DE69731221T2

DE69731221T2 - Resistenz gegen nematoden und/oder blattläuse

Info

Publication number: DE69731221T2
Application number: DE69731221T
Authority: DE
Inventors: Pieter Vos; Marc Zabeau; Guus Simons; Jelle Wijbrandi
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-08
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-08-09
Also published as: JP2001500006A; PL331542A1; MX235300B; IL128198A0; DK1493817T3; JP2008289481A; DE69731221D1; ATE493499T1; AU735063B2; WO1998006750A3; EP1493817A1; JP4339404B2; PL191777B1; HUP9902900A3; MX9901354A; CA2262411A1; RU2221044C2; PT1493817E; BR9711048A; HUP9902900A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Resistenzgene, DNA-Konstrukte, Mikroorganismen, Pflanzenzellen und Pflanzen, die diese Resistenzgene umfassen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung genetisch transformierte Pflanzen, die gegen Nematoden und/oder Blattläuse resistent sind. Zusätzlich betrifft die Erfindung Sonden und Primer für die Identifizierung der Resistenzgene und diagnostische Kits, welche diese Sonden und/oder Primer umfassen. Schließlich betrifft die Erfindung Polypeptide, die durch diese Resistenzgene kodiert werden, und die Verwendung dieser Polypeptide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pflanzenpathogene sind für substantielle Verluste von Pflanzen und pflanzlichen Erzeugnissen aufgrund einer Infektion der Pflanze verantwortlich. Pflanzenkrankheiten als Ergebnis einer Infektion durch Pflanzenpathogene oder Schädlinge bewirken bei den Pflanzen und/oder pflanzlichen Erzeugnissen Schäden, verringern Produktion und Ertrag, begrenzen die Art von Pflanzen, die in bestimmten geographischen Gebieten wachsen können, und verursachen als Ergebnis schwere (finanzielle) Verluste für den Anbauer.
Für Pflanzen parasitäre Nematoden treten weltweit auf und die meisten von ihnen verbringen den Großteil ihres Lebens in der Oberbodenschicht. Obwohl durch direktes Fressen von Nematoden an Pflanzenwurzeln verursachte Verluste als von geringerer Bedeutung angesehen werden, verursachen mehrere Spezies, unter diesen die Wurzelknoten- oder Wurzelgallen-Nematoden, die zu der Meloidogyne-Spezies gehören, die Zysten-Nematoden, die zu der Heterodera-Spezies und Globodera-Spezies gehören, und andere Nematoden, wie die Nacobbus-Spezies, schwere Schäden und wirtschaftliche Feldfruchtverluste. Wurzelknoten-Nematoden kommen ebenfalls in der ganzen Welt vor, werden aber häufiger und in größeren Zahlen in Gebieten mit wärmerem Klima und in Gewächshäusern gefunden. Die wichtigsten Meloidogyne-Spezies sind M. incognita, M. arenaria, M. hapla und M. javanica, von denen M. hapla auch in gemäßigteren klimatischen Zonen vorkommt.
Es existieren verschiedene Mittel zur Kontrolle der Pflanzenpathogene, wie mechanische Kultivierung des Bodens, chemische Behandlung mit Pestiziden, einschließlich Nematoziden und Insektiziden, und Fruchtwechsel. Jedoch sind für bestimmte Pflanzenpathogene, speziell Nematoden, diese Kontrollmittel unzureichend, um die Pflanzen vor Infektion und daraus resultierenden Krankheiten zu schützen. Das einzige wirksame Kontrollmittel umfasst Pflanzenwirtresistenz (Russell, 1978, Plant Breeding for pest and disease resistance, Hrsg. Butterworths, S. 485 ff.) Die Entwicklung von Sorten, die gegen übliche Pflanzenpathogene resistent sind, ist eines der Hauptziele von Pflanzenzüchtern heutzutage, um den intensiven Bedarf an Pestiziden zu verringern und schließlich zu beseitigen. Die Belastung für die Umwelt durch die großen Mengen von Pestiziden, die weltweit jedes Jahr in den Boden injiziert oder auf Feldfrüchte, Bäume u. s. w. gesprüht werden, wird zu schwer. Darüber hinaus beschränken staatliche Verordnungen in den westlichen Ländern die Verwendung oder verbieten sogar die Verwendung von bestimmten Pestiziden. Dementsprechend wird der Bedarf an Pflanzen, die gegen eines oder mehrere von deren Pathogenen resistent sind oder die eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber ihren Angreifern aufweisen, immer dringender. Die Entwicklung von resistenten Pflanzen ist eines der wichtigen Ziele von gegenwärtigen Pflanzenzüchtungsprogrammen. Pflanzengenotypen, die für bestimmte Pathogene empfindlich sind, werden mit resistenten Pflanzengenotypen gekreuzt, um den resistenten Phänotyp in die Zuchtlinie einzuführen.
Schäden durch Wurzelknoten-Nematoden resultieren primär aus der Invasion der Pflanzenwurzeln durch Larven, welche in einer verträglichen Beziehung mit der Pflanze sich zu einem reproduzierenden weiblichen Tier entwickeln. Nach der Invasion bewirken die Larven, dass Wurzelzellen sich zu Riesenzellen entwickeln, von denen sie sich ernähren. Nach einer Infektion werden an den Wurzeln Gallen oder Knoten gebildet und die Pflanzenwurzeln werden anderweitig gestört, verdickt und verkrüppelt. Das Wurzelsystem zeigt folglich Funktionsstörungen bei der Aufnahme von Wasser und Nährstoffen, was das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung schädigt. Häufig werden die Schäden an infizierten Pflanzen durch parasitäre Pilze, die das geschwächte Wurzelgewebe angreifen, verstärkt. Infizierte Pflanzen zeigen ein verringertes Wachstum und kleinere, blass gefärbte Blätter mit zwergenwüchsigen Früchten von schlechter Qualität oder sogar ohne Früchte und neigen dazu, in wärmerem Klima zu welken (Agrios, 1988, in: Plant Pathology, Academic Press, Inc.). Die durch Wurzelknoten-Nematoden verursachte(n) Schäden und/oder Ertragsverringerung sind bezogen auf die gesamte landwirtschaftliche Produktion weltweit substantiell. An individuellen Standorten können Ertragsverluste bis zu 25–50% betragen oder es kann sogar eine Ernte vernichtet werden.
In Gewächshäusern können Wurzelknoten-Nematoden mittels Dampfsterilisation des Bodens oder Begasung des Bodens mit Nematoziden kontrolliert werden. Unter Freilandbedingungen kann eine Kontrolle durch die Verwendung von Nematoziden erreicht werden. Jedoch wird die Verwendung von solchen, in einigen Fällen sehr langlebigen Chemikalien zunehmend diskutiert und in einigen Ländern ist die Verwendung von bestimmten Nematoziden sogar verboten.
Die Züchtung von genetisch resistenten Genotypen ist der verlässlichste und wirksamste Weg, um Wurzelknoten-Erkrankungen zu kontrollieren. Bei einer Anzahl von Feldfruchtspezies ist über die Verfügbarkeit von Resistenz innerhalb des mit diesen verbundenen Keimplasmas berichtet worden, z. B. bei Kartoffel, Baumwolle, Tabak, Weizen, Sojabohne, Tomate, Aubergine, gewöhnlicher Bohne und Alfalfa. Die Resistenzzüchtung wird erstens durch das begrenzte Vorkommen von (bekannten) Resistenzgenen in dem verfügbaren Keimplasma, zweitens bei einigen Pflanzenspezies durch die Existenz von Kreuzungsbarrieren zwischen den kultivierten Feldfruchtspezies und den die Resistenz tragenden verwandten Spezies gehemmt und drittens sind Screening-Tests auf Resistenz gegenüber Empfindlichkeit gegenüber Nematoden arbeitsaufwändig und oftmals nicht verlässlich. Dementsprechend ist die Resistenzzüchtung sehr schwierig oder nicht zu erreichen oder, wenn möglich, zeitaufwändig.
Die erfolgreiche Einführung von Resistenzgenen ist bei der Tomate ausgeführt worden. Das Resistenzgen Mi (Meloidogyne incognita) ist in kultivierte Tomate, Lycopersicon esculentum, nach Kreuzung mit der verwandten wilden Spezies L. peruvianum (PI 128657) unter Verwendung von Embryokultur eingeführt worden. Das Mi-Gen verleiht Resistenz gegen verschiedene Meloidogyne-Spp. (Fassuliotis, 1991, in: Genetic Improvement of Tomato, Hrsg. Springer Verlag). Es wird berichtet, dass das Mi-Resistenzgen ein monogenes dominantes Gen ist (Gilbert und McGuire, 1956, Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 68, 437–442) und sich auf dem Tomaten-Chromosom 6 befindet. Es wird auch postuliert, dass die durch Introgression erzeugte Region, welche den Mi-Genort umfasst, daran beteiligt ist, Resistenz gegen die Kartoffel-Blattlaus (Macrosiphum euphorbia) zu verleihen (Kaloshian et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 622–625).
Pflanzen haben einen komplexen Abwehrmechanismus gegen den Angriff und die Infektion durch Pathogene entwickelt. Gegenwärtig ist der genaue Mechanismus von deren Abwehrsystem noch nicht aufgedeckt worden.
Resistenz gegen Nematoden bei Tomaten wird nach dem Eindringen exprimiert. Nachdem die juvenile Larve in die Wurzel eindringt und sich an einem Fressort festsetzt, wird eine hypersensitive Reaktion (HR) angrenzend an den Kopf der Nematode ausgelöst, die zum örtlichen Tod der Wirtszellen führt. Die Nematode wird ebenfalls durch diese HR abträglich beeinflusst und stirbt (Fassuliotis, 1991: in Genetic Improvement of Tomato, Hrsg. Springer Verlag). Ob es eine Gen-für-Gen-Beziehung im Florschen Sinne gibt (1956, Adv. Gen. 8, 29–54), wie dies bei anderen Pflanzen-Pathogen-Beziehungen, wo die Resistenz auf HR-Inkompatibilität basiert, der Fall ist, oder nicht, ist unbekannt.
Die Isolation von Pflanzengenen ohne Kenntnis von deren Genprodukten ist aufgrund der enormen Genomgrößen von Pflanzenspezies sehr arbeitsaufwändig und schwierig: z. B. weist Tomate eine Genomgröße von 1000 Mb (10⁹ Basenpaare von nukleärer DNA) auf, Mais hat eine Genomgröße von 3000 Mb und Weizen weist sogar mehr als 16 × 10⁹ Basenpaare auf. Das Suchen nach einem speziellen Gen unter diesen Milliarden von Basenpaaren ist nur machbar, wenn (i) es ausreichend molekulare Marker gibt, die eng mit dem Gen von Interesse verknüpft sind, und (ii) gutes genetisches Material zur Verfügung steht (Tanksley et al., 1995, Trends in Genetics, 11, S. 63–68).
Obwohl über die Isolation von einigen wenigen Resistenzgenen berichtet worden ist, ist keines von diesen Resistenzgenen in der Lage, der Wirtszelle Resistenz gegen Nematoden oder gegen Blattläuse zu verleihen. Beispiele von solchen isolierten Resistenzgenen sind: RPS2 aus Arabidopsis (Resistenz gegen avrRpt2 exprimierendes Pseudomonas syringae), N aus Tabak (Resistenz gegen das Tabakmosaikvirus), Cf-9 aus Tomate (Resistenz gegen das pilzliche Blattpathogen Cladosporium fulvum, welches avr9 trägt) und L⁵ aus Flachs (Resistenz gegen die entsprechende, für den Blattrost verantwortliche pilzliche Subspezies) (Dangl, 1995, Cell 80, 363–366).
Die Erfindung stellt das erste isolierte Nematodenresistenzgen bereit und stellt darüber hinaus das erste isolierte Blattlausresistenzgen bereit. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Resistenzgen mit doppelter Funktion, welches verringerte Empfindlichkeit gegenüber Nematoden wie auch gegenüber Blattläusen und vorzugsweise gegenüber Meloidogyne incognita bzw. Macrosiphum euphorbiae verleiht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die das Mi-Resistenzgen umfasst, das, wenn es in einer Pflanze vorhanden und exprimiert wird, in der Lage ist, der Pflanze Resistenz gegen Nematoden und/oder Blattläuse zu verleihen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung das Mi-Resistenzgen, dessen DNA-Sequenz hier offenbart wird. Die Erfindung betrifft auch ein durch das Mi-Resistenzgen kodiertes Genprodukt. Zusätzlich betrifft die Erfindung DNA-Konstrukte, Cosmide, Vektoren, Bakterienstämme, Hefezellen und Pflanzenzellen, die das Mi-Resistenzgen umfassen. Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine genetisch transformierte Pflanze, die gegen einen Nematoden, welcher Nematode in der Lage ist, die nicht-transformierte Pflanze zu infizieren, resistent ist. Darüber hinaus betrifft die Erfindung Resistenzgene, die zu dem Mi-Resistenzgen homolog sind und die, wenn sie in einer Pflanze vorhanden sind, in der Lage sind, der Pflanze Resistenz gegen eine Infektion durch Pathogene zu verleihen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, welche das Meu-1-Resistenzgen umfasst, welches, wenn es in einer Pflanze vorhanden ist, in der Lage ist, der Pflanze verringerte Empfindlichkeit gegenüber Blattläusen zu verleihen. Das Meu-1-Resistenzgen entspricht insbesondere dem Mi-Resistenzgen. Speziell weist das Meu-1-Resistenzgen die gleiche Nukleotidsequenz wie das Mi-Resistenzgen auf. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch genetisch transformierte Pflanzen, die weniger empfindlich und bevorzugt resistent gegen Blattläuse, insbesondere gegen Kartoffel-Blattläuse sind.
Schließlich betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die der Sequenz des Resistenzgens oder eines Teils davon entsprechen, und Detektionskits, welche die Oligonukleotide umfassen.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine physische Karte von YAC 1/1172, YAC 2/1256 und YAC 1/1084 mit einer Größe von 570, 500 bzw. 470 kb. Die Position der SfiI- und BssHII-Restriktionsstellen und die Größe der Restriktionsfragmente sind angegeben. Die Lage der verschiedenen AFLP-Marker auf den Restriktionsfragmenten ist angegeben.
2 zeigt eine schematische Zeichnung des binären Cosmidvektors pJJ04541, der verwendet wird, um eine Cosmid-Bibliothek von YAC 1/546 zu konstruieren. Als Ausgangsvektor wurde das Plasmid pRK290 (20 kb groß) (Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347–7351) verwendet. „Tet" bezieht sich auf das Resistenz gegen Tetracyclin verleihende Gen. „LB" bezeichnet die Wiederholungssequenz am linken Rand und „RB" bezeichnet die Wiederholungssequenz am rechten Rand. Die Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotorsequenz wird durch „p35S" angegeben und „ocs3" bezeichnet das Octopinsynthase-3'-Ende. „NPT" bezeichnet Neomycinphosphotransferase und „cos" bezieht sich auf die cos-Stelle des Bakteriophagen lambda, welche die in vitro-Verpackung ermöglicht. „pDBS" bezeichnet den Polylinker von pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
3A zeigt eine schematische Darstellung der detaillierten Lage der AFLP-Marker auf YAC 1/1172, YAC 2/1256 und YAC 1/1084. Die Positionierung basiert auf dem für die verschiedenen definierten Regionen konstruierten Cosmid-Contig.
3B zeigt eine schematische Darstellung des Cosmid-Contigs der das Mi-Resistenzgen umfassenden Region. Die Cosmide Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 und Mi-14 werden durch horizontale Linien angegeben. Die Lage der AFLP-Marker PM14 und PM25 ist angegeben.
4 zeigt eine feine physische Karte der Cosmide Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 und Mi-14 für das Restriktionsenzym PstI. Die Größe der PstI-Fragmente ist angegeben (in kb). Der Mi-Phänotyp, wie in einem in vitro-Krankheitsassay identifiziert, der R₀-Pflanzen, welche die ver schiedenen Cosmide umfassen, ist in dem Abschnitt auf der rechten Seite der Figur angegeben. Der DNA-Abschnitt, von welchem die Nukleotidsequenz bestimmt wurde, wird durch eine doppelte Linie mit einem Doppelpfeil angegeben.
5 zeigt die Nukleotidsequenz eines DNA-Abschnitts von ungefähr 9,9 kb um den AFLP-Marker PM14 herum und eine abgeleitete Aminosäuresequenz des Mi-Resistenzgens. Das Startcodon (ATG Position 3263–3265) ist unterstrichen und das Stopcodon (TAG Position 7109–7111) ist doppelt unterstrichen, was ein offenes Leseraster (ORF1), welches ein Polypeptid von 1257 Aminosäuren (7A) kodiert, zeigt. Das Mi-Resistenzgen umfasst zwei Intronsequenzen (kursiv gezeigt): ein Intron von 1306 Nukleotiden von Position 1936 bis Position 3241 und ein Intron von 75 Nukleotiden von Position 3305 bis Position 3379.
Ein zweites Startcodon (ATG Position 3491–3493), welches im Raster mit dem ersten Startcodon ist, führt zu einem zweiten offenen Leseraster (ORF2), welches ein verkürztes Polypeptid von 1206 Aminosäuren (7B) kodiert.
Die Lage des AFLP-Markers PM14 ist von Nukleotid-Position 6921 (5'-TGCAGGA-3') bis Nukleotid-Position 7034 (5'-AGATTA-3').
6 zeigt eine physische Karte der Cosmide Mi-11 und Mi-18 und die bestimmte Nukleotidsequenz des Cosmids Mi-11. Die Sequenz ist in vier Contigs unterteilt: con25 (5618 bp, con10 (898 kb), con62 (2495 bp) und Mi (9870 bp). Der untere Teil der Figur zeigt das Vorhandensein („+") oder die Abwesenheit („–") von mehreren PCR-Fragmenten, welche Teilen des DNA-Abschnitts von 5, die als horizontale Linien von unterschiedlichen Längen an der rechten Seite der Tabelle aufgeführt sind, entsprechen, in den verschiedenen genetischen Hintergründen (YAC-Klon 2/1256; E. coli, enthaltend das Cosmid Mi-11; A. tumefaciens, enthaltend das Cosmid Mi-11, E. coli, enthaltend das Cosmid Mi-18, A. tumefaciens, enthaltend das Cosmid Mi-18, die resistente Tomatenlinie E22, die empfindliche Tomatenlinie 52201, R₀-Pflanzen, transformiert mit dem Cosmid Mi-11, und R₀-Pflanzen, transformiert mit dem Cosmid Mi-18).
Nukleotidsequenz des Cosmids Mi-11 und des Cosmids Mi-18. Analyse von verschiedenen Contigs.
7A: zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des durch ORF1 kodierten Polypeptids.
7B: zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des durch ORF2 kodierten verkürzten Polypeptids.
8 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur des Mi-Resistenzgens.
9 zeigt eine schematische Darstellung der Mi-Resistenzgen-Familie.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der Beschreibung und den Beispielen, die folgen, wird eine Anzahl von Begriffen verwendet. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche, einschließlich des Umfangs, der durch solche Begriffe angegeben wird, zu ermöglichen, werden die folgenden Definitionen aufgeführt.

– Nukleinsäure: ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Die Nukleinsäure kann genomische DNA, cDNA, synthetische DNA oder eine jegliche andere DNA sein;
– Oligonukleotid: ein kurzes einzelsträngiges DNA-Molekül;
– Primer: im allgemeinen bezieht sich der Begriff Primer auf ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das die Synthese von DNA starten kann;
– Nukleinsäurehybridisierung: ein Verfahren zum Detektieren von verwandten DNA-Sequenzen durch Hybridisierung von einzelsträngiger DNA auf Trägern, wie einer Nylonmembran oder Nitrocellulose-Filterpapieren. Nukleinsäuremoleküle, die komplementäre Basensequenzen aufweisen, werden erneut die doppelsträngige Struktur bilden, wenn sie in Lösung unter den geeigneten Bedingungen gemischt werden. Die doppelsträngige Struktur wird zwischen zwei komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren sogar dann gebildet werden, wenn eine auf einem Träger immobilisiert ist. Bei einem Southern-Hybridisierungsverfahren tritt die letztgenannte Situation auf;
– Hybridisierungssonde: um eine bestimmte DNA-Sequenz in dem Southern-Hybridisierungsverfahren zu detektieren, lässt man ein markiertes DNA-Molekül oder eine markierte Hybridisierungssonde mit der aufgetrennten DNA, welche an einen Träger, wie eine Nylonmembran oder Nitrocellulose-Filterpapier, gebunden ist, reagieren. Die Bereiche auf dem Filter, die DNA-Sequenzen tragen, die zu der markierten DNA-Sonde komplementär sind, werden ihrerseits als Folge der Rehybridisierungsreaktion (erneute Doppelstrangbildungsreaktion) markiert. Die Bereiche des Filters, die eine solche Markierung zeigen, können dann gemäß der Art der verwendeten Markierung detektiert werden. Die Hybridisierungssonde wird im Allgemeinen durch molekulare Klonierung einer spezifischen DNA-Sequenz oder durch Synthetisieren eines synthetischen Oligonukleotids hergestellt.
– homologe Sequenz: eine Sequenz, die wenigstens 50%, vorzugsweise 60%, mehr bevorzugt 70%, am meisten bevorzugt 80% oder sogar 90% Sequenzidentität mit der jeweiligen Sequenz aufweist, wobei die Länge von Sequenzen, die hinsichtlich Nukleinsäuren verglichen werden sollen, im Allgemeinen wenigstens 120 Nukleotide, vorzugsweise 200 Nukleotide und mehr, bevorzugt 300 Nukleotide beträgt und die Länge von Sequenzen, die hinsichtlich Polypeptiden verglichen werden sollen, im allgemeinen wenigstens 40 Aminosäurereste, vorzugsweise 65 Aminosäurereste und mehr bevorzugt 100 Aminosäurereste beträgt. Alternativ bezieht sich eine homologe Sequenz auf eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer bestimmten Sequenz hybridisieren kann, und/oder eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, das im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das durch die jeweilige DNA-Sequenz kodierte Polypeptid aufweist, und/oder eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das durch die jeweilige DNA-Sequenz kodierte Polypeptid und/oder einer Aminosäuresequenz, bei welcher einige Aminosäurereste bezogen auf die Aminosäuresequenz des jeweiligen Polypeptids verändert worden sind, ohne die hauptsächlichen Eigenschaften des Polypeptids substantiell zu beeinflussen, kodiert;
– stringente Bedingungen beziehen sich auf Hybridisierungsbedingungen, die erlauben, dass eine Nukleinsäuresequenz mit einer jeweiligen Sequenz hybridisiert. Im Allgemeinen beziehen sich hochstringente Bedingungen auf die Hybridisierungsbedingungen, die erlauben, dass eine Nukleinsäuresequenz von wenigstens 50 Nukleotiden und vorzugsweise ungefähr 200 oder mehr Nukleotiden mit einer jeweiligen Sequenz bei ungefähr 65°C in einer Lösung, die ungefähr 1 M Salz umfasst, vorzugsweise 6 × SSC, oder einer jeglichen anderen Lösung, die eine vergleichbare Ionenstärke aufweist, und unter Waschen bei 65°C in einer ungefähr 0,1 M Salz oder weniger umfassenden Lösung, vorzugsweise 0,2 × SSC, oder einer jeglichen anderen Lösung, die eine vergleichbare Ionenstärke aufweist, hybridisiert. Diese Bedingungen erlauben die Detektion von Sequenzen, die ungefähr 90% Sequenzidentität oder mehr aufweisen. Im Allgemeinen beziehen sich weniger stringente Bedingungen auf die Hybridisierungsbedingungen, die erlauben, dass eine Nukleinsäuresequenz von wenigstens 50 Nukleotiden und vorzugsweise ungefähr 200 oder mehr Nukleotiden mit einer jeweiligen Sequenz bei ungefähr 45°C in einer Lösung, die ungefähr 1 M Salz umfasst, vorzugsweise 6 × SSC, oder einer jeglichen anderen Lösung, die eine vergleichbare Ionenstärke aufweist, und unter Waschen bei Raumtemperatur in einer ungefähr 1 M Salz umfassenden Lösung, vorzugsweise 6 × SSC, oder einer jeglichen anderen Lösung, die eine vergleichbare Ionenstärke aufweist, hybridisiert. Diese Bedingungen erlauben den Nachweis von Sequenzen, die bis zu 50% Sequenzidentität aufweisen. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein, diese Hybridisierungsbedingungen zu modifizieren, um Sequenzen zu identifizieren, deren Identität zwischen 50% und 90% variiert;
– Promotor: eine Transkriptionsregulationsregion strangaufwärts von der kodierenden Sequenz, welche die regulatorischen Sequenzen enthält, die für die Transkription der angrenzenden kodieren Sequenz erforderlich sind, und umfasst die 5'-nicht-translatierte Region oder die sogenannte Leader-Sequenz von mRNA;
– Terminator: eine Region strangabwärts der kodierenden Sequenz, die die Beendigung der Transkription dirigiert, auch als 3'-nicht-translatierte Region bezeichnet, die das Polyadenylierungssignal umfasst;
– Resistenzgen: eine Nukleinsäure, die eine kodierende Sequenz, wie in 5 gezeigt, oder einem Teil davon oder eine beliebige entsprechende oder homologe Sequenz aufweist;
– Nematode(n): Meloidogyne-Subsp., wie Meloidogyne incognita, M. arenaria oder M. Javanica, oder ein jeglicher anderer Genotyp, der nicht in der Lage ist, einen Wirt zu infizieren, der ein Resistenzgen gemäß der Erfindung aufweist, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf andere Wurzelknoten-Nematoden, wie M. hapla, Zysten-Nematoden, wie Heterodera-Subsp. oder Globodera-Subsp., oder andere Nematoden, wie Nacobbus-Subsp., Insekten, wie Kartoffel-Blattlaus, oder ein jegliches anderes Pflanzenpathogen oder ein jeglicher anderer Pflanzenschädling;
– Resistenzgenprodukt: ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz wie in 5 gezeigt oder einem Teil davon oder einer jeglichen homologen Aminosäuresequenz;
– R₀-Pflanze: primäre regenerierte Pflanze aus einem Transformationsexperiment, auch als transformierte Pflanze oder transgene Pflanze bezeichnet;
– R₁-Linie: die Nachkommenschaft einer durch Selbsten erhaltenen R₀-Pflanze;
– R₂-Linie: die Nachkommenschaft einer durch Selbsten erhaltenen R₁-Pflanze;
– R₁BC-Linie: die Nachkommenschaft einer Rückkreuzung zwischen einer R₁-Pflanze und einer Pflanze des Genotyps, der ursprünglich für das Transformationsexperiment verwendet worden war.

Im Rahmen der Erfindung sind wir in der Lage gewesen, das Meloidogyne incognita (Mi)-Resistenzgen zu identifizieren und zu isolieren. Das Gen wurde ausgehend von einem Tomaten-Genotyp, der gegen Meloidogyne incognita resistent ist, kloniert. Das isolierte Mi-Resistenzgen gemäß der Erfindung kann in eine empfindliche Wirtspflanze unter Verwendung einer Agrobacterium-vermittelten Transformation oder einer jeglichen anderen Transformationsmethode transferiert werden und ist daran beteiligt, der Wirtspflanze Resistenz gegen Pflanzenpathogene, speziell gegen Nematoden, zu verleihen. Die Wirtspflanze kann Tomate oder ein jeglicher anderer Genotyp sein, der durch das Pflanzenpathogen infiziert wird.
Die Erfindung stellt auch eine Nukleinsäuresequenz bereit, die das Mi-Resistenzgen, das in 5 gezeigt ist, umfasst.
Mit dem erfindungsgemäßen Mi-Resistenzgen verfügt man über ein wirksames Mittel zur Kontrolle von Pflanzenpathogenen und/oder -schädlingen, da das Gen verwendet werden kann, um empfindliche Pflanzengenotypen zu transformieren, wodurch genetisch transformierte Pflanzen hergestellt werden, die eine verringerte Empfindlichkeit aufweisen oder vorzugsweise resistent sind gegen ein Pflanzenpathogen oder einen Pflanzenschädling. Insbesondere weist eine Pflanze, die mit dem erfindungsgemäßen Mi-Resistenzgen genetisch transformiert ist, eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Wurzelknoten-Nematoden auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mi-Resistenzgen die in 5 angegebene kodierende Sequenz oder eine jegliche entsprechende oder homologe Sequenz oder cDNA-Sequenz, welcher eine Promotorregion vorangeht und welcher eine Terminatorregion folgt. Die Promotorregion sollte in Pflanzenzellen funktionsfähig sein und entspricht vorzugsweise der nativen Promotorregion des Mi-Resistenzgens. Es sollte sich jedoch verstehen, dass eine jegliche heterologe Promotorregion in Verbindung mit den kodierenden Sequenzen verwendet werden kann solange, als sie in Pflanzenzellen funktionsfähig ist. Es wird vorzugsweise ein konstitutiver Promotor verwendet, wie der CaMV-35S-Promotor oder T-DNA-Promotoren, die allesamt den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind. Darüber hinaus sollte eine geeignete Terminatorregion in Pflanzenzellen funktionsfähig sein, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt ist.
Zusätzlich betrifft die Erfindung das Mi-Resistenzgenprodukt, das durch das erfindungsgemäße Mi-Resistenzgen kodiert wird und das eine abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist, die in 5 und 7A angegeben ist oder die zu der abgeleiteten Aminosäuresequenz oder einem Teil davon homolog ist. Darüber hinaus kann das Mi-Resistenzgenprodukt oder ein verkürztes Polypeptid, wie in 7B angegeben, verwendet werden, um Antikörper dagegen zu erzeugen, welche Antikörper für die Detektion der Anwesenheit des Mi-Resistenzgenprodukts verwendet werden können.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung kann das Mi-Resistenzgen verwendet werden für die Gestaltung von Oligonukleotiden, die zu einem Strang der DNA-Sequenz, wie in 5 beschrieben, oder einem Teil davon komplementär sind, die als Hybridisierungssonden, wobei sie entsprechend markiert sind, um eine Detektion zu ermöglichen, für das Screenen von genomischen DNA- oder cDNA-Bibliotheken auf homologe Gene verwendet werden können. Homologe Sequenzen, die mit der Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren können und die ein Genprodukt kodieren, das daran beteiligt ist, einer Pflanze verringerte Empfindlichkeit oder Resistenz gegen ein Pflanzenpathogen, das die Pflanze normalerweise infiziert, zu verleihen, sind in dem Umfang der Erfindung mit enthalten.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung werden Oligonukleotide basierend auf der Sequenz des Mi-Resistenzgens gestaltet, so dass sie als Hybridisierungssonden bei einer Southern- Analyse verwendet werden können. Diese Sonden können als molekulare Marker verwendet werden, um Pflanzengenotypen, die das Resistenzgen enthalten, und Pflanzengenotypen, denen das Resistenzgen fehlt, zu unterscheiden. Eine solche Sonde kann als ein zusätzliches Werkzeug bei der Selektion verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Oligonukleotide basierend auf der Sequenz des Mi-Resistenzgens gestaltet, so dass sie als Primer in einer Amplifizierungsreaktion, wie einer Polymerasekettenreaktion (PCR), bei welcher die Bildung eines Amplifizierungsprodukts das Vorhandensein des Mi-Resistenzgens in einem bestimmten Pflanzen-Genotyp anzeigt, verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung dirigieren die Primer die Amplifizierung von polymorphen Fragmenten, sogenannten molekularen Markern, die mit dem Mi-Resistenzgen eng verknüpft sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Primer bei einer selektiven Restriktionsfragmentamplifizierung verwendet, um AFLP-Marker, die mit dem Mi-Resistenzgen eng verknüpft sind, zu identifizieren. Die Erfindung betrifft auch diagnostische Kits, welche erfindungsgemäße Oligonukleotide umfassen, für den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des Mi-Resistenzgens innerhalb eines Genotyps, der untersucht wird. Ein solcher diagnostischer Kit umgeht die Verwendung eines arbeitsaufwändigen Krankheitsassays, um auf Genotypen, die das Resistenzgen aufweisen oder nicht, zu screenen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung DNA-Konstrukte, welche eine DNA-Sequenz, welche der kodierenden Sequenz des Mi-Resistenzgens entspricht, und in Pflanzenzellen funktionsfähige regulatorische Sequenzen umfassen, wobei die DNA-Sequenz genomische DNA, cDNA, synthetische DNA oder DNA von irgendeiner anderen Herkunft sein kann. Die regulatorischen Sequenzen sind entweder homolog oder heterolog zu den kodierenden Sequenzen des Mi-Resistenzgens. Das DNA-Konstrukt umfasst vorzugsweise eine Nukleinsäure, deren Sequenz in 5 angegeben ist, oder einen Teil davon.
Die Erfindung betrifft auch DNA-Konstrukte, welche die regulatorischen Sequenzen umfassen, und mehr bevorzugt die Promotorregion des Mi-Resistenzgens in Verbindung mit einer Strukturgensequenz, die zu den regulatorischen Sequenzen heterolog ist.
Die Erfindung betrifft auch einen DNA-Vektor, welcher ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt umfasst. Geeignete Vektoren können Klonierungsvektoren, Transformationsvektoren, Expressionsvektoren u. s. w., die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, sein.
Des Weiteren sind Zellen, die einen Vektor beherbergen, welcher eine DNA-Sequenz, welche der Sequenz, wie in 5 beschrieben, oder einem Teil davon entspricht oder dazu homolog ist, umfasst, innerhalb des Umfangs der Erfindung. Darüber hinaus sind Zellen, die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten, innerhalb des Umfangs der Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine genetisch transformierte Pflanze erhalten, indem das Mi-Resistenzgen in das Genom der Pflanze, die gegenüber Nematoden empfindlich ist, unter Verwendung von Standardtransformationstechniken eingeführt wird, wobei die genetisch transformierte Pflanze gegen Nematoden resistent ist. Die Erfindung betrifft auch das rekombinante Pflanzengenom als solches, welches ein DNA-Konstrukt, wie oben definiert, umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Mi-Resistenzgen unter Verwendung von allgemein bekannten Transformationstechniken in ein heterologes System transferiert werden, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Melone, Tabak, Arabidopsis thaliana, Kartoffel, Zuckerrübe, Rüb- oder Rapssamen, Gurke, Paprika, Aubergine. Ein heterologes System bezieht sich auf eine Pflanzenspezies, die von der Pflanzenspezies, ausgehend von welcher das Resistenzgen isoliert worden ist, verschieden ist.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung entspricht das Mi-Resistenzgen dem Macrosiphum euphorbiae (Meu-1)-Resistenzgen und ist daran beteiligt, Pflanzen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden sind, Resistenz gegen Insekten und insbesondere gegen Blattläuse zu verleihen.
Die das Mi-Resistenzgen, wie im Rahmen der Erfindung bereitgestellt, umfassende DNA-Sequenz hat zahlreiche Anwendungen, von denen einige hier beschrieben werden, die aber den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
Die Erfindung wird weiter detailliert in Hinblick auf die Isolierung des in gegen Wurzelknoten-Nematoden resistenten Tomatenlinien vorhandenen Mi-Resistenzgens beschrieben. Für die Isolierung des Mi-Resistenzgens haben wir eine auf Kartierung basierende Klonierungs (Positionsklonierungs)-Strategie verwendet, die die folgenden Schritte umfasst:

(1) Identifizierung von molekularen Markern, die mit dem Mi-Resistenzgen verknüpft sind,
(2) Konstruktion einer genomischen Bibliothek von Hochmolekulargewichts-YACs,
(3) physische Kartierung der molekularen Marker auf den YAC-Klonen und YAC-Contig-Bildung;
(4) Konstruktion einer Cosmid-Bibliothek der YAC-Klone, welche die verknüpften molekularen Marker beherbergen,
(5) physische Feinkartierung und Cosmid-Contig-Bildung;
(6) genetische Charakterisierung von Tomatenmutanten, die gegenüber Wurzelknoten-Nematoden empfindlich sind,
(7) Transformation von empfindlichen Pflanzen mit den das Contig bildenden Cosmiden,
(8) Komplementationsanalyse.

Zur Identifizierung von molekularen Markern haben wir die selektive Restriktionsfragmentamplifizierungstechnik, welche nachfolgend auch als AFLP^TM-Technik bezeichnet wird, verwendet, die eine Untergruppe von DNA-Fragmenten aus einer komplexen Mischung von vielen DNA-Fragmenten heraus willkürlich amplifiziert und wobei die amplifizierten Fragmente Fingerprints erzeugen, die analysiert werden können. Allgemein wird die Gesamt-DNA von verschiedenen Genotypen der gleichen Pflanzenspezies der AFLP-Technik unterworfen und es werden die verschiedenen AFLP-Fingerprints, die von den verschiedenen Genotypen erhalten werden, verglichen. Fragmente, die bei einem Genotyp vorhanden sind und bei einem anderen Genotyp fehlen, sind polymorphe Fragmente und werden als AFLP-Marker bezeichnet. Bei den AFLP-Reaktionen wird die Selektivität erhalten, indem willkürlich gewählte selektive Nukleotide am 3'-Ende der PCR-Primer unmittelbar angrenzend an die Nukleotide der Restriktionsenzymstelle verwendet werden. Bei einem AFLP-Screening wird die zu untersuchende DNA verschiedenen Primerkombinationen unterworfen. Die Gesamtmenge von unterschiedlichen Primern, die verwendet werden können, wird durch die Anzahl von selektiven Nukleotiden, die an dem 3'-Ende hinzugefügt werden, bestimmt (4 Primer bei 1 selektivem Nukleotid, 16 Primer bei 2 selektiven Nukleotiden, 64 Primer bei 3 selektiven Nukleotiden). Wenn zwei unterschiedliche Restriktionsenzyme verwendet werden, dann gibt es die doppelte Menge von Primern. Jene Primer können in unterschiedlichen Kombinationen verwendet werden. Wenn alle möglichen Kombinationen in einem AFLP-Screening verwendet werden, dann sollten alle vorhandenen Fragmenten mit einer der Primerkombinationen amplifiziert worden sein (Zabeau und Vos, EP 0534858 ).
Zur Identifizierung von AFLP-Markern, die mit dem Mi-Resistenzgen verknüpft sind, wurden verschiedene Tomatenlinien einem AFLP-Screening unterworfen. In einem ersten Schritt wurden zwei Sätze von nahezu isogenen Linien für Nematodenresistenz gegenüber -empfindlichkeit durch AFLP-Fingerprinting analysiert unter Verwendung der folgenden Primer:
Die N's bezeichnen die variablen selektiven Nukleotide. Bei dem AFLP-Screening wurden alle 16 Primer, die für den PstI-Primer möglich sind, und alle 64 Primer, die für den MseI-Primer möglich sind, an den beiden Sätzen von nahezu isogenen Linien angewendet, was eine Ge samtmenge von 16 × 64 = 1024 getesteten Primerkombinationen ergab. Bei einer Analyse von allen AFLP-Fingerprints wurde eine Gesamtmenge von 30 Kandidaten für AFLP-Marker, die mit dem Mi-Resistenzgen verknüpft sind, identifiziert. Diese Marker-Kandidaten wurden nachfolgend an einer Gruppe von Nematoden-resistenten und Nematoden-empfindlichen Tomatenlinien zur Bestätigung und hinsichtlich des Abstands der Verknüpfung mit dem Mi-Genort getestet. Das Mi-Resistenzgen wurde durch Introgression in die 1944 aus Lycopersicon peruvianum kultivierte Tomate eingeführt. Moderne Nematoden-resistente Tomatenlinien sind zahlreichen Kreuzungszyklen unterworfen worden mit der Erwartung, dass sie in einer kleinen, durch Introgression erhaltenen Region aus Lycopersicon peruvianum mit dem Mi-Resistenzgen resultierten. Es wird erwartet, dass das Testen der AFLP-Marker-Kandidaten an diesen modernen Tomaten-Genotypen ein guter Test ist, um eine enge Verknüpfung mit dem Mi-Genort zu bestimmen. Mit den AFLP-Marker-Kandidaten wurde eine Gruppe von 7 resistenten und 11 empfindlichen Tomaten-Genotypen getestet. Es zeigte sich, dass insgesamt 20 AFLP-Marker in allen resistenten Linien vorhanden waren und in allen empfindlichen Linien fehlten, und diese werden als mit Mi verknüpfte AFLP-Marker bezeichnet.
Als nächstes wurden vier der AFLP-Marker an einer genomischen Bibliothek von Fragmenten mit hohem Molekulargewicht gescreent. Die Klonierung von sehr großen DNA-Abschnitten als große künstliche Chromosome in Hefe ist ein essentieller Schritt bei der Isolierung von Genen über Positionsklonierung geworden. Das Klonierungsvermögen des YAC-Vektors erlaubt die Isolierung von DNA-Fragmenten mit einer Länge von bis zu einer Million Basenpaaren. Die Tomatenlinie Lycopersicon esculentum E22, die hinsichtlich des Mi-Genorts homozygot ist, wurde als Ausgangs-DNA für die Konstruktion einer YAC-Bibliothek verwendet. Wir erhielten eine YAC-Bibliothek, welche 3840 Klone mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 520 kb, welche ungefähr 2,2 Genomäquivalente des Tomatengenoms repräsentieren, enthielt. Nach dem AFLP-Screening mit den mit Mi verknüpften AFLP-Markern: 1/1084, 1/1172 und 2/1256 wurden drei positive YAC-Klone erhalten. Nachfolgend wurde das Vorhandensein von allen mit Mi verknüpften AFLP-Markern in den 3 YAC-Klonen bestimmt. Es zeigte sich, dass alle Marker in einem oder mehreren der 3 YAC-Klone vorhanden waren, was eine erste Lagebestimmung der verschiedenen, mit Mi verknüpften AFLP-Marker erlaubte. Die AFLP-Daten zeigten, dass die 3 YAC-Klone ein überlappendes Contig von ungefähr 1,4 Mb bildeten (siehe 1).
Um die physische Größe des Mi-Genorts, welcher die mit Mi verknüpften AFLP-Marker umfasst und in den YAC-Klonen 1/1084, 1/1172 und/oder 2/1256 enthalten ist, zu bestimmen, wurde eine Großbereichsrestriktionskarte des YAC-Contigs konstruiert. Dies definierte einen den Mi-Genort umfassenden DNA-Abschnitt von ungefähr 700 kb, auf welchem alle mit Mi verknüpften AFLP-Marker lokalisiert waren (siehe 1).
Eine Größe von 700 kb ist für eine direkte Lokalisierung des Mi-Resistenzgens noch zu groß. Solche großen Inserts können nicht direkt durch Transformation in Pflanzenzellen eingeführt werden. Dementsprechend wurde eine Cosmid-Bibliothek des YAC 1/1172 enthaltenden Hefestamms konstruiert und es wurde eine Cosmid-Bibliothek des YAC 2/1256 enthaltenden Hefestamms konstruiert unter Verwendung von Cosmid-Vektoren, die für eine Agrobacterium -vermittelte Transformation geeignet sind. Die Größe dieses binären Cosmid-Vektors beträgt 29 kb und ist schematisch in 2 gezeigt. Das Klonierungsvermögen dieses binären Cosmid-Vektors unter Verwendung von lambda-Phagen-Verpackungsextrakt liegt im Bereich von 9 bis 24 kb. Es wurden zwei Banken von jeweils ungefähr 250000 Cosmid-Klonen ausgehend von anhand der Größe aufgetrennter Hefe-DNA erhalten. Die Cosmid-Banken wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung von markierten Restriktionsfragmenten der YACs als Sonden gescreent. Es wurden positive Cosmid-Klone identifiziert und zusätzlich wurden die Cosmide in sieben definierte Regionen, die die Mi-Region abdeckten, gruppiert.
In dem folgenden Schritt wurden Fingerprints von dem Satz von Cosmiden der sieben definierten Regionen unter Verwendung von Restriktionsfragmentamplifizierung erzeugt, um deren relative Reihenfolge zu bestimmen. Es konnte ein Cosmid-Contig, welches einen DNA-Abschnitt von ungefähr 700 kb umfasste, konstruiert werden. Nachfolgend wurde die Anwesenheit der mit Mi verknüpften AFLP-Marker in diesem Cosmid-Contig bestimmt. Es wurde eine physische Karte des das Mi-Resistenzgen umfassenden DNA-Abschnitts mit den Positionen der verschiedenen mit Mi verknüpften AFLP-Marker erhalten (siehe 3).
Insgesamt bildeten 96 überlappende Cosmide zusammen den das Mi-Resistenzgen umfassenden DNA-Abschnitt. Eine Komplementationsanalyse zur Identifizierung des Mi-Resistenzgens mit einem derart großen Satz von Cosmiden ist eine sehr arbeitsaufwändige Aufgabe. Dementsprechend wurde die Position des Mi-Resistenzgens auf dem Cosmid-Contig unter Verwendung von mutierten Tomatenlinien bestimmt. Diese mutierten Linien sind Mitglieder aus einer Familie, die von einem gemeinsamen Vorfahren abstammt und einen Wildtyp (Nematoden-resistenten)-Mi-Genotyp, aber einen mutierten Nematoden-empfindlichen Phänotyp enthielt. Bei einer Analyse mit dem Satz von mit Mi verknüpften AFLP-Markern an einer großen Anzahl von diesen mutierten Linien zeigte sich, dass drei mit Mi verknüpfte AFLP-Marker bei den meisten Mutanten fehlten. Diese AFLP-Marker zeigten dementsprechend eine gute Korrelation zwischen dem AFLP-Mi-Genotyp und dem Mi-Phänotyp im Gegensatz zu allen anderen 17 AFLP-Markern. Zwei von diesen AFLP-Markern, PM14 und PM25, grenzten aneinander an und es wurde angenommen, dass die Region um diese Marker herum die wahrscheinlichste Position für das Mi-Resistenzgen war. Ein Satz von 6 überlappenden Cosmiden, die einen DNA-Abschnitt von un gefähr 50 kb um die AFLP-Marker PM14 und PM25 herum definierten, wurde für eine Komplementationsanalyse ausgewählt (siehe 4).
Der abschließende Schritt bei der Identifizierung des Mi-Resistenzgens über Positionsklonierung ist die Komplementation des entsprechenden empfindlichen Phänotyps. Die 6 Cosmide aus der Mi-Kandidatenregion wurden in Agrobacterium tumefaciens durch konjugativen Transfer in einer Drei-Eltern-Kreuzung eingeführt. Die Anwesenheit des Cosmids in den A. tumefaciens-Stämmen wurde bestimmt, indem verschiedene Restriktionsenzymmuster wie auch DNA-Fingerprints aus den A. tumefaciens-Stämmen mit dem E. coli-Stamm, der das Cosmid enthielt, verglichen wurden. Nur jene A. tumefaciens-Kulturen, die ein Cosmid mit dem gleichen DNA-Muster wie die entsprechende E. coli-Kultur beherbergten, wurden verwendet, um eine empfindliche Tomatenlinie zu transformieren. Eine empfindliche Tomatenlinie wurde mit den Cosmiden Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 und Mi-14 unter Verwendung von Standardtransformationsmethoden transformiert.
Wurzeln von in vitro-kultivierten, transformierten R₀-Pflanzen wurden auf Krankheitssymptome untersucht, um Cosmide mit dem Resistenzgen zu identifizieren. Wurzelexplantate wurden auf verfestigtes Medium in Petrischalen transferiert und mit zehn Gallen aus einer axenischen Nematodenkultur der Wurzelknoten-Nematode Meloidogyne incognita inokuliert. Krankheitssymptome wurden sechs Wochen nach der Inokulation bestimmt. Eine transgene Pflanze wird als resistent angesehen, wenn keine Gallen oder eine Galle an ihrer Wurzelkultur sichtbar ist. Eine transgene Pflanze wird als empfindlich angesehen, wenn wenigstens zwei Gallen an ihrer Wurzelkultur induziert worden sind. Die Beobachtungen des in vitro-Krankheitsassays enthüllten, dass 2 Cosmide in der Lage waren, den empfindlichen Phänotyp zu komplementieren. Die Anwesenheit des AFLP-Markers PM14 in den resistenten R₀-Pflanzen zeigte, dass das in den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 vorhandene genomische Insert auch in den R₀-Pflanzen vorhanden ist und daran beteiligt ist, den R₀-Pflanzen Resistenz gegen Meloidogyne incognita zu verleihen.
Die primären regenerierten Pflanzen (R₀-Pflanzen) der Transformationsexperimente wurden im Gewächshaus für einen Samenansatz kultiviert, um R₁-Linien zu erhalten, die auf Krankheitssymptome untersucht wurden. Der Krankheitsassay wird an Sämlingen ausgeführt. Dafür werden Samen ausgesät oder kleine bewurzelte Pflänzchen werden in mit Meloidogyne incognita infizierte Erde transferiert und Krankheitssymptome werden 4 bis 8 Wochen nach der Inokulation bestimmt. Pflanzen werden als resistent angesehen, wenn drei oder weniger Gallen an den Wurzeln sichtbar sind. Pflanzen werden als empfindlich angesehen, wenn mehr als drei Gallen an den Wurzeln gebildet werden. Die Beobachtungen des in vivo-Krankheitsassays enthüllten, dass die resistenten R₀-Pflanzen Cosmid Mi-11-Transformanten entsprechen.
Um die stabile Integration des Mi-Resistenzgens in das Genom der transgenen R₀-Pflanzen zu bestätigen, wurden resistente Pflanzen der R₁-Linien einem Selbsten unterzogen und im Gewächshaus für einen Samenansatz kultiviert, um R₂-Linien zu erhalten. Sämlinge der R₂-Linien wurden einem in vivo-Nematoden-Krankheitsassay unterworfen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten die stabile Vererbung des Mi-Resistenzgens.
Schließlich wurden die Inserts in den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 weiter charakterisiert. Eine Sequenzierungsanalyse enthüllte ein großes offenes Leseraster (ORF2) von 3621 Nukleotiden. Die DNA-Sequenz ist in 5 aufgelistet.
Die das Mi-Resistenzgen umfassende DNA-Sequenz wurde des weiteren Transkriptkartierungsuntersuchungen unterworfen, um die Existenz von Intronsequenzen zu bestimmen. Diese Transkriptkartierungsuntersuchungen wurden gemäß allgemein bekannten Methoden ausgeführt, in welchen genomische DNA-Sequenzen mit cDNA-Sequenzen verglichen werden. Der Vergleich von cDNA-Sequenzen und genomischen Sequenzen enthüllte die Existenz von zwei Intronsequenzen in dem Mi-Resistenzgen. Ein Intron von 1306 Nukleotiden befindet sich von Nukleotidposition 1936 bis 3241 und ein zweites Intron von 75 Nukleotiden befindet sich von Nukleotidposition 3305 bis 3379, wie in 5 gezeigt. Die Position der Transkriptionsstartstelle wird bei oder strangaufwärts von Nukleotid 1880 postuliert. Das erste ATG-Startcodon befindet sich bei Nukleotidposition 3263, welche 52 Nukleotide strangaufwärts von dem zweiten Intron liegt, was ein großes offenes Leseraster (ORF1), welches ein Polypeptid von 1257 Aminosäuren (7A) kodiert, ergibt.
Homologierecherchen haben gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide zu der LRR-Klasse von Pflanzenresistenzproteinen (Staskawicz et al., 1995, Science, 268, 661–667) gehören. Zusätzlich kann das Protein in vier Regionen, die A bis D bezeichnet werden, unterteilt werden: Region A umfasst eine hohe Menge an Leucinresten; Region B umfasst ein Nukleotidbindungsstellen-Motiv; Region C ist die LRR-Region, welche 13 Wiederholungen mit der folgenden Consensus-Sequenz a-a-NL-L-a-a-a/S- | (Jones und Jones, 1997, Advances in Botanical Research, 24, 89–167) umfasst, und Region D enthüllt keinerlei Homologie zu irgendeinem bekannten Protein.
Zur Identifizierung und Isolierung von homologen Sequenzen, die in den Umfang der Erfindung fallen, wurden genomische und cDNA-Bibliotheken mit der kodierenden Sequenz des Mi-Resistenzgens als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen gescreent. Es wurden positive Klone isoliert und für eine Komplementationsanalyse verwendet.
Southern-Blot-Hybridisierungen an dem YAC-Contig sind mit einem internen PstI-Fragment der kodierenden Sequenz des Mi-Resistenzgens ausgeführt worden. Es konnten drei zusätzliche homologe Regionen identifiziert werden: zwei in YAC 1/1172 und eine in YAC 1/1084. Jede Region umfasst 2 bis 3 Mi-Homologe, was die Tatsache zeigt, dass die Mi-Genfamilie aus ungefähr 10 bis 12 Mitgliedern gebildet wird.
Überraschenderweise enthüllten Blattlaus-Krankheitsassays, dass die R₀-Pflanzen, die mit dem Cosmid Mi-11 transformiert waren, gegen Meloidogyne incognita resistent waren und ebenso auch gegen Macrosiphum euphorbiae resistent waren, was zeigt, dass das in dem Cosmid Mi-11 vorhandene Genominsert daran beteiligt ist, den R₀-Pflanzen Resistenz gegen Nematoden zu verleihen, und ebenso auch daran beteiligt ist, den R₀-Pflanzen Resistenz gegen Blattläuse zu verleihen. Insbesondere weist eine Pflanze, die mit dem erfindungsgemäßen Resistenzgen transformiert ist, zumindest eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber einem oder mehreren Pathogenen, insbesondere gegenüber Wurzelknoten-Nematoden und/oder Blattläusen, auf.
Um die Vererbung der Blattlausresistenz zu bestätigen, wurden (i) die zuvor erhaltenen R₁-Tomatenlinien, die von Nematoden-resistenten Cosmid Mi-11-Transformanten abgeleitet worden waren, (ii) die R₂-Linien, die von mittels Selbsten erhaltenen Nematoden-resistenten R₁-Pflanzen abgeleitet worden waren, und (iii) R₁BC-Linien, die ausgehend von Nematodenresistenten R₁-Pflanzen, die mit der empfindlichen Tomatenlinie 52201 rückgekreuzt worden sind, erhalten worden sind, auch auf Resistenz gegen M. euphorbiae getestet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten die Vererbung der Blattlausresistenz.
Das Cosmid Mi-11 wurde für die Transformation von Nematoden-empfindlichen Genotypen von Tabak und Kartoffel gemäß allgemein bekannten Transformationsmethoden verwendet. Wurzeln von in vitro kultivierten R₀-Pflanzen von Tabak und Kartoffel wurden auf Krankheitssymptome getestet, wie hier zuvor beschrieben. Die Beobachtungen des Krankheitsassays an den Wurzelkulturen der transformierten Pflanzen zeigten, dass das Cosmid daran beteiligt ist, den transformierten Pflanzen eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Nematoden zu verleihen. Das erfindungsgemäße Resistenzgen hat die Wirkung, die Empfindlichkeit einer heterologen Pflanzenspezies gegenüber Nematoden, vorzugsweise gegenüber Meloidogyne-Subsp., speziell Meloidogyne incognita, zu verringern.
Darüber hinaus wurden Tabak-Transformanten auch auf Blattlausresistenz getestet und es konnten resistente R₀-Pflanzen identifiziert werden.
Das erfindungsgemäße Resistenzgen weist eine doppelte Funktion auf und hat eine Wirkung in heterologen Systemen.
Das Cosmid Mi-11 ist am 05. August 1996 als Plasmid pKGMi-11 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, unter der Hinterlegungsnummer CBS 822.96 hinterlegt worden.
Das Cosmid Mi-18 ist am 05. August 1996 als Plasmid pKGMi-18 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, unter der Hinterlegungsnummer CBS 821.96 hinterlegt worden.
Die folgenden Beispiele werden die Erfindung weiter veranschaulichen, die nichtsdestoweniger nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: KRANKHEITSASSAY
Eine axenische Kultur der Wurzelknoten-Nematode Meloidogyne incognita wird auf sterilen Wurzeln des Tomatenkultivars Moneymaker gehalten. Die Wurzelkulturen werden auf verfestigtem B5-Medium (Gamborg et al., 1968, Experimental Cell Research 50: 151–158) mit 2% Saccharose und ohne Hormone kultiviert.
Von in vitro kultivierten transgenen Tomatenpflanzen abgeleitete Wurzelexplantate (1–5 cm) werden auf das oben erwähnte verfestigte B5-Medium transferiert, um Wurzelkulturen zu beginnen. Zur gleichen Zeit wird jedes Wurzelexplantat mit zehn Gallen aus der axenischen Nematodenkultur inokuliert. Die Gallen werden einige Zentimeter von dem Wurzelexplantat entfernt platziert. Die Petrischalen mit den Wurzeln und Gallen werden im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Nach vier bis sechs Wochen wird der Infektionsgrad bestimmt, indem die Anzahl von Gallen, die sich an den Wurzelkulturen gebildet haben, gezählt wird.
Die Auswertung auf Resistenz/Empfindlichkeit gegenüber M. incognita erfolgt, wie folgt: Eine transgene Pflanze wird als resistent angesehen, wenn keine oder weniger als zwei Gallen an ihrer Wurzelkultur sichtbar sind. Eine transgene Pflanze wird als empfindlich angesehen, wenn wenigstens zwei Gallen an ihrer Wurzelkultur induziert worden sind.
BEISPIEL 2: IDENTIFIZIERUNG VON AFLP-MARKERN, DIE MIT EINEM DAS Mi-RESISTENZGEN UMFASSENDEN DNA-ABSCHNITT VERKNÜPFT SIND
Tomatenlinien (Lycopersicon esculentum)
Es wurden insgesamt 9 gegen Meloidogyne incognita resistente Tomatenlinien und 13 gegenüber M. incognita empfindliche Tomatenlinien verwendet, um AFLP-Marker zu identifizieren. Zu Beginn wurde das AFLP-Screening an zwei Sätzen von nahezu isogenen Linien 83M-R (resistent) und 83M-S (empfindlich) und Motelle (resistent) und Mobox (empfindlich) ausgeführt. Die aus diesem ersten Screening resultierenden Marker-Kandidaten wurden durch ein zweites Screening an 7 M. incognita-resistenten und 11 M. incognita empfindlichen Linien bestätigt.
Zwei Sätze von nahezu isogenen Linien
Die 7 M. incognita-resistenten Linien und die 11 M. incognita-empfindlichen Linien für die Bestätigung
Isolierung und Modifikation der DNA
Aus den 22 oben beschriebenen Linien wurde aus jungen Blättern Tomaten-Gesamt-DNA isoliert, wie von Bernatzki und Tanksley beschrieben (Theor. Appl. Genet. 72, 314–321). Die typische Ausbeute betrug 50–100 μg DNA pro Gramm frisches Blattmaterial. Matrizen-DNA für die AFLP-Analyse mit der Enzymkombination PstI-MseI wurde hergestellt, wie von Zabeau und Vos beschrieben (Europäische Patentanmeldung, EP 0534858 ), und wird nachfolgend kurz beschrieben:
0,5 μg Tomaten-DNA wurde 1 h bei 37°C mit 5 Einheiten PstI und 5 Einheiten MseI in 40 μl 10 mM Tris·HAc, pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT, 50 ng/μl BSA, inkubiert. Als nächstes wurden 10 μl einer 5 pMol PstI-Adaptoren, 50 pMol MseI-Adaptoren, 1 Einheit T4-DNA-Ligase, 1 mM ATP in 10 mM Tris·HAc, pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 5 mM DTT, 50 ng/μl BSA enthaltenden Lösung zugesetzt und die Inkubation wurde 3 h bei 37°C fortgeführt. Die Adaptoren sind nachfolgend gezeigt:
Die Struktur des PstI-Adaptors war:
Die Struktur des MseI-Adaptors war:
Die Adaptoren wurden hergestellt, indem äquimolare Mengen von beiden Strängen hinzugefügt wurden; die Adaptoren waren nicht phosphoryliert. Nach der Ligation wurde die Reaktionsmischung auf 500 μl mit 10 mM Tris·HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0, verdünnt und bei –20°C aufbewahrt. Die verdünnte Reaktionsmischung wird des Weiteren als Matrizen-DNA bezeichnet.
AFLP-Reaktionen
Die für das AFLP-Screening verwendeten Primer sind nachfolgend gezeigt:
Die N's in den Primern zeigen an, dass dieser Teil der Primer variabel war. Bei dem AFLP-Screening wurden für den PstI-Primer alle 16 möglichen Primer verwendet und für den MseI-Primer wurden alle 64 möglichen Primer verwendet. Dies ergab insgesamt 16 × 64 Kombinationen von PstI- und MseI-Primern, d. h. 1024 Primerkombinationen. Alle 1024 Primerkombinationen wurden in dem AFLP-Screening auf mit Mi verknüpfte AFLP-Marker verwendet. Die AFLP-Reaktionen wurden auf die folgende Weise ausgeführt:
AFLP-Reaktionen setzten einen radioaktiv markierten PstI-Primer und einen nicht-markierten MseI-Primer ein. Die PstI-Primer wurden unter Verwendung von (γ-³³P)ATP und T4-Polynukleotidkinase endmarkiert. Die Markierungsreaktionen wurden in 50 μl 25 mM Tris·HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 mM Spermidin·3HCl unter Verwendung von 500 ng Oligonukleotidprimer, 100 μCi (γ-³³P)ATP und 10 Einheiten T4-Polynukeotidkinase ausgeführt. Für die AFLP-Analyse wurden 20 μl Reaktionsmischung hergestellt, welche 5 ng markierten PstI-Primer (0,5 μl von der Markierungsreaktionsmischung), 30 ng MseI-Primer, 5 μl Matrizen-DNA, 0,4 Einheiten Taq-Polymerase, 10 mM Tris·HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,2 mM von allen 4 dNTPs enthielten. Die AFLP-Reaktionen wurden ausgeführt unter Verwendung des folgenden Zyklusprofils: ein 30-sekündiger DNA-Denaturierungsschritt bei 94°C, ein 30-sekündiger Hybridisierungsschritt (siehe unten) und ein einminütiger Verlängerungsschritt bei 72°C. Die Hybridisierungstemperatur in dem ersten Zyklus betrug 65°C, wurde nachfolgend für die nächsten 12 Zyklen bei jedem Zyklus um 0,7°C verringert und wurde für die übrigen 23 Zyklen bei 56°C fortgesetzt. Alle Amplifizierungsreaktionen wurden in einem PE-9600-Thermocycler-Gerät (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA) ausgeführt.
Gelanalyse der AFLP-Reaktionsprodukte
Nach der Amplifizierung wurden Reaktionsprodukte mit einem gleichen Volumen (20 μl) Formamid-Farbstoff (98% Formamid, 10 mM EDTA, pH 8,0, und Bromphenolblau und Xylencyanol als Verfolgungsfarbstoffe) gemischt. Die resultierenden Mischungen wurden 3 min bei 90°C erwärmt und dann auf Eis schnell abgekühlt. 2 μl von jeder Probe wurden auf ein 5%-iges denaturierendes (Sequenzierungs)-Polyacrylamidgel aufgeladen (Maxam und Gilbert, Method in Enzymology 65, 499–560). Die Gelmatrix wurde hergestellt unter Verwendung von 5% Acrylamid, 0,25% Methylenbisacrylamid, 7,5 M Harnstoff in 50 mM Tris/50 mM Borsäure/1 mM EDTA. Zu 100 ml Gellösung wurden 500 μl 10% APS und 100 μl TEMED hinzugesetzt und die Gele wurden unter Verwendung eines SequiGen-38 × 50 cm-Gelapparats (Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) gegossen. Es wurden Haizahn-Kämme verwendet, um auf den SequiGen- Geleinheiten 97 Bahnen zu erhalten. 100 mM Tris/100 mM Borsäure/2 mM EDTA wurde als Laufpuffer verwendet. Die Elektrophorese wurde bei konstanter Leistung, 110 Watt, für ungefähr 2 Stunden ausgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele 30 min in 10% Essigsäure fixiert, auf den Glasplatten getrocknet und Fuji-Phospho-Image-Folien 16 h ausgesetzt. Fingerprint-Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000-Phospho-Image-Analysensystems (Fuji Photo Film Company Ltd., Japan) sichtbar gemacht.
AFLP-Screening auf verknüpfte Marker
Ein AFLP-Screening wurde unter Verwendung von allen möglichen 1024 PstI-MseI-Primerkombinationen an den beiden Sätzen von nahezu isogenen Linien ausgeführt. Das Ziel war, AFLP-Marker zu identifizieren, die in beiden resistenten Linien vorhanden waren und in beiden empfindlichen Linien fehlten. AFLP-Gele enthielten die AFLP-Fingerprints von 24 Primerkombinationen der 4 isogenen Linien, was eine Gesamtmenge von 43 Gelen ergab. Es wurde eine Gesamtmenge von 30 AFLP-Markern, die in beiden resistenten Linien vorhanden waren und in beiden empfindlichen Linien fehlten, identifiziert. Diese Marker werden als mit Mi verknüpfte AFLP-Marker-Kandidaten bezeichnet.
Als nächstes wurden AFLP-Reaktionen ausgeführt, um die Anwesenheit der 30 Marker-Kandidaten auf den 7 resistenten und 11 empfindlichen Tomatenlinien zu bestimmen. Es zeigte sich, dass von den 30 Marker-Kandidaten 20 Marker in den 7 resistenten Linien vorhanden waren und in den 11 empfindlichen Linien fehlten. Diese 20 Marker wurden in weiteren Untersuchungen verwendet, um das Mi-Resistenzgen zu kartieren. Die Primerkombinationen, die benötigt wurden, um die 20 PstI-MseI-Marker zu identifizieren, sind in Tabelle 1 aufgeführt. In der Spalte mit den Primerkombinationen bezieht sich „PstI-" auf die Sequenz 5'-GACTGCGTACATGCAG-3' und bezieht sich „MseI-" auf die Sequenz 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'. Beispielsweise kann der Marker PM14 identifiziert werden unter Verwendung des PstI-Primers mit der folgenden Sequenz: 5'-GACTGCGTACATGCAGGA-3' und des MseI-Primers mit der folgenden Sequenz: 5'-GATGAGTCCTGAGTAATCT-3'.
TABELLE 1
BEISPIEL 3: KONSTRUKTION UND SCREENING EINER TOMATEN-YAC-BIBLIOTHEK
Material
Die Tomatenlinie Lycopersicon esculentum E22 (Enza Zaden), die für den Mi-Genort homozygot ist, wurde als Ausgangs-DNA für die Konstruktion einer YAC-Bibliothek verwendet. Aus den Blättern von in vitro-Schößlingen, die zwei bis drei Wochen alt waren, wurden Protoplasten isoliert, wie von Van Daelen et al. (Plant Mol. Biol. 12, 341–352) beschrieben.
Lebensfähige Protoplasten (Konzentration 50 Millionen Protoplasten pro Milliliter) wurden gesammelt und mit einem gleichen Volumen Agarose (1%, Seaplaque, FMC Bioproducts, Rock land, Maine, USA) gemischt, um einen Pfropfen zu bilden. Die in die Pfropfen eingebetteten Protoplasten wurden mit einer Lysis-Mischung (0,5 M EDTA, 1% N-Laurylsarcosinat und 1 mg/ml Proteinase K, pH = 8,0) lysiert. Nach der Lyse wurden die Pfropfen bei 4°C in Aufbewahrungspuffer (frische Lysis-Mischung) bis zur Verwendung aufbewahrt. Es wurden ungefähr 3 Millionen Protoplasten pro Pfropfen, um ungefähr 4,5 μg chromosomale DNA zu erhalten, für die weiteren Untersuchungen verwendet. Das Plasmid pYAC4, welches eine einmalig vorkommende EcoRI-Klonierungsstelle enthält, wurde als Klonierungsvektor verwendet und der Hefestamm AB1380 wurde als Wirt verwendet (Burke et al., Science 236, 806-812).
YAC-Bibliothek-Konstruktion
Isolierung von DNA mit hohem Molekulargewicht, partieller Verdau mit EcoRI in Gegenwart von EcoRI-Methylase, Ligation von Vektorarmen an genomische DNA, Größenselektion durch Pulsfeldgelelektrophorese und Transformation des Hefe-Wirts erfolgten, wie von Burke et al., (Science 236, 806–812) und Larin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4123–4127) beschrieben.
Alle Standardmanipulationen wurden ausgeführt, wie in Molecular Cloning: a laboratory manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben.
Es wurden schließlich 3840 Klone mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 520 kb, was 2,2 Genomäquivalenten entspricht, erhalten und die individuellen Klone wurden in 40 Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, welche 75 μl YPD-Lösung (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Dextrose) enthielten, aufbewahrt.
Screening der YAC-Bibliothek
Um die Anzahl von gehandhabten Proben zu verringern, wurden die Zellen von einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gepoolt (ein Plattenpool) und für eine DNA-Isolierung verwendet, wie von Ross et al. beschrieben (Nucleic Acids Res., 19, 6053). Die 2,2-Genomäquivalenten entsprechende Tomaten-YAC-Bibliothek besteht aus den Vertiefungen von 40 Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und als Ergebnis wurde die DNA der 40 Plattenpools mit den AFLP-Markern PM10, PM13, PM21 und PM25 unter Verwendung des AFLP-Protokolls, wie in Beispiel 2 beschrieben, gescreent. PM10, PM13, PM21 und PM25 wurden ausgewählt, um die YAC-Plattenpools zu screenen, da diese Marker mit den Hintergrundbanden des Hefestamms AB1380 nicht interferieren. Mit diesen vier AFLP-Markern wurden drei positive Plattenpools aus den 40 identifiziert, wie in Tabelle 2 gezeigt. Nachfolgend wurde ein zweites Screening der 96 individuellen YAC-Klone von jeder Platte mit den vier AFLP-Markern (PM10, PM13, PM21 und PM25) eingesetzt, um die korrekte Adresse der YAC-Klone zu finden. Es wurden drei individuel le YAC-Klone identifiziert, die als 1/1084, 1/1172 und 2/1256 bezeichnet wurden (Tabelle 2). Nachfolgend wurden die drei individuellen YAC-Klone mit den übrigen AFLP-Markern analysiert. Alle der identifizierten Marker PM02 bis PM29 waren auf einem oder mehreren dieser drei YAC-Klone vorhanden (Tabelle 3). Die Größe des YAC-Klons wurde durch Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)-Analyse unter Verwendung eines „contour-clamped" homogenen elektrischen Felds („contour-clamped homogeneous electric field"; CHEF; Chu et al., Science, 235, 1582–1585) bestimmt und erwies sich als 470 kb (1/1084), 570 kb (1/1172) bzw. 500 kb (2/1256).
TABELLE 2
TABELLE 3
BEISPIEL 4: KONSTRUKTION EINER PHYSISCHEN GROSSBEREICHS-KARTE DES Mi-YAC-CONTIGS UND LOKALISIERUNG DER AFLP-MARKER
Die 3 YAC-Klone 1/1172, 2/1256 und 1/1084 wurde einem partiellen Verdau mit steigenden Konzentrationen der Restriktionsenzyme SfiI und BssHII unterworfen. Die Proben wurden durch PFGE aufgetrennt, auf eine Gene Screen Plus-Membran (DuPont NEN, Boston, MA, USA) transferiert und durch Hybridisierung unter Verwendung von am Ende angrenzenden Sequenzsonden gemäß dem Protokoll für die indirekte Endmarkierungskartierung, wie von Burke et al. beschrieben (Science 236, 806–812), getestet. Es konnte eine physische Karte von YAC 1/1172, 2/1256 und 1/1084 für die Enzyme SfiI und BssHII konstruiert werden, wie in 1 gezeigt. Die Überlappung zwischen den verschiedenen YAC-Klonen wurde durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung der erhaltenen Restriktionsfragmente als Sonde bei Verdau der drei YAC-Klone bestimmt. Es konnte ein YAC-Contig mit einer Größe von 1,4 Mb konstruiert werden. Um die YAC-Fragmente zu isolieren, wurden die Verdaue einer PFGE unterzogen. Ein Verdau von YAC 1/1172 mit SfiI führte zu zwei Fragmenten (200 kb und 370 kb). En Verdau von YAC 2/1256 mit BssHII führte zu vier Fragmenten (40 kb, 90 kb, 110 kb und 260 kb), wohingegen ein Verdau von YAC 1/1084 mit BssHII zwei Fragmente mit einer Größe von 70 und 400 kb lieferte. Als Ergebnis konnte das 1,4 Mb-YAC-Contig in 8 Regionen entsprechend den ausgehend von den drei YAC-Klonen erhaltenen 8 Restriktionsfragmenten, welche die vollständige Mi-Region und angrenzende Sequenzen abdeckten, aufgeteilt werden.
Um die verschiedenen AFLP-Marker innerhalb dieser 8 Regionen auf der physischen Karte zu lokalisieren, wurden die AFLP-Marker als Hybridisierungssonden an den partiellen und vollständigen SfiI- und BssHII-Verdauen der YAC-Klone 1/1172, 2/1256 und 1/1084 verwendet. Dafür wurde jeder AFLP-Marker aus dem getrockneten Gel ausgeschnitten und mittels Diffusion in einen 0,5 M Ammoniumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM EDTA (pH = 8,0), 0,1% SDS enthaltenden Puffer eluiert, mit den entsprechenden unmarkierten AFLP-Primern reamplifiziert und nachfolgend gemäß der Random-Primer-Methode von Feinberg und Vogelstein (Anal. Biochem. 132, 6–10) mit ³²P markiert. Jeder AFLP-Marker konnte einer oder mehreren der acht Regionen zugeordnet werden, wie in Tabelle 4 und 1 erläutert.
TABELLE 4
BEISPIEL 5: KONSTRUKTION EINER COSMID-BIBLIOTHEK DER YAC-KLONE 1/1172 UND 2/1256
Material
Der binäre Cosmidvektor pJJ04541 ist ein Derivat von pJJ1881 (Jones et al., Transgenic Research 1, 285–297) und basiert auf dem Plasmid pRK290, welches das Tetracyclinresistenzgen für eine Selektion in Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens enthält. In die einmalig vorkommende EcoRI-Stelle von pRK290 T-DNA tragende Sequenzen (LB, Wiederholungssequenz am linken Rand; RB bezeichnet die Wiederholungssequenz am rechten Rand), die

– die cos-Stelle des Bakteriophagen lambda,
– das Neomycintransferasegen (Beck et al., Gene 19, 327–336), dessen Expression durch die Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotorsequenz (Odell et al., Mol. Gen. Genet. 223, 369–378) gesteuert wird, und
– die pBluescript (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA)-Polylinkersequenz flankieren.

Die Größe von pJJ04541 beträgt 29 kb und ist schematisch in 2 gezeigt. Das Klonierungsvermögen dieses binären Cosmidvektors unter Verwendung von Phage lambda-Verpackungsextrakten liegt im Bereich von 9 bis 24 kb.
Bibliothekskonstruktion
Gesamt-DNA des Saccharomyces cerevisiae-Stamms AB1380, welcher YAC 1/1172 enthält, und Gesamt-DNA des Saccharomyces cerevisiae-Stamms AB1380, welcher YAC 2/1256 enthält, wurde unter Verwendung von Zymolyase zur Herstellung von Protoplasten gemäß Green und Olsen (Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 1213–1217) isoliert.
Ein Aliquot von beiden DNAs wurde mittels PFGE analysiert. Es zeigte sich, dass beide DNA-Isolate eine Größe von ≥ 100 kb haben.
Ungefähr 15 μg von jeder DNA wurden mit Sau3A partiell verdaut, wodurch Moleküle mit einer durchschnittlichen Größe von 15–25 kb erzeugt wurden. Nachfolgend wurden die Proben 22 h bei 20°C und 22000 Upm in einem Beckman-SW41-Rotor durch einen 10–35%-igen Sucrosegradienten zentrifugiert. 0,5 ml-Fraktionen wurden unter Verwendung einer Nadel, die durch den Boden des Zentrifugenröhrchens gestochen wurde, gesammelt. Ein Aliquot von diesen Fraktionen wurde auf einem 0,7%-igen Agarosegel analysiert. Die DNA-Moleküle mit einer Größe von ca. 20 kb enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und durch Ethanolpräzipitation aufkonzentriert.
Nachfolgend wurden die kohäsiven Enden partiell mit dATP und dGTP unter Verwendung der partiellen Auffüllstrategie von 5'-DNA-Überhängen erzeugt durch Typ II-Restriktionsendonuklease partiell aufgefüllt, wie von Korch (Nucleic Acids Res. 15, 3199–3220) und Loftus et al. (Biotechniques 12, 172–176) beschrieben.
Der binäre Cosmidvektor pJJ04541 wurde mit XhoI vollständig verdaut und das lineare Fragment wurde mit dTTP und dCTP partiell aufgefüllt, wie von Korch beschrieben (Nucleic Acids Res. 15, 3199–3220).
Die 20 kb-Fragmente wurden an den Cosmidvektor ligiert und damit der E. coli-Stamm XL1-Blue MR (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) unter Verwendung von „Phage lambda-Gigapack II XL"-Verpackungsextrakten (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) transduziert, wie von den Herstellern empfohlen. Die Selektion erfolgte auf LB (1% Bactotrypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt und 1% NaCl, pH 7,5)-Agarplatten, welche 10 mg/l Tetracyclin enthielten. Aus 2–3 μg hinsichtlich der Größe aufgetrennter Hefe-DNA der YAC-Klone 1/1172 bzw. 2/1256 wurden zwei Banken von ungefähr 250000 Cosmid-Klonen pro Bank hergestellt.
Nachfolgend wurden diese Transformanten in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, 100 μl LB-Medium, enthaltend 10 mg/l Tetracyclin) aufbewahrt. Replikate des 96 Vertiefungen-Gitters von Cosmid-Klonen in Mikrotiterplatten wurden auf Gene Screen Plus-Membranfilter (NEN Dupont) gestempelt und man ließ sie auf Medium zu Kolonien wachsen. Eine Koloniehybridisierung, wie von Sambrook et al. beschrieben (in: Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), unter Verwendung der ³²P-markierten YAC-Klone 1/1172 und 2/1256 enthüllte positive Cosmide. Ausgehend von ungefähr 10000 Kolonien von YAC 1/1172 wurden ungefähr 200 positive Cosmid-Klone identifiziert. Ausgehend von ungefähr 20000 Kolonien von YAC 2/1256 wurden 300 positive Cosmid-Klone identifiziert.
BEISPIEL 6: FEINKARTIERUNG DES Mi-RESISTENZGEN-ABSCHNITTS UND LOKALISIERUNG DER AFLP-MARKER
Unterteilen der Cosmide in definierte Regionen
Um die Cosmide in sieben definierte Regionen zu unterteilen, wurden die 200 positiven Cosmid-Klone von YAC 1/1172 und die 300 positiven Cosmid-Klone von YAC 2/1256 mit 7 der 8 Restriktionsfragmente (YAC-Fragmente) hybridisiert, wie in Beispiel 4 erläutert (siehe Tabelle 4 und 1). Es wurden für jedes der 7 YAC-Fragmente positive Cosmide identifiziert. Zusätzlich konnte Cosmide identifiziert werden, die positiv mit den überlappenden Restriktionsfragmenten der zwei unterschiedlichen YAC-Klone reagierten.
Konstruktion eines Cosmid-Contigs des Mi-Resistenzgenabschnitts
Um ein Cosmid-Contig von allen positiven identifizierten Cosmiden in den verschiedenen definierten Regionen zu konstruieren, wurde eine Restriktionsfragmentamplifizierung verwendet. Ungefähr 500 ng von jedem Cosmid wurden für die Herstellung der Matrizen verwendet und die Primer bei der Amplifizierung von Restriktionsfragmenten waren ein EcoRI-Primer 5'-GACTGCGTACCAATTC-3' ohne selektive Nukleotide und ein MseI-Primer 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' ohne selektive Nukleotide gemäß der Methode, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der EcoRI-Primer war am 5'-Ende markiert und alle 500 Cosmide wurden unter Verwendung des EcoRI/MseI-Primersatzes amplifiziert. Die DNA-Fingerprints enthielten ungefähr 8 bis 20 amplifizierte Fragmente. Sätze von Cosmiden, die amplifizierte Fragmente von identischer Größe enthielten, wurden aus jeder Region ausgewählt und wurden erneut auf Polyacrylamidgelen analysiert, wie in Beispiel 2 beschrieben, bis eine aneinander angrenzende Anordnung von allen amplifizierten Fragmenten innerhalb der definierten Regionen konstruiert werden konnte. Zusätzlich wurde das Cosmid-Contig von einer Region gegenüber den angrenzenden Regionen anhand von Homologie ausgerichtet („alignment"), um ein Cosmid-Contig des Mi-Genorts zu konstruieren. Auf diese Weise wurde ein Cosmid-Contig von 96 Cosmiden konstruiert, welches den Mi-Genort von ungefähr 800 kb überspannte.
Detaillierte Lokalisierung der mit Mi verknüpften AFLP-Marker auf dem Cosmid-Contig
Um die 20 mit Mi verknüpften AFLP-Marker auf dem Cosmid-Contig zu lokalisieren, wurden die 96 Cosmide mit PstI verdaut, gefolgt von einer Southern-Blot-Analyse gemäß Southern, J. Mol. Biol. 98, 503–515.
Die AFLP-Marker wurden als Hybridisierungssonden verwendet, wie in Beispiel 4 an dem Southern-Blot der 96 PstI-Verdaue der Cosmide beschrieben. Die genaue Lage der mit Mi verknüpften AFLP-Marker mit Ausnahme des Markers PM02 ist in 3A erläutert.
BEISPIEL 7: GENETISCHE ANALYSE VON Mi-MUTANTEN
Eine Familie von mutierten Tomatenlinien wurde durch Enza Zaden zur Verfügung gestellt. Diese Linien leiteten sich von einer F₁-Hybride ab, die hinsichtlich des Mi-Resistenzgens heterozygot war und hinsichtlich des Aps-1-Gens (welches saure Phosphatase-1 kodiert), das sehr eng mit Mi verknüpft ist (Stevens und Rick, 1986, in: The Tomato Crop, Hrsg. Atherton & Rudich, Chapman and Hall, S. 35–109), heterozygot war. Unterschiedliche Allele des Aps-1-Gens können durch Isozym-Analyse bestimmt werden (Vallejos, 1983, in: Isozymes in plant genetics and breeding, Hrsg. Tanksley und Orton, Teil A, Elsevier, Amsterdam, 469–515). Das Aps-1¹-Allel stammt aus L. peruvianum und ist durch Introgression in mehrere Nematoden-resistente Toma ten-Genotypen durch Cosegregation mit dem Mi-Resistenzgen eingeführt worden. Ein Schema dieser mutierten Linien ist nachfolgend gezeigt.
F₁-Hybride (heterozygot hinsichtlich Aps-1, Mi-resistenter Phänotyp)
↓ Selbsten
F₂-Linien (segregieren Aps-1 1 : 2 : 1, segregieren Mi-Resistenz 3 : 1)
↓ Selbsten von heterozygoten (Aps-1)-F₂-Pflanzen
F₃-Linien (segregieren Aps-1 1 : 2 : 1, segregieren Mi-Resistenz 3 : 1)
↓ Selbsten von heterozygoten (Aps-1)-F₃-Pflanzen
F₄-Linien (segregieren Aps-1 1 : 2 : 1, segregieren Mi-Resistenz 3 : 1)
↓ Selbsten von heterozygoten (Aps-1)-F₄-Pflanzen
F₅-Linien (segregieren Aps-1 1 : 2 : 1, Mi-empfindlich)
↓ Selbsten von heterozygoten (Aps-1)-F₅-Pflanzen
F₆-Linien (segregieren Aps-1 1 : 2 : 1, Mi-empfindlich)
↓ Selbsten von homozygoten (Aps-1¹)-F₆-Pflanzen
F₇-Linien (allesamt Aps-1¹, Mi-empfindlich)
↓ Selbsten von homozygoten (Aps-1¹)-F₇-Pflanzen
F₈-Linien (allesamt Aps-1¹, Mi-empfindlich)
In den F₁-, F₂,- F₃- und F₄-Linien dieser Familie korreliert die Anwesenheit des Aps-1¹-Allels mit dem Mi-resistenten Phänotyp, wohingegen die Abwesenheit des Aps-1¹-Allels mit dem Mi-empfindlichen Phänotyp korreliert. Bei den F₅- und nachfolgenden Nachkommen geht diese Korrelation verloren: alle Pflanzen sind empfindlich gegen Nematoden unabhängig von den Aps-1-Allelen.
Zwanzig Individuen aus jeder F₂-, F₃-, F₄-, F₅-, F₆-, F₇- und F₈-Generation wurden auf Nematodenresistenz, auf die Anwesenheit des Aps-1-Allels und die Anwesenheit der mit Mi verknüpften AFLP-Marker getestet. Die Nematoden-Testung von Sämlingen wurde in mit Wurzelgallen von M. incognita kontaminierter Erde ausgeführt. Die Nematodenresistenzergebnisse waren, wie in dem obigen Schema angegeben: 3 : 1-Segregation in F₂-, F₃- und F₄-Pflanzen und Empfindlichkeit bei F₅- und Nachkommenpopulationen. Die meisten der mit Mi verknüpften AFLP-Marker zeigten einen identischen Mi-Genotyp wie der Aps-1-Isozymmarker. Jedoch zeigte sich, dass 3 der AFLP-Marker, PM14, PM16 und PM25, mit dem Mi-Phänotyp segregierten: Bei den meisten F₅-, F₆-, F₇- und F₈-Pflanzen wurde die Mi-Empfindlichkeit durch das Fehlen von diesen Markern angezeigt. Die AFLP-Marker PM14, PM16 und PM25 zeigten eine Korrelation zwischen dem AFLP-Mi-Genotyp und dem Mi-Phänotyp in den Mutanten. Die Marker PM14 und PM25 grenzen auf der physischen Karte, wie sie in 3B gezeigt ist, aneinander und es wurde dement sprechend postuliert, dass die diese AFLP-Marker umgebende Region ein guter Kandidat, das Mi-Resistenzgen zu umfassen, war.
BEISPIEL 8: PHYSISCHE KARTE DER ÜBERLAPPENDEN COSMID-KLONE, WELCHE DAS Mi-RESISTENZGN UMFASSEN
Die Identifizierung von Cosmiden, die mit den mit Mi verknüpften AFLP-Markern PM14 und PM25 hybridisieren, wurde in Beispiel 6 ausgeführt. PM14 identifiziert die Cosmide Mi-11, Mi-18 und Mi-01, wohingegen PM25 die Cosmide Mi-18 und Mi-01 identifiziert.
Nachfolgend wurde eine kleine Cosmid-Anordnung im Bereich der Cosmide Mi-11, Mi-18 und Mi-01 aus dem in Beispiel 6 beschriebenen Cosmid-Contig ausgewählt. Es wurde ein Contig von 6 Cosmiden, welches die 3 identifizierten Cosmide und die angrenzenden Cosmide umfasste, ausgewählt. Diese 6 Cosmide sind Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 und Mi-14. Um eine detailliertere physische Karte von diesen 6 Cosmiden zu erstellen, wurden die DNA-Proben des Cosmid-Contigs mit PstI verdaut, gefolgt von einer Elektrophorese auf einem 0,8%-Agarosegel. Es konnte die physische Überlappung zwischen den verschiedenen Cosmiden bestimmt werden. Durch Kombinieren dieser Daten mit den Daten, die bezüglich der detaillierten Lokalisierung der mit Mi verknüpften AFLP-Marker auf dem Cosmid-Contig erhalten worden waren (siehe Beispiel 6), konnte eine detailliertere physische Karte mit der Lage von PM14 und PM25 konstruiert werden, wie in 4 gezeigt. Es wurde berechnet, dass das Cosmid-Contig im Bereich der AFLP-Marker PM14 und PM25 ungefähr 50 kb groß war.
BEISPIEL 9: TRANSFORMATION
Transfer von Cosmiden in Agrobacterium tumefaciens
Die Cosmid-Klone Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01, Mi-14 und das Kontrollcosmid pJJ04541 wurden in Agrobacterium tumefaciens durch konjugativen Transfer in einer Drei-Eltern-Paarung mit dem Helferstamm HB101 (pRK2013) im wesentlichen gemäß Deblaere et al. (Methods in Enzymology 153, 277–292) eingeführt. E. coli wurden in LB-Medium (1% Bactotrypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt und 1% NaCl, pH 7,5), ergänzt mit 5 mg/l Tetracyclin, bei 37°C kultiviert. Der Helferstamm HB101 (pRK2013) wurde unter identischen Bedingungen in LB-Medium, welches mit 100 mg/l Kanamycinsulfat ergänzt worden war, kultiviert.
Der Agrobacterium tumefaciens-Stamm AGL1 (Lazo et al., Bio/Technology, 9, 963–971, 1991) wurde in mit 100 mg/l Carbenicillin ergänztem LB-Medium bei 28°C kultiviert. Übernachtkulturen wurden 1 : 100 in LB-Medium ohne jegliche Antibiotika verdünnt und nach 6 h Vermehrung wurden jeweils 0,1 ml der Agrobacterium-Kultur, der Helferstamm-Kultur und einer Cosmid-Stammkultur gemischt und auf LB-Agarplatten ohne Antibiotika ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 28°C wurde die Mischung auf LB-Medium-Agarplatten, welche 100 mg/l Carbenicillin und 10 mg/l Tetracyclin enthielten, ausplattiert, um auf Transkonjuganten zu screenen. Die Platten wurden 3–4 Tage bei 28°C inkubiert. Es wurden zwei Reihenpassagen mittels selektiver Agarplatten ausgeführt, um eine Selektion auf einzelne Agrobacterium-Transkonjuganten-Kolonien auszuführen.
Charakterisierung von A. tumefaciens-Transkonjuganten
Kulturen in kleinem Maßstab wurden ausgehend von ausgewählten Kolonien kultiviert und in LB-Medium, welches 10 mg/l Tetracyclin enthielt, kultiviert. Plasmid-DNA wurde durch alkalische Lyse unter Verwendung der Methode, wie von Ish-Horowicz et al. beschrieben (Nucl. Acids Res. 9, 2989–2997, 1981) isoliert und mit BglII unter Verwendung von Standardtechniken verdaut. Zusätzlich wurde eine Restriktionsfragmentamplifizierung an Minipräp-DNA von A. tumefaciens ausgeführt unter Verwendung der Enzymkombination EcoRI/MseI und von Primern, die kein selektives Nukleotid aufweisen, wie in Beispiel 6 beschrieben. Nachfolgend wurden das BglII-Restriktionsenzymmuster wie auch der DNA-Fingerprint der A. tumefaciens-Transkonjugante mit jenen von Minipräp-DNA des E. coli-Stamms, der das Cosmid enthielt, verglichen. Nur jene A. tumefaciens-Transkonjuganten, die ein Cosmid mit dem gleichen DNA-Muster wie die entsprechende E. coli-Kultur beherbergten, wurden verwendet, um eine empfindliche Tomatenlinie zu transformieren.
Transformation einer empfindlichen Tomatenlinie
Samen der empfindlichen Tomatenlinie 52201 (Rijk Zwaan, De Lier, Niederlande) wurden in 2% Natriumhypochlorit 10 min oberflächensterilisiert, dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült und auf Keimungsmedium (bestehend aus halbkonzentriertem MS-Medium nach Murashige und Skoog, Physiol. Plant. 15, 473–497, mit 1% (Gew./Vol.) Sucrose und 0,8% Agar) in Glasgefäßen oder Polypropylenkulturgefäßen gegeben. Man ließ sie 8 Tage keimen. Die Kulturbedingungen waren 25°C, eine Photonenflussdichte von 30 μmol·m^–2·s^–1 und eine Photoperiode von 16/24 h.
Die Transformation von Tomate wurde gemäß Koornneef et al. (1986) in: Tomato Biotechnology, 169–178, Alan R. Liss, Inc., ausgeführt und wird nachfolgend kurz beschrieben. Acht Tage alte Cotyledon-Explantate wurden 24 h in Petrischalen, welche eine Feeder-Schicht von Petunia hybrida-Suspensionszellen, ausplattiert auf MS20-Medium (Kulturmedium nach Murashige und Skoog, (1962) Physiol. Plant, 15, 473–497, mit 2% (Gew./Vol.) Sucrose und 0,8% Agar), ergänzt mit 10,7 μM α-Naphthalinessigsäure und 4,4 μM 6-Benzylaminopurin, enthielten, vorkultiviert. Die Explantate wurden dann mit der verdünnten Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens, welche die Cosmid-Klone Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 und Mi-14 oder den Cosmid-Vektor pJJ04541 enthielten, 5–10 min infiziert, auf sterilem Filterpapier trocken getupft und 48 h auf den ursprünglichen Feederschicht-Platten cokultiviert. Die Kulturbedingungen waren, wie oben beschrieben. Übernachtkulturen von Agrobacterium tumefaciens wurden mit flüssigem MS20-Medium (Medium nach Murashige und Skoog (1962) mit 2% (Gew./Vol.) Sucrose, pH 5,7) bis zu einer O.D.₆₀₀ von 0,8 verdünnt.
Nach der Cokultivierung wurden die Cotyledon-Explantate auf Petrischalen mit selektivem Medium, bestehend aus MS20 ergänzt mit 4,56 μM Zeatin, 67,3 μM Vancomycin, 418,9 μM Cefotaxim und 171,6 μM Kanamycinsulfat, transferiert und unter den oben beschriebenen Kulturbedingungen kultiviert. Die Explantate wurden alle 3 Wochen auf frisches Medium subkultiviert. Auftretende Triebe wurden von dem darunterliegenden Kallus abgeschnitten und in Glasgefäße mit selektivem Medium ohne Zeatin transferiert, um Wurzeln zu bilden. Die Bildung von Wurzeln in einem Kanamycinsulfat enthaltenden Medium wurde als ein Hinweis auf die transgene Natur des fraglichen Triebs angesehen. Wahrhaft transgene Regeneranten wurden in vitro vermehrt durch Subkultivierung des apikalen Meristems und von zusätzlichen Knospen in Glasgefäße mit frischem selektivem Medium ohne Zeatin.
BEISPIEL 10: KOMPLEMENTATIONSANALYSE
Identifizierung von Cosmiden mit dem Mi-Resistenzgen durch Screenen auf Resistenz in Wurzeln von transformierten Pflanzen
Wurzeln von in vitro kultivierten transformierten R₀-Pflanzen sind dem Krankheitsassay, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen worden. Ausgehend von jeder Transformante sind zwei Wurzelexplantate dem Assay unterzogen worden. Insgesamt sind 72 R₀-Pflanzen aus 7 unterschiedlichen Cosmid-Transformationen getestet worden; 6 Cosmide, die Tomaten-Insert-DNA trugen, und ein Cosmid, pJJ04541, ist ohne Tomaten-Insert-DNA. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Dreiundsechzig transgene R₀-Pflanzen erwiesen sich als empfindlich, da sich Gallen an wenigstens einer der beiden Wurzelkulturen gebildet hatten. Neun R₀-Pflanzen wurden als resistent bewertet, da keine Gallen an den Wurzelkulturen gefunden werden konnten. Sieben resistente Pflanzen waren aus einer Transformation mit dem Cosmid Mi-11 abgeleitet worden, während zwei resistente Pflanzen mit dem Cosmid Mi-18, das zu einem großen Teil mit dem Cosmid Mi-11 überlappt, abgeleitet worden waren. Die Cosmide Mi-11 und Mi-18 wurden für eine weitergehende molekulare Analyse verwendet.
TABELLE 5
Molekulare Analyse der transformierten Pflanzen mit einem resistenten Phänotyp
Um zu zeigen, dass der resistente Phänotyp von transgenen R₀-Pflanzen, die mit den überlappenden Cosmiden Mi-11 und Mi-18 worden waren, durch das in den verschiedenen Cosmiden vorhandene genomische Insert determiniert wird, wurde eine AFLP-Analyse mit dem AFLP-Marker PM14 ausgeführt. Es wurde eine selektive Restriktionsfragmentamplifizierung mit der Primerkombination, welche den Marker PM14 identifiziert, bei den mit den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 transformierten R₀-Pflanzen ausgeführt. Die erhaltenen DNA-Fingerprints zeigten die Anwesenheit des Markers PM14 in den resistenten Pflanzen, was anzeigt, dass das in den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 vorhandene genomische Insert auch in den R₀-Pflanzen vorhanden ist und dass die beiden identifizierten überlappenden Cosmide Mi-11 und Mi-18 das Mi-Resistenzgen umfassen.
Die Inserts in den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 und die Inserts in den angrenzenden Cosmiden Mi-32, Mi-30 auf der einen Seite und den Cosmiden Mi-01 und Mi-14 auf der anderen Seite wurden weiter charakterisiert. Die das Mi-Resistenzgen umfassende DNA-Region wurde basierend auf der Überlappung zwischen den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 auf ungefähr 16–18 kb geschätzt. Basierend auf der Empfindlichkeit der R₀-Pflanzen, die das in dem Cosmid Mi-30 vorhandene Insert aufweisen, konnte diese Region auf ungefähr 12 kb eingegrenzt werden. Es wurde ein das Mi-Resistenzgen umfassender DNA-Abschnitt, welcher der durch die rechten Enden der Cosmide Mi-30 und Mi-11 flankierten Region entspricht, sequenziert (siehe 4).
BEISPIEL 11: NUKLEOTIDSEQUENZ UND ABGELEITETE AMINOSÄURESEQUENZ DES Mi-RESISTENZGENS AUS TOMATE
Subklonierung des überlappenden DNA-Abschnitts
Um die Sequenz des überlappenden DNA-Abschnitts in den das Mi-Resistenzgen enthaltenden Cosmiden Mi-11 und Mi-18 zu bestimmen, wurde ein Satz von willkürlichen Subklonen mit einer Insertgröße von ungefähr 2 kb erzeugt. 7,5 μg CsCl-gereinigte DNA der Cosmide Mi-11 und Mi-18 wurden 10 s bei 4°C mit 15% Sondenenergie (in 40 μl 10 mM Tris-acetat, 10 mM Mg-acetat und 50 mM K-acetat) unter Verwendung eines Misonix (Misonix Inc., Farmingdale, NY, USA)-Beschallungsgeräts (Typ XL2020) mit einem mit Wasser gefüllten Bechertrichter („cup horn") (Typ 431A) geschert. Nachfolgend wurde die DNA 10 min bei 60°C erwärmt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Enden der DNA-Fragmente wurden durch Zugabe von 10 μl einer Reparaturmischung (10 mM Tris-acetat, 10 mM Mg-acetat, 50 mM K-acetat, 10 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase, 10 Einheiten T4-DNA-Polymerase und 2 mM von allen 4 dNTPs) und gefolgt von einer Inkubation für 30 min bei 20°C aufgefüllt. Die gescherte DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 1%-Seakem-GTG-Agarosegel (FMC Bio Products, Rockland, ME, USA) aufgetrennt. Die Fraktion mit einer Größe von 1,8–2,2 kb wurde aus dem Gel ausgeschnitten und nachfolgend wurde das Gelscheibchen mit β-Agarase I gemäß dem Protokoll des Herstellers (New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA) verdaut und die DNA wurde präzipitiert.
Ein modifizierter pUC19-Vektor (bezeichnet als pStuc) wurde verwendet, um die 1,8–2,2 kb-Fraktion zu klonieren. In diesem Vektor war das BamHI/SalI-Fragment von pUC19 durch ein DNA-Fragment, welches eine StuI-, SpeI- und SalI-Restriktionsstelle enthielt, unter Verwendung von zwei Oligonukleotidprimern und Standardklonierungstechniken, wie von Sambrook et al. (in: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben, ersetzt worden. Die 1,8–2,2 kb-Fraktion wurde bei 16°C in den mit StuI verdauten und dephosphorylierten pStuc-Vektor ligiert. Mit der Ligationsmischung wurden nachfolgend ultrakompetente Epicurian Coli XL2-Blue-MRF'-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA, USA) transformiert. Es wurden individuelle Kolonien kultiviert und in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (100 μl LB-Medium, enthaltend 100 mg/l Carbenicillin) aufbewahrt.
Um Klone zu isolieren, die die überlappende DNA-Region in den das Mi-Resistenzgen enthaltenden Cosmiden Mi-11 und Mi-18 repräsentieren, wurden das 8,6 und 4,5 kb-PstI-Fragment des Cosmid-Klons Mi-18 (siehe 4) wie auch der AFLP-Marker PM14 als Hybridisierungssonden bei Koloniehybridisierungen verwendet. Dafür wurden Replikate des 384 Vertiefungen-Gitters von Klonen in Mikrotiterplatten auf Gene Screen Plus-Membranfilter (DuPont NEN, Boston, MA, USA) gestempelt und man ließ sie auf Medium zu Kolonien wachsen. Vierundachtzig positive Klone wurden verwendet, um Plasmid-DNA unter Verwendung der alkalischen Lysemethode, wie von Ish-Horowicz et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2989–2997, beschrieben, zu isolieren.
Sequenzanalyse
Es wurde der „ABI PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction"-Kit verwendet, um Sequenzierungsreaktionen in einem Gene-Amp-PCR-System, Modell 9600 (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) auszuführen. Es wurden Standard-M13-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden auf 48 cm-Gelen eines ABI Prism 377 analysiert. Die DNA-Sequenz von 84 ausgewählten Klonen wurde unter Verwendung der Standard-Vorwärts- und -Rückwärts-Sequenzierungsprimer bestimmt. Sequenzzusammenfügung und -analyse erfolgten mit der 1994er-Version des STADEN-Sequenzanalyseprogramms (Dear und Staden, 1991, Nucl. Acids Res. 19, 3907–3911). Es konnte eine zusammenhängende DNA-Sequenz von ungefähr 9,9 kb Nukleotiden gebildet werden und ist in 5 gezeigt. Es konnte ein großes offenes Leseraster von 3621 Nukleotiden (ORF2), welches ein verkürztes Polypeptid von 1206 Aminosäuren (7B) kodiert, abgeleitet werden.
BEISPIEL 12: WURZELKNOTEN-NEMATODEN-INFEKTION: BODEN-INOKULATION
Mit der Wurzelknoten-Nematode Meloidogyne incognita infizierte Erde war, wie folgt, hergestellt worden: Wurzelsysteme von schwer infizierten Tomatenpflanzen mit einer hohen Anzahl von Gallen (oder Wurzelknoten) wurden in Stücke geschnitten und in frischer Erde eingemischt.
Es wurden Samen in die infizierte Erde ausgesät oder kleine bewurzelte Pflänzchen wurden in die infizierte Erde transferiert. Die Pflanzen wurden in einem Gewächshaus bei einer Temperatur von 25°C kultiviert. Nach 4 bis 8 Wochen wurden die Pflanzen vorsichtig aus der Erde herausgezogen und die Wurzeln wurden mit Wasser gespült, um die anhaftende Erde zu entfernen. Der Infektionsgrad wurde durch Zählen der Anzahl von gebildeten Gallen bestimmt.
Pflanzen wurden als resistent angesehen, wenn drei Gallen oder weniger an den Wurzeln sichtbar waren. Pflanzen wurden als empfindlich angesehen, wenn mehr als drei Gallen sich an dem Wurzelsystem gebildet hatten.
BEISPIEL 13: KOMPLEMENTATIONSANALYSE
Identifizierung von Cosmiden mit dem Mi-Resistenzgen durch Screenen auf Resistenz in den durch Selbsten erhaltenen Nachkommen von transformierten Pflanzen
Die primären Regeneranten (regenerierten Pflanzen) (R₀-Generation) aus den Transformationsexperimenten wurden im Gewächshaus für einen Samenansatz kultiviert. Für jedes Cosmid wurden zehn bis fünfzehn Regeneranten kultiviert und es wurden die R₁-Samen geerntet. R₁-Linien von wenigstens sieben R₀-Pflanzen von jedem Cosmid wurden auf Resistenz gegen Meloidogyne incognita getestet, um Cosmide mit dem Resistenzgen zu identifizieren. Zwanzig bis 30 Sämlinge oder Pflänzchen von jeder R₁-Linie wurden inokuliert und ausgewertet, wie in Beispiel 12 beschrieben.
Es sind insgesamt 63 R₁-Linien von 7 verschiedenen Cosmidtransformationen getestet worden; 6 Cosmide, die Tomaten-Insert-DNA trugen, und ein Cosmid, pJJ04541 ohne Tomaten-Insert-DNA. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Vierundfünfzig transgene R₀-Pflanzen erwiesen sich als empfindlich, da Gallen sich an den Wurzelsystemen von allen getesteten R₁-Pflanzen gebildet hatten. Neun R₀-Pflanzen werden als resistent angesehen, da wenigstens die Hälfte der Pflanzen von jeder R₁-Linie drei oder weniger Gallen aufwies. Eine R₁-Linie war vollständig resistent, sechs R₁-Linien segregierten in einem Verhältnis von ungefähr 3 : 1 (resistente zu empfindlichen Pflänzchen) und die Nachkommen von zwei R₀-Pflanzen segregierten 1 : 1. Alle neun resistenten R₀-Pflanzen waren aus Transformationen mit dem Cosmid Mi-11 abgeleitet worden.
Zusätzliche genetische Hinweise auf das Vorhandensein des Mi-Resistenzgens auf dem Cosmid Mi-11 wurde in der nächsten Generation erhalten. Resistente R₁-Pflanzen wurden einem Selbsten unterzogen. Vierzehn der resultierenden R₂-Linien, welche von vier unterschiedlichen R₀-Pflanzen abstammten, wurden auf Resistenz gegen M. incognita getestet. Zwanzig bis dreißig Sämlinge von jeder R₂-Linie wurden inokuliert und ausgewertet, wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Fünf R₂-Linien waren vollständig resistent, was anzeigt, dass die R₁-Elternpflanzen bezüglich des Mi-Resistenzgens homozygot waren. Acht R₂-Linien segregierten in einem Verhältnis von 3 : 1, was anzeigt, dass ihre R₁-Elternpflanzen hinsichtlich des Mi-Resistenzgens heterozygot waren. Eine R₂-Linie segregierte in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 1 und keine der getesteten Linien erwies sich als vollständig empfindlich. Diese Ergebnisse beweisen, dass die ausgewählten R₁-Pflanzen, die sich von mehreren mit dem Cosmid Mi-11 transformierten Pflanzen ableiten, das funktionsfähige Mi-Resistenzgen enthalten.
TABELLE 6
TABELLE 7
BEISPIEL 14: KARTOFFELBLATTLAUS-INFEKTIONSASSAY
Kleine Tomatenpflanzen (4 Wochen alt) wurden mit der Kartoffelblattlaus (Macrosiphum euphorbiae) inokuliert, indem fünf bis acht weibliche Blattläuse auf die Blätter gesetzt wurden. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus bei einer Temperatur von 18 bis 20°C kultiviert. Nach einer bis zwei Wochen wurde das Resistenzniveau bestimmt, indem die Anzahl von neu geborenen Blattläusen bestimmt wurde.
Pflanzen wurden als resistent angesehen, wenn keine lebenden Blattläuse auf dem Stengel oder den Blättern vorhanden waren. Pflanzen waren empfindlich, wenn neugeborene Blattläuse vorhanden waren.
BEISPIEL 15: KOMPLEMENTATIONSANALYSE
Identifizierung von Cosmiden mit dem Meu-1-Resistenzgen durch Screenen auf Resistenz in den durch Selbsten erhaltenen Nachkommen von transformierten Pflanzen
Eine Untergruppe der in Beispiel 13 erhaltenen R₁-Linien wurde auf Resistenz gegen Macrosiphum euphorbiae getestet, um Cosmide mit dem Meu-1-Resistenzgen zu identifizieren. Zehn bis fünfzehn Pflänzchen von jeder R₁-Linie wurden inokuliert und ausgewertet, wie in Beispiel 14 beschrieben. Insgesamt sind 41 R₁-Linien von 7 verschiedenen Cosmid-Transformationen getestet worden; 6 Cosmide, die Tomaten-Insert-DNA trugen, und ein Cosmid, pJJ04541, ohne Tomaten-Insert-DNA. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Sechsunddreißig transgene R₀-Pflanzen werden als empfindlich angesehen, da Dutzende von Blattläusen sich auf allen oder den meisten Pflanzen von jeder R₁-Linie vermehrten. Fünf R₀-Pflanzen waren resistent, da wenigstens die Hälfte der Pflanzen von jeder R₁-Linie ohne lebende Blattläuse war. Alle diese fünf resistenten R₀-Pflanzen waren mit dem Cosmid Mi-11 transformiert worden.
Die erhaltenen Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass die R₀-Pflanzen, die sich von Transformationen mit dem Cosmid Mi-11 ableiten, ein funktionsfähiges Meu-1-Resistenzgen enthalten.
TABELLE 8
Zusätzliche genetische Nachweise für das Vorhandensein des Meu-1-Resistenzgens auf dem Cosmid Mi-11 wurden bei der nächsten Generation erhalten. Vierundzwanzig R₂-Linien, die aus Selbstungen von Nematoden-resistenten R₁-Pflanzen, die von neun unterschiedlichen R₀-Pflanzen stammten, erhalten worden waren (siehe Beispiel 13), wurden auf Resistenz gegen M. euphorbiae getestet. Elf bis fünfzehn Sämlinge von jeder R₂-Linie wurden inokuliert und ausgewertet, wie in Beispiel 14 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Eine R₂-Linie segregierte in einem Verhältnis von 3 : 1 und acht R₂-Linien segregierten in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 1. In diesen neun Linien ist der Kartoffelblattlausresistenz-Phänotyp deutlich erkennbar. Fünf R₂-Linien erwiesen sich als vollständig empfindlich. Die übrigen zehn R₂-Linien wurden dazwischenliegend eingestuft: sie segregierten in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 3. Diese Ergebnisse zeigen, dass mehrere R₁-Pflanzen, die gegen Meloidogyne incognita resistent sind und die von mit dem Cosmid Mi-11 transformierten R₀-Pflanzen abgeleitet worden sind, ein funktionsfähiges Meu-1-Resistenzgen aufweisen.
Zusätzlich wurden acht R₁BC-Linien, die ausgehend von Nematoden-resistenten R₁-Pflanzen, die mit der empfindlichen Tomatenlinie 52201 rückgekreuzt worden waren, erhalten worden waren, auf Resistenz gegen M. euphorbiae getestet, um die Vererbung des durch Introgression eingeführten Meu-1-Resistenzgens zu bestätigen. Zwölf bis fünfzehn Sämlinge von jeder R₁BC-Linie wurden inokuliert und ausgewertet, wie in Beispiel 14 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
Die in Tabelle 9 und Tabelle 10 gezeigten Segregationsverhältnisse dienen nur dazu, die Vererbung des Resistenzphänotyps zu veranschaulichen.
TABELLE 9
TABELLE 10
BEISPIEL 16: TRANSKRIPTKARTIERUNG
Transkriptkartierungsuntersuchungen wurden ausgeführt, um das 5'- und 3'-Ende des Mi-Resistenzgens zu kartieren und um zu bestimmen, ob das Mi-Resistenzgen irgendwelche Introns enthält. Für diesen Zweck wurde die Polymerasekettenreaktion zur Amplifizierung von Teilen der Transkripte ausgehend von dem Mi-Resistenzgen verwendet.
Gesamt-RNA aus Blattgewebe der resistenten Tomatensorte E22 wurde gemäß der heißen Phenol-Methode isoliert, wie von Sambrook et al. beschrieben (in: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Poly A+-RNA wurde unter Verwendung von biotinyliertem oligo(dT), gebunden an Dynabeads M-280 Streptavidin (DYNAL A. S., Oslo, Norwegen), gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Unter Verwendung des „Superscript Rnase H Reverse Transcriptase cDNA"-Kits von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA, und des von dem Hersteller bereitgestellten Protokolls wurde eine cDNA-Bibliothek konstruiert.
5'- und 3'-RACE-Produkte wurden unter Verwendung des „Marathon cDNA amplification"-Kits von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhalten. Die verwendeten Primer wurden basierend auf der genomischen Mi-Sequenz und speziell auf dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz des ORF2 gestaltet. Nachfolgend wurden die verschiedenen 5'- und 3'-RACE-Fragmente in den TA-Klonierungsvektor pCRII (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA) kloniert und unter Ver wendung von Standardprotokollen sequenziert. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden gegenüber der genomischen Sequenz von 9,9 kb anhand von Homologie ausgerichtet („alignment") und es konnten für das 5'-Ende des Mi-Resistenzgens zwei Intronsequenzen abgeleitet werden. Ein Intron von 1306 Nukleotiden war von Nukleotidposition 1936 bis 3241 gelegen und das zweite von Nukleotidposition 3305 bis 3379 (5).
Das größte, mit dem „Marathon cDNA amplification"-Kit detektierte Mi-Transkript kartiert an Nukleotidposition 1880. Wir schließen daraus, dass die Mi-Transkriptionsstartstelle sich bei oder strangaufwärts von Nukleotid 1880 befindet. Das erste ATG-Codon, das innerhalb der 5'-cDNA detektiert werden konnte, befand sich bei Nukleotidposition 3263, 52 Nukleotide strangaufwärts von dem zweiten Intron, und es konnte ein großes offenes Leseraster (ORF1), welches ein Polypeptid von 1257 Aminosäuren kodiert, abgeleitet werden und dieses ist in 7A gezeigt. Als Ergebnis befindet sich dieses zweite Intron zwischen Aminosäure 14 und 15 des Produkts des Mi-Resistenzgens.
BEISPIEL 17: PCR-ANALYSE VON MIT Mi-11 UND Mi-18 TRANSFORMIERTEN PFLANZEN
Aus einer Komplementationsanalyse in Wurzeln von transformierten Pflanzen (Beispiel 10) erhaltene Daten zeigten, dass das Mi-Resistenzgen sich auf einem zwischen den Cosmiden Mi-11 und Mi-18 überlappenden DNA-Abschnitt unter Ausschluss des dem Cosmid Mi-30, dessen Transformanten allesamt empfindlich waren, entsprechenden DNA-Abschnitts befand. Es wurde geschätzt, dass diese Region ungefähr 12 kb groß war. Jedoch wurden bei einer Komplementationsanalyse der durch Selbsten erhaltenen Nachkommen von transformierten Pflanzen nur mit dem Cosmid Mi-11 transformierte Pflanzen als resistent bewertet (Beispiele 13 und 15). Um die Frage anzusprechen, warum mit Mi-18 transformierte Pflanzen als empfindlich bewertet wurden, wurde eine PCR-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des mutmaßlichen Mi-ORF in transformierten Mi-11- und Mi-18-Pflanzen ausgeführt.
Es sind die folgenden DNA-Proben analysiert worden:

1. YAC-Klon 2/1256.
2–3. Cosmid Mi-11 in E. coli bzw. in A. tumefaciens.
4–5. Cosmid Mi-18 in E. coli bzw. in A. tumefaciens.
6. Tomatenlinie E22 (resistent).
7. Tomatenlinie 52201 (empfindlich).
8–12. Fünf mit dem Cosmid Mi-11 transformierte Pflanzen.
13–17. Fünf mit dem Cosmid Mi-18 transformierte Pflanzen.

Die DNA wurde mit PstI verdaut und es wurden PstI-Adaptoren ligiert. Nachfolgend wurde eine PCR-Analyse mit einem die PstI-Stelle und drei zusätzliche selektive Nukleotide identifizierenden Primer oder dem Marker PM14 und verschiedenen PCR-Primern, die sich strangaufwärts von PM14 befanden, unter Verwendung des Enzyms rTh-Polymesse (Gene Amp XL PCR-Kit; Perkin-Elmer) ausgeführt. Die erzeugten Produkte variierten in der Größe von 443 bis 6110 bp und umfassen die vollständige strangaufwärts gelegene PM14-Region des mutmaßlichen Mi-ORF (siehe 6).
Es zeigte sich, dass alle Matrizen PCR-Produkte der erwarteten Größe erzeugten mit der Ausnahme der fünf Pflanzen, die mit dem Cosmid Mi-18 transformiert worden waren. Es wurde nur das kleinste PCR-Produkt (443 bp) gebildet. Diese Daten zeigen, dass nahezu die vollständige strangaufwärts gelegene P14-Region in Pflanzen, die mit dem Cosmid Mi-18 transformiert sind, nicht vorhanden ist. Diese Deletionen treten bei dem Cosmid Mi-18, das in E. coli oder A. tumefaciens vorhanden ist, nicht auf, sondern treten nur in transformierten Pflanzen auf. Wir schließen daher, dass diese Deletionen für den empfindlichen Phänotyp gegenüber Meloidogyne incognita und/oder Macrosiphum euphorbiae von Mi-18-transformierten Pflanzen verantwortlich sind.
BEISPIEL 18: NUKLEOTIDSEQUENZ VON COSMID Mi-11
Die Beobachtung, dass nur mit dem Cosmid Mi-11 transformierte Pflanzen einen resistenten Phänotyp zeigen, könnte darauf hinweisen, dass zusätzliche offene Leseraster, die auf Mi-11 vorhanden sind, Kandidaten sein könnten, um eine Resistenz gegen Nematoden und/oder Blattläuse zu kodieren. Dementsprechend wurde die Nukleotidsequenz der Region strangaufwärts des postulierten ORF-1 bestimmt, um zusätzliche offene Leseraster zu identifizieren.
Unter Verwendung des 2,1, 4,7 und 2,9 kb-PstI-Fragments des Cosmid-Klons Mi-11 als Hybridisierungssonden in einer Koloniehybridisierung im wesentlichen, wie in Beispiel 11 beschrieben, wurde ein Satz von willkürlichen Subklonen mit einer Insertgröße von 2 kb isoliert. Neunundvierzig positive Klone wurden verwendet, um die DNA-Sequenz unter Verwendung der Standard-Vorwärts- und -Rückwärtssequenzierungsprimer zu bestimmen. Sequenzzusammenfügung und -analyse erfolgten, wie in Beispiel 11 beschrieben.
Es konnten drei aneinander angrenzende DNA-Abschnitte mit Größen von 5618 bp (con25), 898 bp (con10) und 2495 bp (con62) abgeleitet werden. Die Lücken zwischen diesen DNA-Abschnitten und der 9870 bp-DNA-Sequenz, die das mutmaßliche Mi-ORF (6) enthält, wurden unter Verwendung von PCR berechnet und variierten zwischen 50 und 200 bp.
Die drei ermittelten Contigs (con25, con10 und con62) wurden hinsichtlich der Verteilung von Stop-Codons in allen sechs möglichen Rastern analysiert. Es konnten keine signifikanten ORF-Raster mit einer Größe von oder über 120 Aminosäuren postuliert werden. Zusätzlich wurde keine DNA-Homologie mit dem mutmaßlichen ORF-1 detektiert. Folglich war das einzige auf dem Cosmid Mi-11 vorhandene signifikante ORF ORF-1, wie in 5 beschrieben. Basierend auf diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass das durch ORF1 kodierte Polynukleotid Resistenz gegen Nematoden ebenso wie gegen Blattläuse verleiht und folglich, dass das Mi-Resistenzgen und das Meu-1-Resistenzgen sich auf die gleiche kodierende Sequenz, wie sie in 5 gezeigt ist, beziehen.
BEISPIEL 19: TRANSFORMATION VON TABAK UND KOMPLEMENTATIONSANALYSEN
Transformation von Tabak
Die Tabaksorte Petit Havana, Typ SR1, wurde mit dem Cosmid Mi-11 oder dem Cosmidvektor pJJ04541 unter Verwendung des Protokolls, wie von Horsch et al. (Science 227, 1229–1231, 1985) beschrieben, transformiert.
Komplementationsanalyse: Screening auf Nematodenresistenz in Wurzelkulturen von transformierten Tabakpflanzen
Wurzeln von in vitro kultivierten transformierten R₀-Pflanzen von Tabak sind dem Krankheitsassay, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen worden. Ausgehend von jeder der 31 Transformanten sind zwei oder mehr Wurzelexplantate dem Assay unterzogen worden. Zusätzlich sind alle 17 Mi-11-Transformanten durch PCR auf die Anwesenheit des mutmaßlichen Mi-ORF1 durch Screening auf ein internes Fragment mit einer Größe von 823 Basenpaaren (reichend von Nukleotidposition 4824 bis 5646, siehe 5) analysiert worden. Aus der Sequenz, wie in 5 gezeigt, wurden einfache PCR-Primer für das Fragment abgeleitet. Die verwendeten Primer haben die folgenden Sequenzen:
Primer S21 ist auf die Sequenz von Nukleotidposition 4824 bis 4844 gerichtet und Primer S22 ist auf die Sequenz von Nukleotidposition 5626 bis 5646 gerichtet (siehe 5).
Die Ergebnisse des in vitro-Krankheitsassays und der PCR-Analyse (Anwesenheit „+" oder Abwesenheit „–" des internen PCR-Fragments) sind in Tabelle 11 gezeigt. „Mi-11" steht für transformierte Pflanzen, die das mutmaßliche Mi-ORF1 umfassen, und „Mi-11Δ" steht für jene transformierten Pflanzen, die eine Deletion in dem mutmaßlichen Mi-ORF1, wie durch die PCR-Analyse (oben beschrieben) bestimmt, aufweisen. Neunundzwanzig R₀-Transformanten waren empfindlich, da sich Gallen an wenigstens einer der getesteten Wurzelkulturen gebildet hatten. Im Allgemeinen ist die Rate der Gallenbildung an Tabakwurzeln geringfügig geringer als an empfindlichen Tomatenwurzeln. Zwei R₀-Pflanzen wurden als resistent gegenüber Meloidogyne incognita bewertet, da keine Gallen an den Wurzelkulturen gefunden werden konnten. Beide resistenten Pflanzen waren mit dem Cosmid Mi-11, welches das interne PCR-Fragment, welches die Anwesenheit des Mi-Resistenzgens anzeigt, umfasst, transformiert worden.
TABELLE 11
Komplementationsanalyse: Screening auf Blattlausresistenz bei Stecklingen von transformierten Tabakpflanzen
Bewurzelte Stecklinge von transformierten R₀-Pflanzen von Tabak wurden inokuliert und ausgewertet, wie in Beispiel 14 beschrieben. Ausgehend von jeder der 23 Transformanten wurden zwei oder drei Stecklinge auf Resistenz gegen Macrosiphum euphorbiae getestet. Die Ergebnisse des Infektionsassays und der PCR-Analyse (wie oben beschrieben) sind in Tabelle 12 gezeigt. Einundzwanzig R₀-Pflanzen werden als empfindlich angesehen, da mehrere lebende Blattläuse auf wenigstens einem der getesteten Stecklinge gezählt wurden. Im Allgemeinen ist das Vermehrungsausmaß der Blattläuse auf Tabak verglichen mit der Vermehrung auf empfindlichen Tomatenpflanzen gering. Zwei R₀-Pflanzen wurden als resistent bewertet, da alle Stecklinge von diesen Pflanzen ohne lebende Blattläuse waren. Die Blattlaus-resistenten Pflanzen waren mit dem Cosmid Mi-11, welches das Mi-Resistenzgen umfasste, wie durch die Anwesenheit des internen PCR-Fragments angezeigt, transformiert.
TABELLE 12
BEISPIEL 20: TRANSFORMATION VON KARTOFFEL UND KOMPLEMENTATIONSANALYSEN
Transformation von Kartoffel
Für die Transformation wurde die Kartoffelsorte Diamant (Cebeco Zaden B. V., Vlijmen, Niederlande) verwendet. Internodium-Explantate von in vitro kultivierten Pflanzen wurden mit dem Cosmid Mi-11 oder dem Cosmidvektor pJJ04541 unter Verwendung des Protokolls, wie von Ooms et al. beschrieben (Theor. Appl. Genet. 73, 744–750) transformiert.
Komplementationsanalyse: Screening auf Nematodenresistenz in Wurzelkulturen von transformierten Pflanzen
Wurzeln von in vitro kultivierten transformierten R₀-Pflanzen von Kartoffel sind dem Krankheitsassay, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen worden. Ausgehend von jeder der 31 Transformanten sind wenigstens zwei Wurzelexplantate dem Assay unterzogen worden; zusätzlich sind alle 26 Mi-11-Transformanten durch PCR unter Verwendung der Primer S21 und S22, wie in Beispiel 19 beschrieben, analysiert worden. Die Ergebnisse des in vitro-Krankheitsassays und der PCR-Analyse (Anwesenheit „+" oder Abwesenheit „" des internen PCR-Fragments) sind in Tabelle 13 gezeigt. „Mi-11" steht für transformierte Pflanzen, die das mutmaßliche Mi-ORF1 umfassen, und „Mi-11Δ" steht für jene transformierten Pflanzen, die eine Deletion in dem mutmaßlichen Mi-ORF1, wie durch die PCR-Analyse (oben beschrieben) bestimmt, aufweisen. Achtundzwanzig R₀-Transformanten waren empfindlich, da sich Gallen an wenigstens einer der Wurzelkulturen gebildet hatten. Im Allgemeinen ist die Rate der Gallenbildung an Kartoffelwurzeln geringer als an empfindlichen Tomatenwurzeln. Drei R₀-Pflanzen wurden als resistent gegenüber Meloidogyne incognita bewertet, da keine Gallen an den Wurzelkulturen gefunden werden konnten. Alle diese resistenten Pflanzen waren mit dem Cosmid Mi-11, welches das interne PCR-Fragment, welches die Anwesenheit des Mi-Resistenzgens anzeigt, umfasst, transformiert worden.
TABELLE 13
Komplementationsanalyse: Screening auf Nematodenresistenz bei Stecklingen von transformierten Pflanzen
Bewurzelte Stecklinge von mit Mi-11 transformierten R₀-Pflanzen von Kartoffel wurden dem Krankheitsassay, wie in Beispiel 12 beschrieben, unterworfen. Ausgehend von jeder der 19 Transformanten wurden ein bis drei Stecklinge auf Resistenz gegen Meloidogyne incognita getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Zusätzlich wurden 36 bewurzelte Stecklinge von nicht-transformierten Kartoffelpflanzen (Sorte Diamant) getestet (als empfindliche Kontrollen) und waren allesamt empfindlich. Eine R₀-Pflanze wurde als gegen Meloidogyne incognita resistent bewertet, da keine Gallen an dem Wurzelsystem gefunden werden konnten.
TABELLE 14

Claims

Isolierte Nukleinsäure mit der DNA-Sequenz aus 5, oder ein Teil davon oder eine homologe DNA-Sequenz mit mindestens 50% Identität mit der DNA-Sequenz aus 5, und wobei dieser Teil der Sequenz oder diese homologe Sequenz fähig ist, wenn in eine Pflanze übertragen, die für ein Pflanzenpathogen anfällig ist, die Anfälligkeit dieser Pflanze für das Pflanzenpathogen zu reduzieren.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, die fähig ist, wenn in eine Wirtspflanze übertragen, die für ein Pflanzenpathogen anfällig ist, diese Wirtspflanze gegenüber dem Pflanzenpathogen resistent zu machen.
Isolierte Nukleinsäure, die eine cDNA darstellt, die fähig ist, wenn in eine Wirtspflanze übertragen, die für ein Pflanzenpathogen anfällig ist, die Anfälligkeit dieser Pflanzen für dieses Pflanzenpathogen zu reduzieren, wobei die Sequenz der cDNA die DNA-Sequenz aus 5 oder zumindest ein Teil der in 5 bereitgestellten DNA-Sequenz ist.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 3, die fähig ist, wenn in eine Wirtspflanze übertragen, diese gegenüber Nematoden resistent zu machen.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 3, die fähig ist, wenn in eine Wirtspflanze übertragen, diese gegenüber Blattläusen resistent zu machen.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 3, die fähig ist, wenn in eine Wirtspflanze übertragen, diese gegenüber Nematoden und Blattläusen resistent zu machen.
Isolierte Nukleinsäure, die fähig ist, wenn in eine Pflanze übertragen, die für ein Pflanzenpathogen anfällig ist, die Anfälligkeit dieser Pflanze für dieses Pflanzenpathogen zu reduzieren, wobei diese Nukleinsäure entweder (i) eine Sequenz aufweist, die an der Nukleotidposition 3263 beginnt und an der Nukleotidposition 7111 der Sequenz aus 5 endet, oder (ii) eine homologe DNA mit einer Identität von wenigstens 50% mit der in (i) definierten Sequenz darstellt, wobei diese homologe Sequenz fähig ist, wenn in eine Pflanze übertragen, die Anfälligkeit dieser Pflanze für das Pathogen zu reduzieren.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 3, die zumindest Teil des genomischen Inserts, das im Plasmid pKGMi-11 vorliegt, oder eine homologe Sequenz mit wenigstens 50% Identität mit dem genomischen Insert, das im Plasmid pKGMi-11 vorliegt, darstellt, wobei das Plasmid pKGMi-11 beim Centraal Bureau Voor Schimmelkultures in Baarn, Niederlande, unter der Hinterlegungsnummer CBS 822.96 hinterlegt ist.
Isolierte Nukleinsäure, die eine Promotorsequenz, die 5' aufwärts von der Nukleotidposition 3263 der in 5 dargestellten DNA-Sequenz angeordnet ist, oder eine dazu homologe Sequenz, die mindestens 50% Identität mit dieser Promotorsequenz aufweist, darstellt, wobei die homologe DNA-Sequenz die Regulationssequenzen enthält, die für die Transkription der benachbarten kodierenden Sequenz notwendig sind.
Rekombinantes DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 10, umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei diese Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors ist, der in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei der Promotor entweder endogen oder exogen zu der Pflanzenzelle ist und wirksam die Transkription dieser DNA-Sequenz in solchen Pflanzenzellen kontrolliert.
Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 11, in dem der Promotor eine Promotorsequenz, die 5' aufwärts von der Nukleotidposition 3263 der in 5 bereitgestellten DNA-Sequenz angeordnet ist, oder eine homologe Sequenz darstellt, die mindestens 50% Identität mit der Promotorsequenz aufweist und die Regulationssequenzen enthält, die für die Transkription der benachbarten kodierenden Sequenz notwendig sind.
Vektor, der für eine Transformation von Pflanzenzellen geeignet ist, wobei der Vektor ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 umfasst.
Plasmid pKGMi-11, wie unter der Nummer CBS 822.96 hinterlegt.
Plasmid pKGMi-18, wie unter der Nummer CBS 821.96 hinterlegt.
Bakterienzellen umfassend einen Vektor oder ein Plasmid gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15.
Pflanzenzellen umfassend ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12.
Pflanze umfassend Pflanzenzellen gemäß Anspruch 17.
Pflanze gemäß Anspruch 18, die eine reduzierte Anfälligkeit für Nematoden aufweist.
Pflanze gemäß Anspruch 19, worin die Nematode eine Wurzelgallen-Nematode ist, insbesondere Meloidogyne incognita.
Pflanze gemäß Anspruch 18, die eine reduzierte Anfälligkeit für Blattläuse aufweist, insbesondere Macrosiphum euphorbia.
Saatgut umfassend ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12.
Verfahren zum Erhalten von Pflanzen mit reduzierter Anfälligkeit für ein Pathogen, umfassend die folgenden Schritte: (i) Insertieren eines DNA-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 in das Genom einer Pflanzenzelle, (ii) Erhalten von transformierten Pflanzenzellen, (iii) Bilden von genetisch transformierten Pflanzen aus diesen transformierten Pflanzenzellen, und (iv) gegebenenfalls Vermehren dieser Pflanzen.
Verfahren gemäß Anspruch 23, worin das Pathogen eine Nematode ist, und bevorzugt eine Wurzelgallen-Nematode, insbesondere Meloidogyne incognita.
Verfahren gemäß Anspruch 23, worin das Pathogen eine Blattlaus ist, und bevorzugt Macrosiphum euphorbia.
Verfahren zum Schutz von Pflanzen in Anbau vor Pathogeninfektion umfassend: (i) Insertieren eines DNA-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 in das Genom einer Pflanzenzelle, (ii) Erhalten von transformierten Pflanzen, und (iii) Züchten der transformierten Pflanzen.
Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die folgenden Schritte: (i) Screenen einer genomischen Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek einer Pflanze mit einer DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, (ii) Identifizieren von positiven Klonen, die an diese DNA-Sequenz hybridisieren, und (iii) Isolieren dieser positiven Klone.
Verfahren gemäß Anspruch 27, worin die Bibliothek aus einer ersten Pflanze stammt und die DNA-Sequenz zu einer zweiten Pflanze gehört.
Verfahren zum Identifizieren einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei dieses Verfahren einen Schritt umfasst, bei dem Primerkombinationen verwendet werden, die wenigstens einen der AFLP-Marker PM02 bis PM29, wie in Tabelle 1 dargestellt, identifizieren.
Verfahren gemäß Anspruch 29, worin die Primerkombination den AFLP-Marker PM14, wie in Tabelle 1 dargestellt, identifiziert.
Paar von Primern, die für eine Amplifizierungsreaktion geeignet sind, wobei die Bildung eines Amplifizierungsproduktes auf das Vorliegen des Mi-Resistenzgens hinweist, wobei diese Primer aus Oligonukleotiden ausgewählt sind, die eine Größe aufweisen, die ausreicht, um selektiv an die DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zu hybridisieren.
Paar von Primern gemäß Anspruch 31, worin die DNA-Sequenz die Sequenz ist, die an der Nukleotidposition 6921 beginnt und an der Nukleotidposition 7034 der in 5 bereitgestellten DNA-Sequenz endet.
Paar von Primern umfassend ein erstes Oligonukleotid, dessen DNA-Sequenz 5'-TGCAGGA-3' ist und ein zweites Oligonukleotid, dessen DNA-Sequenz 5'-TAATCT-3' ist.
Diagnostisches Kit umfassend mindestens ein Paar von Primern gemäß einem der Ansprüche 31 bis 33.
Verfahren zum Detektieren des Vorliegens oder der Abwesenheit einer DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, insbesondere in einer Pflanzen-DNA umfassend einen Schritt der Verwendung eines diagnostischen Kits gemäß Anspruch 34.
Polypeptid, das das Expressionsprodukt einer Nukleinsäure von rekombinanter DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und 10 bis 12 ist.
Isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die in 7A bereitgestellte Sequenz aufweist oder die durch die korrespondierende homologe Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert wird.
Isolierte RNA mit einer Ribonukleinsäuresequenz eines Transkripts der DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.