductora.
Después de la invasión, las larvas hacen que las células de las
raíces se desarrollen para dar células gigantes de las cuales se
alimentan. Después de la infección se forman agallas o nudos en las
raíces y las raíces de la planta resultan por otra parte alteradas,
se engrosan y atrofian. El sistema de las raíces no funciona bien
por tanto para captar el agua y los elementos nutricionales, lo cual
daña el crecimiento y desarrollo de la planta. Frecuentemente, el
daño a las plantas infectadas es incrementado por hongos parásitos
que atacan al tejido de la raíz debilitado. Las plantas infectadas
muestran un crecimiento reducido y hojas de color pálido más
pequeñas, con frutos diminutos de poca calidad o incluso sin frutos,
y tienden a marchitarse en los climas más cálidos (Agrios, 1988, en:
Plant Pathology, Academic Press, Inc.). El daño y/o la reducción del
rendimiento ocasionados por los nematodos de los nudos de las raíces
es considerable en la producción agrícola total mundial. En una
plantación individual las pérdidas de producción pueden ser tan
elevadas como del 25-50%, o incluso el cultivo
puede ser aniquilado.
Los nematodos de los nudos de las raíces de
invernaderos pueden ser controlados mediante esterilización por
vapor del suelo o mediante la fumigación del suelo con nematicidas.
Bajo condiciones de campo, el control puede lograrse mediante la
utilización de nematicidas. Sin embargo, el uso de éstos, en algunos
casos productos químicos muy persistentes, está siendo cada vez más
debatido y en algunos países está incluso prohibido el uso de
ciertos nematicidas.
La producción de genotipos genéticamente
resistentes es la forma más fiable y eficaz para controlar la
enfermedad de los nudos de las raíces. Se ha descrito para varias
especies de cultivo la disponibilidad de resistencia dentro del
plasma germinal relacionado, por ejemplo, patata, algodón, tabaco,
trigo, soja, tomate, berenjena, frijol común y alfalfa. La
producción de resistencia está dificultada primeramente por la
existencia limitada de genes de resistencia (conocidos) en el plasma
germinal disponible; en segundo lugar, en algunas especies de
plantas, la existencia de barreras cruzadas entre la especie de
planta cultivada y la resistencia que lleva la especie relacionada,
y en tercer lugar, los ensayos para seleccionar resistencia frente a
susceptibilidad a nematodos son laboriosos y por lo regular no
fiables. Por lo tanto, la producción de resistencia es muy difícil
de conseguir o no se consigue, o si es posible, requiere mucho
tiempo.
La introducción con éxito de genes de resistencia
se ha logrado en el tomate. El gen de resistencia Mi
(Meloidogyne incognita) ha sido introducido en tomates
cultivados, Lycopersicon esculentum, después del cruce con la
especie salvaje relacionada L. peruvianum (PI 128657),
utilizando un cultivo de embriones. El gen Mi confiere
resistencia a varias especies de Meloidogyne (Fassuliotis,
1991, en: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). Se
ha descrito que el gen de resistencia Mi es un gen dominante
monogénico (Gilbert y McGuire, 1956, Proc. Am. Soc.
Hortic. Sci., 68, 437-442), y está ubicado en el cromosoma 6 del tomate. También se postula que la región introducida que comprende el locus Mi está involucrada en la concesión de resistencia al áfido de la patata (Macrosiphum euphorbia) (Kaloshian y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 622-625).
Hortic. Sci., 68, 437-442), y está ubicado en el cromosoma 6 del tomate. También se postula que la región introducida que comprende el locus Mi está involucrada en la concesión de resistencia al áfido de la patata (Macrosiphum euphorbia) (Kaloshian y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 622-625).
Las plantas han desarrollado un mecanismo
complejo de defensa frente al ataque y la infección por patógenos.
Hasta la fecha, el mecanismo exacto de su sistema de defensa aún no
ha sido averiguado.
La resistencia a nematodos en el tomate se
expresa después de la penetración. Una vez que la larva juvenil
entra en la raíz y se establece en un sitio de alimentación, se
desencadena una reacción hipersensible (HR) adyacente a la cabeza
del nematodo que tiene como resultado la muerte local de las células
del huésped. El nematodo también es afectado adversamente por esta
HR y muere (Fassuliotis, 1991, en: Genetic Improvement of Tomato,
Springer Verlag edit.). Se desconoce si existe o no un sentido de
relación gen por gen (Flor, 1956, Adv. Gen., 8,
29-54) como es frecuentemente el caso en otras
relaciones planta-patógeno en las que la resistencia
se basa en la incompatibilidad de HR.
El aislamiento de genes vegetales sin conocer sus
productos génicos es muy laborioso y difícil, debido a los enormes
tamaños del genoma de las especies vegetales: por ejemplo, el tomate
tiene un tamaño de genoma de 1000 Mb (10^{9} pares de bases de ADN
nuclear), el maíz tiene un tamaño de genoma de 3000 Mb y el trigo
tiene incluso más de 16 x 10^{9} pares de bases. La búsqueda de un
gen específico entre estos billones de pares de bases solamente es
posible cuando, (i) existen suficientes marcadores moleculares
estrechamente unidos al gen de interés y (ii) existe un buen
material genético disponible (Tanksley y col., 1995, Trends in
Genetics, 11, p. 63-68).
Aunque se ha descrito el aislamiento de unos
cuantos genes de resistencia, ninguno de estos genes de resistencia
es capaz de conferir a la planta huésped resistencia a nematodos o a
áfidos. Ejemplos de dichos genes de resistencia aislados son:
RPS2 de Arabidopsis (resistencia a Pseudomonas
syringae que expresa avrRpt2), N del tabaco (resistencia
al virus del mosaico del tabaco), Cf-9 del
tomate (resistencia al patógeno fúngico de las hojas Cladosporium
fulvum que lleva avr9) y L^{6} del lino
(resistencia a la estirpe fúngica del óxido de las hojas
correspondiente) (Dangl, 1995, Cell, 80,
363-366).
La presente invención proporciona el primer gen
de resistencia a nematodos aislado, y además, proporciona el primer
gen de resistencia a áfidos aislado. Además, la presente invención
se refiere a un gen de resistencia de doble función que confiere
susceptibilidad reducida a nematodos así como a áfidos, y
preferiblemente a Meloidogyne incognita y Macrosiphum
euphorbiae, respectivamente.
La presente invención se refiere a un ácido
nucleico que contiene el gen de resistencia Mi, el cual
cuando está presente y es expresado en una planta es capaz de
conferir a dicha planta resistencia contra nematodos y/o áfidos.
Además, la invención se refiere al gen de resistencia Mi cuya
secuencia de ADN se describe en la presente. La invención también se
refiere a un producto génico codificado por el gen de resistencia
Mi. Además, la presente invención se refiere a construcciones
de ADN, cósmidos, vectores, cepas bacterianas, células de levadura y
células vegetales que contienen el gen de resistencia Mi. En
otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta
genéticamente transformada, la cual es resistente a un nematodo,
siendo dicho nematodo capaz de infectar la planta no transformada.
Además, la invención se refiere a genes de resistencia que son
homólogos al gen de resistencia Mi y que, cuando están
presentes en una planta, son capaces de conferir a dicha planta
resistencia a la infección por patógenos.
Además, la presente invención se refiere a un
ácido nucleico que contiene el gen de resistencia
Meu-1, el cual cuando está presente en una
planta es capaz de conferir a dicha planta una susceptibilidad
reducida a áfidos. En particular, el gen de resistencia
Meu-1 corresponde al gen de resistencia
Mi. Especialmente, el gen de resistencia
Meu-1 tiene la misma secuencia de nucleótidos
que el gen de resistencia Mi. De esta manera, la presente
invención también se refiere a plantas genéticamente transformadas,
las cuales tienen susceptibilidad reducida, y son preferiblemente
resistentes a áfidos, en particular a los áfidos de la patata.
Finalmente, la invención se refiere a
oligonucleótidos que corresponden a la secuencia de dicho gen de
resistencia o a parte del mismo, y a kits de detección que contienen
tales oligonucleótidos.
La Figura 1 muestra un mapa físico de YAC 1/1172,
YAC 2/1256 y YAC 1/1084, con un tamaño de 570, 500 y 470 kb,
respectivamente. Se indican la posición de los sitios de restricción
de SfiI y BssHII y el tamaño de los fragmentos de
restricción. Se indica la ubicación de los diferentes marcadores
AFLP en los fragmentos de restricción.
La Figura 2 muestra un dibujo esquemático del
vector cosmídico binario pJJ04541, el cual es utilizado para
construir una biblioteca de cósmidos de YAC 1/546. El plásmido
pRK290 (20 kb de tamaño) (Ditta y col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 7347-7351) fue utilizado como vector de
inicio. "Tet" se refiere al gen que confiere resistencia a
tetraciclina. "LB" indica la secuencia de repetición del límite
izquierdo del ADN-T, y "RB" indica la
repetición del límite derecho. La secuencia del promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor está indicada por "p35S", y
"ocs3'" indica el extremo 3' de la sintasa de octopina.
"NPT" indica fosfotransferasa de neomicina, y "cos" se
refiere al sitio cos del bacteriófago lambda que permite el
empaquetamiento in vitro. "pDBS" indica el poliadaptador
de pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.).
La Figura 3A muestra una representación
esquemática de la posición detallada de los marcadores AFLP en YAC
1/1172, YAC 2/1256 y YAC 1/1084. La colocación se basa en el contig
cosmídico construido para las diferentes regiones definidas.
La Figura 3B muestra una representación
esquemática del contig cosmídico de la región que comprende el gen
de resistencia Mi. Los cósmidos Mi-32,
Mi-30, Mi-11, Mi-18,
Mi-01 y Mi-14 están representados
por líneas horizontales. Se indica la ubicación de los marcadores
AFLP, PM14 y PM25.
La Figura 4 muestra un mapa físico preciso de los
cósmidos Mi-32, Mi-30,
Mi-11, Mi-18, Mi-01
y Mi-14 para el enzima de restricción PstI.
Se indica el tamaño de los fragmentos de PstI (en kb). El
fenotipo Mi, según se identificó en un ensayo de enfermedad
in vitro, de las plantas R_{0} que contienen los diferentes
cósmidos está indicado en la parte del extremo derecho de la figura.
El segmento de ADN del cual se determinó la secuencia de nucleótidos
está indicado por una línea doble con una flecha bidireccional.
La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos
de un segmento de ADN de aproximadamente 9,9 kb alrededor del
marcador AFLP, PM14, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen
de resistencia Mi. El codón de inicio (ATG, posición
3263-3265) está subrayado y el codón de terminación
(TAG, posición 7109-7111) está doblemente subrayado,
mostrando un marco de lectura abierto (ORF1) que codifica un
polipéptido de 1257 aminoácidos (Figura 7A). El gen de resistencia
Mi comprende dos secuencias intrónicas (mostradas en
cursiva): un intrón de 1306 nucleótidos desde la posición 1936 hasta
la posición 3241 y un intrón de 75 nucleótidos desde la posición
3305 hasta la posición 3379.
Un segundo codón de inicio (ATG, posición
3491-3493), el cual está en marco con el primer
codón de inicio, da como resultado un segundo marco de lectura
abierto (ORF2) que codifica un polipéptido truncado de 1206
aminoácidos (Figura 7B).
La posición del marcador AFLP, PM14, es desde el
nucleótido en posición 6921
(5'-TGCAGGA-3') hasta el nucleótido
en posición 7034 (5'-AGATTA-3').
La Figura 6 muestra un mapa físico de los
cósmidos Mi-11 y Mi-18 y la
secuencia de nucleótidos determinada del cósmido
Mi-11. La secuencia está dividida en cuatro contigs:
con25 (5618 pb), con10 (898 kb), con62 (2495 pb) y Mi (9870
pb). La parte inferior de la figura representa la presencia
("+") o ausencia ("-") de varios fragmentos de PCR, que
corresponden a las partes del segmento de ADN de la Figura 5, que
están representados como líneas horizontales de diferentes
longitudes en el lado derecho de la tabla, en los diferentes fondos
genéticos (clon YAC 2/1256, E. coli conteniendo el cósmido
Mi-11, A. tumefaciens conteniendo el cósmido
Mi-11, E. coli conteniendo el cósmido
Mi-18, A. tumefaciens conteniendo el cósmido
Mi-18, línea E22 de tomate resistente, línea 52201
de tomate susceptible, plantas R_{0} transformadas con el cósmido
Mi-11 y plantas R_{0} transformadas con el cósmido
Mi-18).
Secuencia de nucleótidos del cósmido
Mi-11 y del cósmido Mi-18. Análisis
de diferentes contigs.
La Figura 7
\,A: muestra la secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido codificado por ORF1.
- B: muestra la secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido truncado codificado por ORF2.
La Figura 8 ilustra una representación
esquemática de la estructura del gen de resistencia Mi.
La Figura 9 ilustra una representación
esquemática de la familia del gen de resistencia Mi.
En la presente descripción y en los ejemplos que
siguen, se utilizan varios términos. Con el fin de proporcionar un
entendimiento claro y consistente de la especificación y las
reivindicaciones, incluyendo el alcance de tales términos, se
proporcionan las siguientes definiciones.
- -
- ácido nucleico: molécula de ADN de doble hebra. El ácido nucleico puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o cualquier otro ADN;
- -
- oligonucleótido: una molécula de ADN de hebra sencilla corta;
- -
- cebadores: en general, el término cebador se refiere a una molécula de ADN de hebra sencilla que puede iniciar la síntesis del ADN;
- -
- hibridación de un ácido nucleico: un método para detectar secuencias de ADN relacionadas a través de la hibridación de ADN de hebra sencilla sobre soportes tales como una membrana de nailon o papeles de filtro de nitrocelulosa. Las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de bases complementarias reformarán la estructura de doble hebra si se mezclan en solución bajo condiciones apropiadas. Se formará la estructura de doble hebra entre dos ácidos nucleicos de hebra sencilla complementarios incluso si uno está inmovilizado sobre un soporte. En un procedimiento de hibridación Southern, tiene lugar esta última situación;
- -
- sonda de hibridación: para detectar una secuencia particular de ADN en el procedimiento de hibridación Southern, una molécula de ADN marcada o sonda de hibridación se hace reaccionar con el ADN fraccionado unido a un soporte tal como una membrana de nailon o un papel de filtro de nitrocelulosa. Las áreas del filtro que llevan secuencias de ADN complementarias a la sonda de ADN marcada quedan marcadas como consecuencia de la reacción de rehibridación. Las áreas del filtro que presentan tal marcaje pueden ser detectadas posteriormente de acuerdo con el tipo de marca utilizado. La sonda de hibridación es producida generalmente por clonaje molecular de una secuencia de ADN específica o sintetizando un oligonucleótido sintético;
- -
- secuencia homóloga: una secuencia que tiene al menos un 50%, preferiblemente un 60%, más preferiblemente un 70%, muy preferiblemente un 80% o incluso un 90% de identidad de secuencias con la secuencia particular, por lo que la longitud de las secuencias que serán comparadas para ácidos nucleicos es generalmente de al menos 120 nucleótidos, preferiblemente de 200 nucleótidos y más preferiblemente de 300 nucleótidos y la longitud de las secuencias que serán comparadas para polipéptidos es generalmente de al menos 40 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 65 residuos de aminoácidos y más preferiblemente de 100 residuos de aminoácidos. Alternativamente, una secuencia homóloga se refiere a una secuencia que puede hibridarse bajo condiciones rigurosas a una secuencia particular, y/o a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene sustancialmente las mismas propiedades que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN particular, y/o a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN particular, y/o a una secuencia de aminoácidos en la que algunos residuos de aminoácidos han sido cambiados con respecto a la secuencia de aminoácido del polipéptido particular sin afectar sustancialmente las propiedades principales de dicho polipéptido;
- -
- condiciones rigurosas se refiere a condiciones de hibridación que permiten que una secuencia de ácido nucleico se hibride a una secuencia particular. En general, condiciones muy rigurosas se refiere a las condiciones de hibridación que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, y preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una secuencia particular a aproximadamente 65ºC en una solución que contiene sal 1 M aproximadamente, preferiblemente SSC 6 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavando a 65ºC en una solución que contiene sal 0,1 M aproximadamente, o menos, preferiblemente SSC 0,2 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Estas condiciones permiten la detección de secuencias que tienen alrededor de un 90% o más de identidad de secuencias. En general, condiciones menos rigurosas se refiere a las condiciones de hibridación que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, y preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una secuencia particular a aproximadamente 45ºC en una solución que contiene sal 1 M aproximadamente, preferiblemente SSC 6 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavando a temperatura ambiente en una solución que contiene sal 1 M aproximadamente, preferiblemente SSC 6 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Estas condiciones permiten la detección de secuencias que tengan hasta un 50% de identidad de secuencias. Los expertos en la técnica serán capaces de modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar secuencias que tengan una identidad que varíe entre el 50% y el 90%;
- -
- promotor: una región de regulación de la transcripción corriente arriba desde la secuencia codificadora que contiene las secuencias reguladoras requeridas para la transcripción de la secuencia codificadora adyacente e incluye la región 5' no traducida o la llamada secuencia líder de ARNm;
- -
- terminador: una región corriente abajo de la secuencia codificadora que dirige la terminación de la transcripción, también denominada región 3' no traducida, la cual incluye la señal de poli-adenilación;
- -
- gen de resistencia: un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora como la representada en la Figura 5, o parte de la misma, o cualquier secuencia homóloga o correspondiente;
- -
- nematodo(s): especies de Meloidogyne, tales como Meloidogyne incognita, M. arenaria o M. javanica, o cualquier otro genotipo que no sea capaz de infectar un huésped que tenga un gen de resistencia de acuerdo con la invención, tales como, pero no limitándose a, otros nematodos de los nudos de las raíces, tales como M. hapla, nematodos quísticos tales como las especies de Heterodera, o las especies de Globodera, u otros nematodos tales como las especies de Nacobbus, insectos tales como el áfido de la patata o cualquier otro patógeno o plaga de las plantas;
- -
- producto de un gen de resistencia: un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la presentada en la Figura 5, o parte de la misma, o cualquier secuencia de aminoácidos homóloga;
- -
- planta R_{0}: regenerante primario procedente de un experimento de transformación, también denominada planta transformada o planta transgénica;
- -
- línea R_{1}: la progenie de una planta R_{0} autofecundada;
- -
- línea R_{2}: la progenie de una planta R_{1} autofecundada;
- -
- línea R_{1}BC: la progenie de un retrocruzamiento entre una planta R_{1} y una planta del genotipo que se utilizó originalmente para el experimento de transformación.
En la presente invención, hemos podido
identificar y aislar el gen de resistencia a Meloidogyne
incognita (Mi). El gen fue clonado a partir de un
genotipo de tomate, que es resistente a Meloidogyne
incognita. El gen de resistencia Mi aislado de acuerdo
con la invención puede ser transferido a una planta huésped
susceptible utilizando transformación mediada por
Agrobacterium o cualquier otro método de transformación
conocido, y está implicado en la concesión de resistencia a la
planta huésped frente a patógenos vegetales, especialmente
nematodos. La planta huésped puede ser el tomate o cualquier otro
genotipo que esté infectado por dicho patógeno vegetal.
La presente invención proporciona también una
secuencia de ácido nucleico que contiene el gen de resistencia
Mi, la cual está representada en la Figura 5.
Con el gen de resistencia Mi de acuerdo
con la invención, se tiene un medio de control eficaz frente a
patógenos y/o plagas de las plantas, ya que el gen puede ser
utilizado para transformar genotipos de plantas susceptibles,
produciendo así plantas genéticamente transformadas que tienen una
susceptibilidad reducida o que son preferiblemente resistentes a un
patógeno o a una plaga de las plantas. En particular, una planta que
es transformada genéticamente con el gen de resistencia Mi de
acuerdo con la invención tiene una susceptibilidad reducida a los
nematodos de los nudos de las raíces.
En una realización preferida, el gen de
resistencia Mi comprende la secuencia codificadora
proporcionada en la Figura 5 o cualquier secuencia correspondiente u
homóloga o una secuencia de ADNc, precedida por una región promotora
y seguida por una región de terminación. La región promotora debe
ser funcional en células vegetales y, preferiblemente, corresponde a
la región promotora nativa del gen de resistencia Mi. Sin
embargo, debe reconocerse que puede utilizarse cualquier región
promotora heteróloga junto con las secuencias codificadoras, siempre
que sea funcional en células vegetales. Preferiblemente, se utiliza
un promotor constitutivo, tal como el promotor 35S del CaMV o los
promotores de ADN-T, todos bien conocidos por los
expertos en la técnica. Además, una región de terminación adecuada
debe ser funcional en células vegetales todas bien conocidas por los
expertos en la técnica.
Además, la invención se refiere a un producto del
gen de resistencia Mi, el cual está codificado por el gen de
resistencia Mi de acuerdo con la invención y tiene una
secuencia de aminoácidos deducida proporcionada en la Figura 5 y en
la Figura 7A, o que es homóloga a la secuencia de aminoácidos
deducida o a parte de la misma. Además, el producto del gen de
resistencia Mi o un polipéptido truncado como el
proporcionado en la Figura 7B, puede ser utilizado para producir
anticuerpos contra el mismo, anticuerpos que pueden ser utilizados
para la detección de la presencia del producto del gen de
resistencia Mi.
En otro aspecto de la invención, el gen de
resistencia Mi puede ser utilizado para el diseño de
oligonucleótidos que sean complementarios a una hebra de la
secuencia de ADN según se describe en la Figura 5, o a parte de la
misma, que pueden ser utilizados como sondas de hibridación, siendo
marcados por consiguiente para permitir la detección, para la
selección de bibliotecas de ADN genómico o ADNc por genes homólogos.
Las secuencias homólogas que pueden hibridarse a la sonda bajo
condiciones de hibridación rigurosas, y que codifican un producto
génico que está involucrado en la concesión de susceptibilidad
reducida o resistencia a una planta frente a un patógeno vegetal que
normalmente infecta dicha planta, están comprendidas dentro del
ámbito de la presente invención.
En otro aspecto de la invención, se diseñan
oligonucleótidos basados en la secuencia del gen de resistencia
Mi, de tal manera que pueden ser utilizados como sondas de
hibridación en el análisis Southern. Estas sondas pueden ser
utilizadas como marcadores moleculares para distinguir genotipos de
plantas que tengan el gen de resistencia y genotipos de plantas que
carezcan del gen de resistencia. Dicha sonda puede ser utilizada
como una herramienta adicional en la selección. En una realización
preferida de la invención, los oligonucleótidos son diseñados sobre
la base de la secuencia del gen de resistencia Mi, de tal
manera que pueden ser utilizados como cebadores en una reacción de
amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), en la que la formación de un producto de amplificación indica
la presencia del gen de resistencia Mi en cierto genotipo
vegetal. En una realización particular de la invención, dichos
cebadores dirigen la amplificación de fragmentos polimórficos,
llamados marcadores moleculares, los cuales están estrechamente
ligados al gen de resistencia Mi. En una realizaión
preferida, dichos cebadores son utilizados en la amplificación
selectiva de fragmentos de restricción para identificar marcadores
AFLP, los cuales están estrechamente ligados al gen de resistencia
Mi. La invención también se refiere a kits de diagnóstico,
que comprenden oligonucleótidos de acuerdo con la invención, para la
detección de la presencia o ausencia del gen de resistencia
Mi dentro de un genotipo bajo estudio. Dicho kit de
diagnóstico elimina la utilización de un análisis laborioso de
enfermedades para seleccionar genotipos que tengan o no el gen de
resistencia.
Además, la invención se refiere a construcciones
de ADN que comprenden una secuencia de ADN que corresponde a la
secuencia codificadora del gen de resistencia Mi y secuencias
reguladoras funcionales en células vegetales; dicha secuencia de ADN
puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o ADN de cualquier otro
origen. Dichas secuencias reguladoras son homólogas o heterólogas a
las secuencias codificadoras del gen de resistencia Mi.
Preferiblemente, dicha construcción de ADN comprende un ácido
nucleico cuya secuencia está proporcionada en la Figura 5, o parte
del mismo.
La invención se refiere también a construcciones
de ADN que comprenden las secuencias reguladoras, y más
preferiblemente la región del promotor del gen de resistencia
Mi junto con una secuencia de un gen estructural heteróloga a
dichas secuencias reguladoras.
La invención también se refiere a un vector de
ADN que comprende una construcción de ADN de acuerdo con la
invención. Los vectores adecuados pueden ser vectores de clonaje,
vectores de transformación, vectores de expresión, etc..., los
cuales son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Además, están dentro del ámbito de la invención
células que llevan un vector que comprende una secuencia de ADN que
corresponde a la secuencia descrita en la Figura 5 o parte de la
misma, u homóloga a la misma. Además, están dentro del ámbito de
esta invención células que llevan una construcción de ADN de acuerdo
con la invención.
En una realización preferida de la invención, se
obtiene una planta genéticamente transformada introduciendo el gen
de resistencia Mi dentro del genoma de dicha planta, que es
susceptible a nematodos, utilizando técnicas de transformación
estándar, donde dicha planta transformada genéticamente es
resistente a nematodos. La invención se refiere también al genoma de
la planta recombinante, como tal, que contiene una construcción de
ADN como la definida anteriormente.
En otra realización de la invención, el gen de
resistencia Mi puede ser transferido, utilizando generalmente
técnicas de transformación conocidas, a un sistema heterólogo, tal
como, pero no limitándose a, melón, tabaco, Arabidopsis
thaliana, patata, remolacha, colza, pepino, pimienta, berenjena.
Un sistema heterólogo se refiere a una especie de planta que es
diferente de la especie de planta de la que se aisló el gen de
resistencia.
En otra realización más de la invención, el gen
de resistencia Mi corresponde al gen de resistencia de
Macrosiphum euphorbiae (Meu-1), y está
implicado en la concesión a las plantas, transformadas con el gen de
acuerdo con la invención, de resistencia a insectos y en particular
a áfidos.
La secuencia de ADN que contiene el gen de
resistencia Mi según es proporcionada en la presente
invención tiene numerosas aplicaciones de las cuales algunas están
descritas en la presente, pero no limitan el ámbito de la
invención.
La presente invención será descrita
adicionalmente con detalle a la vista del aislamiento del gen de
resistencia Mi presente en líneas de tomate que son
resistentes a nematodos de los nudos de las raíces. Para el
aislamiento del gen de resistencia Mi, hemos utilizado una
estrategia de clonaje basado en el mapa (clonaje posicional), que
comprende las etapas siguientes:
- (1)
- identificación de los marcadores moleculares ligados al gen de resistencia Mi,
- (2)
- construcción de una biblioteca genómica de YAC de peso molecular alto,
- (3)
- creación de mapas físicos de los marcadores moleculares en los clones de YAC y construcción de contigs de YAC,
- (4)
- construcción de una biblioteca de cósmidos de los clones de YAC que lleven los marcadores moleculares unidos,
- (5)
- creación de mapas físicos precisos y construcción de contigs cosmídicos,
- (6)
- caracterización genética de mutantes de tomate susceptibles a nematodos de los nudos de las raíces,
- (7)
- transformación de plantas susceptibles con los cósmidos que forman el contig,
- (8)
- análisis de la complementación.
Para la identificación de marcadores moleculares,
hemos utilizado la tecnología de amplificación de fragmentos de
restricción selectiva, de aquí en adelante también denominada
tecnología AFLP™, la cual amplifica aleatoriamente un subgrupo de
fragmentos de ADN de una mezcla compleja de muchos fragmentos de ADN
y dichos fragmentos amplificados generan huellas que pueden ser
analizadas. En general, el ADN total de diferentes genotipos de la
misma especie de planta es sometido a la tecnología AFLP y se
comparan las diferentes huellas de AFLP obtenidas de los diferentes
genotipos. Los fragmentos que están presentes en un genotipo y
ausentes en otro genotipo son fragmentos polimórficos y se denominan
marcadores AFLP. La selectividad de las reacciones AFLP se obtiene
utilizando nucleótidos selectivos aleatoriamente seleccionados en el
extremo 3' de los cebadores de PCR inmediatamente adyacentes a los
nucleótidos del sitio del enzima de restricción. En una selección
por AFLP, el ADN que será estudiado es sometido a diferentes
combinaciones de cebadores. La cantidad total de los diferentes
cebadores que puede ser utilizada está determinada por el número de
nucleótidos selectivos que son añadidos al extremo 3' (4 cebadores
con 1 nucleótido selectivo, 16 cebadores con 2 nucleótidos
selectivos, 64 cebadores con 3 nucleótidos selectivos). Si se
utilizan dos enzimas de restricción diferentes, hay entonces una
cantidad doble de cebadores. Esos cebadores pueden ser utilizados en
una combinación diferente. Si se utilizan todas las combinaciones
posibles en una selección por AFLP, todos los fragmentos presentes
deben haber sido amplificados con una de las combinaciones de
cebadores (Zabeau y Vos, EP 0534858).
Para la identificación de marcadores AFLP ligados
al gen de resistencia Mi, diferentes líneas de tomate fueron
sometidas a una selección por AFLP. En una primera etapa, se
analizaron dos grupos de líneas casi isogénicas para determinar
resistencia a nematodos frente a susceptibilidad mediante la
formación de huellas de AFLP utilizando los siguientes
cebadores:
| Cebadores de PstI | 5'-GACTGCGTACATGCAGNN-3' |
| Cebadores de MseI | 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3' |
Las Ns indican los nucleótidos selectivos
variables. En la selección por AFLP se utilizaron todos los 16
cebadores posibles para el cebador de PstI y los 64 cebadores
posibles para el cebador de MseI en los dos grupos de líneas
casi isogénicas, dando un total de 16 x 64 = 1024 combinaciones de
cebadores ensayadas. Después del análisis de todas las huellas de
AFLP, se identificaron un total de 30 marcadores AFLP candidatos
ligados al gen de resistencia Mi. Estos marcadores candidatos
fueron posteriormente ensayados en un panel de líneas de tomate
resistentes a nematodos y susceptibles a nematodos para la
confirmación y determinación de la distancia de la unión al
locus Mi. El gen de resistencia Mi fue
introducido en el tomate cultivado en 1944 a partir de
Lycopersicon peruvianum. Las líneas de tomate resistentes a
nematodos modernas han sido sometidas a numerosos ciclos de cruce
esperando obtener como resultado una región pequeña introducida de
Lycopersicon peruvianum con el gen de resistencia Mi.
Se espera que el análisis de los marcadores AFLP candidatos en estos
genotipos de tomate modernos sea un buen análisis para determinar la
estrecha unión al locus Mi. Un panel de 7 genotipos de
tomate resistentes y 11 genotipos de tomate susceptibles fue
analizado con los marcadores AFLP candidatos. Parecía que un total
de 20 marcadores AFLP estaban presentes en todas las líneas
resistentes y ausentes en todas las líneas susceptibles y se
denominaron marcadores AFLP ligados a Mi.
Posteriormente, cuatro de los marcadores AFLP
fueron seleccionados en una biblioteca genómica de alto peso
molecular. El clonaje de segmentos muy grandes de ADN como
cromosomas artificiales grandes en levaduras se ha convertido en una
etapa esencial para el aislamiento de genes mediante clonaje
posicional. La capacidad de clonaje del vector YAC permite el
aislamiento de fragmentos de ADN de hasta un millón de pares de
bases de longitud. La línea de tomate Lycopersicon esculentum
E22, homocigota para el locus Mi, fue utilizada como
una fuente de ADN para construir una biblioteca de YAC. Obtuvimos
una biblioteca de YAC conteniendo 3840 clones con un tamaño de
inserto promedio de 520 kb, representando aproximadamente 2,2
equivalentes de genoma del genoma del tomate. Se obtuvieron tres
clones de YAC positivos después de la selección de AFLP con los
marcadores AFLP ligados a Mi: 1/1084, 1/1172 y 2/1256.
Posteriormente, se determinó la presencia de todos los marcadores
AFLP ligados a Mi en los 3 clones de YAC. Todos los
marcadores parecían estar presentes en uno o más de los 3 clones de
YAC, lo cual permitió una primera colocación de los diferentes
marcadores AFLP ligados a Mi. Los datos de AFLP indicaban que
los tres clones de YAC constituían un contig solapante de
aproximadamente 1,4 Mb (ver la Figura 1).
Para determinar el tamaño físico del locus
Mi que contenía los marcadores AFLP ligados a Mi y que
estaba contenido en los clones de YAC 1/1084, 1/1172 y/o 2/1256, se
construyó un mapa de restricción de gran alcance del contig de YAC.
Éste definía un segmento de ADN que contenía el locus
Mi de aproximadamente 700 kb en el cual estaban ubicados
todos los marcadores AFLP ligados a Mi (ver la Figura 1).
Un tamaño de 700 kb es aún demasiado grande para
la localización directa del gen de resistencia Mi. Dichos
insertos grandes no pueden ser transformados en células vegetales
directamente. Por lo tanto, se construyó una biblioteca de cósmidos
de la cepa de levadura que contenía YAC 1/1172 y se construyó una
biblioteca de cósmidos de la cepa de levadura que contenía YAC
2/1256 utilizando vectores cosmídicos que son adecuados para la
transformación mediada por Agrobacterium. El tamaño del este
vector cosmídico binario viene a ser de 29 kb y se muestra
esquemáticamente en la Figura 2. La capacidad de clonaje de este
vector cosmídico binario, utilizando un extracto de empaquetamiento
del fago lambda, está dentro del rango de 9 a 24 kb. Se obtuvieron
dos bancos de aproximadamente 250.000 clones cosmídicos cada uno a
partir del ADN de levadura fraccionado por tamaños. Los bancos de
cósmidos fueron sometidos a selección por hibridación de colonias
utilizando como sondas fragmentos de restricción marcados de los
YACs. Se identificaron clones de cósmidos positivos y además, los
cósmidos fueron agrupados en siete regiones definidas que cubrían la
región Mi.
En la siguiente etapa, se determinó la huella del
grupo de cósmidos de las siete regiones definidas utilizando la
amplificación de fragmentos de restricción para determinar su orden
relativo. Pudo construirse un contig cosmídico que cubría un
segmento de ADN de aproximadamente 700 kb. Posteriormente, se
determinó la presencia de los marcadores AFLP ligados a Mi en
este contig cosmídico. Se obtuvo un mapa físico del segmento de ADN
que contenía el gen de resistencia Mi con las posiciones de
los diferentes marcadores AFLP ligados a Mi (ver la Figura
3).
Un total de 96 cósmidos solapantes constituían
conjuntamente el segmento de ADN que contenía el gen de resistencia
Mi. El análisis de complementación para identificar el gen de
resistencia Mi con tal grupo grande de cósmidos es una tarea
muy laboriosa. Por lo tanto, la posición del gen de resistencia
Mi en el contig cosmídico fue determinada utilizando líneas
de tomate mutantes. Estas líneas mutantes son miembros de una
familia que se origina de un ancestro común y contienen un genotipo
Mi de tipo salvaje (resistente a nematodos) pero un fenotipo
mutante susceptible a nematodos. Después del análisis con el grupo
de marcadores AFLP ligados a Mi en un gran número de estas
líneas mutantes, tres marcadores AFLP ligados a Mi parecían
estar ausentes en la mayoría de los mutantes. Estos marcadores AFLP,
por lo tanto, mostraban una buena correlación entre el genotipo
Mi de AFLP y el fenotipo Mi, en constraste con los
demás 17 marcadores AFLP. Dos de estos marcadores AFLP, PM14 y PM25,
eran adyacentes, y se asumió que la región alrededor de estos
marcadores era la posición más probable para el gen de resistencia
Mi. Un grupo de 6 cósmidos solapantes que definían un
segmento de ADN de aproximadamente 50 kb alrededor de los marcadores
AFLP PM14 y PM25 fue seleccionado para el análisis de
complementación (ver la Figura 4).
La etapa final en la identificación del gen de
resistencia Mi mediante clonaje posicional es la
complementación del fenotipo susceptible correspondiente. Los 6
cósmidos de la región de Mi candidata fueron introducidos en
Agrobacterium tumefaciens mediante transferencia por
conjugación en apareamiento triparental. La presencia del cósmido en
las cepas de A. tumefaciens fue determinada comparando varios
patrones de enzimas de restricción, así como huellas de ADN de las
cepas de A. tumefaciens con la cepa de E. coli que
contenía el cósmido. Solamente aquellos cultivos de A.
tumefaciens que albergaban un cósmido con el mismo patrón de ADN
que el cultivo de E. coli correspondiente fueron utilizados
para transformar una línea de tomate susceptible. Una línea de
tomate susceptible fue transformada con los cósmidos
Mi-32, Mi-30, Mi-11,
Mi-18, Mi-01 y Mi-14
utilizando métodos estándar de transformación.
Raíces de plantas R_{0} transformadas
cultivadas in vitro fueron analizadas para determinar
síntomas de enfermedad con el fin de identificar los cósmidos con el
gen de resistencia. Explantes de raíces fueron transferidos a un
medio solidificado en placas Petri e inoculados con diez agallas de
un cultivo axénico de nemátodos del nematodo de los nudos de la raíz
Meloidogyne incognita. Los síntomas de enfermedad fueron
valorados seis semanas después de la inoculación. Una planta
transgénica es considerada resistente cuando no es visible ninguna
agalla o solamente una agalla en el cultivo de su raíz. Una planta
transgénica es considerada susceptible cuando al menos dos agallas
han sido inducidas en el cultivo de su raíz. Las observaciones del
ensayo de enfermedad in vitro revelaron que dos cósmidos
fueron capaces de complementar el fenotipo susceptible. La presencia
del marcador AFLP PM14 en plantas R_{0} resistentes indicaba que
el inserto genómico presente en los cósmidos Mi-11 y
Mi-18 estaba también presente en las plantas R_{0}
y estaba involucrado en la concesión de resistencia a las plantas
R_{0} frente a Meloidogyne incognita.
Los regenerantes primarios (plantas R_{0}) de
los experimentos de transformación fueron cultivados en el
invernadero para que dieran semillas con el fin de obtener líneas
R_{1}, las cuales fueron analizadas para determinar síntomas de
enfermedad. El ensayo de enfermedad se realizó en los plantones.
Para esto, se sembraron las semillas o se transfirieron plántulas de
raíz pequeña a tierra infectada con Meloidogyne incognita y
se valoraron los síntomas de enfermedad de 4 a 8 semanas después de
la inoculación. Las plantas se consideran resistentes cuando son
visibles tres o menos agallas en las raíces. Las plantas se
consideran susceptibles cuando se forman más de tres agallas en las
raíces. Las observaciones del ensayo de enfermedad in vivo
revelaron que las plantas R_{0} resistentes correspondían a los
transformantes con el cósmido Mi-11.
Con el fin de confirmar la integración estable
del gen de resistencia Mi en el genoma de las plantas R_{0}
transgénicas, las plantas resistentes de las líneas R_{1} fueron
autofecundadas y cultivadas en el invernadero para que dieran
semillas con el fin de obtener líneas R_{2}. Los plantones de las
líneas R_{2} fueron sometidos a un ensayo de enfermedad de
nematodos in vivo. Los resultados obtenidos indicaban la
herencia estable del gen de resistencia Mi.
Finalmente, los insertos de los cósmidos
Mi-11 y Mi-18 fueron caracterizados
adicionalmente. El análisis de las secuencias reveló un marco de
lectura abierto grande (ORF2) de 3621 nucleótidos. La secuencia de
ADN se presenta en la Figura 5.
La secuencia de ADN comprendiendo el gen de
resistencia Mi se sometió posteriormente a estudios de mapeo
de los transcritos con el fin de determinar la existencia de
secuencias intrónicas. Estos estudios de mapeo de los transcritos
fueron realizados de acuerdo con métodos generalmente conocidos,
mediante los cuales las secuencias de ADN genómico son comparadas
con secuencias de ADNc. La comparación de secuencias de ADNc y
secuencias genómicas reveló la existencia de dos secuencias
intrónicas en el gen de resistencia Mi. Un intrón de 1306
nucleótidos está ubicado desde el nucleótido en posición 1936 al
3241 y un segundo intrón de 75 nucleótidos está ubicado desde el
nucleótido en posición 3305 al 3379, según está representado en la
Figura 5. Se postuló que la posición del sitio de inicio de la
transcripción estaba en o corriente arriba del nucleótido 1880. El
primer codón de inicio ATG está localizado en el nucleótido en
posición 3263, que está 52 nucleótidos corriente arriba del segundo
intrón, dando un marco de lectura abierto grande (ORF1) que codifica
un polipéptido de 1257 aminoácidos (Figura 7A).
Las búsquedas de homología han mostrado que los
polipéptidos de acuerdo con la invención pertenecen a la clase LRR
de las proteínas de resistencia de las plantas (Staskawicz y col.,
1995, Science, 268, 661-667). Además, la proteína
puede ser dividida en cuatro regiones designadas A a D: la región A
comprende una gran cantidad de residuos de leucina, la región B
comprende un motivo de un sitio de unión a nucleótidos, la región C
es la región LRR que contiene 13 repeticiones con la siguiente
secuencia consenso:
a- - -a-NL- -L-a- - - - -a- -a/S- - - -
(Jones y Jones, 1997, Advances in Botanical Research, 24,
89-167) y la región D no revela homología con
ninguna proteína conocida.
Para la identificación y el aislamiento de
secuencias homólogas que caen dentro del alcance de la presente
invención, se sometieron a selección bibliotecas genómicas y de ADNc
con la secuencia codificadora del gen de resistencia Mi como
sonda bajo condiciones de hibridación rigurosas. Los clones
positivos fueron aislados y utilizados para el análisis de
complementación.
Se realizaron hibridaciones de transferencia
Southern en el contig de YAC con un fragmento de PstI interno
de la secuencia codificadora del gen de resistencia Mi. Se
pudieron identificar tres regiones homólogas adicionales: dos en YAC
1/1172 y una en YAC 1/1084. Cada región comprende de 2 a 3 homólogos
de Mi indicativos del hecho de que la familia del gen
Mi está compuesta por 10 a 12 miembros aproximadamente.
Sorprendentemente, los ensayos de enfermedad por
áfidos revelaron que las plantas R_{0}, transformadas con el
cósmido Mi-11, son resistentes a Meloidogyne
incognita así como resistentes a Macrosiphum euphorbiae,
indicando que el inserto de genoma presente en el cósmido
Mi-11 está involucrado en el hecho de conferir a las
plantas R_{0} resistencia a nematodos, además de estar involucrado
en el hecho de conferir a las plantas R_{0} resistencia a áfidos.
En particular, una planta que es transformada con el gen de
resistencia de acuerdo con la invención tiene por lo menos una
susceptibilidad reducida a uno o más patógenos, especialmente a los
nematodos de los nudos de las raíces y/o áfidos.
Con el fin de confirmar la herencia de la
resistencia a áfidos, (i) las líneas de tomate R_{1} previamente
obtenidas que fueron derivadas de los transformantes con el cósmido
Mi-11 resistentes a nematodos, (ii) las líneas
R_{2} derivadas de plantas R_{1} resistentes a nematodos
autofecundadas, y (iii) las líneas R_{1}BC obtenidas de plantas
R_{1} resistentes a nematodos retrocruzadas con la línea de tomate
susceptible 52201, fueron también analizadas para determinar su
resistencia frente a M. euphorbiae. Los resultados obtenidos
indicaban la herencia de la resistencia a áfidos.
Se utilizó el cósmido Mi-11 para
la transformación de genotipos susceptibles a nematodos de tabaco y
patata, de acuerdo con los métodos generales de transformación
conocidos. Raíces de plantas R_{0} transformadas cultivadas in
vitro de tabaco y patata fueron analizadas para detectar
síntomas de enfermedad según se describió previamente en la
presente. Las observaciones del ensayo de enfermedad en los cultivos
de raíces de las plantas transformadas, indicaron que el cósmido
está implicado en el hecho de conferir a las plantas transformadas
una susceptibilidad reducida a nematodos. El gen de resistencia de
acuerdo con la invención tiene un efecto reductor de la
susceptibilidad de una especie de planta heteróloga a nematodos,
preferiblemente a las especies de Meloidogyne, especialmente
Meloidogyne incognita.
Además, también se analizaron transformantes de
tabaco para determinar su resistencia a áfidos, y pudieron
identificarse plantas R_{0} resistentes.
El gen de resistencia de acuerdo con la invención
tiene una doble función y tiene efecto en los sistemas
heterólogos.
El cósmido Mi-11 fue depositado
el 5 de Agosto de 1996 como plásmido pKGMi-11 en el
Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn, Países Bajos, bajo el
número de depósito CBS 822.96.
El cósmido Mi-18 fue depositado
el 5 de Agosto de 1996 como plásmido pKGMi-18 en el
Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn, Países Bajos, bajo el
número de depósito CBS 821.96.
Los siguientes ejemplos proporcionarán una
ilustración adicional de la presente invención, la cual sin embargo
no está limitada a estos ejemplos.
Un cultivo axénico del nematodo de los nudos de
la raíz Meloidogyne incognita se mantuvo sobre raíces
estériles de la variedad de tomate Moneymaker. Los cultivos de las
raíces se desarrollaron en un medio B5 solidificado (Gamborg y col.,
1968, Experimental Cell Research, 50, 151-158) con
un 2% de sacarosa y sin hormonas.
Explantes de las raíces (1-5 cm),
derivados de plantas de tomate transgénicas desarrolladas in
vitro, se transfirieron al medio B5 solidificado mencionado
anteriormente para iniciar los cultivos de las raíces. Al mismo
tiempo, cada explante de raíz fue inoculado con 10 agallas del
cultivo axénico de nematodos. Las agallas se colocaron a pocos
centímetros del explante de raíz. Las placas Petri con las raíces y
las agallas se incubaron en la oscuridad a 25ºC. Después de 4 a 6
semanas, se determinó el nivel de infección contando el número de
agallas formadas en los cultivos de raíces.
La evaluación para determinar la resistencia/
susceptibilidad a M. incognita es como sigue:
Una planta transgénica fue considerada resistente
cuando ninguna agalla o menos de dos agallas fueron visibles en el
cultivo de sus raíces. Una planta transgénica fue considerada
susceptible cuando por lo menos dos agallas fueron inducidas en el
cultivo sus raíces.
Un total de 9 líneas de tomate resistentes a
Meloidogyne incognita y 13 líneas de tomate susceptibles a
M. incognita fueron utilizadas para identificar marcadores
AFLP. Inicialmente, se realizó la selección de AFLP en dos grupos de
líneas casi isogénicas 83M-R (resistente) y
83M-S (susceptible), y Motelle (resistente) y Mobox
(susceptible). Los marcadores candidatos que resultaron de esta
primera selección fueron confirmados mediante una segunda selección
en 7 líneas resistentes a M. incognita y en 11 líneas
susceptibles a M. incognita.
Dos grupos de líneas casi isogénicas:
| 1. | 83M-R | resistente | \begin{minipage}[t]{85mm}De Ruiter Zonen C.V. Bergschenhoek, Países Bajos (de aquí en adelante "De Ruiter") \end{minipage} |
| 2. | 83M-S | susceptible | De Ruiter |
| 3. | Motelle | resistente | INRA, Montfavet, Francia |
| 4. | Mobox | susceptible | INRA, Montfavet, Francia |
Las 7 líneas resistentes a M. incognita y
las 11 líneas susceptibles a M. incognita para
confirmación:
| 5. | DR30 | resistente | De Ruiter |
| 6. | DR17 | resistente | De Ruiter |
| 7. | E22 | resistente | \begin{minipage}[t]{85mm} Enza Zaden, de Enkhuizen Zaadhandel B.V. Enkhuizen, Países Bajos (de aquí en adelante "Enza Zaden") \end{minipage} |
| 8. | E1 | resistente | Enza Zaden |
| 9. | DR6 | resistente | De Ruiter |
| 10. | DR10 | resistente | De Ruiter |
| 11. | 1872 | resistente | \begin{minipage}[t]{85mm} Royal Sluis B.V., Enkhuizen, Países Bajos (de aquí en adelante "Royal Sluis") \end{minipage} |
| 12. | Moneymaker | susceptible | Agricultural University Wageningen |
| 13. | DR12 | susceptible | De Ruiter |
| 14. | DR23 | susceptible | De Ruiter |
| 15. | GT | susceptible | De Ruiter |
| 16. | RZ3 | susceptible | \begin{minipage}[t]{85mm} Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V., De Lier, Países Bajos (de aquí en adelante "Rijk Zwaan") \end{minipage} |
| 17. | RZ5 | susceptible | Rijk Zwaan |
| 18. | E3 | susceptible | Enza Zaden |
| 19. | E7 | susceptible | Enza Zaden |
| 20. | E16 | susceptible | Enza Zaden |
| 21. | RS1 | susceptible | Royal Sluis |
| 22. | RS2 | susceptible | Royal Sluis |
El ADN total de tomate de las 22 líneas descritas
anteriormente fue aislado de hojas jóvenes según está descrito por
Bernatzki y Tanksley (Theor. Appl. Genet., 72,
314-321). El rendimiento típico fue de
50-100 \mug de ADN por gramo de material de hoja
fresco. El ADN molde para el análisis de AFLP con la combinación de
enzimas PstI-MseI fue preparado según está descrito
por Zabeau y Vos (Solicitud de Patente Europea, EP 0534858), y se
describe a continuación brevemente:
Se incubaron 0,5 \mug de ADN de tomate durante
1 hora a 37ºC con 5 unidades de PstI y 5 unidades de
MseI en 40 \mul de Tris.HAc 10 mM pH 7,5, MgAc 10 mM, KAc
50 mM, DTT 5 mM, 50 ng/\mul de BSA. A continuación, se añadieron
10 \mul de una solución que contenía 5 pmoles de adaptadores de
PstI, 50 pmoles de adaptadores de MseI, 1 unidad de
ADN-ligasa de T4, ATP 1 mM en Tris.HAc 10 mM pH
7,5, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, 50 ng/\mul de BSA, y se
continuó la incubación durante 3 horas a 37ºC. Los adaptadores se
representan a continuación:
La estructura del adaptador de PstI
era:
5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3'
3'-CATCTGACGCATGT-5'
La estructura del adaptador de MseI
era:
5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'
3'-TACTCAGGACTCAT-5'
Los adaptadores fueron preparados agregando
cantidades equimolares de ambas hebras; los adaptadores no estaban
fosforilados. Después de la ligadura, la mezcla de reacción se
diluyó a 500 \mul con Tris.HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM pH 8,0, y se
almacenó a -20ºC. La mezcla de reacción diluida es denominada
posteriormente ADN molde.
Los cebadores utilizados para la selección de
AFLP se presentan a continuación:
| Cebadores de PstI: | 5'-GACTGCGTACATGCAGNN-3' |
| Cebadores de MseI: | 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3' |
Las Ns en los cebadores indican que esta parte de
los cebadores era variable. En la selección de AFLP se utilizaron
los 16 cebadores posibles para el cebador de PstI y los 64
cebadores posibles para el cebador de MseI. Esto daba un
total de 16 x 64 combinaciones de cebadores de PstI y
MseI, es decir 1024 combinaciones de cebadores. Las 1024
combinaciones de cebadores fueron todas utilizadas en la selección
de AFLP por marcadores AFLP ligados a Mi. Las reacciones de
AFLP se realizaron de la siguiente manera:
Las reacciones de AFLP emplearon un cebador de
PstI marcado radiactivamente y un cebador de MseI no
marcado. Los cebadores de PstI fueron marcados en su extremo
utilizando (\gamma-^{33}P)ATP y
polinucleótido quinasa de T4. Las reacciones de marcaje se
realizaron en 50 \mul de Tris.HCl 25 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM,
DTT 5 mM, espermidina.3HCl 0,5 mM, utilizando 500 ng del cebador
oligonucleotídico, 100 \muCi de
(\gamma-^{33}P)ATP y 10 unidades de
polinucleótido quinasa de T4. Para el análisis de AFLP, se preparó
una mezcla de reacción de 20 \mul conteniendo 5 ng del cebador de
PstI marcado (0,5 \mul de la mezcla de reacción de
marcaje), 30 ng del cebador de MseI, 5 \mul del ADN molde,
0,4 unidades de polimerasa Taq, Tris.HCl 10 mM pH 8,3, MgCl_{2}
1,5 mM, KCl 50 mM, 0,2 mM de los 4 dNTPs. Las reacciones de AFLP
fueron realizadas utilizando el siguiente perfil de ciclo: una etapa
de desnaturalización del ADN de 30 segundos a 94ºC, una etapa de
hibridación de 30 segundos (ver más adelante), y una etapa de
extensión de un minuto a 72ºC. La temperatura de hibridación en el
primer ciclo fue de 65ºC, fue posteriormente reducida en cada ciclo
en 0,7ºC durante los siguientes 12 ciclos, y se continuó a 56ºC
durante los 23 ciclos restantes. Todas las reacciones de
amplificación fueron realizadas en un termociclador
PE-9600 (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT,
EE.UU.).
Después de la amplificación, se mezclaron los
productos de reacción con un volumen igual (20 \mul) de colorante
de formamida (formamida 98%, EDTA 10 mM pH 8,0, y azul de bromofenol
y xilencianol como colorante de rastreo). Las mezclas resultantes se
calentaron durante 3 minutos a 90ºC, y después se enfriaron
rápidamente en hielo. Se cargaron 2 \mul de cada muestra en un gel
de poliacrilamida desnaturalizante (secuenciación) al 5% (Maxam y
Gilbert, Methods in Enzymology, 65, 499-560). La
matriz del gel se preparó utilizando acrilamida 5%, metilén
bisacrilo 0,25%, urea 7,5 M en Tris 50 mM/ácido bórico 50 mM/EDTA 1
mM. A 100 ml de la solución de gel se añadieron 500 \mul de APS al
10% y 100 \mul de TEMED y los geles fueron moldeados utilizando un
aparato para geles de SequiGen de 38 x 50 cm (Biorad Laboratories
Inc., Hercules, CA, EE.UU.). Se utilizaron peines de dientes de
tiburón para dar 97 calles en las unidades de gel de SequiGen. Se
utilizó Tris 100 mM/ácido bórico 100 mM/EDTA 2 mM como tampón para
el proceso. Se realizó la electroforesis a una potencia constante,
110 watios, durante aproximadamente 2 horas. Después de la
electroforesis, los geles se fijaron durante 30 minutos en ácido
acético al 10%, se secaron sobre placas de vidrio y se expusieron a
pantallas Phosphorimage de Fuji durante 16 horas. Se visualizaron
los patrones de huellas utilizando un sistema de análisis
Phosphorimage BAS-2000 de Fuji (Fuji Photo Film
Company Ltd., Japón).
Se realizó una selección de AFLP utilizando todas
las 1024 combinaciones posibles de los cebadores de
PstI-MseI en los dos grupos de líneas casi isogénicas.
El objetivo era identificar marcadores AFLP presentes en ambas
líneas resistentes y ausentes en ambas líneas susceptibles. Los
geles de AFLP contenían las huellas de AFLP de 24 combinaciones de
cebadores de las 4 líneas isogénicas, dando un total de 43 geles. Se
identificó un total de 30 marcadores AFLP que estaban presentes en
ambas líneas resistentes y ausentes en ambas líneas susceptibles.
Estos marcadores son denominados marcadores AFLP ligados a Mi
candidatos.
A continuación, se realizaron reacciones de AFLP
para determinar la presencia de los 30 marcadores candidatos en las
7 líneas de tomate resistentes y en las 11 líneas de tomate
susceptibles. De los 30 marcadores candidatos, 20 marcadores
parecían estar presentes en las 7 líneas resistentes y ausentes en
las 11 líneas susceptibles. Estos 20 marcadores fueron utilizados en
estudios adicionales para crear mapas del gen de resistencia
Mi. Las combinaciones de cebadores requeridas para
identificar los 20 marcadores PstI-MseI están
representadas en el Tabla 1. En la columna con las combinaciones de
cebadores, "PstI" se refiere a la secuencia
5'-GACTGCGTACATGCAG-3' y
"MseI" se refiere a la secuencia 5'-
GATGAGTCCTGAGTAA-3'. Por ejemplo, el marcador PM14
puede ser identificado utilizando el cebador de PstI que
tiene la siguiente secuencia:
5'-GACTGCGTACATGCAGGA-3', y el
cebador de MseI que tiene la siguiente secuencia:
5'-GATGAGTCCTGAGTAATCT-3'.
Se utilizó la línea de tomate Lycopersicon
esculentum E22 (Enza Zaden) homocigota para el locus
Mi como fuente de ADN para construir una biblioteca de YAC.
Se aislaron los protoplastos de las hojas de brotes in vitro
que tenían de 2 a 3 semanas de edad según está descrito por Van
Daelen y col. (Plant Mol. Biol., 12, 341-352).
Se recogieron los protoplastos viables
(concentración de 50 millones de protoplastos por ml) y se mezclaron
con un volumen igual de agarosa (1%, Seaplaque, FMC Bioproducts,
Rockland, Maine, EE.UU.) para formar un bloque. Los protoplastos
incluidos en los bloques fueron lisados con una mezcla de lisis
(EDTA 0,5 M, 1% de sarcosinato de N-laurilo y 1
mg/ml de proteinasa K, pH=8,0). Después de la lisis, los bloques
fueron almacenados a 4ºC en tampón de almacenamiento (mezcla de
lisis fresca) hasta se utilización. Aproximadamente 3 millones de
protoplastos por bloque, para obtener aproximadamente 4,5 \mug de
ADN cromosómico, fueron utilizados para estudios posteriores. El
plásmido pYAC4 que contenía un sitio de clonaje único de
EcoRI fue utilizado como vector de clonaje y la cepa de
levadura AB1380 fue utilizada como huésped (Burke y col., Science,
236, 806-812).
El aislamiento de ADN de peso molecular alto, la
digestión parcial con EcoRI en presencia de metilasa de
EcoRI, la ligadura de brazos del vector a ADN genómico, la
selección por tamaños a través de electroforesis en gel de campo
pulsado y la transformación del huésped levadura, se llevaron a cabo
según está descrito por Burke y col. (Science, 236,
806-812) y Larin y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88, 4123-4127).
Todas las manipulaciones estándar se realizaron
según está descrito en Molecular cloning: a laboratory manual por
Sambrook y col. (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Finalmente, se obtuvieron 3840 clones con un
tamaño de inserto promedio de 520 kb, el cual corresponde a 2,2
equivalentes de genoma y los clones individuales fueron almacenados
en 40 placas de microvaloración de 96 pocillos que contenían 75
\mul de una solución de YPD (1% de extracto de levadura, 2% de
peptona y 2% de dextrosa).
Para reducir el número de muestras manejadas, las
células de una placa de microvaloración de 96 pocillos fueron
combinadas (una combinación de placa) y utilizadas para el
aislamiento de ADN como se describió por Ross y col. (Nucleic Acids
Res., 19, 6053). La biblioteca de YAC de tomate de 2,2 equivalentes
de genoma constaba de 40 placas de microvaloración de 96 pocillos y
como resultado el ADN de las 40 combinaciones de placa fue sometido
a selección con los marcadores AFLP, PM10, PM13, PM21 y PM25
utilizando el protocolo de AFLP como se describió en el Ejemplo 2.
Se seleccionaron PM10, PM13, PM21 y PM25 para someter a selección
las combinaciones de placa de YAC porque estos marcadores no
interfieren con las bandas de fondo de la cepa de levadura AB1380.
Se identificaron tres combinaciones de placa positivas de las 40
sometidas a selección con estos cuatro marcadores AFLP como se
muestra en la Tabla 2. Posteriormente, se empleó una selección
secundaria con los cuatro marcadores AFLP (PM10, PM13, PM21 y PM25)
de los 96 clones de YAC individuales de cada placa para encontrar la
dirección correcta de los clones de YAC. Se identificaron tres
clones de YAC individuales, designados 1/1084, 1/1172 y 2/1256
(Tabla 2). Posteriormente, los tres clones de YAC individuales
fueron analizados con los marcadores AFLP restantes. Todos los
marcadores identificados, PM02 a PM29, estaban presentes en uno o
más de estos tres clones de YAC (Tabla 3). El tamaño del clon de YAC
fue determinado mediante análisis electroforético en gel de campo
pulsado (PFGE) utilizando un campo eléctrico homogéneo fijado al
contorno (CHEF; Chu y col., Science, 235, 1582-1585)
y pareció ser de 470 kb (1/1084), 570 kb (1/1172) y 500 kb (2/1256),
respectivamente.
Los tres clones de YAC 1/1172, 2/1256 y 1/1084
fueron sometidos a digestión parcial con una concentración creciente
de los enzimas de restricción SfiI y BssHII. Las
muestras fueron fraccionadas por PFGE, transferidas a una membrana
Gene Screen Plus (DuPont NEN, Boston MA, EE.UU.) y analizadas por
hibridación utilizando sondas de secuencia adyacente a los extremos
de acuerdo con el protocolo para el mapeo indirecto mediante marcas
en los extremos según está descrito por Burke y col. (Science, 236,
806-812). Pudo construirse un mapa físico de YAC
1/1172, 2/1256 y 1/1084 para los enzimas SfiI y BssHII
según se muestra en la Figura 1. El solapamiento entre los varios
clones de YAC fue determinado mediante análisis de transferencia
Southern utilizando los fragmentos de restricción obtenidos como
sonda sobre el digesto de los tres clones de YAC. Un contig de YAC
con un tamaño de 1,4 Mb pudo ser construido. Con el fin de aislar
los fragmentos de YAC, los digestos fueron procesados en PFGE. La
digestión de YAC 1/1172 con SfiI dio como resultado dos
fragmentos (200 kb y 370 kb). La digestión de YAC 2/1256 con
BssHII dio como resultado cuatro fragmentos (40 kb, 90 kb,
110 kb y 260 kb), mientras que la digestión de YAC 1/1084 con
BssHII dio dos fragmentos con un tamaño de 70 y 400 kb. Como
resultado, el contig de YAC de 1,4 Mb pudo ser separado en 8
regiones correspondientes a los 8 fragmentos de restricción
obtenidos a partir de los tres clones de YAC, cubriendo la región de
Mi completa y secuencias adyacentes.
Para colocar los diferentes marcadores AFLP
dentro de estas 8 regiones sobre el mapa físico, los marcadores AFLP
fueron utilizados como sondas de hibridación en los digestos
parciales y completos de SfiI y BssHII de los clones
de YAC 1/1172, 2/1256 y 1/1084. Por lo tanto, cada fragmento
marcador AFLP fue cortado del gel secado y eluido mediante difusión
en un tampón conteniendo acetato de amonio 0,5 M, acetato de
magnesio 10 mM, EDTA 1 mM (pH=8,0), SDS 0,1%, reamplificado con los
cebadores AFLP no marcados correspondientes y, marcado
posteriormente con ^{32}P de acuerdo con el método de cebadores
aleatorios de Feinberg y Vogelstein (Anal. Biochem., 132,
6-10). Cada marcador AFLP pudo ser asignado a una o
más de las ocho regiones según está esquematizado en la Tabla 4 y la
Figura 1.
El vector cosmídico binario pJJ04541 es un
derivado de pJJ1881 (Jones y col., Transgenic Research, 1,
285-297) y está basado en el plásmido pRK290 que
contiene el gen de resistencia de tetraciclina para la selección en
Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens. En el
único sitio de EcoRI de pRK290, ADN-T que
lleva secuencias (LB; repetición del límite izquierdo, RB significa
la repetición del límite derecho) que flanquean:
- el sitio de cos del bacteriófago lambda,
- el gen de la fosfotransferasa de neomicina
(Beck y col., Gene, 19, 327-336) cuya expresión está
dirigida por la secuencia del promotor 35S del virus del mosaico de
la coliflor (Odell y col., Mol. Gen Genet., 223,
369-378), y
- la secuencia del poliadaptador de pBluescript
(Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.). El tamaño de pJJ04541
asciende a 29 kb y se muestra esquemáticamente en la Figura 2. La
capacidad de clonaje de este vector cosmídico binario, utilizando
extractos de empaquetamiento del fago lambda, está dentro del rango
de 9 a 24 kb.
El ADN total de la cepa de Saccharomyces
cerevisae AB1380 que contenía YAC 1/1172 y el ADN total de la
cepa de Saccharomyces cerevisae AB1380 que contenía YAC
2/1256 fue aislado utilizando zimoliasa para producir protoplastos
de acuerdo con Green y Olsen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,
1213-1217).
Se analizó una alícuota de ambos ADNs en PFGE.
Ambos aislados de ADN parecían tener un tamaño de \geq100 kb.
Aproximadamente 15 \mug de cada ADN fueron
digeridos parcialmente con Sau3A generando moléculas con un
tamaño promedio de 15-25 kb. Posteriormente, las
muestras fueron centrifugadas a través de un gradiente de sacarosa
al 10-35% durante 22 horas, 22.000 rpm a 20ºC en un
rotor de Beckman SW41. Se recogieron fracciones de 0,5 ml utilizando
una aguja perforada a través del fondo del tubo de centrífuga. Una
alícuota de estas fracciones fue analizada en un gel de agarosa al
0,7%. Las fracciones que contenían moléculas de ADN con un tamaño de
\approx20 kb fueron combinadas y concentradas mediante
precipitación con etanol.
Posteriormente, los extremos cohesivos fueron
parcialmente rellenados con dATP y dGTP utilizando la estrategia de
relleno parcial de extensiones 5' de ADN producidas por
endonucleasas de restricción de tipo II según está descrito por
Korch (Nucleic Acids Res., 15, 3199-3220) y Loftus y
col. (Biotechniques, 12, 172-176).
El vector cosmídico binario pJJ04541 fue digerido
completamente con XhoI y el fragmento lineal fue parcialmente
rellenado con dTTP y dCTP según está descrito por Korch (Nucleic
Acids Res., 15, 3199-3220).
Los fragmentos de 20 kb fueron ligados al vector
cosmídico y transducidos a la cepa de E. coli
XL1-Blue MR (Stratagene, La Jolla, California,
EE.UU.) utilizando extractos de empaquetamiento del fago lambda
Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.) según está
recomendado por los fabricantes. La selección se realizó sobre
placas de agar LB (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de
bactolevadura y 1% de NaCl, pH 7,5) conteniendo 10 mg/l de
tetraciclina. Dos bancos de aproximadamente 250.000 clones de
cósmidos por banco fueron producidos a partir de 2-3
\mug de ADN de levadura fraccionado por tamaños de los clones de
YAC 1/1172 y 2/1256, respectivamente.
Posteriormente, estos transformantes fueron
almacenados en los pocillos de placas de microvaloración (96
pocillos, 100 \mul del medio LB conteniendo 10 mg/l de
tetraciclina). Réplicas de la cuadrícula de 96 pocillos de los
clones cosmídicos en las placas de microvaloración fueron estampadas
sobre filtros de membrana Gene Screen Plus (NEN DuPont) y se dejaron
crecer hasta formar colonias sobre el medio. La hibridación de
colonias, según está descrito por Sambrook y col. (en: Molecular
cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press) utilizando los clones de YAC 1/1172 y 2/1256 marcados con
^{32}P reveló cósmidos positivos. De 10.000 colonias
aproximadamente de YAC 1/1172 se identificaron 200 clones de
cósmidos positivos aproximadamente. De 20.000 colonias
aproximadamente de YAC 2/1256 se identificaron 300 clones de
cósmidos positivos.
Con el fin de dividir los cósmidos en siete
regiones definidas, los 200 clones de cósmidos positivos de YAC
1/1172 y los 300 clones de cósmidos positivos de YAC 2/1256 fueron
hibridados con 7 de los 8 fragmentos de restricción (fragmentos de
YAC) como se esquematizó en el Ejemplo 4 (ver la Tabla 4 y la Figura
1). Los cósmidos positivos para cada uno de los 7 fragmentos de YAC
fueron identificados. Además, se pudieron identificar cósmidos que
reaccionaban positivamente con los fragmentos de restricción
solapantes de los dos clones de YAC diferentes.
Con el fin de construir un contig cosmídico de
todos los cósmidos identificados positivos en las varias regiones
definidas, se utilizó la amplificación de fragmentos de restricción.
Aproximadamente 500 ng de cada cósmido fueron utilizados para la
preparación del molde y los cebadores de la amplificación de los
fragmentos de restricción fueron un cebador de EcoRI
5'-GACTGCGTACCAATTC-3' que no tenía
ningún nucleótido selectivo y un cebador de MseI
5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' que no tenía
ningún nucleótido selectivo de acuerdo con el método descrito en el
Ejemplo 2. El cebador de EcoRI fue marcado en el extremo 5' y
los 500 cósmidos fueron todos amplificados utilizando el grupo de
cebadores de EcoRI/MseI. Las huellas de ADN contenían
de 8 a 20 fragmentos amplificados aproximadamente. Grupos de
cósmidos conteniendo fragmentos amplificados de tamaño idéntico
fueron seleccionados de cada región y se volvieron a procesar en
geles de poliacrilamida como se describió en el Ejemplo 2 hasta que
se pudo construir una serie contigua de todos los fragmentos
amplificados de todas las regiones definidas. Además, el contig
cosmídico de una región fue alineado con las regiones adyacentes con
el fin de construir un contig cosmídico del locus Mi.
De esta manera, se construyó un contig cosmídico de 96 cósmidos, que
abarcaba el locus Mi, de aproximadamente 800 kb.
Con el fin de ubicar los 20 marcadores AFLP
ligados a Mi en el contig cosmídico, los 96 cósmidos fueron
digeridos con PstI seguido por análisis de transferencia
Southern de acuerdo con Southern, J. Mol. Biol., 98,
503-515.
Los marcadores AFLP fueron utilizados como sondas
de hibridación según se describió en el Ejemplo 4 en la
transferencia Southern de los 96 digestos de PstI de los
cósmidos. La posición exacta de los marcadores AFLP ligados a
Mi, excepto el marcador PM02, está esquematizada en la Figura
3A.
Una familia de líneas de tomate mutantes se hizo
disponible a través de Enza Zaden. Estas líneas fueron derivadas de
un F_{1} híbrido heterocigoto para el gen de resistencia Mi
y heterocigoto para el gen Aps-1 (que codifica fosfatasa
ácida-1), que está ligado muy estrechamente a
Mi (Stevens y Rick, 1986, en: The Tomato Crop., Atherton
& Rudich edit., Chapman y Hall, p. 35-109). Se
pudieron determinar diferentes alelos del gen Aps-1 a través
de análisis de isozimas (Vallejos, 1983, en: Isozymes in plant
genetics and breeding, Tanksley y Orton edit., parte A, Elsevier,
Amsterdam, 469-515). El alelo Aps-1^{1}
procede de L. peruvianum y ha sido introducido en varios
genotipos de tomate resistentes a nematodos a través de
co-segregación con el gen de resistencia a
Mi. Un esquema de estas líneas mutantes está representado a
continuación:
| F_{1}-híbrido | \hskip0.7cm (Aps-1 heterocigoto, fenotipo resistente a Mi) |
| \shortdownarrow | autofecundado |
| Líneas F_{2} | \hskip0.7cm (segregación de Aps-1 1:2:1, segregación de resistencia a Mi 3:1) |
| \shortdownarrow | autofecundación de plantas F_{2} heterocigotas (Aps-1) |
| Líneas F_{3} | \hskip0.7cm (segregación de Aps-1 1:2:1, segregación de resistencia a Mi 3:1) |
| \shortdownarrow | autofecundación de plantas F_{3} heterocigotas (Aps-1) |
| Líneas F_{4} | \hskip0.7cm (segregación de Aps-1 1:2:1, segregación de resistencia a Mi 3:1) |
| \shortdownarrow | autofecundación de plantas F_{4} heterocigotas (Aps-1) |
| Líneas F_{5} | \hskip0.7cm (segregación de Aps-1 1:2:1, susceptible a Mi) |
| \shortdownarrow | autofecundación de plantas F_{5} heterocigotas (Aps-1) |
| Líneas F_{6} | \hskip0.7cm (segregación de Aps-1 1:2:1, susceptible a Mi) |
| \shortdownarrow | autofecundación de plantas F_{6} homocigotas (Aps-1^{1}) |
| Líneas F_{7} | \hskip0.7cm (todas Aps-1^{1}, susceptible a Mi) |
| \shortdownarrow | autofecundación de plantas F_{7} homocigotas (Aps-1^{1}) |
| Líneas F_{8} | \hskip0.7cm (todas Aps-1^{1}, susceptible a Mi) |
En las líneas F_{1}, F_{2}, F_{3} y F_{4}
de esta familia la presencia del alelo Aps-1^{1} se
correlaciona con el fenotipo resistente a Mi, mientras que la
ausencia del alelo Aps-1^{1} se correlaciona con el
fenotipo susceptible a Mi. En la F_{5} y las progenies
posteriores, esta correlación se pierde: todas las plantas son
susceptibles a nematodos independientemente de los alelos
Aps-1^{1}.
Veinte individuos de cada generación F_{2},
F_{3}, F_{4}, F_{5}, F_{6}, F_{7} y F_{8} fueron
analizados para determinar resistencia a nematodos, para determinar
la presencia del alelo Aps-1 y la presencia de los marcadores
AFLP ligados a Mi. El análisis de nematodos de las plántulas
se realizó en tierra contaminada con agallas de raíces de M.
incognita. Los resultados de resistencia a nematodos fueron como
se indica en el esquema anterior: segregación 3:1 en plantas
F_{2}, F_{3} y F_{4} y susceptibilidad en F_{5} y en las
poblaciones de la progenie. La mayoría de los marcadores AFLP
ligados a Mi indicaban un genotipo Mi idéntico igual
que el marcador de isozimas de Aps-1. Sin embargo, 3 de los
marcadores AFLP PM14, PM16 y PM25 parecían segregarse con el
fenotipo Mi: en la mayoría de las plantas F_{5}, F_{6},
F_{7} y F_{8}, la susceptibilidad a Mi estaba indicada
por la ausencia de estos marcadores. Los marcadores AFLP PM14, PM16
y PM25 mostraron una correlación entre el genotipo Mi de AFLP
y el fenotipo Mi en los mutantes. Los marcadores PM14 y PM25
están adyacentes en el mapa físico como se muestra en la Figura 3B,
y, por lo tanto, se postuló que la región que rodea a estos
marcadores AFLP era un buen candidato para contener el gen de
resistencia a Mi.
La identificación de los cósmidos que hibridaban
con los marcadores AFLP ligados a Mi PM14 y PM25 se realizó
en el Ejemplo 6. PM14 identifica a los cósmidos
Mi-11, Mi-18 y
Mi-01, mientras que PM25 identifica a los cósmidos
Mi-18 y Mi-01.
Posteriormente, una pequeña serie de cósmidos
alrededor de los cósmidos Mi-11,
Mi-18 y Mi-01 fue seleccionada del
contig cosmídico descrito en el Ejemplo 6. Se seleccionó un contig
de 6 cósmidos que contenía los 3 cósmidos identificados y los
cósmidos adyacentes. Estos 6 cósmidos son Mi-32,
Mi-30, Mi-11, Mi-18,
Mi-01 y Mi-14. Con el fin de
realizar un mapa físico preciso de estos 6 cósmidos, las muestras de
ADN del contig cosmídico fueron digeridas con PstI seguido
por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. El solapamiento
físico entre los diferentes cósmidos pudo ser determinado. Mediante
la combinación de estos datos con los datos obtenidos con respecto a
la ubicación detallada de los marcadores AFLP ligados a Mi en
el contig cosmídico (ver el Ejemplo 6) pudo construirse un mapa
físico preciso con la ubicación de PM14 y PM25 según se muestra en
la Figura 4. Se calculó que el contig cosmídico de alrededor de los
marcadores AFLP PM14 y PM25 tenía 50 kb aproximadamente.
Los clones cosmídicos Mi-32,
Mi-30, Mi-11, Mi-18,
Mi-01, Mi-14 y el cósmido control
pJJ04541 fueron introducidos en Agrobacterium tumefaciens
mediante transferencia por conjugación en un apareamiento
triparental con la cepa cooperadora HB101 (pRK2013) esencialmente de
acuerdo con Deblaere y col. (Methods in Enzymology, 153,
277-292). Se cultivó E. coli en el medio LB
(1% de bacto-triptona, 0,5% de extracto de
bacto-levadura y 1% de NaCl, pH 7,5) suplementando
con 5 mg/l de tetraciclina a 37ºC. La cepa cooperadora HB101
(pRK2013) fue cultivada bajo condiciones idénticas en el medio LB
suplementado con 100 mg/l de sulfato de kanamicina.
La cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1
(Lazo y col., Bio/Technology, 9, 963-971, 1991) fue
cultivada en medio LB suplementado con 100 mg/l de carbenicilina a
28ºC. Los cultivos de una noche fueron diluidos 1:100 en medio LB
sin ningún antibiótico y después de 6 horas de crecimiento, se
mezclaron 0,1 ml de cada cultivo de Agrobacterium, del
cultivo de la cepa cooperadora y del cultivo de una cepa de cósmido
y se sembraron en placas de agar LB sin antibióticos. Después de
incubación durante una noche a 28ºC, la mezcla fue sembrada en
placas de agar con medio LB conteniendo 100 mg/l de carbenicilina y
10 mg/l de tetraciclina para seleccionar por transconjugantes. Las
placas fueron incubadas durante 3-4 días a 28ºC. Se
realizaron dos pases seriados a través de placas de agar selectivas
para seleccionar colonias de Agrobacterium transconjugantes
individuales.
Se desarrollaron cultivos a pequeña escala a
partir de las colonias seleccionadas y se cultivaron en medio LB
conteniendo 10 mg/l de tetraciclina. El ADN plasmídico fue aislado
mediante lisis alcalina utilizando el método descrito por
Ish-Horowicz y col. (Nucleic Acids Res., 9,
2989-2997, 1981) y digerido con BglII
utilizando técnicas estándar. Además, se realizó la amplificación de
fragmentos de restricción en minipreparaciones de ADN de A.
tumefaciens utilizando la combinación de enzimas
EcoRI/MseI y cebadores que no tenían ningún nucleótido
selectivo según se describió en el Ejemplo 6. Posteriormente, se
comparó el patrón del enzima de restricción BglII así como la
huella de ADN del transconjugante de A. tumefaciens con el de
las minipreparaciones de ADN de la cepa de E. coli que
contenía el cósmido. Solamente aquellos transconjugantes de A.
tumefaciens que albergaban un cósmido con el mismo patrón de ADN
que el cultivo de E. coli correspondiente fueron utilizados
para transformar una línea de tomate susceptible.
Semillas de la línea de tomate susceptible 52201
(Rijk Zwaan, De Lier, Países Bajos) fueron esterilizadas
superficialmente en hipoclorito de sodio al 2% durante 10 minutos,
lavadas tres veces en agua destilada estéril y colocadas sobre un
medio de germinación (que consistía en un medio MS de potencia media
de acuerdo con Murashige y Skoog, Physiol. Plant., 15,
473-497, con un 1% (p/v) de sacarosa y un 0,8% de
agar) en jarras de vidrio o en recipientes de cultivo de
polipropileno. Se dejaron germinar durante 8 días. Las condiciones
de cultivo fueron 25ºC, una densidad de flujo de fotones de 30
\mumoles\cdotm^{-2}\cdots^{-1}, y un fotoperiodo de 16/24
horas.
La transformación del tomate se realizó de
acuerdo con Koornneef y col. (1986), en: Tomato Biotecnology,
169-178, Alan R. Liss, Inc., y se describe
brevemente a continuación. Se precultivaron explantes de cotiledones
de 8 días de edad durante 24 horas en placas Petri contiendo una
capa alimentadora de células en suspensión de Petunia hybrida
sembradas en medio MS20 (medio de cultivo de acuerdo con Murashige y
Skoog (1962), Physiol. Plant., 15, 473-497, con un
2% (p/v) de sacarosa y un 0,8% de agar) suplementado con ácido
\alpha-naftalenacético 10,7 \muM y
6-bencilaminopurina 4,4 \muM. Los explantes fueron
luego infectados con el cultivo de una noche diluido de
Agrobacterium tumefaciens conteniendo los clones cosmídicos
Mi-32, Mi-30, Mi-11,
Mi-18, Mi-01 y Mi-14
o el vector cosmídico pJJ04541 durante 5-10 minutos,
secados sobre un papel de filtro estéril y cocultivados durante 48
horas en las placas con capa alimentadora originales. Las
condiciones de cultivo fueron como las descritas anteriormente. Los
cultivos de una noche de Agrobacterium tumefaciens fueron
diluidos en medio MS20 líquido (medio de acuerdo con Murashige y
Skoog (1962) con un 2% (p/v) de sacarosa, pH 5,7) hasta una
D.O._{600} de 0,8.
Después del cocultivo, los explantes de
cotiledones fueron transferidos a placas Petri con medio selectivo
que consistía en MS20 suplementado con zeatina 4,56 \muM,
vancomicina 67,3 \muM, cefotaxima 418,9 \muM y sulfato de
kanamicina 171,6 \muM, y cultivados bajo las condiciones de
cultivo descritas anteriormente. Los explantes fueron subcultivados
cada tres semanas en medio fresco. Los brotes emergentes fueron
disecados de los callos subyacentes y transferidos a jarras de
vidrio con medio selectivo sin zeatina para que se formaran raíces.
La formación de raíces en un medio conteniendo sulfato de kanamicina
se consideró como una indicación de la naturaleza transgénica del
brote en cuestión. Los regenerantes transgénicos auténticos fueron
propagados in vitro subcultivando el meristemo apical y las
yemas auxiliares en jarras de vidrio con medio selectivo fresco sin
zeatina.
Raíces de plantas R_{0} transformadas
cultivadas in vitro han sido sometidas al ensayo de
enfermedad según se describió en el Ejemplo 1. De cada transformante
se han analizado dos explantes de raíz. En total, se han analizado
72 plantas R_{0} de 7 transformaciones cosmídicas diferentes; 6
cósmidos que llevaban un inserto de ADN de tomate y 1 cósmido,
pJJ04541, sin inserto de ADN de tomate. Los resultados se muestran
en la Tabla 5. Sesenta y tres plantas R_{0} transgénicas parecían
susceptibles, ya que se habían formado agallas en al menos uno de
los dos cultivos de raíces. Nueve plantas R_{0} se clasificaron
como resistentes, ya que no pudo encontrarse ninguna agalla en los
cultivos de raíces. Siete plantas resistentes habían sido derivadas
de la transformación con el cósmido Mi-11, mientras
que dos plantas resistentes habían sido derivadas con el cósmido
Mi-18, que solapa una gran parte con el cósmido
Mi-11. Los cósmidos Mi-11 y
Mi-18 fueron utilizados para un análisis molecular
posterior.
Para demostrar que el fenotipo resistente de las
plantas R_{0} transgénicas, las cuales habían sido transformadas
con los cósmidos solapantes Mi-11 y
Mi-18, estaba determinado por el inserto genómico
presente en los diferentes cósmidos, se realizó un análisis AFLP con
el marcador AFLP PM14. La amplificación selectiva de fragmentos de
restricción se realizó con la combinación de cebadores que
identificaban al marcador PM14 para las plantas R_{0}
transformadas con los cósmidos Mi-11 y
Mi-18. Las huellas de ADN obtenidas mostraron la
presencia del marcador PM14 en las plantas resistentes, indicando
que el inserto genómico presente en los cósmidos
Mi-11 y Mi-18 también está presente
en las plantas R_{0} y que los dos cósmidos solapantes
identificados Mi-11 y Mi-18
contienen el gen de resistencia Mi.
Los insertos de los cósmidos
Mi-11 y Mi-18 y los insertos de los
cósmidos adyacentes Mi-32 y Mi-30
por un lado y de los cósmidos Mi-01 y
Mi-14 por el otro lado, fueron caracterizados
posteriormente. Se calculó que la región de ADN que contenía el gen
de resistencia Mi, sobre la base del solapamiento entre los
cósmidos Mi-11 y Mi-18, tenía
16-18 kb aproximadamente. Sobre la base de la
susceptibilidad de las plantas R_{0} que tenían el inserto
presente en el cósmido Mi-30, esta región pudo ser
reducida hasta 12 kb aproximadamente. Se secuenció un segmento de
ADN que contenía el gen de resistencia Mi, correspondiente a
la región flanqueada por los extremos derechos de los cósmidos
Mi-30 y Mi-11 (ver la Figura 4).
Para determinar la secuencia del segmento de ADN
solapante en los cósmidos Mi-11 y
Mi-18 que contenía el gen de resistencia Mi,
se generó un grupo de subclones aleatorios con un tamaño de inserto
de aproximadamente 2 kb. Se cortaron 7,5 \mug de ADN purificado en
CsCl de los cósmidos Mi-11 y Mi-18
durante 10 segundos a 4ºC con una potencia de la sonda del 15% (en
40 \mul de Tris-acetato 10 mM,
Mg-acetato 10 mM y K-acetato 50 mM)
utilizando un sonicador Misonix (Misonix Inc., Farmingdale, NY,
EE.UU.) (tipo XL-2020) con el soporte de la cubeta
lleno de agua (tipo 431A). Posteriormente, el ADN fue calentado
durante 10 minutos a 60ºC y enfriado a temperatura ambiente. Los
extremos de los fragmentos de ADN fueron reparados agregando 10
\mul de una mezcla de reparación (Tris-acetato 10
mM, Mg-acetato 10 mM, K-acetato 50
mM, 10 U de ADN polimerasa Klenow, 10 U de ADN polimerasa T_{4} y
2 mM de los 4 dNTP's) seguido por incubación durante 30 minutos a
20ºC. El ADN cortado fue separado mediante electroforesis en un gel
de agarosa GTG Seakem al 1% (FMC Bio Products, Rockland, ME,
EE.UU.). La fracción con un tamaño de 1,8-2,2 kb fue
cortada del gel y posteriormente el corte de gel fue digerido con
\beta-agarasa I de acuerdo con el protocolo del
fabricante (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; EE.UU.) y el ADN
fue precipitado.
Un vector pUC19 modificado (denominado pStuc) fue
utilizado para clonar la fracción de 1,8-2,2 de kb.
En este vector, el fragmento BamHI/SalI de pUC19 fue
reemplazado por un fragmento de ADN conteniendo sitios de
restricción de StuI, SpeI y SalI utilizando dos
cebadores oligonucleotídicos y técnicas de clonaje estándar según
está descrito por Sambrook y col. (en: Molecular cloning: a
laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La
fracción de 1,8-2,2 kb fue ligada a 16ºC en el
vector pStuc digerido con StuI y desfosforilado. La mezcla de
ligadura fue utilizada posteriormente para transformar células
ultracompetentes Epicurean Coli XL2-Blue MRF'
(Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Se cultivaron colonias
individuales y se almacenaron en placas de microvaloración de 384
pocillos (100 \mul del medio LB conteniendo 100 mg/l de
carbenicilina).
Para aislar los clones que representaban la
región de ADN solapante de los cósmidos Mi-11 y
Mi-18 que contenía el gen de resistencia Mi,
se utilizaron los fragmentos de PstI de 8,6 y 4,5 kb del clon
cosmídico Mi-18 (ver la Figura 4), así como el
marcador AFLP PM14, como sondas de hibridación en hibridaciones de
colonias. Por lo tanto, réplicas de la cuadrícula de 384 pocillos de
los clones en placas de microvaloración fueron estampadas sobre
filtros de membrana Gene Scren Plus (DuPont NEN, Boston, MA, EE.UU.)
y se dejaron crecer en colonias sobre el medio. Se utilizaron 84
clones positivos para aislar el ADN plasmídico utilizando el método
de lisis alcalina según está descrito por
Ish-Horowicz y col., 1981, Nucl. Acids Res., 9,
2989-2997.
Se utilizó el kit "ABI PRISM Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" para llevar a cabo las
reacciones de secuenciación en un sistema Gene-Amp
PCR Modelo 9600 (Perkin-Elmer, Foster City, CA,
EE.UU.). Se utilizaron cebadores directos e inversos de M13
estándar. Los productos de reacción fueron analizados en geles de 48
cm de un ABI PRISM 377. La secuencia de ADN de 84 clones
seleccionados fue determinada utilizando los cebadores de
secuenciación directos e inversos estándar. El ensamblaje y el
análisis de la secuencia se realizó con la versión de 1994 del
programa de análisis de secuencias STADEN (Dear y Staden, 1991,
Nucl. Acids Res., 19, 3907-3911). Pudo formarse una
secuencia de ADN contigua de aproximadamente 9,9 kb de nucleótidos y
está mostrada en la Figura 5. Pudo deducirse un marco de lectura
abierto grande de 3621 nucleótidos (ORF2) que codificaba un
polipéptido truncado de 1206 aminoácidos (Figura 7B).
Suelo infectado con el nematodo del nudo de la
raíz Meloidogyne incognita fue preparado como sigue: se
cortaron en trozos sistemas de raíces de plantas de tomate altamente
infectadas con un gran número de agallas (o nudos de la raíz), y se
mezclaron con tierra fresca.
Se sembraron semillas o se transfirieron
plántulas de raíz pequeña al suelo infectado. Las plantas se
desarrollaron en un invernadero a una temperatura de 25ºC. Después
de 4 a 8 semanas, las plantas fueron arrancadas cuidadosamente del
suelo y las raíces fueron lavadas con agua con el fin de eliminar la
tierra adherida. Se determinó el nivel de infección contando el
número de agallas formadas.
Las plantas fueron consideradas resistentes
cuando eran visibles tres agallas o menos en las raíces. Las plantas
fueron consideradas susceptibles cuando se formaron más de tres
agallas en el sistema radicular.
Identificación de cósmidos con el gen de
resistencia Mi mediante selección por resistencia de las
progenies autofecundadas de las plantas transformadas.
Los regenerantes primarios (generación R_{0})
de los experimentos de transformación fueron cultivados en el
invernadero para que produjeran semillas. Para cada cósmido, se
cultivaron de 10 a 15 regenerantes y se recogieron las semillas
R_{1}. Las líneas R_{1} de al menos 7 plantas R_{0} de cada
cósmido fueron analizadas para determinar su resistencia frente a
Meloidogyne incognita con el fin de identificar cósmidos con
el de resistencia. De 20 a 30 plantones o plántulas de cada línea
R_{1} fueron inoculados y evaluados según se describió en el
Ejemplo 12.
En total se analizaron 63 líneas R_{1} de 7
diferentes transformaciones cosmídicas; 6 cósmidos que llevaban el
inserto de ADN del tomate y un cósmido, pJJ04541, sin el inserto de
ADN de tomate. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Cincuenta y
cuatro plantas R_{0} transgénicas parecían ser susceptibles, ya
que se formaron agallas en los sistemas de raíces de todas las
plantas R_{1} analizadas. Nueve plantas R_{0} se consideraron
resistentes, ya que por lo menos la mitad de las plantas de cada
línea R_{1} tuvieron 3 agallas o menos. Una línea R_{1} fue
completamente resistente, 6 líneas R_{1} se segregaron en una
proporción de aproximadamente 3:1 (plántulas resistentes respecto a
susceptibles), y las progenies de dos plantas R_{0} se segregaron
1:1. Las nueve plantas R_{0} resistentes derivaban todas de
transformaciones con el cósmido Mi-11.
La evidencia genética adicional de la presencia
del gen de resistencia Mi en el cósmido Mi-11
se obtuvo en la siguiente generación. Las plantas R_{1}
resistentes fueron autofecundadas. Catorce de las líneas R_{2}
resultantes, que se originaron de 4 plantas R_{0} diferentes,
fueron analizadas para determinar su resistencia frente a M.
incognita. De 20 a 30 plantones de cada línea R_{2} fueron
inoculados y evaluados según se describió en el Ejemplo 12. Los
resultados se muestran en la Tabla 7. Cinco líneas R_{2} fueron
completamente resistentes, indicando que las plantas R_{1}
parentales eran homocigotas para el gen de resistencia Mi.
Ocho líneas R_{2} se segregaron en una proporción de 3:1,
indicando que sus plantas R_{1} parentales eran heterocigotas para
el gen de resistencia Mi. Una línea R_{2} se segregó en una
proporción de aproximadamente 1:1, y ninguna de las líneas
analizadas parecía ser completamente susceptible. Estos resultados
demuestran que las plantas R_{1} seleccionadas, las cuales derivan
de varias plantas transformadas con el cósmido
Mi-11, contienen el gen de resistencia Mi
funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon plantas pequeñas de tomate (4
semanas de edad) con el áfido de la patata (Macrosiphum
euphorbiae) colocando de 5 a 8 áfidos hembra sobre las hojas.
Las plantas fueron cultivadas en el invernadero a una temperatura de
18º a 20ºC. Después de una a dos semanas, se determinó el nivel de
resistencia contando el número de áfidos recién nacidos.
Las plantas fueron consideradas resistentes
cuando no estaban presentes áfidos vivos en el tallo o en las hojas.
Las plantas eran susceptibles cuando estaban presentes áfidos recién
nacidos.
Un subgrupo de las líneas R_{1} obtenidas en el
Ejemplo 13 fue analizado para determinar su resistencia frente a
Macrosiphum euphorbiae con el fin de identificar cósmidos con
el gen de resistencia Meu-1. De 10 a 15 plántulas de cada
línea R_{1} fueron inoculadas y evaluadas según se describió en el
Ejemplo 14. En total, se analizaron 41 líneas R_{1} de 7
diferentes transformaciones cosmídicas; 6 cósmidos que llevaban el
inserto de ADN del tomate y un cósmido, pJJ04541, sin el inserto de
ADN del tomate. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Treinta y
seis plantas R_{0} transgénicas se consideraron susceptibles, ya
que docenas de áfidos proliferaron en todas o en la mayoría de las
plantas de cada línea R_{1}. Cinco plantas R_{0} son
resistentes, ya que por lo menos la mitad de las plantas de cada
línea R_{1} no tuvieron áfidos vivos. Estas 5 plantas R_{0}
resistentes han sido todas transformadas con el cósmido
Mi-11.
Mi-11.
Los resultados obtenidos indican firmemente que
las plantas R_{0} que derivan de transformaciones con el cósmido
Mi-11, contienen un gen de resistencia Meu-1
funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Una evidencia genética adicional de la presencia
del gen de resistencia Meu-1 en el cósmido
Mi-11 se obtuvo en la siguiente generación.
Veinticuatro líneas R_{2} que habían sido obtenidas de
autofecundaciones de plantas R_{1} resistentes a nematodos (ver el
Ejemplo 13), que se originaron de 9 plantas R_{0} diferentes,
fueron analizadas para determinar su resistencia frente a M.
euphorbiae. De 11 a 15 plantones de cada línea R_{2} fueron
inoculados y evaluados según se describió en el Ejemplo 14. Los
resultados se muestran en la Tabla 9. Una línea R_{2} se segregó
en una proporción de 3:1 y 8 líneas R_{2} se segregaron en una
proporción de aproximadamente 1:1. En estas nueve líneas, el
fenotipo de resistencia al áfido de la patata es claramente visible.
Cinco líneas R_{2} parecían ser completamente susceptibles. Las 10
líneas R_{2} restantes tuvieron una clasificación intermedia: se
segregaron en una proporción de aproximadamente 1:3. Estos
resultados indican que varias plantas R_{1}, que son resistentes a
Meloidogyne incognita y que derivan de plantas R_{0}
transformadas con el cósmido Mi-11, tienen un gen de
resistencia Meu-1 funcional.
Además, 8 líneas R_{1}BC que fueron obtenidas
de plantas R_{1} resistentes a nematodos retrocruzadas con la
línea de tomate susceptible 52201, fueron analizadas para determinar
su resistencia frente a M. euphorbiae, con el fin de
confirmar la herencia del gen de resistencia Meu-1
introducido. De 12 a 15 plantones de cada línea R_{1}BC fueron
inoculados y evaluados según se describió en el Ejemplo 14. Los
resultados se muestran en la Tabla 10.
Las proporciones de segregación mostradas en la
Tabla 9 y en la Tabla 10 solamente sirven para ilustrar la herencia
del fenotipo de resistencia.
Se realizaron estudios de construcción de mapas
de los transcritos para crear un mapa de los extremos 5' y 3' del
gen de resistencia Mi y para determinar si el gen de
resistencia Mi contiene algún intrón. La reacción en cadena
de la polimerasa para amplificar partes de los transcritos del gen
de resistencia Mi fue utilizada para este fin.
El ARN total del tejido de hojas del cultivo de
tomate resistente E22 fue aislado de acuerdo con el método del fenol
caliente según está descrito por Sambrook y col. (en: Molecular
cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press). Se aisló el ARN poli A+ utilizando oligo(dT)
biotinilado unido a Dynabeads M-280 Streptavidin
(DYNAL A.S., Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc utilizando el kit
"Superscript Rnase H Reverse Transcriptase cDNA" de Life
Technologies, Inc, Gaithersburg, MD, EE.UU. y el protocolo
suministrado por el fabricante.
Se obtuvieron los productos RACE 5' y 3'
utilizando el kit de amplificación de ADNc Marathon de Clontech
(Palo Alto, CA, EE.UU.). Los cebadores utilizados fueron diseñados
sobre la base de la secuencia genómica de Mi, y especialmente
del extremo 5' de la secuencia codificadora de ORF2. Posteriormente,
los diferentes fragmentos 5' y 3'-RACE fueron
clonados en el vector de clonaje TA PCRII (Invitrogen Corporation,
San Diego, CA, EE.UU.) y secuenciados utilizando protocolos
estándar. Las secuencias de nucleótidos obtenidas fueron alineadas
con la secuencia genómica de 9,9 kb y pudieron deducirse dos
secuencias intrónicas para el extremo 5' del gen de resistencia
Mi. Un intrón de 1306 nucleótidos estaba ubicado desde el
nucleótido en posición 1936 al nucleótido en posición 3241 y el
segundo desde el nucleótido en posición 3305 al 3379 (Figura 5).
El transcrito de Mi más grande detectado
con el kit de amplificación de ADNc Marathon mapea en la posición de
nucleótido 1880. Por lo tanto, concluímos que el sitio de inicio de
la transcripción de Mi está ubicado en o corriente arriba del
nucleótido 1880. El primer codón ATG que pudo ser detectado dentro
del ADNc 5' estaba situado en la posición de nucleótido 3263, 52
nucleótidos corriente arriba del segundo intrón, y pudo deducirse un
marco de lectura abierto grande (ORF1) que codificaba un polipéptido
de 1257 aminoácidos y está mostrado en la Figura 7A. Como resultado,
este segundo intrón está ubicado entre el aminoácido 14 y el 15 del
producto del gen de resistencia Mi.
Los datos obtenidos del análisis de
complementación en raíces de plantas transformadas (Ejemplo 10)
indicaban que el gen de resistencia Mi estaba ubicado en un
segmento de ADN que solapaba entre los cósmidos
Mi-11 y Mi-18, excluyendo el
segmento de ADN correspondiente al cósmido Mi-30,
cuyos transformantes eran todos susceptibles. Se calculó que esta
región tenía alrededor de 12 kb. Sin embargo, en el análisis de
complementación de las progenies autofecundadas de las plantas
transformadas, solamente las plantas transformadas con el cósmido
Mi-11 fueron clasificadas como resistentes (Ejemplos
13 y 15). Para resolver la cuestión de porqué las plantas
transformadas con Mi-18 eran susceptibles, se
realizó un análisis de PCR en presencia o ausencia del supuesto ORF
de Mi en las plantas transformadas con Mi-11
y Mi-18.
Se analizaron las siguientes muestras de ADN:
- 1.
- Clon 2/1256 de YAC.
- 2-3.
- Cósmido Mi-11 en E. coli y en A. tumefaciens, respectivamente.
- 4-5.
- Cósmido Mi-18 en E. coli y en A. tumefaciens, respectivamente.
- 6.
- Línea de tomate E22 (resistente).
- 7.
- Línea de tomate 52201 (susceptible).
- 8-12.
- Cinco plantas transformadas con el cósmido Mi-11.
- 13-17.
- Cinco plantas transformadas con el cósmido Mi-18.
El ADN fue digerido con PstI y se ligaron
adaptadores de PstI. Posteriormente, se realizó un análisis
de PCR con un cebador que identificaba el sitio de PstI y
tres nucleótidos selectivos adicionales o marcador PM14 y varios
cebadores de PCR ubicados corriente arriba de PM14 utilizando el
enzima polimerasa rTh (kit Gene Amp XL PCR; Perkin Elmer).
Los productos generados variaban en tamaño desde 443 a 6110 pb y
abarcan la región corriente arriba de PM14 completa del supuesto ORF
de Mi (ver la Figura 6).
Parecía que todos los moldes generaron productos
de PCR del tamaño esperado con la excepción de las 5 plantas
transformadas con el cósmido Mi-18. Solamente se
formó el producto de PCR más pequeño (443 pb). Estos datos indican
que la región corriente arriba de PM14 casi completa no estaba
presente en las plantas transformadas con el cósmido
Mi-18. Estas deleciones no tienen lugar con el
cósmido Mi-18 presente en E. coli o A.
tumefaciens, sino que ocurren solamente en las plantas
transformadas. Por lo tanto, concluímos que estas deleciones son
responsables del fenotipo susceptible a Meloidogyne incognita
y/o a Macrosiphum euphorbiae de las plantas transformadas
con
Mi-18.
Mi-18.
La observación de que solamente las plantas
transformadas con el cósmido Mi-11 mostraban un
fenotipo resistente, podría indicar que los marcos de lectura
abiertos adicionales presentes en Mi-11 pueden ser
candidatos para codificar resistencia frente a nematodos y/o áfidos.
Por lo tanto, la secuencia de nucleótido de la región corriente
arriba del ORF1 postulado fue determinada para identificar marcos de
lectura abiertos adicionales. Un grupo de subclones aleatorios con
un tamaño de inserto de 2 kb fueron aislados utilizando los
fragmentos de PstI de 2,1, 4,7 y 2,9 kb del clon cosmídico
Mi-11 como sondas de hibridación en la hibridación
de colonias, esencialmente como se describió en el Ejemplo 11.
Cuarenta y nueve clones positivos fueron
utilizados para determinar la secuencia de ADN utilizando los
cebadores de secuenciación directos e inversos estándar. El
ensamblaje de la secuencia y el análisis se realizaron según se
describió en el Ejemplo 11.
Pudieron deducirse tres tramos contiguos de ADN
con tamaños de 5618 pb (con25), 898 pb (con10) y 2495 pb (con62).
Los huecos entre estos tramos de ADN y la secuencia de ADN de 9870
pb que contenía el supuesto ORF de Mi (Figura 6) fueron
calculados utilizando PCR y variaban entre 50 y 200 pb.
Los tres contigs determinados (con25, con10 y
con62) fueron analizados para determinar la distribución de codones
de parada en los 6 marcos posibles. No se pudo postular ningún marco
ORF significativo con un tamaño de o superior a 120 aminoácidos.
Además, no se detectó ninguna homología de ADN con el supuesto ORF1.
Por tanto, el único ORF significativo presente en el cósmido
Mi-11 era ORF1 según se describe en la Figura 5.
Sobre la base de estos resultados, puede concluirse que el
polinucleótido codificado por ORF1 confiere resistencia a nematodos,
así como a áfidos y, por lo tanto, que el gen de resistencia
Mi y el gen de resistencia Meu-1 se refieren a la
misma secuencia codificadora que la representada en la Figura 5.
El cultivo de tabaco Petit Havana, tipo SR1, fue
transformado con el cósmido Mi-11 o con el vector
cosmídico pJJ04541, utilizando el protocolo descrito por Horsch y
col. (Science, 227, 1229-1231, 1985).
Se sometieron raíces de plantas de tabaco R_{0}
transformadas cultivadas in vitro al ensayo de enfermedad
según se describió en el Ejemplo 1. De cada uno de los 31
transformantes se analizaron dos o más explantes de raíz. Además,
los 17 transformantes con Mi-11 fueron todos
analizados mediante PCR para determinar la presencia del supuesto
ORF1 de Mi, seleccionando por un fragmento interno con un
tamaño de 823 pares de base (que se extendía desde el nucleótido en
posición 4824 al 5646, ver la Figura 5). Los cebadores de PCR simple
para el fragmento fueron deducidos a partir de la secuencia mostrada
en la Figura 5. Los cebadores utilizados tienen las siguientes
secuencias:
| Cebador S21: | 5'-CCAAGGACAGAGGTCTAATCG-3' |
| Cebador S22: | 5'-TTGAGGTGATGTGGTAAATGG-3' |
El cebador S21 está dirigido a la secuencia desde
el nucleótido en posición 4824 al 4844 y el cebador S22 está
dirigido a la secuencia desde el nucleótido en posición 5626 al 5646
(ver la Figura 5).
Los resultados del ensayo de enfermedad in
vitro y del análisis por PCR (presencia "+" o ausencia
"-" del fragmento de PCR interno) se muestran en la Tabla 11.
"Mi-11" representa plantas transformadas que
contienen el supuesto ORF1 de Mi y
"Mi-11\Delta" representa aquellas plantas
transformadas que tienen una deleción en el supuesto ORF1 de
Mi, según se determinó por el análisis de PCR (descrito
anteriormente). Veintinueve transformantes R_{0} eran
susceptibles, ya que se habían formado agallas en al menos uno de
los cultivos de raíces analizados. Generalmente, el índice de
formación de agallas en las raíces de tabaco es ligeramente menor
que en raíces de tomate susceptible. Dos plantas R_{0} se
clasificaron como resistentes a Meloidogyne incognita, ya que
no pudieron encontrarse agallas en los cultivos de raíces. Ambas
plantas resistentes fueron transformadas con el cósmido
Mi-11 que contenía el fragmento de PCR interno que
indicaba la presencia del gen de resistencia Mi.
| Genotipo | Fragmento de PCR | Plantas R_{0} | |
| Resistentes | Susceptibles | ||
| \hskip-3mm Mi-11 | + | 2 | 7 |
| Mi-11\Delta | - | 0 | 8 |
| pJJ04541 | - | 0 | \hskip-3mm 14 |
Se inocularon y evaluaron cortes de raíces de
plantas R_{0} transformadas de tabaco según se describió en el
Ejemplo 14. De cada uno de los 23 transformantes se analizaron dos o
tres cortes para determinar su resistencia frente a Macrosiphum
euphorbiae. Los resultados del ensayo de infección y del
análisis de PCR (como se describió anteriormente) se muestran en la
Tabla 12. Veintiún plantas R_{0} se consideraron susceptibles, ya
que se contaron varios áfidos vivos en al menos uno de los cortes
analizados. En general, el nivel de proliferación de los áfidos en
el tabaco es bajo comparado con la proliferación en plantas de
tomate susceptibles. Dos plantas R_{0} se clasificación como
resistentes, ya que todos los cortes de estas plantas estuvieron sin
áfidos vivos. Las plantas resistentes a áfidos fueron transformadas
con el cósmido Mi-11, que contenía el gen de
resistencia Mi, según está indicado por la presencia del
fragmento de PCR interno.
| Genotipo | Fragmento de PCR | Plantas R_{0} | |
| Resistentes | Susceptibles | ||
| \hskip-3mm Mi-11 | + | 2 | 3 |
| Mi-11\Delta | - | 0 | 6 |
| pJJ04541 | - | 0 | \hskip-2mm 12 |
La variedad de papa Diamant (Cebeco Zaden, B.V.,
Vlijmen, Países Bajos) fue utilizada para la transformación. Se
transformaron explantes entre nudos de plantas cultivadas in
vitro con el cósmido Mi-11 o con el vector
cosmídico pJJ04541 utilizando el protocolo descrito por Ooms y col.
(Theor. Appl. Genet., 73, 744-750).
Raíces de plantas de patata R_{0} transformadas
cultivadas in vitro fueron sometidas al ensayo de enfermedad
según se describió en el Ejemplo 1. De cada uno de los 31
transformantes se analizaron al menos 2 explantes de raíz. Además,
los 26 transformantes con Mi-11 fueron analizados
mediante PCR utilizando los cebadores S21 y S22 según se describió
en el Ejemplo 19. Los resultados del ensayo de enfermedad in
vitro y del análisis por PCR (presencia "+" o ausencia
"-" del fragmento de PCR interno) se muestran en la Tabla 13.
"Mi-11" representa plantas transformadas que
contienen el supuesto ORF1 de Mi y
"Mi-11\Delta" representa aquellas plantas
transformadas que tienen una deleción en el supuesto ORF1 de
Mi, según se determinó mediante el análisis por PCR (descrito
anteriormente). Veintiocho transformantes R_{0} fueron
susceptibles, ya que se formaron agallas en al menos uno de los
cultivos de raíces. Generalmente, la tasa de formación de agallas en
raíces de patata es menor que en raíces de tomate susceptibles. Tres
plantas R_{0} se clasificaron como resistentes a Meloidogyne
incognita, ya que no pudieron encontrarse agallas en los
cultivos de raíces. Todas estas plantas resistentes fueron
transformadas con el cósmido Mi-11 que contenía el
fragmento de PCR interno que indicaba la presencia del gen de
resistencia Mi.
| Genotipo | Fragmento de PCR | Plantas R_{0} | |
| Resistentes | Susceptibles | ||
| \hskip-3mm Mi-11 | + | 3 | \hskip-2mm 17 |
| Mi-11\Delta | - | 0 | 6 |
| pJJ04541 | - | 0 | 5 |
Cortes de raíces de plantas R_{0} de patata
transformadas con Mi-11 fueron sometidos al ensayo
de enfermedad según se describió en el Ejemplo 12. De cada uno de
los 19 transformantes, se analizaron de 1 a 3 cortes para determinar
su resistencia frente a Meloidogyne incognita. Los resultados
se muestran en la Tabla 14. Además, se analizaron 36 cortes de
raíces de plantas de patata no transformadas (variedad Diamant)
(como controles susceptibles) y todos fueron susceptibles. Una
planta R_{0} fue resistente a Meloidogyne incognita, ya que
no pudieron encontrarse agallas en el sistema de radicular.
| Genotipo | Fragmento de PCR | Plantas R_{0} | |
| Resistentes | Susceptibles | ||
| \hskip-3mm Mi-11 | + | 1 | \hskip-2mm 12 |
| Mi-11\Delta | - | 0 | 6 |
| Control no | |||
| transformado | - | 0 | 1 |
Claims (38)
1. Un ácido nucleico aislado que tiene la
secuencia de ADN de la Figura 5, o parte de la misma, o una
secuencia de ADN homóloga que tiene al menos un 50% de identidad con
la secuencia de ADN de la Figura 5 y donde dicha parte de la
secuencia o dicha secuencia homóloga, cuando es transferida a una
planta que es susceptible a un patógeno vegetal, es capaz de reducir
la susceptibilidad de dicha planta a dicho patógeno vegetal.
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que
es capaz, cuando es transferido a una planta huésped que es
susceptible a un patógeno vegetal, de convertir dicha planta huésped
en resistente a dicho patógeno vegetal.
3. Un ácido nucleico aislado que es un ADNc capaz
de, cuando es transferido a una planta que es susceptible a un
patógeno vegetal, reducir la susceptibilidad a dicho patógeno
vegetal, donde la secuencia de dicho ADNc es la secuencia de ADN de
la Figura 5 o al menos parte de la secuencia de ADN proporcionada en
la Figura 5.
4. El ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 3,
que cuando es transferido a una planta huésped es capaz de
convertirla en resistente a nematodos.
5. El ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 3,
que cuando es transferido a una planta huésped es capaz de
convertirla en resistente a áfidos.
6. El ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 3,
que cuando es transferido a una planta huésped es capaz de
convertirla en resistente a nematodos y áfidos.
7. Un ácido nucleico aislado que es capaz de,
cuando es transferido a una planta que es susceptible a un patógeno
vegetal, reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicho patógeno
vegetal, donde dicho ácido nucleico
- i)
- tiene una secuencia que comienza en el nucleótido en posición 3263 y finaliza en el nucleótido en posición 7111 de la secuencia de la Figura 5; o,
- ii)
- es un ADN homólogo que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia definida en (i), donde dicha secuencia homóloga, cuando es transferida a un patógeno vegetal, es capaz de reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicho patógeno.
8. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación
1 ó 3, que es al menos parte del inserto genómico presente en el
plásmido pKGMi-11, o cualquier secuencia homóloga
que tenga al menos un 50% de identidad con el inserto genómico
presente en el plásmido pKGMi-11, estando depositado
dicho plásmido pKGMi-11 en el Centraal Bureau Voor
Schimmelkultures de Baam, Países Bajos, bajo el Número de depósito
CBS822.96.
9. Un ácido nucleico aislado que es una secuencia
promotora ubicada 5' corriente arriba del nucleótido en posición
3263 de la secuencia de ADN proporcionada en la Figura 5 o de
cualquier secuencia de ADN homóloga a la misma que tenga al menos un
50% de identidad con dicha secuencia promotora, donde dicha
secuencia de ADN homóloga contiene las secuencias reguladoras
requeridas para la transcripción de la secuencia codificadora
adyacente.
10. Una construcción de ADN recombinante que
contiene un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-8.
11. Una construcción de ADN recombinante de la
reivindicación 10 que contiene un ácido nucleico de cualquiera de
las reivindicaciones 1-8, donde dicho ácido nucleico
está bajo el control de un promotor que es funcional en una célula
vegetal, siendo dicho promotor endógeno o exógeno para dicha célula
vegetal, y eficaz para controlar la transcripción de dicha secuencia
de ADN en tales células vegetales.
12. Una construcción de ADN recombinante de la
reivindicación 11 en la que dicho promotor es una secuencia
promotora ubicada 5' corriente arriba del nucleótido 3263 según se
proporciona en la Figura 5, o cualquier secuencia de ADN homóloga
que tenga al menos un 50% de identidad con dicha secuencia promotora
y contenga las secuencias reguladoras requeridas para la
transcripción de la secuencia codificadora adyacente.
13. Un vector adecuado para transformar células
vegetales, conteniendo dicho vector una construcción de ADN de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
10-12.
14. El plásmido pKGMi-11 según
está depositado bajo el número CBS822.96.
15. El plásmido pKGMi-18 según
está depositado bajo el número CBS821.96.
16. Células bacterianas que contienen un vector o
plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
13-15.
17. Células vegetales que contienen una
construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 10-12.
18. Una planta que contiene células vegetales de
acuerdo con la reivindicación 17.
19. Una planta de acuerdo con la reivindicación
18 que tiene susceptibilidad reducida a nematodos.
20. Una planta de acuerdo con la reivindicación
19, en la que dicho nematodo es un nematodo de los nudos de la raíz,
especialmente Meloidogyne incognita.
21. Una planta de acuerdo con la reivindicación
18 que tiene susceptibilidad reducida a áfidos, especialmente a
Macrosiphum euphorbiae.
22. Una semilla que contiene una construcción de
ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
10-12.
23. Un proceso para obtener plantas con
susceptibilidad reducida a un patógeno, que comprende las etapas
de:
- i)
- la inserción en el genoma de una célula vegetal de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12,
- ii)
- la obtención de las células vegetales transformadas,
- iii)
- la regeneración a partir de dichas células vegetales transformadas de plantas transformadas genéticamente y
- iv)
- opcionalmente, la propagación de dichas plantas.
24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
23, en el que dicho patógeno es un nematodo, y preferiblemente un
nematodo de los nudos de la raíz, especialmente Meloidogyne
incognita.
25. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
23, en el que dicho patógeno es un áfido, y preferiblemente
Macrosiphum euphorbiae.
26. Un proceso para proteger plantas en cultivo
frente a la infección por patógenos, que comprende:
- i)
- la inserción en el genoma de una célula vegetal de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12,
- ii)
- la obtención de las plantas transformadas y
- iii)
- el cultivo de dichas plantas transformadas.
27. Un proceso para aislar un ácido nucleico de
acuerdo con las reivindicaciones 1-9, que comprende
las etapas siguientes:
- i)
- la selección de una biblioteca genómica o de ADNc de una planta con una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9,
- ii)
- la identificación de los clones positivos que hibridan con dicha secuencia de ADN y
- iii)
- el aislamiento de dichos clones positivos.
28. El proceso de la reivindicación 27, en el que
dicha biblioteca procede una primera planta y la secuencia de ADN
pertenece a una segunda planta.
29. Un proceso para identificar un ácido nucleico
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-9, comprendiendo dicho proceso una etapa de
utilización de combinaciones de cebadores que identifican al menos
uno de los marcadores AFLP PM02 a PM29 según está representado en la
Tabla 1.
30. El proceso de la reivindicación 29, en el que
dicha combinación de cebadores identifica el marcador AFLP PM14
según está representado en la Tabla 1.
31. Un par de cebadores apropiados para una
reacción de amplificación en la que la formación de un producto de
amplificación indica la presencia del gen de resistencia Mi,
donde dichos cebadores son seleccionados entre oligonucleótidos de
un tamaño suficiente para hibridar selectivamente con la secuencia
de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
32. Un par de cebadores de acuerdo con la
reivindicación 31, donde dicha secuencia de ADN es la secuencia que
comienza en el nucleótido en posición 6921 y finaliza en el
nucleótido en posición 7034 de la secuencia de ADN proporcionada en
la Figura 5.
33. Un par de cebadores que comprende un primer
oligonucleótido cuya secuencia de ADN es
5'-TGCAGGA-3' y un segundo
oligonucleótido cuya secuencia de ADN es
5'-TAATCT-3'.
34. Un kit de diagnóstico que contiene al menos
un par de cebadores de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 31-33.
35. Un proceso para detectar la presencia o
ausencia de una secuencia de ADN de acuerdo con las reivindicaciones
1-9, particularmente en un ADN vegetal, que
comprende una etapa de utilización de un kit de diagnóstico de
acuerdo con la reivindicación 34.
36. Un polipéptido que es el producto de
expresión de un ácido nucleico de ADN recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10 a 12.
37. Un polipéptido aislado con una secuencia de
aminoácidos que tiene la secuencia proporcionada en la Figura 7A o
que está codificado por la secuencia homóloga correspondiente de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
38. Un ARN aislado que tiene una secuencia de
ácido ribonucleico de un transcrito de la secuencia de ADN de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
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