WO2016156583A1 - Männlich sterile pflanze der gattung triticum - Google Patents

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WO2016156583A1
WO2016156583A1 PCT/EP2016/057247 EP2016057247W WO2016156583A1 WO 2016156583 A1 WO2016156583 A1 WO 2016156583A1 EP 2016057247 W EP2016057247 W EP 2016057247W WO 2016156583 A1 WO2016156583 A1 WO 2016156583A1
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plant
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tdf
seq
gene
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PCT/EP2016/057247
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Klaus Schmidt
Kerstin Koch
Alexandra MOLITOR
Harold VERSTEGEN
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Kws Saat Se
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
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    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
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    • C12Q2600/13—Plant traits
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a male-sterile plant of the genus Triticum in which all the alleles of the gene encoding the protein tapetal development and function (TDF) are inactivated. Furthermore, the invention relates to progeny of this plant and parts and seeds of these progeny, which contain an inactivated TDF gene.
  • TDF protein tapetal development and function
  • CMS lines which have a mutation in the mitochondrial genome, which leads to a cytoplasmic male sterility (CMS). Since these lines no longer produce pollen, they can be pollinated with pollen from other lines, so that the hybrid seeds can be harvested on the CMS lines.
  • CMS lines cytoplasmic male sterility
  • Lines are fertile. By using this maintainer line as father and the CMS line as mother, seed can be obtained on the mother plants, which is still sterile, as the sterility phenotype is only inherited maternally.
  • Gametocides are alternatively used commercially on a small scale: the application of a chemical substance disturbs the development of the male flower organs, resulting in male sterility.
  • the problem here, however, is the close
  • Hybrid seed production (Whitford et al., 2013).
  • GMS genetic male sterility
  • the sterile phenotype can only be determined at the time of flowering.
  • GMS lines can not normally be used for the large-scale production of hybrids.
  • GMS lines are only possible if a distinction between homozygous sterile and heterozygous fertile plants is possible at a very early stage in the development of the plants. Ideally, this distinction is already evident in the seed.
  • genetic analyzes at an early stage of plant development, ie before the start of flower development, it is absolutely necessary to know the position of the mutation in the nuclear genome of the male sterile line as well as the sequence of the mutated gene in order to obtain corresponding DNA markers to apply to it. With the help of these markers, it will then be possible to carry out investigations already on very young seedlings or at an even earlier stage, on the basis of which the fertile plants could be discarded and the sterile plants used for hybrid seed production.
  • US 2006288440 A1 discloses a system for using nuclear-encoded male sterility for corn.
  • the system named SEED PRODUCTION TECHNOLOGY (SPT)
  • SPT SEED PRODUCTION TECHNOLOGY
  • the transgene contains the non-mutated allele of the sterility or fertility gene, so that the transgene acts as a wild-type allele.
  • the fertility-restoring transgene is genetically linked to another transgene that prevents transmission of the transgene via the pollen (pollen killer).
  • the transgenic seeds can on the one hand as dad line for the further
  • Propagation of the maternal line can be used (maintainer line) and also propagated by simple self-fertilization (Whitford et al., 2013).
  • MS1 locus In addition to the MS1 locus, other genomic loci are known in wheat that lead to male sterility (Whitford et al., 2013). So far, however, the gene responsible for sterility has never been identified and cloned.
  • the cloned gene can be used in a SPT-like system.
  • This system allows a large-scale and therefore cost-effective increase in the sterile line and thus also a cost-effective hybrid seed production.
  • the establishment of the SPT system in wheat has so far failed due to the availability of a cloned sterility gene.
  • a "plant of the genus Triticum” is a plant selected from one of the species: Triticum aestivum, Triticum aethiopicum, Triticum antiquorum, Triticum baeoticum, Triticum carthlicum, Triticum compactum, Triticum dicoccoides, Triticum dicoccone, Triticum durum, Triticum ispahanicum, Triticum macha.
  • male sterility refers to the property of a plant, still less than 20%, preferably less than 15% or 10%, more preferably less than 5% and all particularly preferred to produce no (0%) fertile progeny by crossing with a fertile plant of the same genus in comparison with a normally fertile plant, the male sterile plant being used as a parent in the cross and the normally fertile plant being used as a mother in the Crossbred is a plant of the same genotype as the male sterile plant, but which has the genetic modification such as
  • All alleles means that all alleles of the TDF gene are inactivated in all subgenomes of wheat, and since wheat has three subgenomes (subgenoms A, B and D), there are six total alleles of the TDF gene in wheat Alleles are inactivated according to the invention.
  • gene coding for tapetal development and function / "gene coding for TDF” and “TDF gene” are used synonymously herein, meaning a functional TDF gene or an allele of it.
  • the latter can also be referred to as “active TDF gene” or “active TDF allele”, in contrast to the “inactivated TDF gene” or “inactivated TDF allele”.
  • SEQ ID NOs: 1-3 Exemplary genomic sequences of the wild-type wheat TDF locus from a genotype of the typhoon variety are shown in SEQ ID NOs: 1-3.
  • SEQ ID NO: 1 is from subgenome A
  • SEQ ID NO: 2 is from subgenome B
  • SEQ ID NO: 3 is from
  • Subgenomic D SEQ ID NOs: 4, 5 and 6 show the corresponding promoter sequences.
  • SEQ ID NOs: 7, 8 and 9 show the cDNA sequence of the TDF genes from wheat subgenomes A, B and D, respectively.
  • the amino acid sequence of the encoded TDF protein is shown in SEQ ID NO: 10 (subgenome A), SEQ ID NO: 11 (subgenome B) and SEQ ID NO: 12 (subgenome D).
  • Inactivation of the TDF gene / TDF protein results in that the plant in which all the alleles of the gene coding for the TDF protein are inactivated is male sterile.
  • the male sterility can be checked by known methods, for example, by the cultivation of the plant and morphological examination of the anthers formed at the macro- and microscopic level.
  • the transcript examinations should then preferably take place in anther tissue produced by the plant in order to make reliable predictions about the occurrence of male sterility.
  • one skilled in the art can also predict the insertion of deletions or insertions into the nucleotide sequence of the TaTDF gene which will not result in frameshifting but deletion and / or insertion of amino acids into the TaTDF protein, if this results in inactivation of the functional Protein and thus the formation of a
  • Protein structure prediction can be made using appropriate software.
  • the "active gene / allele” may refer to a wild-type TDF gene / allele, such as is present in a male fertile plant
  • the locus of the "wild type TDF gene / allele” comprises a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or a nucleotide sequence which is homologous to SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
  • the cDNA of the TDF wild-type gene / allele preferably corresponds to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 7, 8 or 9 or a nucleotide sequence which is homologous to SEQ ID NO: 7, 8 or 9.
  • the “active protein” is a wild type TDF protein
  • the "wild type TDF protein” preferably comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 11 or 12 or an amino acid sequence that is at least 80%, preferably at least 85 % or at least 90%, more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% is identical to one of SEQ ID NOs: 10, 11 or 12.
  • Inactivation of the TDF gene or TDF allele may be e.g. by altering coding or regulatory (e.g., promoter) TDF sequences, wherein the
  • Change prevents or significantly reduces the function (expression) of the TDF gene.
  • One or more mutations in the coding TDF sequences (exons) or the splice signals which prevent the emergence of a functional TDF protein can also be targeted.
  • translation of a TDF sequence mutated in this way results in the synthesis of a non-functional TDF protein or a TDF protein with a significantly reduced function.
  • a suitable mutation in a coding sequence of the TDF gene or a splice signal includes the addition or deletion of one or more
  • Splice signal leads.
  • the number of added or deleted nucleotides is not divisible by three, so that the addition or deletion to a
  • Translation may also result in the synthesis of additional amino acids or fewer amino acids, which may interfere with or completely destroy the function of the TDF protein by affecting the secondary and tertiary protein structure.
  • Suitable means of mutation in addition to the known mutagenesis techniques, are in particular the technologies of "genome editing", such as meganucleases, TALENs, zinc finger nucleases or a CRISPR / Cas system, which can induce double-strand breaks in the DNA and then the addition or loss of Nucleotides, for example during a
  • one or more point mutations may also be inserted into the coding sequence, for example for introducing stop codons or for substituting nucleotides for altering the amino acid sequence of the encoded TDF protein, for example by radiation or chemical mutagens or by directed mutagenesis,
  • the male sterile plant according to the invention contains one or more mutations that either reduce (reduce) or prevent (prevent) the expression of the TDF gene, or to synthesize a non-functional TDF protein or reduced TDF protein Functionality / Activity leads (lead).
  • Deletion preferably deletion (s) from 1 to 28 nucleotides. Particularly preferably, these deletion (s) occur in exon 2 in the region corresponding to a sequence section between nucleotide positions 256 and 286 of SEQ ID NO: 3 (reference sequence).
  • the mutation (s) in the male sterile plant according to the invention which results in the inactivation of the TDF gene can be generated transgenically or non-transgenically. Furthermore, the present invention relates to parts and seeds of a male sterile plant according to the invention in which all the alleles of the gene coding for TDF are inactivated.
  • the plant cell is derived from a male sterile plant of the genus Triticum.
  • a nucleic acid molecule comprising a partial sequence (fragment) of the nucleotide sequences mentioned in (a) to (f) is likewise provided by the present invention. The fragment has a length of at least 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400 or 500 consecutive nucleotides.
  • the partial nucleotide sequence is preferably in sense orientation, anti-sense (inverse complementary) orientation or complementary
  • stringency refers to hybridization conditions High stringency is given when base pairing is difficult, low stringency when base pairing is facilitated, for example, stringency of hybridization conditions depends on salt concentration and ionic strength and temperature For example, the stringency can be increased by raising the temperature and / or lowering the salt content
  • Hybridization conditions are to be understood as those conditions in which a
  • Hybridization takes place predominantly only between homologous nucleic acid molecules.
  • hybridization conditions does not only refer to the conditions prevailing during the actual attachment of the nucleic acids, but also to the conditions prevailing during the subsequent washing steps
  • Hybridization conditions are, for example, conditions under which predominantly only those nucleic acid molecules which hybridize to at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85% or at least 90%, particularly preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity.
  • Stringent hybridization conditions are, for example:
  • Hybridization conditions may also mean: hybridization at 68 ° C in 0.25M
  • the nucleic acids according to the invention can be contained in a vector.
  • the vector may be a plasmid, a cosmid, a phage or an expression vector, a transformation vector, shuttle vector or cloning vector.
  • the vector may be double- or single-stranded, linear or circular and may transform a prokaryotic or eukaryotic host either by integration into its genome or extrachromosomally.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably in a vector with one or more regulatory sequence (s) which transcript and optionally
  • Chimeric promoters can be designed to the desired specificities and induced or repressed by different factors. Examples of such promoters can be found in Gurr & Rushton, 2005 or Venter, 2007.
  • a suitable terminator is, for example, the nos terminator (Depicker et al., 1982).
  • the present invention further relates to a method for producing a transgenic plant, comprising the following steps: (i) transforming at least one cell of a plant with a nucleic acid according to the invention or with a vector according to the invention; and (ii) regenerating a plant from said transformed cell (s).
  • the invention also includes a plant of the genus Triticum produced by this process.
  • the present invention relates to the use of a nucleic acid molecule for detecting that one allele of the TDF coding gene is inactivated, the
  • Nucleic acid molecule comprises a partial sequence (fragment) of a nucleotide sequence, wherein the nucleotide sequence is preferably selected from (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9; (B) a nucleotide sequence which is complementary to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9; or (c) one
  • the fertility of the male sterile plant according to the invention can be restored (restored) by introducing a transgene comprising an active allele of the TDF gene.
  • the present invention also relates to a method for restoring the fertility of a male sterile plant of the genus Triticum, comprising the steps of: (i) transforming at least one cell of a male sterile plant of the genus
  • Triticum in which all alleles of the TDF coding gene are inactivated, with a nucleic acid or with a vector containing a TDF coding nucleotide sequence; and (ii) regenerating a fertile plant from the at least one transformed cell from (i).
  • the invention also includes a plant of the genus Triticum produced by this process.
  • the present invention provides methods involving the incorporation of a transgene, for example, in the form of a nucleic acid of the invention or a vector of the invention into a plant cell or prokaryotic cell (such as Agrobacterium).
  • the transgene can be introduced, for example, by conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium-mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation.
  • conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium-mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation are familiar to the person skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention also relates to a method for maintaining male sterility of the male sterile plant of the invention, the method comprising the steps of: (i) transforming at least one cell of a male sterile plant of the genus Triticum, in which all alleles of the TDF encoding (B) a pollen-specifically expressed transgene coding for a nucleic acid molecule or a protein preventing production of fertile pollen, and (c) a transgene causing a phenotypic trait in the plant which can be used as a selection marker; (ii) regenerating a fertile plant from the transformed cell of (i); (iii) the selves of the plants of (ii); and (iv) selecting progeny plants based on the selection marker of (i).
  • the transgenes (a) to (c) are tightly coupled, i. two
  • transgenes are less than 5 cM, less than 4 cM, less than 3 cM, less than 2 cM, less than 1 cM, less than 0.5 cM, less than 0.2 cM, less than 0.1 cM or less than 0.05 cM apart.
  • transgenes are less than 5 cM, less than 4 cM, less than 3 cM, less than 2 cM, less than 1 cM, less than 0.5 cM, less than 0.2 cM, less than 0.1 cM or less than 0.05 cM apart.
  • two of the transgenes (a) to (c) or all three transgenes (a) to (c) are on a DNA construct (e.g., an expression cassette).
  • the male sterile plant of the genus Triticum according to the invention can be used for the production of hybrid plants.
  • a male sterile plant of the genus Triticum according to the invention can be used for the production of hybrid plants.
  • a preferred embodiment a male sterile plant of the genus Triticum according to the invention.
  • a method for producing a hybrid plant of the genus Triticum comprises crossing a male sterile plant according to the invention in which all TDF alleles are inactivated with a plant having at least one active TDF allele in a subgenome.
  • the invention also encompasses a plant of the genus Triticum, preferably a hybrid plant containing at least one inactivated allele of the gene coding for tapetal development and function (TDF), obtainable by crossing the male sterile plant according to the invention in which all TDF alleles are inactivated, with a plant that has at least one active allele of the gene coding for TDF in a subgenome.
  • TDF tapetal development and function
  • the invention further relates to a method for detecting male sterility in a plant of the genus Triticum or in a seed thereof, comprising the following steps: (i) isolating DNA from the plant, a part thereof or the seed; (ii) analyzing the DNA with the aid of a nucleic acid molecule having a partial sequence of a nucleotide sequence selected from (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9, ( b) a nucleotide sequence which is complementary to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9, or (c) a nucleotide sequence which under stringent conditions with (a) or (b) hybridizes; and (iii) identifying a plant in which all alleles of the TDF coding gene are inactivated.
  • FIG. 1 Top: predicted gene structure of the gene TaTDF; bottom: a section of the gene from subgenome A ("4AS”, SEQ ID NO: 1, starting at nucleotide position 236), subgenome B (“4BL”, SEQ ID NO: 2, starting at nucleotide position 236) and subgenome D (“4DL SEQ ID NO: 3, beginning at nucleotide position 235) and sequence of a portion of the second exon (“Exon2”) exemplarily from subgenom A. Also shown are the binding sites of the two generated TALEN arms (“TAL-2” or “ TaTDF-TAL2 "and” TAL-1 "or” TaTDFTAL1 ”) as well as the Rsal interface used for the later analyzes.
  • TAL-2 binding sites of the two generated TALEN arms
  • Figure 2A and B vectors comprising the TALEN constructs for the transformation of wheat for the targeted mutation of TaTDF alleles.
  • TALEN-2 was the
  • Construct A the construct B was used for the transformation of TALEN-1.
  • ColE1 oh origin of replication for the amplification of the plasmid in E. coli
  • pVS1 -REP origin of replication for the amplification of the plasmid in Agrobacterium tumefaciens
  • Spec-R spectinomycin resistance gene for bacterial selection
  • LB Left border site of T-DNA
  • Ubiquitin promoter Promoter of the ubiquitin 1 gene from Zea mays including the 1.
  • introns Introns; Intronl: 1. Intron of the ubiquitin 1 gene from Zea mays; HPT:
  • Hygromycin phosphotransferase gene for selecting transgenic plants for hygromycin; pat: phosphinotricin acetyltransferase gene for selecting transgenic plants for phosphinotricin; 35S terminator: termination sequence of the cauliflower mosaic virus 35S gene; nosT: termination sequence of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens; Fok:
  • TaTDF-TAL2 repeats Amino acid sequence within the artificial TALEN responsible for the sequence-specific binding and the TAL-1 sequence (cf. Figure 1); TaTDF-TAL1 repeats: Amino acid sequence within the artificial TALEN responsible for the sequence-specific binding to the TAL-1 sequence (see Figure 1); TAL N terminus: N-terminus of the transcription activation-like effector (TALE) protein from Xanthomonas campestris; d35S promoter: promoter of the 35S gene from the
  • Figure 3A and 3B Sequence analysis of amplified, genomic DNA fragments from transgenic plants of the transformation experiments WA499 and WA500 (lines 1 to 22, codogenic strand). Genomic DNA of the plants was digested with Rsal, PCR amplification of the region shown was performed, and the PCR fragments were digested again with Rsal. Undigested fragments were cloned and sequenced. The binding sites of the two TALEN arms show deletions leading to a loss of the Rsal interface. Corresponding deletions are for example translated into reference sequence SEQ ID NO: 3 and shown in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 19-25.
  • FIG. 4 Analysis of individual plant progeny of the WA500-T-003 line by means of a PCR assay. All plants were subjected to PCR amplification of the TaTDF locus and the PCR product was subsequently digested with Rsal. Undigested DNA indicates the presence of mutations.
  • FIG. 6 Sterile wheat plant WA500-T-003-03-25.
  • FIG. 6 isolated ovaries with anthers of the sterile line WA500-T-003-03-25 in comparison with the wild-type plant typhoon;
  • Figure 7 Ear of the plant WA500-T-003-03-25. There are no anthers out of the husks see that would be typical of the stage shown;
  • FIG. 8 Comparison of the flowers of the sterile wheat plant WA500-T-003-03-25 and of the wild-type plant typhoon. (Arrows show anthers).
  • Example 1 Identification of candidate genes in wheat (Triticum aestivum)
  • Example 3 Generation of TALENs constructs and their use for transforming
  • FIG. 1 shows the exon / intron structure of the TaTDF gene from wheat and the binding sites for the two TALEN arms TaTDF-TAL1 and TaTDF-TAL2, which bind with a distance of 14 bp on the codogenic and non-codogenic DNA strand, respectively.
  • Sublingin is fused and cloned into either the p7U or p6U binary vector ( Figure 2).
  • the transformation of the two TALEN arms into the wheat variety typhoon then took place as a co-transformation by mixing the two Agrobacterium strains in equal parts.
  • the transgenic plants were then selected in the experiment WA499 by means of hygromycin, so that all generated transgenic plants contained the construct p6U70 SubintronTaTDF-TAL2, a part of the plants but also additionally the construct p7U70SubiintronTaTDF-TAL1.
  • WA499 9 transgenic wheat lines were identified in which both TALEN arms were integrated.
  • WA500 a co-transformation was carried out.
  • the presence of the bar gene was selected by addition of phosphinotricin in the regeneration medium.
  • 13 transgenic shoots were identified that contained both TALEN arms.
  • the transgenic starting transformants from Example 3 were examined for deletions in the region of the spacer between the two TALEN arms.
  • the Enrichment PCR method was used (Curtin et al., 201 1). This method is made use of by the effect of TALENS either
  • Deletions or insertions occur in the region of the interface, ie in the region of the spacer between the binding sites of the two TALEN arms. This can result in an existing restriction site being mutagenized in the region of the spacer, and thus can no longer cut the restriction enzyme.
  • the restriction enzyme Rsal was identified, which was to cut in the region of the spacer within the genomic wheat DNA (FIG. 1).
  • isolated genomic DNA of the transgenic wheat lines was digested with the enzyme Rsal. Mutagenized DNA should now not be digested, so that in a subsequent PCR on the gene to be mutagenized only that DNA should be amplified that was not digested, that was mutagenized by the action of TALEN. Since restriction digestion on genomic DNA is never complete, However, it will always come to the amplification of non-mutagenized DNA. In a second step, therefore, the amplified PCR product was digested once more with the enzyme Rsal. If undigested fragments are formed here, it is likely that the amplified gene locus was indeed mutagenized by the action of TALEN. To confirm this assumption, the generated undigested PCR products were cloned into the cloning vector pGEM-T and sequenced.
  • Leaf material was used.
  • the TALENs should be active in all cells.
  • the detected mutations may be present only in the analyzed leaf tissue but not in other parts of the plant.
  • This chimeric character of the plant requires that the transgenic plants be transferred to the next generation. Then the chimeric nature of the plants should be eliminated, and the mutation should be present in all cells of the plant and thereby be inherited according to the Mendelian rules.
  • Example 5 Generation and analysis of plants of the T1 generation
  • the plants resulting from the grains of the TO plants (T1 generation) were again tested by PCR for the presence of the mutation. First, a PCR was made on the individual wheat plants, then the PCR products
  • Example 6 Subquenom-specific analysis of plants of the T1 generation
  • Table 1 Primer systems for the subgenome-specific amplification of the wheat TaTDF gene.
  • the primers developed were then used again for the PCR assay, in which the amplified fragment of the TaTDF gene was subsequently digested with Rsal.
  • Table 2 Analysis of the mutations in the TaTDF locus of progeny line WA500-T-003 by subgenom-specific PCR. Underlined are plants bearing mutations in all three subgenomes of the TaTDF locus (WA500-T-003-003, WA500-T-003-009, WA500-T-003-012, WA500-T-003-015, WA500 -T-003-020, WA500-T-003-021, WA500-T-003-025, WA500-T-003-026 and WA500-T-003-039).
  • PCR products of the TaTDF locus specific for the A, B or D subgenome were generated and then digested with Rsal. In the presence of exclusively undigested DNA, it was assumed that the mutation was homozygous; in the presence of undigested and digested DNA it was assumed that the mutation was in the heterozygous state.
  • marker systems for capillary electrophoresis were developed based on the primer systems. These marker systems were able to clearly detect the mutations on the A, B and D subgenomes as well as distinguish between homozygous and heterozygous plants (Table 3).
  • Table 3 Subgenom-specific examination of the TaTDF locus by capillary electrophoresis. Descendants of the WA500-T-003 line were used for PCR of the TaTDF locus with fluorescently labeled, subgenom-specific primers. The PCR products were then separated by capillary electrophoresis to detect size differences of> 1 bp. As a control, DNAs from various commercially available fertile wheat cultivars were used (last 7 lines). In the A sub-genome, a 2 bp deletion could be detected in the WA500-T-003 offspring, which can be recognized as a 403 bp fragment instead of a 405 bp fragment in capillary electrophoresis.
  • the mutation is homozygous; if both the 403 bp and the 405 bp fragment can be detected, then the mutation is heterozygous; if only the 405 bp fragment can be detected, the wt sequence is homozygous.
  • a PCR fragment of 190 bp is detected in the wt in capillary electrophoresis. If the mutation occurs homozygously, only a 187 bp fragment is detected; in the heterozygous state, both a 187 bp and a 190 bp fragment are detected.
  • WA500-T-003-003 was homozygous for the A and D subgenome, and heterozygous for the B subgenome.
  • WA500-T-003-021 was homozygous for the A subgenome and the B subgenome, but only heterozygous for the D subgenome.
  • Typhoon 405 190 189
  • Table 4 Subgenome-specific detection of deletions in the TaTDF locus of progeny lines WA500-T-003-03 and WA500-T-003-21 using capillary electrophoresis markers.
  • the underline marks lines that are homozygous for all three deletions.
  • the female flower organs of the plants are perfectly normal, which does not indicate a disturbance of female fertility. Even otherwise no abnormal phenotypes can be observed on the plants.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, deren sämtliche Allele des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens inaktiviert sind, und Teile, Samen und Nachkommen davon, sowie Nukleinsäuren, Vektoren und transgene Pflanzen, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, Verfahren zur Restauration einer Fertilität und Verfahren zum Nachweis.

Description

Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum
Die Erfindung betrifft eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für das Protein tapetal development and function (TDF) codierenden Gens inaktiviert sind. Desweiteren betrifft die Erfindung Nachkommen dieser Pflanze sowie Teile und Samen dieser Nachkommen, die ein inaktiviertes TDF-Gen enthalten.
Hybriden zeigen in der Regel deutlich höhere Erträge als Liniensorten, so dass bei zahlreichen Kulturpflanzen die Hybridzüchtung für die Sortenentwicklung genutzt wird.
Die kommerzielle Nutzung von Hybridweizen / Hybriden der Gattung Triticum (Weizen) ist sehr begrenzt, da alle zur Zeit zur Verfügung stehenden Systeme mit erheblichen, technischen Problemen zu kämpfen haben.
Voraussetzung für die Entwicklung von Hybridsorten ist die Verfügbarkeit von männlich sterilen Linien, um die Befruchtung gezielt steuern zu können.
Häufig werden hierzu sogenannte CMS-Linien verwendet, die eine Mutation im mitochondrialen Genom aufweisen, was zu einer cytoplasmatisch bedingten, männlichen Sterilität (CMS) führt. Da diese Linien keinen Pollen mehr produzieren, können sie gezielt mit Pollen einer anderen Linien bestäubt werden, so dass auf den CMS-Linien das Hybridsaatgut geerntet werden kann.
Ein Problem stellt die Erhaltung und Vermehrung der CMS-Linien dar, da diese nicht durch Selbstbestäubung vermehrt werden können. Für die Erhaltung dieser Linien benötigt man daher sogenannte Maintainer-Linien. Diese Linien sind im Kerngenom genetisch identisch mit der männlich sterilen Linie, jedoch tragen sie nicht die mitochondriale Mutation, so dass diese
Linien fertil sind. Durch Nutzung dieser Maintainer-Linie als Vater und der CMS-Linie als Mutter kann auf den Mutterpflanzen Saatgut erhalten werden, welches weiterhin steril ist, da der Sterilitätsphänotyp ausschließlich maternal vererbt wird.
Diese maternale Vererbung bedingt aber auch, dass das Hybridsaatgut von CMS-Linien immer im Sterilitätsplasma vorliegt und somit männlich sterile Pflanzen hervorbringt. Bei
Kulturpflanzen, in denen das Ernteprodukt ein vegetatives Organ ist, z.B. Zuckerrübe ist dies kein Problem. Bei Kulturarten, bei denen Saatgut das Ernteprodukt ist, muss durch Einfügen eines sogenannten Restorergens die Fertilität der Hybride wiederhergestellt werden. Das Restorergen ist kerncodiert und ist in der Lage die durch die Mutation im Mitochondrium hervorgerufenen Defekte in der Entwicklung der männlichen Blütenorgane zu kompensieren, und somit die Fertilität wiederherzustellen. Häufig ist es schwer, gut wirksame Restorergene zu identifizieren und für die Züchtung zu nutzen. Die bekannten, CMS-basierten Systeme sind in Weizen aufgrund der schwierigen Saatgutproduktionen (CMS-Linie; Maintainer-Linie; Restorerlinie) zu kostenintensiv, so dass eine kommerzielle Anwendung der Systeme in der Vergangenheit gescheitert ist.
In geringem Maßstab werden alternativ Gametozide kommerziell genutzt: Durch Applikation einer chemischen Substanz wird die Entwicklung der männlichen Blütenorgane gestört, so dass es zu einer männlichen Sterilität kommt. Das Problem hierbei ist jedoch das enge
Ausbringungsfenster des Gametozids im Feld. Durch ungeeignete Wetterbedingungen kann die Applikation des Gametozids verhindert werden, was somit zu einem Totalausfall der
Hybridsaatgutproduktion führt (Whitford et al., 2013).
Neben den CMS-basierten, männlich sterilen Phänotypen sind ferner Systeme bekannt, die auf Mutationen im Kerngenom basieren und eine sogenannte Genetic Male Sterility (GMS) hervorrufen. Solche Mutationen sind meist rezessiv, so dass der männlich sterile Phänotyp nur im homozygot, rezessiven Zustand ausgebildet wird. Dadurch ist eine einfache Restoration der Fertilität gegeben, da durch Einbringen eines nicht mutierten Allels des GMS-Gens (z.B. durch die Vaterpflanze bei der Hybridsaatgutproduktion) die männliche Sterilität wieder aufgehoben werden kann, und die Hybriden somit voll fertil sind.
Das Problem liegt allerdings auch hier in der Erhaltung und Vermehrung der männlich sterilen Linien (Kempe und Gils, 201 1 ). Durch Kreuzung der sterilen GMS-Linien mit Pollen einer heterozygoten Mutante werden in der Nachkommenschaft immer nur maximal 50% der
Nachkommen steril sein. Der sterile Phänotyp ist allerdings erst zum Zeitpunkt der Blüte festzustellen. Somit können GMS-Linien normalerweise nicht für die großflächige Produktion von Hybriden eingesetzt werden.
Die Nutzung von GMS-Linien ist nur dann möglich, wenn zu einem sehr frühen Zeitpunkt in der Entwicklung der Pflanzen eine Unterscheidung zwischen homozygot sterilen und heterozygot- fertilen Pflanzen möglich ist. Im Idealfall ist diese Unterscheidung bereits am Samen erkennbar. Um genetische Analysen in einem frühen Stadium der Pflanzenentwicklung, also vor Beginn der Blütenentwicklung, durchführen zu können, ist es jedoch zwingend notwendig, die Position der Mutation im Kerngenom der männlich sterilen Linie sowie die Sequenz des mutierten Gens zu kennen, um entsprechende DNA-Marker darauf anwenden zu können. Mit Hilfe dieser Marker ist es dann möglich sein, bereits an sehr jungen Sämlingen oder in einem noch früheren Stadium Untersuchungen durchzuführen, auf deren Grundlage die fertilen Pflanzen verworfen und die sterilen Pflanzen für die Hybridsaatgutproduktion genutzt werden könnten. US 2006288440 A1 offenbart ein System zur Nutzung von kerncodierter, männlicher Sterilität für Mais. Das System mit dem Namen SEED PRODUCTION TECHNOLOGY (SPT) basiert darauf, dass eine sterile Maismutante, deren Sterilität durch eine Mutation in einem bekannten, kerncodierten Gen verursacht wird, durch Einfügen eines Transgens restauriert werden kann. Das Transgen enthält dabei das nicht mutierte Allel des Sterilitäts- bzw. Fertilitätsgens, so dass das Transgen als Wildtyp-Allel fungiert. Das Fertilität restaurierende Transgen ist genetisch gekoppelt mit einem weiteren Transgen, welches die Weitergabe des Transgens über den Pollen verhindert (Pollenkiller). Dadurch entsteht bei Selbstbefruchtungen der transgenen Linie nur Saatgut, das hemizygot für das die Fertilität wiederherstellende Transgen ist. Für das Transgen homozygotes Saatgut kann nicht gebildet werden. Dies ist sehr wichtig für die Effizienz des Systems, da der Maintainer nur im hemizygoten Zustand sowohl fertiles, transgenes Saatgut als auch steriles, nicht transgenes Saatgut nach Selbstbefruchtung erzeugen kann. Liegt das Transgen hingegen im homozygoten Zustand vor, würden alle Nachkommen wieder fertil sein. Das Transgen enthält des Weiteren eine Expressionskassette, die zur Rotfluoreszenz der Samen führt. Somit lassen sich transgene von nicht transgenen Samen einfach unterscheiden. Da die transgenen Samen fertil sind, kann auf Basis der Fluoreszenz auch eine Separierung in fertile und sterile Pflanzen stattfinden. Durch Aussaat der nicht transgenen Samen erhält man somit die für die Hybridproduktion notwendigen
Mutterpflanzen, die transgenen Samen können zum einen als Vaterlinie für die weitere
Vermehrung der Mutterlinie verwendet werden (Maintainerlinie) und auch durch einfache Selbstung vermehrt werden (Whitford et al., 2013).
Das SPT System kann theoretisch in allen Pflanzenarten angewandt werden. Voraussetzung ist jedoch das Vorhandensein einer GMS-Linie sowie die Kenntnis über die Struktur desjenigen Gens, welches infolge einer Mutation die männliche Sterilität verursacht und somit für den GMS-Phänotyp verantwortlich ist.
Für Weizen sind kerncodierte Sterilitätssysteme auf Basis des Genlocus MS1 (Cornerstone) entwickelt worden (Zhou et al., 2006). Die Restaurierung der Fertilität erfolgt hier durch ein Extra-Chromosom, welches aus Agropyron elongatum stammt. Gleichzeitig vererbt das ExtraChromosom einen Genlocus, der zur Blaufärbung des Aleurons führt, so dass hier eine frühzeitige Unterscheidung von sterilen und fertilen Pflanzen anhand der Samenfärbung möglich ist (Whitford et al., 2013). Obwohl verstanden ist, dass der männlich sterile Phänotyp in der Cornerstone-Mutante durch eine Deletion im kurzen Arm des Chromosoms 4B zustande kommt, konnte das verantwortliche Gen bislang noch nicht identifiziert und kloniert werden. Es ist nicht auszuschließen, dass nicht nur ein Gen innerhalb der Deletion für die Ausprägung des männlich sterilen Phänotyps verantwortlich ist, sondern dass die Kombination der Entfernung mehrerer Gene zu der männlichen Sterilität führt. Inwieweit ein derartiger Locus dann für die Anwendung in einem SPT-ähnlichen System angewendet werden kann, muss erst noch experimentell gezeigt werden.
Neben dem MS1 -Locus sind weitere genomische Loci im Weizen bekannt, die zu männlicher Sterilität führen (Whitford et al., 2013). Bisher konnte jedoch noch in keinem Fall das für die Sterilität verantwortliche Gen identifiziert und kloniert werden.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum zur Verfügung zu stellen, deren Sterilität kerncodiert ist.
Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst. Die vorliegende Erfindung stellt erstmals ein kloniertes Weizengen (TaTDF) zur Verfügung, dessen Inaktivierung zu einem männlich sterilen Phänotyp im Weizen führt. Die durch die Inaktivierung des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens erzeugte Mutante kann für die Entwicklung eines Hybridweizensystems genutzt werden.
Die bekannte, männlich sterile Arabidopsis-Mutante TDF1 (tapetal development and function 1), weist eine Mutation im AtMYB35-Gen auf. Ein bekanntes potentielles Homolog einer monocotyledonen Pflanze ist das Reis-Gen Os03g18480. Mutationen in LOC_Os03g 18480, die im Reis zu einer männlichen Sterilität führen, sind jedoch nicht bekannt.
Das TDF-Gen aus Weizen (TaTDF) zeigt zwar eine hohe Sequenzübereinstimmung mit dem Protein LOC_Os03g 18480 aus Reis, welches wiederum die höchste Homologie zu AtMYB35 zeigt. Vergleicht man jedoch die Aminosäuresequenzen der drei Proteine, so fällt auf, dass die Homologie zwischen dem von AtMYB35 und von Os03g18480 codierten Protein überwiegend auf dem N-Terminus beschränkt ist, wohingegen der C-Terminus des Proteins kaum
signifikante Homologien zeigt.
Durch das von der vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Wissen über das für die Sterilität verantwortliche Gen in Weizen können sehr spezifische DNA-Marker entwickelt werden, die eine Unterscheidung von männlich sterilen und fertilen Pflanzen in einem sehr frühen Stadium ermöglichen. Dies ist insbesondere für den Züchtungsprozess für die
Entwicklung von männlich sterilen Linien von Vorteil.
Gleichzeitig kann das Wissen über das Sterilitätsgen aber auch Anwendung finden bei der Unterscheidung von Samen, die sterile oder fertile Pflanzen hervorbringen. Dazu wird eine Gewebeprobe des Samens mittels Seed clipping Technologie abgenommen und mittels DNA Markern untersucht. Dadurch können die Samen sortiert werden in solche, die fertile bzw. solche, die sterile Pflanzen hervorbringen.
Außerdem kann das klonierte Gen in einem SPT-ähnlichen Systems verwendet werden. Dieses System ermöglicht eine großflächige und damit kostengünstige Vermehrung der sterilen Linie und damit auch eine kostengünstige Hybridsaatgutproduktion. Die Etablierung des SPT- Systems in Weizen scheiterte bisher an der Verfügbarkeit eines klonierten Sterilitätsgens.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens
(sämtliche TDF-Allele) inaktiviert sind. Eine„Pflanze der Gattung Triticum" ist beispielsweise eine Pflanze ausgewählt aus einer der Spezies: Triticum aestivum, Triticum aethiopicum, Triticum antiquorum, Triticum baeoticum, Triticum carthlicum, Triticum compactum, Triticum dicoccoides, Triticum dicoccon, Triticum durum, Triticum ispahanicum, Triticum macha, Triticum monococcum, Triticum parvicoccum, Triticum χ petropavlovskyi, Triticum polonicum, Triticum sinskajae, Triticum spelta, Triticum sphaerococcum, Triticum tetraurartu, Triticum timopheevii, Triticum turanicum, Triticum turgidum, Triticum urartu, Triticum vavilovii oder Triticum χ zhukovskyi.
Die Begriffe„männliche Sterilität",„männlich steriler Phänotyp",„männlich steril" oder vergleichbare Termini bezeichnen die Eigenschaft einer Pflanze, nur noch weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 15% oder 10%, besonders bevorzugt weniger als 5% und ganz besonders bevorzugt keine (0%) fertilen Nachkommen durch Kreuzung mit einer fertilen Pflanze derselben Gattung im Vergleich mit einer normal fertilen Pflanze zu erzeugen, wobei die männlich sterile Pflanze in der Kreuzung als Vater eingesetzt wird und die normal fertile Pflanze, welche als Mutter in der Kreuzung eingesetzt wird, eine Pflanze desselben Genotyps wie die männlich sterile Pflanze ist, welche jedoch die genetische Modifikation wie
beispielsweise Geninaktivierung oder Mutation, die die männliche Sterilität verursacht, nicht aufweist.
„Sämtliche Allele" bedeutet, dass alle Allele des TDF-Gens in allen Subgenomen des Weizens inaktiviert sind. Da Weizen über drei Subgenome verfügt (Subgenome A, B und D), sind insgesamt sechs Allele des TDF-Gens im Weizen vorhanden. Alle sechs Allele sind gemäß der Erfindung inaktiviert.
Die Begriffe„für tapetal development and function codierendes Gen" /„für TDF codierendes Gen" und„TDF-Gen" werden hierin synonym verwendet. Gemeint ist ein funktionelles TDF-Gen bzw. ein Allel davon. Letzteres kann auch als„aktives TDF-Gen" bzw.„aktives TDF-Allel" bezeichnet werden, in Abgrenzung zum„inaktivierten TDF-Gen" oder„inaktivierten TDF-Allel".
Exemplarische genomische Sequenzen des Wildtyp Weizen-TDF-Locus aus einem Genotyp der Sorte Taifun sind in SEQ ID NOs: 1 -3 gezeigt. SEQ ID NO: 1 stammt aus dem Subgenom A, SEQ ID NO: 2 stammt aus dem Subgenom B, und SEQ ID NO: 3 stammt aus dem
Subgenom D. SEQ ID NOs: 4, 5 und 6 zeigen die entsprechenden Promotorsequenzen. In SEQ ID NOs: 7, 8 und 9 ist die cDNA-Sequenz der TDF-Gene aus den Weizen-Subgenomen A, B bzw. D gezeigt. Die Aminosäuresequenz des codierten TDF-Proteins ist in SEQ ID NO: 10 (Subgenom A), SEQ ID NO: 1 1 (Subgenom B) und SEQ ID NO: 12 (Subgenom D)
wiedergegeben.
„Inaktiviertes TDF-Gen" oder„inaktiviertes TDF-Allel" bedeutet, dass die Funktion des TDF- Gens bzw. -Allels und/oder des TDF-Proteins inaktiviert ist (d.h. ausgeschaltet oder nicht mehr vorhanden) oder signifikant reduziert ist. Vorzugsweise ist die Funktion des TDF-Gens bzw. TDF-Allels und/oder des TDF-Proteins um mindestens 80%, oder mindestens 85% im Vergleich zum aktiven Gen/Allel/Protein reduziert. Besonders bevorzugt ist eine Reduzierung der Funktion um mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% im Vergleich zum aktiven Gen/Allel/Protein. Die Funktion des TDF-Gens bzw. -Allels ist zum Beispiel signifikant reduziert, wenn die Expression des Gens nur 20% oder weniger, 15% oder weniger, 10% oder weniger, oder 5% oder weniger als die Expression eines aktiven Gens/Alles beträgt. Die Funktion des TDF-Proteins ist zum Beispiel signifikant reduziert, wenn das Proteins nur 20% oder weniger, 15% oder weniger, 10% oder weniger, oder 5% oder weniger der biologischen Aktivität eines aktiven Gens/Allels aufweist.
Die Inaktivierung des TDF-Gens/-Allels bzw. TDF-Proteins hat zur Folge, dass die Pflanze, in der sämtliche Allele des für das TDF-Protein codierenden Gens inaktiviert vorliegen, männlich steril ist. Die männliche Sterilität lässt sich durch bekannte Verfahren überprüfen, beispielsweise durch den Anbau der Pflanze und morphologische Untersuchung der gebildeten Antheren auf makro- und mikroskopischer Ebene. Weiterhin können auch bekannte molekulare
Analyseverfahren herangezogen werden, mit deren Hilfe für den Fall, dass die Inaktivierung aufgrund einer Mutation auf DNA-Ebene erfolgt, die molekulare Struktur dieser Mutation festgestellt werden kann. Führt die Mutation, beispielsweise eine Deletion oder Insertion von Nukleotiden, zu einer Leserasterverschiebung, kann der Fachmann Vorhersagen darüber treffen, ob eine männliche Sterilität in der Pflanze vorliegen wird. Im Fall einer Inaktivierung durch Inhibition des TDF-Gens/-Allels oder der TDF-Gene/-Allele über ein RNAi-vermitteltes Gene-Silencing oder einer Mutation/Deletion/Insertion im Genpromotor (zum Beispiel im Bereich des Minimalpromoters oder Transkriptionsstarts), sollte dies zu einer reduzierten Transkriptmenge führen. Hierbei sollten die Transkriptuntersuchungen dann vorzugsweise im von der Pflanze gebildeten Antherengewebe erfolgen, um verlässliche Vorhersagen über das Auftreten der männlichen Sterilität zu machen. Desweiteren kann der Fachmann auch bei der Einfügung von Deletionen oder Insertionen in die Nukleotidsequenz des TaTDF Gens, die nicht zur Leserasterverschiebung führen aber zu einer Deletion und/oder Insertion von Aminosäuren in das TaTDF-Protein eine Vorhersage treffen, ob dies zu einer Inaktivierung des funktionalen Proteins und damit zur Ausbildung einer
männlichen Sterilität führt. Eine derartige Vorhersage kann z.B. durch eine
Proteinstrukturvorhersage mittels geeigneter Software getroffen werden.
Das„aktive Gen/Allel" kann ein TDF-Wildtyp-Gen/-Allel meinen, wie es zum Beispiel in einer männlich fertilen Pflanze vorliegt. Vorzugsweise umfasst der Locus des„TDF-Wildtyp-Gens/- Allels" ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 , 2 oder 3 oder eine Nukleotidsequenz, die zur SEQ ID NO: 1 , 2, oder 3 homolog ist. Die cDNA des TDF-Wildtyp-Gen/-Allel entspricht vorzugsweise einem Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 7, 8 oder 9 oder eine Nukleotidsequenz, die zur SEQ ID NO: 7, 8 oder 9 homolog ist. Das„aktive Protein" ist ein TDF-Wildtyp-Protein. Das „TDF-Wildtyp-Protein" umfasst vorzugsweise die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist zu einer der SEQ ID NOs: 10, 1 1 oder 12.
Die Inaktivierung des TDF-Gens bzw. TDF-Allels kann z.B. durch die Veränderung von codierenden oder regulatorischen (z.B. Promotor) TDF-Sequenzen erfolgen, wobei die
Veränderung die Funktion (Expression) des TDF-Gens verhindert oder signifikant reduziert. Es können auch gezielt eine oder mehrere Mutationen in die codierenden TDF-Sequenzen (Exons) oder die Spleißsignale eingefügt werden, die das Entstehen eines funktionellen TDF-Proteins verhindern, d.h. dass die Translation einer auf diese Art mutierten TDF-Sequenz zur Synthese eines nicht-funktionellen TDF-Proteins oder eines TDF-Proteins mit einer signifikant reduzierten Funktion führt.
Eine geeignete Mutation in einer codierenden Sequenz des TDF-Gens oder einem Spleißsignal umfasst zum Beispiel die Addition oder Deletion von einer oder mehreren
Teilnukleotidsequenzen mit einer Länge von mindestens einem Nukleotid der genomischen TDF-Sequenz, vorausgesetzt diese Addition oder Deletion führt dazu, dass keine Funktion oder nur eine signifikant reduzierte Funktion des synthetisierten TDF-Proteins gegeben ist, d.h. dass eine Inaktivierung des TDF-Gens/-Allels bzw. TDF-Proteins vorliegt. Eine solche Addition oder Deletion ist dann eine besonders geeignete Mutation, wenn die Addition zur Insertion von mindestens einem Nukleotid in einem Exon führt und/oder zum Zerstören eines Spleißsignals führt, oder die Deletion zum Verlust eines Teils eines Exons und/oder zum Verlust eines
Spleißsignals führt. Im Falle einer Addition mit Insertion in einem Exon oder einer Deletion mit Verlust eines Teils des Exons, ist vorzugsweise die Anzahl der addierten bzw. deletierten Nukleotide nicht durch drei teilbar, so dass die Addition bzw. Deletion zu einer
Leserasterverschiebung führt. Eine Addition oder Deletion kann weiterhin im Zuge der
Translation auch die Synthese zusätzlicher Aminosäuren bzw. weniger Aminosäuren zur Folge haben, was die Funktion des TDF-Proteins stören oder vollends zerstören kann, indem es Auswirkungen auf die sekundäre und tertiäre Proteinstruktur hat. Geeignete Mittel zur Mutation sind neben den bekannten Mutagenese-Techniken insbesondere die Technologien des „Genome Editing", wie beispielsweise Meganukleasen, TALENs, Zinkfingernukleasen oder ein CRISPR/Cas-System, welche Doppelstrangbrüche in der DNA induzieren können und dann das Hinzufügen oder den Verlust von Nukleotiden beispielsweise während eines
Rekombinationsereignisses begünstigen.
Ferner können auch eine oder mehrere Punktmutationen in die codierende Sequenz eingefügt werden, zum Beispiel zum Einbringen von Stopp-Codons oder zur Substitution von Nukleotiden zwecks Veränderung der Aminosäuresequenz des codierten TDF-Proteins, beispielsweise durch Strahlung oder chemische Mutagenzien oder durch gerichtete Mutagenese,
beispielsweise mittels TILLING. Teilweise können Punktmutationen auch durch Gene-Repair- OligoNucleotide (GRON)-Technik oder auch CRISPR/Cas erfolgen. Weiterhin können
Insertionen, die zur Inaktivierung führen, auch durch Transposon-Mutagenese eingebracht werden. Die oben genannten Techniken des Genome Editings wie auch die Mutagenisierungs- Technologien sind auch geeignet, vorhandene Spleißsignale zu zerstören oder neue einzufügen.
Die Inaktivierung des TDF-Gens bzw. TDF-Allels kann durch eine oder mehrere der oben und auch weiter unten beschriebenen Techniken herbeigeführt werden; dem Fachmann sind jedoch noch weitere Verfahren zur Inaktivierung bekannt, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Somit sollen die genannten Techniken der Inaktivierung nicht als abschließend oder den Umfang der Erfindung beschränkend verstanden werden.
Die Entstehung von funktionellem TDF-Protein kann ferner posttranskriptionell verhindert oder signifikant reduziert werden, z.B. durch RNA-Inhibierung. Ein weiterer Weg zur Inaktivierung des TDF-Gens bzw. TDF-Allels ist, inaktive Genversionen in natürlichen Quellen mittels EcoTILLING zu identifizieren und diese dann durch sexuelle Kreuzung, Protoplastenfusion oder ähnliche Verfahren und gleichzeitige Marker-gestützte Selektion in das Kerngenom von anderen Linien, vorzugweise Elite-Linien, zu überführen. Folglich kann das TDF-Gen der männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum gemäß der Erfindung eine oder mehrere Mutation(en) enthalten. Vorzugsweise enthält die männlich sterile Pflanze gemäß der Erfindung eine oder mehrere Mutation(en), die entweder die Expression des TDF-Gens reduziert (reduzieren) oder verhindert (verhindern), oder zur Synthese eines nichtfunktionellen TDF-Proteins oder eines TDF-Proteins mit reduzierter Funktionalität/Aktivität führt (führen).
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt (liegen) diese Mutation(en) in einem oder mehreren Exon(s) vor, besonders bevorzugt in demselben Exon des TDF-Gens bzw. der TDF-Allele der Subgenome, vorzugsweise in Exon 2. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform liegt (liegen) die Mutation(en) im Exon 2 in einer Region korrespondierend zu einem
Sequenzabschnitt zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 286 der SEQ ID NO: 3, beispielsweise (a) zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 285 der SEQ ID NO: 3, (b) zwischen den Nukleotidpositionen 258 und 285 der SEQ ID NO: 3, (c) zwischen den
Nukleotidpositionen 281 und 286 der SEQ ID NO: 3, oder (d) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 283 der SEQ ID NO: 3; oder (e) an der Nukleotidposition 282 der SEQ ID NO: 3.
Besonders bevorzugt entsprechen die Mutationen mindestens einer der Mutationen in einer der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 19 bis 25, welche mit Referenz zu SEQ ID NO: 3 wiedergegeben sind. Vorstehende Angaben zu Nukleotidpositionen bzw. Mutationenbeziehen sich auf SEQ ID NO: 3 aus dem Subgenom D (die„Referenzsequenz"). In den TDF-Genen/- Allelen der anderen Subgenome können die Nukleotidpositionen aufgrund der Divergenz zwischen den Allelen unterschiedlich sein. Die für die Mutation(en) gemäß der Erfindung bevorzugten Regionen im TDF-Gen/-Allel sind nicht beschränkt auf die für die Referenzsequenz angegebenen Nukleotidpositionen, vielmehr können die Mutation(en) auch an den
entsprechenden Positionen der Nukleotidsequenz anderer Allele liegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der(den) Mutation(en) um
Deletion(en), vorzugsweise um Deletion(en) von 1 bis 28 Nukleotiden. Besonders bevorzugt treten diese Deletion(en) im Exon 2 in der Region korrespondierend einem Sequenzabschnitt zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 286 der SEQ ID NO: 3 (Referenzsequenz) auf.
Die Mutation(en) in der männlich sterilen Pflanze gemäß der Erfindung, die zur Inaktivierung des TDF-Gens führt (führen), kann (können) transgen oder nicht-transgen erzeugt werden. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Teile und Samen einer männlich sterilen Pflanze gemäß der Erfindung, in der sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind.
Ein„Teil" einer Pflanze meint im Sinne der vorliegenden Erfindung ein pflanzliches Organ wie beispielsweise Blatt, Sprossachse, Stamm, Wurzel, vegetative Knospe, Meristem, Embryo, Anthere, Ovula oder Frucht; oder bezeichnet einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z.B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z.B. einen Querschnitt aus der Sprossachse; oder bezeichnet ein pflanzliches Gewebe wie Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematisches Gewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe,
Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Pflanzenzelle, dadurch
gekennzeichnet, dass sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind.
Vorzugsweise stammt die Pflanzenzelle aus einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum.
Unter einer„Pflanzenzelle" ist im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise eine isolierte Zelle mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nachkommen der erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum und Teile oder Samen davon, enthaltend mindestens ein inaktiviertes TDF-Gen/-Allel. Für beispielsweise hexaploide Pflanzen der Gattung Triticum wie Triticum aestivum können auch zwei, drei, vier oder fünf inaktivierte TDF-Gene/-Allele enthalten sein; für beispielsweise tetraploide Pflanzen der Gattung Triticum wie Triticum durum können auch zwei oder drei inaktivierte TDF-Gene/-Allele enthalten sein. Die Nachkommen der Pflanzen sind beispielsweise herstellbar durch Kreuzung einer erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum mit einer fertilen Pflanze derselben Gattung, wobei die männlich sterile Pflanze in der Kreuzung als Vater eingesetzt wird und die normal fertile Pflanze als Mutter in der Kreuzung eingesetzt wird. Die Nachkommenpflanzen oder ein Teil oder Samen davon können eine Hybridpflanze der Gattung Triticum bzw. ein Teil oder Samen davon sein. Vorzugsweise meint„Hybridpflanze" eine Pflanze der F1 Generation einer Kreuzung aus zwei nicht identischen Elternlinien.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, umfassend das Inaktivieren von sämtlichen Allelen des für TDF codierenden Gens in der Pflanze. Geeignete Verfahren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt. Die oben aufgeführten Verfahren zum Herstellen einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum stellen keine abschließende oder beschränkende Aufzählung dar. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus den folgenden: (a) einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 , 2 oder 3 oder SEQ ID NO: 7, 8 oder 9; (b) einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein enthaltend eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 oder eine
Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 96%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% zu einer der
Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 aufweist, codiert; (c) einer
Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu (a) oder (b); (d) einer Nukleotidsequenz, die homolog ist zu (a) oder (b) oder eine Identität von mindestens 70 % zu (a) oder (b) aufweist, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein kodiert; (e) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und (f) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (c) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein kodiert. Ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Teilsequenz (Fragment) der in (a) bis (f) genannten Nukleotidsequenzen ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Das Fragment hat eine Länge von mindestens 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400 oder 500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Die Teilnukleotidsequenz liegt vorzugsweise in sense Orientierung, anti-sense (invers komplementäre) Orientierung oder komplementärer
Orientierung zu derjenigen Nukleotidsequenz vor, aus welcher die Teilsequenz / dasFragment stammt. Fragmente können als Primer, Sonden, oder inhibitorische Sequenzen (zum Beispiel für einen RNAi-Ansatz) verwendet werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter„homologen Sequenzen" oder„Homologe" oder vergleichbaren Termini Nukleinsäuremoleküle verstanden, welche den gleichen phylogenetischen Ursprung haben. Vorzugsweise üben Proteine, die durch diese
Nukleinsäuremoleküle codiert werden, die gleiche Funktion aus. Homologe
Nukleinsäuremoleküle weisen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität auf. Unter„Hybridisieren" oder„Hybridisierung" wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären
Nukleinsäurestrang anlagert, d.h. Basenpaarungen eingeht. Standardverfahren zur
Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. 2001 beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäuremoleküls eine Basenpaarung mit dem weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff„Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. lonenstärke und der Temperatur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter„stringenten
Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine
Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente
Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise:
Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff "stringente
Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M
Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und
anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 x SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einem Vektor enthalten sein. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen oder einen Expressionsvektor, einen Transformationsvektor, Shuttle-Vektor oder Klonierungsvektor handeln. Der Vektor kann doppel- oder einzelsträngig, linear oder zirkulär sein und kann einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in dessen Genom oder extrachromosomal transformieren. Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenz(en), welche die Transkription und optional die
Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle erlauben, operativ verknüpft. Eine regulatorische Sequenz, vorzugsweise DNA, kann homolog oder heterolog zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäure sein. Beispielsweise steht die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder eines Terminators. Geeignete Promotoren können Promotoren sein, welche konstitutiv induziert werden (Bsp.: 35S-Promoter aus dem„Cauliflower mosaic virus" (Odell et al., 1985). Besonders geeignet sind solche Promotoren, welche gewebespezifisch sind (zum Beispiel pollenspezifische Promotoren (Chen et al., 2010; Zhao et al., 2006; oder Twell et al., 1991 )), oder entwicklungsspezifisch sind (zum Beispiel
blühspezifische Promotoren). Geeignete Promotoren können auch synthetische bzw. chimäre Promotoren sein, welche in der Natur nicht vorkommen, aus mehreren Elementen
zusammengesetzt sind und einen Minimalpromotor beinhalten sowie stromaufwärts des Minimalpromotors mindestens ein cis-regulatorisches Element aufweisen, welches als
Bindungsstelle für spezielle Transkriptionsfaktoren dient. Chimäre Promotoren können den gewünschten Spezifitäten nach konzipiert und durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert werden. Beispiele für solche Promotoren finden sich in Gurr & Rushton, 2005 oder Venter, 2007. Ein geeigneter Terminator ist beispielsweise der nos-Terminator (Depicker et al., 1982).
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor; und (ii) Regenerieren einer Pflanze aus dieser (diesen) transformierten Zelle(n). Von der Erfindung umfasst ist auch eine durch dieses Verfahren hergestellte Pflanze der Gattung Triticum. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls zum Nachweis, dass ein Allel des für TDF codierenden Gens inaktiviert ist, wobei das
Nukleinsäuremolekül eine Teilsequenz (Fragment) einer Nukleotidsequenz umfasst, wobei die Nukleotidsequenz vorzugsweise ausgewählt ist aus (a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; (b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; oder (c) einer
Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert.
Die Fertilität der männlich sterilen Pflanze gemäß der Erfindung kann durch Einführen eines Transgens, das ein aktives Allel des TDF-Gens umfasst, wieder hergestellt (restauriert) werden. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Restauration der Fertilität einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer männlich sterilen Pflanze der Gattung
Triticum, in der sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind, mit einer Nukleinsäure oder mit einem Vektor enthaltend eine für TDF codierende Nukleotidsequenz; und (ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der mindestens einen transformierten Zelle aus (i). Von der Erfindung umfasst ist auch eine durch dieses Verfahren hergestellte Pflanze der Gattung Triticum.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die die Einbringung eines Transgens zum Beispiel in Form einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors in eine pflanzliche Zelle oder prokaryotische Zelle (wie Agrobacterium) umfassen. Das Transgen kann beispielsweise durch Konjugation, Mobilisation, biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation, Transfektion, Transduktion, Vakuuminfiltration oder Elektroporation eingebracht werden. Solche Verfahren ebenso wie Verfahren zur Präparation von beschriebenen Vektoren sind dem Fachmann geläufig (Sambrook et al. 2001 ).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Aufrechterhalten der männlichen Sterilität der erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind, mit (a) einem aktiven Allel des für TDF codierenden Gens, (b) einem Pollen-spezifisch exprimierten Transgen, das für ein Nukleinsäuremolekül oder ein Protein codiert, das die Ausbildung von fertilen Pollen verhindert, und (c) einem Transgen, das in der Pflanze ein phänotypisches Merkmal verursacht, welches als Selektionsmarker verwendet werden kann; (ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der transformierten Zelle aus (i); (iii) Selbsten der Pflanzen aus (ii); und (iv) Selektieren von Nachkommenpflanzen aufgrund des Selektionsmarkers aus (i).
Vorzugsweise werden die Transgene (a) bis (c) eng gekoppelt transformiert, d.h. zwei
Transgene sind jeweils bevorzugt weniger als 5 cM, weniger als 4 cM, weniger als 3 cM, weniger als 2 cM, weniger als 1 cM, weniger als 0,5 cM, weniger als 0,2 cM, weniger als 0,1 cM oder weniger als 0,05 cM voneinander entfernt. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform befinden sich zwei der Transgene (a) bis (c) oder alle drei Transgene (a) bis (c) auf einem DNA-Konstrukt (z.B. einer Expressionskassette).
Die erfindungsgemäße männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum kann zur Herstellung von Hybridpflanzen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein
Verfahren zum Herstellen einer Hybridpflanze der Gattung Triticum das Kreuzen einer erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze, in der sämtliche TDF-Allele inaktiviert sind, mit einer Pflanze, die mindestens ein aktives TDF-Allel in einem Subgenom aufweist. Weiterhin erfasst die Erfindung auch eine Pflanze der Gattung Triticum, vorzugsweise eine Hybridpflanze, enthaltend mindestens ein inaktiviertes Allel des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens, erhältlich durch Kreuzen der erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze, in der sämtliche TDF-Allele inaktiviert sind, mit einer Pflanze, die mindestens ein aktives Allel des für TDF codierenden Gens in einem Subgenom aufweist.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer männlichen Sterilität in einer Pflanze der Gattung Triticum oder in einem Samen davon, umfassend die folgenden Schritte: (i) Isolieren von DNA aus der Pflanze, einem Teil davon oder dem Samen; (ii) Analysieren der DNA mit Hilfe eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Teilsequenz einer Nukleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus (a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, (b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, oder (c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und (iii) Identifizieren einer Pflanze, in welcher sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.
Figur 1 : Oben: Vorhergesagte Genstruktur des Gens TaTDF; unten: ein Ausschnitt des Gens aus Subgenom A („4AS"; SEQ ID NO: 1 , beginnend mit Nukleotidposition 236), Subgenom B („4BL"; SEQ ID NO: 2, beginnend mit Nukleotidposition 236) und Subgenom D („4DL"; SEQ ID NO: 3, beginnend mit Nukleotidposition 235) und Sequenz eines Teils des zweiten Exons („Exon2") exemplarisch aus Subgenom A. Dargestellt sind außerdem die Bindungsstellen der beiden generierten TALEN-Arme („TAL-2" bzw.„TaTDF-TAL2" und„TAL-1 " bzw.„TaTDF- TAL1 "), sowie die für die späteren Analysen verwendete Rsal-Schnittstelle.
Figur 2A und B: Vektoren umfassend die TALEN-Konstrukte für die Transformation von Weizen zur gezielten Mutation der TaTDF Allele. Für die Transformation des TALEN-2 wurde das
Konstrukt A, für die Transformation des TALEN-1 wurde das Konstrukt B verwendet.
Vektorbestandteile: ColE1 oh: Replikationsursprung für die Amplifikation des Plasmids in E. coli; pVS1 -REP: Replikationsursprung für die Amplifikation des Plasmids in Agrobacterium tumefaciens ;Spec-R: Spectinomycinresistenzgen zur bakteriellen Selektion; LB: Left border site der T-DNA; Ubiquitinpromotor: Promotor des Ubiquitin 1 Gens aus Zea mays inklusive des 1 .
Introns; Intronl : 1 . Intron des Ubiquitin 1 Gens aus Zea mays; HPT:
Hygromycinphosphotransferase Gen zur Selektion transgener Pflanzen auf Hygromycin; pat: Phosphinotricin-acetyltransferase Gen zur Selektion transgener Pflanzen auf Phosphinotricin; 35S Terminator: Terminationssequenz des 35S-Gens aus dem Blumenkohlmosaikvirus; nosT: Terminationssequenz des Nopalinsythasegens aus Agrobacterium tumefaciens; Fokl:
Nukleasedomäne des Restriktionsenzyms Fokl aus Flavobacterium okeanokoites; TAL C terminus: C-Terminus des Transcription activation like effector (TALE) Proteins aus
Xanthomonas campestris; TaTDF-TAL2 repeats: Aminosäuresequenz innerhalb des artifiziellen TALEN verantwortlich für die sequenzspezifische Bindung und die TAL-1 Sequenz (vergleiche Figur 1 ); TaTDF-TAL1 repeats: Aminosäuresequenz innerhalb des artifiziellen TALEN verantwortlich für die sequenzspezifische Bindung an die TAL-1 Sequenz (vergleiche Figur 1 ); TAL N terminus: N-Terminus des Transcription activation like effector (TALE) Proteins aus Xanthomonas campestris; d35S-Promotor: Promotor des 35S-Gens aus dem
Blumenkohlmosaikvirus mit duplizierten Enhancerelement; RB: Right border site der T-DNA.
Figur 3A und 3B: Sequenzanalyse von amplifizierten, genomischen DNA-Fragmenten von transgenen Pflanzen der Transformationsexperimente WA499 und WA500 (Zeilen 1 bis 22; codogener Strang). Genomische DNA der Pflanzen wurde mit Rsal verdaut, eine PCR- Amplifikation des dargestellten Bereichs durchgeführt und die PCR-Fragmente wurden erneut mit Rsal verdaut. Unverdaute Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Im Bereich der Bindungsstellen der beiden TALEN-Arme sind Deletionen zu erkennen, die zu einem Verlust der Rsal-Schnittstelle führen. Entsprechende Deletionen sind beispielhaft in Referenzsequenz SEQ ID NO: 3 übersetzt und in den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 19-25 dargestellt.
Figur 4: Analyse von Einzelpflanzennachkommen der Linie WA500-T-003 mittels PCR Assay. Von allen Pflanzen wurde eine PCR-Amplifikation des TaTDF-Locus durchgeführt und das PCR Produkt anschließend mit Rsal verdaut. Unverdaute DNA zeigt die Präsenz von Mutationen an.
Figur 5A-J: Sequenzvergleich von amplifizierten und klonierten PCR-Fragmenten des Weizen TaTDF-Gens aus der Sorte Taifun. Sequenzübereinstimmungen sind durch Unterstreichung kenntlich gemacht; Bereiche, in denen sich die Sequenzen unterscheiden, weisen keine Unterstreichung auf. Die dargestellten Sequenzunterschiede lassen eine Zuordnung der jeweiligen Sequenz zu den einzelnen Weizensubgenomen zu. Dazu wurde die in den öffentlich verfügbaren Datenbanken vorhandenen Sequenzen aus dem A-, B- oder D-Subgenom des Weizens mit den amplifizierten Sequenzen verglichen (letzten drei Zeilen 4B (=Sugenom B), 4A (=Sugenom A) und 4D (=Sugenom D)). Zwischen den Sequenzen der Subgenome gibt es signifikante Unterschiede, die auch in den amplifizierten Sequenzen aus Taifun gefunden werden konnten. Wie aus dem Vergleich in Figur 5 zu sehen, sind die Fragmente 4 und 8 anhand der gefundenen Polymorphismen eindeutig als PCR Produkte aus dem Subgenom A anzusehen, wohingegen die übrigen Fragmente dem Subgenom D zuzuordnen sind. Aus dem Subgenom B wurde in dieser PCR somit kein Amplifikat erhalten. Die spezifischen
Sequenzunterschiede zwischen den Subgenomen wurden dann für die Generierung von Subgenom-spezifischen Primern verwendet.
Figuren 6-8: Sterile Weizenpflanze WA500-T-003-03-25. Figur 6: isolierte Ovarien mit Antheren der sterilen Linie WA500-T-003-03-25 im Vergleich zur Wildtyppflanze Taifun; Figur 7: Ähre der Pflanze WA500-T-003-03-25. Es sind keine aus den Spelzen hervortretende Antheren zu sehen, die für das dargestellte Stadium typisch wären; Figur 8: Vergleich der Blüten der sterilen Weizenpflanze WA500-T-003-03-25 und der Wildtypflanze Taifun. (Pfeile zeigen Antheren).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, schränken die Erfindung jedoch in keiner Weise ein. Beispiel 1 : Identifizieren von Kandidatenqenen in Weizen ( Triticum aestivum)
Zur Identifizierung geeigneter Kandidaten-Gene wurden folgende Auswahlkriterien angelegt:
1 ) Gene codieren für Transkriptionsfaktoren, da diese eine Vielzahl von anderen Genen steuern, sollte eine Mutation bzw. Inaktivierung dieser Gene zu stärkeren Effekten führen, als die Mutation bzw. Inaktivierung eines Strukturgens; 2) Gene werden in anderen monocotyledonen Pflanzen wie beispielsweise Reis ausschließlich Antheren-spezifisch exprimiert
Anhand der Liste möglicher Kandidatengene wurden, sofern möglich, die jeweiligen
Weizenhomologe identifiziert. Anschließend wurden die verfügbaren Expressionsdaten der Gene analysiert. Es wurde nun eine weitere Einschränkung vorgenommen auf solche
Weizengene, die eine möglichst spezifische Expression in den Antheren hatten.
Beispiel 2: Identifizieren von geeigneten Bereichen innerhalb der Gene
Auf Basis der vorhandenen Genomdaten des Weizens wurden nun Genvorhersagemodelle für die identifizierten Gene erstellt. Ziel war es, Exonbereiche für eine gezielte Mutagenese zu nutzen, um eine Veränderung der Proteinstruktur oder einen vorzeitigen Abbruch der
Translation zu erreichen. Die Mutagenese sollte dann die männliche Sterilität zur Folge haben. Erfolgreich gelang dies nur im Fall eines Kandidatengens, nämlich dem TaTDF-Gen, weshalb sich die nachfolgende Ausführungen ausschließlich auf die Arbeiten an und mit dem TaTDF- Gen beschränken.
Nach Vorlage der Exon/Intronstruktur konnten Bereiche in den Exons des TaTDF-Gens identifiziert werden, die in allen drei Subgenomen des Weizens identisch oder sehr ähnlich waren. Diese Bereiche wurden dann für die Entwicklung von TALENS genutzt (Figur 1 ).
Beispiel 3: Erzeugen von TALENs-Konstrukten und deren Verwendung zur Transformation von
Weizen
Es wurden zweimal 19 bp bzw. 25 bp des genomischen Bereichs als Bindungsstelle für eine TAL-Nuklease ausgewählt, mit einem Abstand von 12-18 bp zwischen den beiden Bindungsstellen. Figur 1 zeigt die Exon/Intron Struktur des Gens TaTDF aus Weizen sowie die Bindungsstellen für die beiden TALEN-Arme TaTDF-TAL1 und TaTDF-TAL2, die mit einem Abstand von 14 bp auf dem codogenen bzw. dem nicht codogenen DNA-Strang binden.
Nach Erstellung der TALENs wurden diese mit dem starken, konstitutiven Promotor
70Subiintron fusioniert und entweder in den Binärvektor p7U oder p6U kloniert (Figur 2). Die Transformation der beiden TALEN-Arme in die Weizensorte Taifun erfolgte dann als Co- Transformation durch Mischen der beiden Agrobakterienstämme zu gleichen Teilen. Selektiert wurden die transgenen Pflanzen dann im Versuch WA499 mittels Hygromycin, so dass alle generierten transgenen Pflanzen das Konstrukt p6U70SubintronTaTDF-TAL2 enthielten, ein Teil der Pflanzen aber auch noch zusätzlich das Konstrukt p7U70SubiintronTaTDF-TAL1 . Im ersten Transformationsversuch (WA499) konnten 9 transgene Weizenlinien identifiziert werden, in denen beide TALEN-Arme integriert waren. Im zweiten Transformationsversuch (WA500) wurde dann ebenfalls eine Co-Transformation durchgeführt. Hier wurde jedoch durch Zusatz von Phosphinotricin in das Regenerationsmedium auf Anwesenheit des bar-Gens selektiert. In diesem Versuch konnten 13 transgene Sprosse identifiziert werden, die beide TALEN-Arme enthielten.
Beispiel 4: Identifizieren von Deletionen in den transgenen Weizenpflanzen
Die transgenen Ausgangstransformanten aus Beispiel 3 wurden auf Deletionen im Bereich des Spacers zwischen den beiden TALEN-Armen untersucht. Dazu wurde die Methode der Enrichment PCR angewandt (Curtin et al., 201 1 ). Bei dieser Methode wird sich zu Nutze gemacht, dass durch die Wirkung der TALENS entweder
Deletionen oder Insertionen im Bereich der Schnittstelle, also im Bereich des Spacers zwischen den Bindungsstellen der beiden TALEN-Arme, entstehen. Dies kann dazu führen, dass eine vorhandene Restriktionsschnittstelle im Bereich des Spacers mutagenisiert wird, und somit das Restriktionsenzym nicht mehr schneiden kann.
Für die Bindungsstelle des TALENs für das TaTDF-Gen wurde das Restriktionsenzym Rsal identifiziert, welches im Bereich des Spacers innerhalb der genomischen Weizen-DNA schneiden sollte (Figur 1 ).
Für die Enrichment-PCR wurde nun isolierte, genomische DNA der transgenen Weizenlinien mit dem Enzym Rsal verdaut. Mutagenisierte DNA sollte nun nicht verdaut werden, so dass bei einer anschließenden PCR über den zu mutagenisierenden Bereich des Gens nur solche DNA amplifiziert werden sollte, die nicht verdaut wurde, also durch die Wirkung des TALEN mutagenisiert wurde. Da ein Restriktionsverdau auf genomische DNA niemals vollständig ist, wird es jedoch auch immer zur Amplifikation der nicht mutagenisierten DNA kommen. In einem zweiten Schritt wurde daher das amplifizierte PCR-Produkt noch einmal mit dem Enzym Rsal verdaut. Sollten hier unverdaute Fragmente entstehen, liegt die Vermutung nahe, dass der amplifizierte Genlocus tatsächlich durch die Wirkung des TALEN mutagenisiert wurde. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurden die generierten, unverdauten PCR-Produkte in den Klonierungsvektor pGEM-T kloniert und sequenziert.
Tatsächlich konnten in den generierten, transgenen Weizenlinien der Transformationen WA499 und WA500 zahlreiche Deletionen im Bereich der TALEN-Bindungsstelle detektiert werden. Diese reichten von einer Deletion von nur 1 bp bis zu 28 bp (Figur 3). Des Weiteren ist zu beachten, dass für die Extraktion der DNA für die Enrichment PCR
Blattmaterial verwendet wurde. Die TALENs sollten in allen Zellen aktiv sein. Somit könnte es sein, dass die detektierten Mutationen nur in dem analysierten Blattgewebe vorliegen, in anderen Teilen der Pflanze jedoch nicht. Dieser chimäre Charakter der Pflanze erfordert es, dass die transgenen Pflanzen in die nächste Generation überführt werden. Dann sollte die chimäre Natur der Pflanzen eliminiert sein, und die Mutation sollte in allen Zellen der Pflanze vorliegen und dadurch gemäß den Mendelschen Regeln vererbt werden.
Beispiel 5: Erzeugen und Analyse von Pflanzen der T1 -Generation
Die transgenen Ausgangs-Weizenlinien, für die Mutationen im Bereich des TaTDF-Gens nachgewiesen werden konnten, wurden daher durch Selbstung in die nächste Generation überführt. Die aus den Körnern der TO-Pflanzen hervorgegangenen Pflanzen (T1 -Generation) wurden erneut mittels PCR auf Vorhandensein der Mutation getestet. Dabei wurde zunächst eine PCR auf die einzelnen Weizenpflanzen gemacht, um dann die PCR Produkte
anschließend mittels Rsal-Verdau auf Mutagenese des TaTDF-Gens zu testen. Ein vorheriger Verdau der genomischen Weizen-DNA vor der PCR Reaktion war nun nicht mehr nötig, da davon ausgegangen werden konnte, dass eine evtl. vorhandene Mutation nun in allen Zellen der Pflanze vorliegt.
Es stellte sich mittels des PCR Assays heraus, dass nicht alle Pflanzen die in der T0- Generation gefundene Mutation weitervererbten.
Besonderes Interesse weckte die Linie WA500-T-003, da hier in der TO-Pflanze in der
Enrichment PCR nahezu die gesamte amplifizierte DNA nicht durch Rsal geschnitten werden konnte. In dem PCR-Assay auf die Selbstungsnachkommenschaft dieser Linie wurde daher erwartet, auch solche Pflanzen zu identifizieren, die nach Verdau der amplifizierten DNA nur unverdautes PCR Produkt nach Gelanalyse zeigen würden. Diese Pflanzen wären dann homozygot für die Mutation. Erstaunlicherweise war dies jedoch nicht der Fall, sondern es wurde in allen Pflanzen sowohl unverdaute als auch verdaute DNA Fragmente identifiziert (Figur 4). Überraschend war allerdings, dass das Verhältnis zwischen verdauten und unverdauten PCR Fragmenten unterschiedlich war. Dies ließ den Schluss zu, dass in der Linie WA500-T-003 zwar eine Mutation im TaTDF-Gen stattgefunden hatte, aber möglicherweise nicht auf allen Chromosomen bzw. nicht auf allen Chromosomen der drei Weizen(sub)genome.
Beispiel 6: Subqenom-spezifische Analyse der Pflanzen der T1 -Generation
Durch Amplifikation von ca. 1 kb langen Fragmenten aus dem Genom der Weizensorte„Taifun" im Bereich des TaTDF-Gens und anschließender Sequenzierung von 8 klonierten PCR- Fragmenten, konnten die Sequenzen des TaTDF-Locus in den einzelnen Subgenomen identifiziert werden (Figur 5). Dementsprechend konnten Primersysteme entwickelt werden, die spezifisch den TaTDF-Locus nur eines Subgenoms amplifizieren (Tabelle 1 ).
Figure imgf000021_0001
Tabelle 1 : Primersysteme für die subgenomspezifische Amplifikation des Weizen TaTDF-Gens.
Die entwickelten Primer wurden dann wieder für das PCR Assay eingesetzt, bei dem das amplifizierte Fragment des TaTDF-Gens anschließend mit Rsal verdaut wurde.
Dabei konnten für die Nachkommen der Linie WA500-T-003 Mutationen in allen drei
Subgenomen festgestellt werden (Tabelle 2).
A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom
Name hetero homo hetero homo hetero homo
WA500-T-003-002 - + - + - -
WA500-T-003-003 - + + - - +
WA500-T-003-008 - + + - - -
WA500-T-003-009 - + + - + -
WA500-T-003-010 - + - - - +
WA500-T-003-012 - + - + + -
WA500-T-003-014 - + + - - -
WA500-T-003-015 - + + - + - A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom
Name hetero homo hetero homo hetero homo
WA500-T-003-020 - + + - + -
WA500-T-003-021 - + - + + -
WA500-T-003-024 - + - - - +
WA500-T-003-025 - + - + + -
WA500-T-003-026 - + + - + -
WA500-T-003-035 - + - + - -
WA500-T-003-038 - + + - - -
WA500-T-003-039 - + + - + -
Tabelle 2: Analyse der Mutationen im TaTDF-Locus von Nachkommen der Linie WA500-T-003 mittels Subgenom-spezifischer PCR. Unterstrichen markiert sind Pflanzen, die Mutationen in allen drei Subgenomen des TaTDF-Locus tragen (WA500-T-003-003, WA500-T-003-009, WA500-T-003-012, WA500-T-003-015, WA500-T-003-020, WA500-T-003-021 , WA500-T-003-025, WA500-T-003-026 und WA500-T-003-039).
PCR-Produkte des TaTDF-Locus spezifisch für das A-, B- oder D-Subgenom wurden generiert und anschließend mit Rsal verdaut. Bei Vorliegen von ausschließlich unverdauter DNA wurde davon ausgegangen, dass die Mutation homozygot vorliegt, bei Vorliegen von unverdauter und verdauter DNA wurde davon ausgegangen, dass die Mutation im heterozygoten Zustand vorliegt.
Erstaunlicherweise konnten dabei innerhalb der Nachkommenschaft der Linie WA500-T-003 Einzelpflanzen identifiziert werden, die in allen drei Genloci des TaTDF-Gens eine Mutation aufwiesen. Die Mutation im A-Subgenom lag bereits homozygot vor, so dass davon
ausgegangen werden muss, dass bereits in der TO-Pflanzen beide Genloci des TaTDF-Gens auf dem A-Subgenom durch die Wirkung des TALEN mutagenisiert wurden.
Um in zukünftigen Analysen den Arbeitsaufwand zu reduzieren, wurden basierend auf den Primersystemen Markersysteme für die Kapillarelektrophorese entwickelt. Diese Markersysteme konnten eindeutig die Mutationen auf dem A-, B- und D-Subgenom nachweisen, sowie zwischen homozygoten und heterozygoten Pflanzen unterscheiden (Tabelle 3).
Name A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom
WA500-T-003-002 403 190 189
WA500-T-003-003 403 187 186/189
WA500-T-003-008 403 190 186/189
WA500-T-003-009 403 187/190 186/189
WA500-T-003-010 403 187 189
WA500-T-003-012 403 187/190 186
WA500-T-003-014 403 190 186/189
WA500-T-003-015 403 187/190 186/189
WA500-T-003-020 403 187/190 186/189 Name A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom
WA500-T-003-021 403 187/190 186
WA500-T-003-024 403 187 189
WA500-T-003-025 403 187/190 186
WA500-T-003-026 403 187/190 186/189
WA500-T-003-035 403 190 186
WA500-T-003-038 403 190 186/189
WA500-T-003-039 403 187/190 186/189
Avalon 405 190 189
Cadenza 405 190 189
Chinese Spring 405 190 189
Opus 405 190 189
Ciaire 405 190 189
Julius 405 190 189
Tabelle 3: Subgenom-spezifische Untersuchung des TaTDF-Locus mittels Kapillarelektrophorese. DNA der Nachkommen der Linie WA500-T-003 wurde für eine PCR des TaTDF-Locus mit fluoreszenzmarkierten, Subgenom-spezifischen Primern eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden dann in der Kapillarelektrophorese aufgetrennt, um so Größenunterschiede von > 1 bp zu detektieren. Als Kontrolle wurden DNAs von verschiedenen kommerziell erhältlichen fertilen Weizensorten eingesetzt (letzte 7 Zeilen). Im A-Subgenom konnte in den WA500-T-003-Nachkommen eine 2 bp Deletion festgestellt werden, die als 403 bp Fragment anstelle eines 405 bp Fragmentes in der Kapillarelektrophorese zu erkennen ist. Tritt nur das 403 bp Fragment auf, so liegt die Mutation homozygot vor; können sowohl das 403 bp als auch das 405 bp Fragment detektiert werden, so liegt die Mutation heterozygot vor; kann nur das 405 bp Fragment detektiert werden, so liegt die wt-Sequenz homozygot vor. Im D-Subgenom liegt eine Deletion von 3 bp vor, ebenso im B-Subgenom. Beim D- Subgenom wird im wt ein PCR Fragment von 190 bp in der Kapillarelektrophorese detektiert. Tritt die Mutation homozygot auf, so wird nur ein 187 bp Fragment detektiert, im heterozygoten Zustand wird sowohl ein 187 bp als auch ein 190 bp Fragment detektiert. Ähnlich verhält es sich für das B-Subgenom, nur das hier ein 189 bp Fragment im wt detektiert wird, wohingegen in homozygoten Mutanten ein 186 bp Fragment und in heterozygoten Mutanten ein 186 bp und ein 189 bp Fragment detektiert wird. Der Assay ließ ebenfalls eine Aussage darüber zu, ob die Deletion homozygot (einfach unterstrichen) oder heterozygot (doppelt unterstrichen) vorliegt. Beispiel 7: Erzeugen und Analyse von Pflanzen, welche die Mutation homozygot tragen
Auf Grundlage der Nachkommenschaftsanalyse der Linie WA500-T-003 wurden zwei
Einzelpflanzen ausgewählt, WA500-T-003-003 bzw. WA500-T-003-021 . WA500-T-003-003 war homozygot für das A- und D-Subgenom, und heterozygot für das B-Subgenom. WA500-T-003- 021 hingegen war homozygot für das A-Subgenom und das B-Subgenom, aber nur heterozygot für das D-Subgenom.
Beide Linien wurden im Gewächshaus geselbstet, und die Nachkommen wurden mit Hilfe des Markersystems auf Anwesenheit der Mutationen in den einzelnen Subgenomen getestet.
Dabei konnten bei beiden Nachkommenschaften Pflanzen identifiziert werden, die für alle drei Subgenome die Mutationen im TaTDF-Genlocus homozygot tragen (Tabelle 4). Diese Pflanzen wurden im Gewächshaus zur Blüte gebracht. Dabei zeigte sich, dass keine der Pflanzen in der Lage war, funktionale Antheren zu bilden, die Pflanzen also männlich steril sind (Figuren 6-8).
Name A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom
Taifun 405 190 189
WA500-T-003-003-01 403 187 189
WA500-T-003-003-02 403 187 186/189
WA500-T-003-003-03 403 187 189
WA500-T-003-003-04 403 187 186
WA500-T-003-003-05 403 187 186
WA500-T-003-003-06 403 187 189
WA500-T-003-003-08 403 187 186/189
WA500-T-003-003-09 403 187 186/189
WA500-T-003-003-10 403 187 186/189
WA500-T-003-003-1 1 403 187 186
WA500-T-003-003-13 403 187 186/189
WA500-T-003-003-14 403 187 186
WA500-T-003-003-15 403 187 189
WA500-T-003-003-16 403 187 186/189
WA500-T-003-003-17 403 187 186/189
WA500-T-003-003-18 403 187 186
WA500-T-003-003-19 403 187 186
WA500-T-003-003-20 403 187 186
WA500-T-003-003-21 403 187 186
WA500-T-003-003-23 403 187 186/189
WA500-T-003-003-24 403 187 186
WA500-T-003-003-25 403 187 186
WA500-T-003-021 -01 403 187 186
WA500-T-003-021 -02 403 187 186
WA500-T-003-021 -03 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -04 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -05 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -06 403 190 186
WA500-T-003-021 -07 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -08 403 187 186
WA500-T-003-021 -09 403 190 186
WA500-T-003-021 -10 403 190 186
WA500-T-003-021 -1 1 403 187 186
WA500-T-003-021 -12 403 190 186
WA500-T-003-021 -13 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -14 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -15 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -17 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -18 403 187/190 186 Name A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom
WA500-T-003-021 -19 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -20 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -21 403 187 186
WA500-T-003-021 -22 403 190 186
WA500-T-003-021 -23 403 187 186
WA500-T-003-021 -24 403 187/190 186
WA500-T-003-021 -25 403 187 186
Tabelle 4: Subgenomspezifischer Nachweis von Deletionen im TaTDF-Locus von Nachkommen der Linien WA500-T-003-03 und WA500-T-003-21 mittels Kapillarelektrophoresemarker. Die Unterstreichung makiert Linien, welche für alle drei Deletionen homozygot sind.
Die Ähren dieser Pflanzen (der Nachkommen von WA500-T-003-003 und WA500-T-003-021 ) wurden dann mit einer Tüte isoliert, um zu prüfen ob doch noch eine Selbstbefruchtung möglich war. In keiner der isolierten Weizenähren konnten Samen gefunden werden. Somit konnte eine 100%-ige männlichen Sterilität etabliert werden.
Die weiblichen Blütenorgane der Pflanzen hingegen sind vollkommen normal ausgebildet, was auf keine Störung der weiblichen Fertilität hindeutet. Auch sonst können an den Pflanzen keine anormalen Phänotypen beobachtet werden.
Um die weibliche Fertilität zu überprüfen, wurden Kreuzungen mit Pollen einer
Winterweizensorte durchgeführt. In den Kreuzungsähren wurden Körner in normaler Anzahl gebildet, so dass eine 100%-ige weibliche Fertilität der Ähren nachgewiesen ist.
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Claims

Patentansprüche:
1 . Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, dadurch gekennzeichnet, dass
sämtliche Allele des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens inaktiviert sind.
2. Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das für tapetal development and function (TDF) codierende Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus den folgenden:
(a) Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 , 2 oder 3 oder SEQ ID NO: 7, 8 oder 9;
(b) Nukleotidsequenz, die für ein Protein enthaltend eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 80 % zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 aufweist, codiert;
(c) Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu (a) oder (b);
(d) Nukleotidsequenz, die homolog ist zu (a) oder (b), wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert;
(e) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und
(f) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (c) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert.
3. Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das inaktivierte TDF- Gen eine oder mehrere Mutation(en) enthält.
4. Pflanze nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) in den Allelen in demselben Exon des TDF-Gens liegt (liegen), vorzugsweise in Exon 2.
5. Pflanze nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) im Exon 2 in einer Region zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 286 der SEQ ID NO: 3 (Referenzsequenz) liegt (liegen), bevorzugt:
(a) zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 285 der SEQ ID NO: 3,
(b) zwischen den Nukleotidpositionen 258 und 285 der SEQ ID NO: 3,
(c) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 286 der SEQ ID NO: 3,
(d) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 283 der SEQ ID NO: 3; oder
(e) an der Nukleotidposition 282 der SEQ ID NO: 3.
6. Pflanze nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) Deletionen sind, vorzugsweise Deletionen von 1 bis 28 Nukleotiden.
7. Pflanze nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die
Mutation(en) transgen oder nicht-transgen erzeugt wurde(n).
8. Teil und Samen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Nachkommen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder ein Teil oder
Samen davon, enthaltend mindestens ein inaktiviertes Allel des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens.
10. Nachkommenpflanze gemäß Anspruch 9, oder ein Teil oder Samen davon, wobei die Nachkommenpflanze eine Hybridpflanze der Gattung Triticum ist.
1 1 . Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus den folgenden:
(a) Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 , 2 oder 3 oder SEQ ID NO: 7, 8 oder 9;
(b) Nukleotidsequenz, die für ein Protein enthaltend eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 80 % zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 1 1 oder 12 aufweist, codiert;
(c) Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu (a) oder (b);
(d) Nukleotidsequenz, die homolog ist zu (a) oder (b), wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert;
(e) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert;
(f) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (c) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert;
(g) Nukleotidsequenz, die eine Teilsequenz der in (a) bis (f) genannten
Nukleotidsequenzen mit mindestens 17 aufeinanderfolgende Nukleotiden in sense, anti-sense oder komplementärer Orientierung ist.
12. Vektor umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1 1 .
13. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die folgenden
Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze mit der Nukleinsäure nach Anspruch 1 1 oder mit dem Vektor nach Anspruch 12; und
(ii) Regenerieren einer Pflanze aus der mindestens einen transformierten Zelle aus (0-
14. Verfahren zur Restauration der Fertilität einer männlich sterilen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Transformieren von mindestens einer Zelle der Pflanze nach einem der
Ansprüche 1 bis 7 mit der Nukleinsäure nach Anspruch 1 1 oder mit dem Vektor nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz codierend für ein TDF-Gen umfasst; und
(ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der mindestens einen transformierten Zelle aus (i).
15. Pflanze der Gattung Triticum, hergestellt durch das Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, oder umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 1 1 oder den Vektor nach Anspruch 12.
16. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend eine Teilsequenz einer
Nukleotidsequenz ausgewählt aus
(a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9;
(b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; oder
(c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b)
hybridisiert
zum Nachweis, dass ein Allel des für TDF codierenden Gens inaktiviert ist.
17. Verfahren zum Aufrechterhalten der männlichen Sterilität einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einem DNA-Konstrukt umfassend
(a) ein aktives Allel des für TDF codierenden Gens,
(b) ein Pollen-spezifisch exprimiertes Transgen, welches für ein
Nukleinsäuremolekül oder ein Protein codiert, das die Ausbildung von fertilen Pollen verhindert, und
(c) ein Transgen, das in der Pflanze ein phänotypisches Merkmal verursacht, welches als Selektionsmarker verwendet werden kann;
(ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der transformierten Zelle aus (i), (iii) Selbsten der Pflanzen aus (ii), und
(iv) Selektieren von Nachkommenpflanzen aufgrund des Selektionsmarkers.
18. Verfahren zum Herstellen einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, umfassend das Inaktivieren von sämtlichen Allelen des für TDF codierenden Gens in der Pflanze.
19. Pflanze der Gattung Triticum enthaltend mindestens ein inaktiviertes Allel des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens, erhältlich durch Kreuzen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer Pflanze, die mindestens ein aktives Allel des für TDF codierenden Gens in einem Subgenom aufweist.
20. Verfahren zum Nachweis einer männlichen Sterilität in einer Pflanze der Gattung Triticum oder in Samen davon, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Isolieren von DNA aus der Pflanze oder dem Samen,
(ii) Analysieren der DNA mit Hilfe eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Teilsequenz einer Nukleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus
(a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9,
(b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, oder
(c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und
(iii) Identifizieren einer Pflanze, in welcher sämtliche Allele des für TDF
codierenden Gens inaktiviert sind.
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