DE10043902A1

DE10043902A1 - Modifizierung des Phänotyps von Pflanzen durch ektopische Expression von Homöoboxgenen

Info

Publication number: DE10043902A1
Application number: DE10043902A
Authority: DE
Inventors: Judith Mueller; Wolfgang Rohde; Francesco Salamini
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-09-06
Filing date: 2000-09-06
Publication date: 2002-03-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Homöoboxgen aus Gerste, das als JuBel2 bezeichnet wird, Gene oder DNA-Moleküle, die Sequenzähnlichkeit zu diesem neuen Gen aufweisen, insbesondere solche, deren Gen- bzw. Expressionsprodukte funktionelle Homologie zu dem Genprodukt des neuen Homöoboxgens aufweisen, die Gen- oder Expressionsprodukte dieser Gene bzw. DNA-Moleküle sowie die Verwendung der genannten Gene und DNA-Moleküle insbesondere zur Modifizierung des Phänotyps von Pflanzen. Aufgrund einer ektopischen Expression eines JuBel2-Gens können Pflanzen erhalten werden, die eine im Vergleich zu einer Pflanze, die keine derartige ektopische JuBel2-Genexpression aufweist, vermehrte Anzahl von Sprossen oder vermehrte Verzweigung aufweisen. Zusätzlich kann bei derartigen Pflanzen ein Verlust der apikalen Dominanz und damit ein vermindertes Längenwachstum der Pflanzen zu beobachten sein.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Homöoboxgen aus Gerste, das als JuBel2 bezeichnet wird, Gene oder DNA-Moleküle, die Se quenzähnlichkeit zu diesem neuen Gen aufweisen, insbesondere solche, deren Gen- bzw. Expressionsprodukte funktionale Homo logie zu dem Genprodukt des neuen Homöoboxgen aufweisen, die Gen- oder Expressionsprodukte dieser Gene bzw. DNA-Moleküle sowie die Verwendung der genannten Gene und DNA-Moleküle ins besondere zur Modifizierung des Phänotyps von Pflanzen.

Hintergrund der Erfindung

Die Homöobox ist eine ca. 180 bp-Konsensus-DNA-Sequenz, die in zahlreichen Genen, die an Entwicklungsprozessen beteiligt sind, sogenannten Homöoboxgenen, vorhanden ist. Ursprünglich im Zuge der Untersuchung von Drosophila-Mutanten entdeckt, wurden Homöoboxgene nachfolgend auch aus evolutionär entfernt stehenden Organismen, einschließlich Tieren, Pilzen und Pflan zen, isoliert.

Die Homöobox kodiert eine etwa 60 Aminosäuren umfassende Ho möodomäne, die die Translationsprodukte der Homöoboxgene cha rakterisiert. Die Sekundärstruktur der Homöodomäne gliedert sich in drei α-Helices, die durch eine Schleife ("loop") und einen "Turn" voneinander getrennt sind, und vermittelt die Fä higkeit zu sequenzspezifischer DNA-Bindung. Helix 2 und Helix 3 bilden eine dem bei prokaryotischen Transkriptionsfaktoren gefundenen Helix-Turn-Helix-Motiv verwandte Struktur, wobei die Helix 3, die sogenannte "Erkennungshelix", sequenzspezifi sche Kontakte mit Basen in der großen Furche der DNA-Doppel helix eingeht. N-terminal zu der Homöodomäne gelegene Bereiche binden, ebenfalls sequenzspezifisch, Basen in der kleinen Fur che, während die Schleife zwischen Helix 1 und Helix 2 unspe zifisch mit dem Phosphatrückgrat der DNA wechselwirkt (Damante et al., EMBO J. 15, 4992-5000 (1996)). Die aus Tieren, Pflan zen und Pilzen mittlerweile isolierten zahlreichen Homöoboxgene konnten in vielen Fällen als Transkriptionsfaktoren, und zwar als transkriptionale Regulatoren grundlegender Entwicklungs prozesse identifiziert werden. Sie werden sowohl anhand von Sequenzhomologien innerhalb der Homöobox als auch aufgrund an derer Strukturmerkmale in verschiedene Familien eingeteilt (siehe z. B. Chan et al., Biochim. Biophys. Acta 1442, 1-19 (1998)).

Aufgrund ihrer Funktion als transkriptionale Regulatoren grundlegender Entwicklungsprozesse sind diverse Gene, insbe sondere Gene, die Transkriptionsfaktoren kodieren, unmittelbar an der Ausprägung bestimmter Phänotypen beteiligt. Speziell im Bereich der Pflanzenzucht ist die Erzielung bestimmter Phäno typen, wie beispielsweise eines bestimmten Habitus, von hohem Interesse. Es besteht daher ein hoher Bedarf an der Identifi zierung neuer Gene, die bei ektopischer Expression in einer Pflanze, insbesondere Kulturpflanze, zur Ausbildung eines be stimmten Phänotyps führen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen Homöobox gens aus Gerste (Hordeum vulgare). Ein erster Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend eine im wesentlichen reine cDNA des Homöoboxgens JuBel2 aus Gerste mit einer der in SEQ ID NO. 1 und 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebenen Sequenzen sowie die zu gehörige, in SEQ ID NO. 3 (Fig. 3) angegebene genomische Se quenz. Gleichfalls umfaßt sind auch andersartige Nukleinsäure moleküle mit einer SEQ ID NO. 1 (Fig. 1A, Fig. 6), 3 (Fig. 3) oder 4 (Fig. 1B) entsprechenden Nukleinsäuresequenz oder mit einer zu der in SEQ ID NO. 1 bzw. 4 (Fig. 1, Fig. 6) oder 3 (Fig. 3) angegebenen Sequenz ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähnlichkeit auf Nukleinsäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 1, 4 (Fig. 1, Fig. 6) bzw. 3 (Fig. 3) angegebenen Sequenz aufweist, sowie Nukleinsäuremoleküle, ein schließlich Gene, die das Genprodukt des JuBel2-Gens aus Ger ste mit der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angege benen Aminosäuresequenz oder einer dazu ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähnlichkeit auf Aminosäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Sequenz aufweist, kodieren. Des weiteren erstreckt sich die Erfindung auch auf Fragmente der genannten cDNA- und Nuklein säuremoleküle, auf Nukleinsäuremoleküle, die die genannten cDNA-Moleküle, Nukleinsäuremoleküle bzw. Fragmente umfassen, auf Nukleinsäuremoleküle, die eine zu den Nukleinsäuresequen zen der genannten Nukleinsäuremoleküle komplementäre Sequenz aufweisen, auf Nukleinsäuremoleküle, die mit den oben erläu terten Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, sowie auf Nuklein säuremoleküle, die eine von den oben erwähnten Nukleinsäurese quenzen abgeleitete Sequenz aufweisen.

Weitere Aspekte der Erfindung sind sense- und antisense-Nukle insäuremoleküle mit einer sense- bzw. antisense-Nukleinsäure sequenz bezüglich der oben erläuterten Nukleinsäuresequenzen sowie Konstrukte, insbesondere Vektoren, Plasmide, Cosmide, Bacmide, YACs, BACs, Virus- oder Phagengenome, die eines der oben erläuterten Nukleinsäuremoleküle umfassen.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Proteine oder Polypep tide, die von den oben erläuterten Nukleinsäuremolekülen ko diert werden, Fragmente dieser Proteine und Polypeptide, Poly peptide oder Proteine, die die erwähnten Proteine, Polypeptide oder Fragmente, z. B. in Form eines Fusionsproteins, umfassen, sowie Antikörper, die die oben erläuterten Proteine, Polypep tide oder Fragmente davon spezifisch erkennen und binden.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der oben erläuterten Nukleinsäuremoleküle oder eines dazu funktionell analogen Nukleinsäuremoleküls zur Modifizierung des Phänotyps von Pflanzen.

Die Erfindung betrifft gleichfalls Organismen, insbesondere transgene Organismen, Teile und Vermehrungsmaterialien solcher Organismen, die eine ektopische Expression eines JuBel2-Gens aufweisen, beispielsweise aufgrund einer Expression des Ju Bel2-Gens als Transgen. Speziell im Bereich von Pflanzen er streckt sich die Erfindung auf Pflanzen, die aufgrund einer ektopischen Expression eines JuBel2-Gens eine im Vergleich zu einer Pflanze, die keine derartige ektopische JuBel2-Genex pression aufweist, vermehrte Anzahl von Sprossen oder vermehr te Verzweigung aufweisen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Grundlage der Erfindung ist die Isolierung und Charakterisie rung eines neuen Homöoboxgens aus Gerste (Hordeum vulgaris), das als JuBel2 bezeichnet wird. Anhand von Sequenzanalysen, die das Vorhandensein einer Homöobox anzeigen, kann JuBel2 in die Familie der Homöoboxgene (HB-Gene) eingeordnet werden. Se quenzvergleiche zeigen, daß es sich bei JuBel2 um ein Mitglied der in Gerste zuvor noch nicht beschriebenen Familie der HD BEL1-Gene handelt, die der Superklasse der TALE-Homöoboxgene zugeordnet wird. BEL2 und ATH1 aus Arabidopsis und eine schnell wachsende Anzahl möglicher homologer Gene, die im Rah men der Sequenzierung des Arabidopsis-Genoms identifiziert werden (Stand September 1999: BEL1, ATH1 und sieben weitere BEL-1-homologe Gene), sind Vertreter dieser Gruppe (Reiser et al., Cell 83, 735-742 (1995); Quaedvlieg et al., The Plant Cell 7, 117-129 (1995); siehe auch WO 98/51800). Ihre Transla tionsprodukte tragen im N-terminalen Bereich eine mögliche "coiled coil"-Domäne, die Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln könnte und außerdem ein mutmaßliches Kernlokalisie rungssignal enthält.

Im Rahmen der Erfindung wurden u. a. cDNA-Abschnitte des Homöo boxgens JuBel2 aus Gerste (Hordeum vulgare) isoliert und des sen Einfluß auf den Phänotyp von Pflanzen durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation von Arabidopsis- und Tabakpflanzen analysiert.

Eine Analyse der Tabak-Primärtransformanten und ihrer Nachkom men ergab, daß, während nicht-transformierte Tabakpflanzen ei nen dominanten elongierten Hauptsproß aufweisen, bei ektopi scher Expression von JuBel2 durch Verzweigungen nahe der Pflanzenbasis buschige Pflanzen mit mehreren annähernd gleich berechtigten Sprossen entstehen (siehe auch Fig. 9).

JuBel2 ektopisch exprimierende Arabidopsis-Pflanzen produzie ren im Vergleich zum Wildtyp eine vermehrte Anzahl von Spros sen, deren Länge innerhalb einer Pflanze konstant ist, von Pflanze zu Pflanze aber stark variieren kann. Die Bandbreite reicht von Wildtyp-Länge bis zum beinahe vollständigen Verlust des Längenwachstums der Sproßachse. In extremen Fällen wirken caudale Blätter, deren Morphologie von vegetativen Rosetten blättern abweicht, und Blüten wie Bestandteile der Rosette. Die Fertilität der Blüten und die allgemeine Fitness der Pflanzen wird durch das Transgen nicht beeinträchtigt (siehe auch Fig. 10).

Zusammenfassend führt die ektopische Expression von JuBel2 in Pflanzen offensichtlich zu vermehrter Sproßbildung, d. h. einer vermehrten Verzweigung. Zusätzlich kann ein Verlust der apika len Dominanz und damit ein vermindertes Längenwachstum der Pflanze zu beobachten sein.

Diese beiden Phänotypmodifizierungen können speziell im Be reich der Kulturpflanzenzucht von überaus hohem Nutzen sein:

Auf dem Gebiet des Zierpflanzendesigns kann eine ektopische Expression des JuBel2-Gens in Zierpflanzen die Anzahl der Sprosse und damit die Anzahl an Infloreszenzen/Blüten pro Pflanze erhöhen. Durch den entstehenden buschigen Habitus kann darüber hinaus das allgemeine Erscheinungsbild verschiedener Pflanzenarten den ästhetischen Ansprüchen des Verbrauchers an gepaßt werden.

Bei Beerensträuchern kann durch die vermehrte Anzahl von Ver zweigungen und damit von Blüten und Früchten bei ektopischer Expression des JuBel2-Gens der Ertrag bei der Produktion von Beeren (z. B. Himbeeren und Brombeeren) erhöht werden.

In der Forstwirtschaft kann der Ertrag bei der Kultivierung von zur Cellulosegewinnung verwendeten schnell wachsenden Bäu men, wie Weide oder Pappel, durch vermehrte Verzweigungen in Folge einer ektopischen Expression des JuBel2-Gens gesteigert werden.

Bei Getreide, wie Gerste oder Weizen, kann eine ektopische Ex pression, insbesondere Überexpression, des JuBel2-Gens deren Verzweigungsgrad und damit den Ertrag erhöhen, aber auch gleichzeitig u. a. die Kontrolle von Frostschäden erleichtern. Ein ggf. gleichzeitig auftretendes vermindertes Längenwachstum der Halme kann durch Wind/Sturm, starke Regenfälle oder Hagel bedingte Ernteausfälle verringern, da der Anteil niederge drückter Halme verringert werden kann.

Wie bereits erwähnt, basiert die Erfindung auf der Entdeckung eines neuen Homöoboxgens aus Gerste (Hordeum vulgare). Aus gangspunkt der Erfindung war dementsprechend die Identifizie rung einer im wesentlichen reinen cDNA des Hömoboxgens JuBel2 aus Gerste mit einer der in SEQ ID NO. 1 und 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebenen Sequenzen sowie einer zugehörigen, in SEQ ID NO. 3 (Fig. 3) angegebenen genomischen Sequenz.

Die Identifizierung zweier geringfügig unterschiedlicher cDNA- Sequenzen resultierte aus der Verwendung zweier Gerstenvarie täten, der Gerstenvarietäten K-Atlas und CalC15, für die Un tersuchungen. Die cDNA-Sequenz aus der Varietät CalC15 enthält insgesamt 10 zusätzliche Nukleotide gegenüber der cDNA-Sequenz aus der K-Atlas-Varietät, und zwar 1 × 3 Basenpaare und 1 × 6 Basenpaare innerhalb des kodierenden Bereichs sowie ein Basen paar im 3'-nicht-translatierten Bereich; darüber hinaus gibt es eine Reihe von Nukleotidaustauschen, die jedoch mit Ausnah me eines Basenaustauschs stumm sind, d. h. keine Veränderung der abgeleiteten Aminosäuresequenz bewirken. Die Expressions produkte der cDNAs sind dementsprechend in ihrer Länge wie auch an einer zusätzlichen, in beiden Expressionsprodukten vorhandenen Position der Aminosäuresequenz geringfügig unter schiedlich.

Die in vivo zwischen den Gerstenvarietäten K-Atlas und CalC15 beobachtbare Sequenzvariabilität bezüglich des JuBel2-Gens liefert einen ersten Hinweis darauf, in welchem Ausmaß bereits in der Natur Sequenzvariabilität bei funktionell identischen oder zumindest äquivalenten Genen bzw. Genprodukten vorhanden ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung muß eine derartige Sequenzvariabilität sowohl auf Nukleinsäure- als auch Ami nosäuresequenzebene somit stets mitberücksichtigt werden.

In Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung soll der Be griff "JuBel2-Gen" dementsprechend nicht auf das in Gerste ge fundene Homöoboxgen JuBel2 mit einer der in SEQ ID NO. 1 und 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebenen Sequenzen seiner cDNA, bestimmt ausgehend von den Gerstenvarietäten K-Atlas bzw. CalC15, be schränkt sein, sondern umfaßt auch

- Nukleinsäuresequenzen allgemein, die eine der in SEQ ID NO. 1 oder 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebenen DNA-Sequenz entsprechende Nukleinsäuresequenz aufweisen;
- die der erwähnten cDNA zugehörigen Abschnitte genomischer DNA, d. h. das zugehörige Gen, einschließlich z. B. mögli cher Intronsequenzen (vgl. SEQ ID NO. 3; Fig. 3),
- Nukleinsäuremoleküle mit zu der in SEQ ID NO. 1 oder 4 (Fig. 1, Fig. 6) oder 3 (Fig. 3) angegebenen Sequenz ähnlichen Sequenzen, die mindestens 75% Sequenzähnlich keit, insbesondere mindestens 80%, speziell mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt minde stens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98% Sequen zähnlichkeit auf Nukleinsäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 1 oder 4 (Fig. 1, Fig. 6) bzw. 3 (Fig. 3) angegebe nen Sequenz aufweisen,
- jegliche Nukleinsäuremoleküle, einschließlich Gene, die das Genprodukt des JuBel2-Gens aus Gerste mit der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäure sequenz kodieren,
- jegliche Nukleinsäuremoleküle, einschließlich Gene, die ein Gen- bzw. Expressionsprodukt mit einer zu der in SEQ ID NO. 2 oder 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäure sequenz ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähn lichkeit, insbesondere mindestens 80%, speziell mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt minde stens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98% Sequen zähnlichkeit auf Aminosäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Sequenz auf weist, kodieren,
- Fragmente der obigen cDNA-Moleküle, Nukleinsäuremoleküle oder Gene, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das ei ne DNA-Bindungsfähigkeit entsprechend dem Expressionspro dukt der cDNA des JuBel2-Gens aus Gerste (SEQ ID NOS. 2 und 5, Fig. 2, Fig. 6) aufweist,
- Fragmente der obigen cDNA-Moleküle, Nukleinsäuremoleküle oder Gene, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das ei ne Fähigkeit zur Interaktion mit anderen Proteinen ent sprechend dem Expressionsprodukt der cDNA des JuBel2-Gens aus Gerste (SEQ ID NOS. 2 und 5, Fig. 2, Fig. 6) auf weist; durch Two-Hybrid-Experimente und durch in vitro- Bindungsstudien konnte gezeigt werden, daß das JuBel2- Protein mit verschiedenen KNOX-Proteinen assoziiert. Das kürzeste interagierende Peptid konnte dabei auf die Ami nosäuren 122-341 des JuBel2-Proteins eingetrenzt werden. Dieser Abschnitt enthält die vermutete "coiled-coil"- Domäne;
- jegliche Nukleinsäuremoleküle, die funktionell analog zu den oben erläuterten cDNA-Molekülen, Nukleinsäuremolekü len, Genen oder Fragmenten sind; solche Nukleinsäuremole küle können auch eine deutlich geringere oder sogar gänz lich fehlende Sequenzähnlichkeit zu den oben erwähnten Se quenzen aufweisen. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet "funktionell analog" eine biologische Aktivität der Nu kleinsäuremoleküle, die jener der oben erläuterten cDNA- Moleküle, Nukleinsäuremoleküle, Gene oder Fragmente ent spricht. Die biologische Aktivität der als Referenz heran zuziehenden Nukleinsäuremoleküle ist beispielsweise die Fähigkeit zu sequenzspezifischer DNA-Bindung des jeweili gen Expressionsprodukts, die im vorangegangenen Unterpunkt erläuterte Fähigkeit des jeweiligen Expressionsprodukts zur Interaktion mit anderen Proteinen, z. B. mit verschie denen KNOX-Proteinen, und/oder die definierte Phänotypbe einflussung bei ektopischer Expression beispielsweise in Pflanzen.

Dabei kann das JuBel2-Gen für die ektopische Expression auch in größeren DNA-Molekülen enthalten sein, beispielsweise in Konstrukten, wie einem Vektor, Plasmid, Cosmid, Bacmid, YAC, BAC, Virus- oder Phagengenom, oder in fusionierter Form vor liegen, so daß das Expressionsprodukt des JuBel2-Gens in Form eines Fusionsproteins exprimiert wird.

Eine "ektopische Expression" versteht sich im vorliegenden zu sammenhang als eine quantitativ und/oder qualitativ gegenüber dem Wildtyp veränderte Expression. Sie umfaßt eine erstmalig vorkommende wie auch eine gegenüber der Wildtyp-Expression mo difizierte Expression. Beispiele für eine ektopische Expressi on des JuBel2-Gens sind:

- Expression des JuBel2-Gens als Transgen in einem Organis mus, insbesondere einer Pflanze, der dieses Gen in seiner Wildtyp-Form nicht exprimiert;
- Überexpression des JuBel2-Gens als Transgen in einem Orga nismus, insbesondere einer Pflanze (insbesondere Gersten pflanzen), der dieses Gen in seiner Wildtyp-Form bereits exprimiert;
- Überexpression des JuBel2-Gens in einem Organismus, insbe sondere einer Pflanze (insbesondere Gerstenpflanzen), der dieses Gen in seiner Wildtyp-Form bereits exprimiert, auf grund einer gegenüber dem Wildtyp-Niveau verstärkten Ex pression ausgehend von dem im Wildtyp bereits vorhandenen Gen; eine solche verstärkte Expression kann beispielsweise durch eine Modifizierung oder einen Austausch von Tran skriptionsregulationselementen, z. B. Promotor- oder Enhan cersequenzen, des Wildtyp-JuBel2-Gens, die bzw. der zu ei ner Überexpression, d. h. gegenüber dem Wildtyp stärkeren Expression, des JuBel2-Gens führt, erreicht werden; und/oder
- Expression, ggf. Überexpression, des JuBel2-Gens als Transgen in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze (hier insbesondere Gerstenpflanzen), der dieses Gen in seiner Wildtyp-Form bereits exprimiert, in dem die Expres sion des Wildtyp-Gens jedoch, beispielsweise mittels "ho mology-dependent gene silencing", teilweise oder vollstän dig verhindert wird oder in dem, z. B. aufgrund einer Muta tion des Wildtyp-Gens, ein teilweise oder vollständig funktionsunfähiges Genprodukt exprimiert wird; eine ekto pische Expression des JuBel2-Gens wird hier eine Expressi on beispielsweise beschränkt auf andere Zelltypen als je ne, in denen das JuBel2-Gen im Wildtyp exprimiert wird, und/oder in einem gegenüber der Expression im Wildtyp ver änderten Ausmaß, z. B. eine Expression, die gegenüber der Expression im Wildtyp als Überexpression aufzufassen ist, oder beschränkt auf ein gegenüber der Expression im Wild typ andersartiges Entwicklungsstadium des Organismus um fassen.

Bei der oben erläuterten zweiten und vierten Variante ektopi scher Expression wird das JuBel2-Transgen in einer genetischen Umgebung vorliegen, in der es im Wildtyp des Organismus nicht vorkommt. Dies trifft im weiteren Sinne auch auf Variante 3 in Hinblick auf einen aufgrund von Modifizierung oder Austausch nicht-wildtypischen Transkriptionsregulationsbereich zu.

Unabhängig davon, ob die ektopische Expression in einem Orga nismus erfolgt, in dessen Wildtyp ein JuBel2-Gen bereits vor handen ist oder nicht, kann die ektopische Expression insbe sondere eines JuBel2-Transgens, sofern gewünscht oder erfor derlich, gegebenenfalls auch ortsspezifisch, d. h. nur in spe ziellen Geweben oder Zelltypen eines Organismus, und/oder ent wicklungsspezifisch, d. h. beschränkt auf ein bestimmtes Ent wicklungsstadium oder bestimmte Entwicklungsstadien, erfolgen. Eine ortspezifische Expression von Transgenen nur in speziel len Geweben oder Zelltypen von Organismen kann durch Einsatz von mit dem Transgen verknüpften Transkriptionsregulationsele menten entsprechender Gewebe- oder Zelltypspezifität erreicht werden. Dem Fachmann sind beispielsweise für diverse Pflanzen arten zahlreiche derartige Gewebe- oder Zelltypspezifität der Expression vermittelnde Transkriptionsregulationselemente be kannt. Gleiches gilt für Transkriptionsregulationselemente, die eine Genexpression auf ein bestimmtes Entwicklungsstadium oder bestimmte Entwicklungsstadien eines Organismus beschrän ken.

Allgemein ist festzuhalten, daß zahlreiche Methoden und Mate rialien, z. B. Vektoren, die für eine jegliche Form ektopischer Expression des JuBel2-Gens eingesetzt werden können, ein schließlich Manipulation und Klonierung von DNA-Sequenzen, Transformation/Transfektion von Zielzellen, Regeneration von Organismen, z. B. Pflanzen, mit ektopischer JuBel2-Genexpres sion u. s. w., dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind und der einschlägigen Fachliteratur entnommen werden können (siehe z. B. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989). Molecu lar cloning: a laboratory manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA; und darin zi tierte Referenzen).

Unter einem ersten Aspekt betrifft somit die Erfindung eine im wesentlichen reine cDNA des Homöoboxgens JuBel2 aus Gerste mit einer der in SEQ ID NO. 1 und 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebenen Sequenz, die zugehörige, in SEQ ID NO. 3 (Fig. 3) angegebene genomische Sequenz sowie Nukleinsäuremoleküle mit einer SEQ ID NO. 1, 4 (Fig. 1, Fig. 6) oder 3 (Fig. 3) entsprechenden Nukleinsäuresequenz oder einer dazu ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähnlichkeit, insbesondere mindestens 80%, speziell mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, beson ders bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt minde stens 98% Sequenzähnlichkeit auf Nukleinsäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 1, 4 (Fig. 1, Fig. 6) bzw. 3 (Fig. 3) an gegebenen Sequenz aufweist. Des weiteren umfaßt sie Nuklein säuremoleküle, einschließlich Gene, die das Genprodukt des Ju Bel2-Gens aus Gerste mit einer der in SEQ ID NO. 2 und 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäuresequenz oder einer dazu ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähnlichkeit, ins besondere mindestens 80%, speziell mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95% und am mei sten bevorzugt mindestens 98% Sequenzähnlichkeit auf Aminosäu resequenzebene zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Sequenz aufweist, kodieren. Von dieser Defini tion werden insbesondere auch allelische Varianten der in vivo auffindbaren, in SEQ ID NO. 1 und 4 (Fig. 1, Fig. 6) angege benen Nukleinsäuresequenzen sowie des zugehörigen Gens (siehe SEQ ID NO. 3, Fig. 3) umfaßt.

Spezielle bevorzugte Aspekte der erfindungsgemäßen Nukleinsäu remoleküle mit Sequenzähnlichkeit zu den in SEQ ID NO. 1, 4 (Fig. 1, Fig. 6) bzw. 3 (Fig. 3) angegebenen Sequenzen sind

- Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzähnlichkeit, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das eine DNA-Bindungsfähig keit entsprechend den Expressionsprodukten der oben erläu terten cDNA- bzw. Nukleinsäureausgangsmoleküle aufweist;
- Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzähnlichkeit, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das eine Fähigkeit zur Inter aktion mit anderen Proteinen, z. B. verschiedenen KNOX- Proteinen, entsprechend den Expressionsprodukten der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäureausgangsmoleküle auf weist;
- Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzähnlichkeit, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das bei ektopischer Expressi on beispielsweise in Pflanzen eine definierte Phänotypbe einflussung entsprechend den Expressionsprodukten der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäureausgangsmoleküle be wirkt;
- Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzähnlichkeit, deren Expres sionsprodukte von Antikörpern, die gegen die Expressions produkte der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäureaus gangsmoleküle erzeugt worden sind, ebenfalls spezifisch erkannt und gebunden werden;
- Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzähnlichkeit, welche bei einer Verwendung als PCR-Primer unter Standardbedingungen eine spezifische Amplifizierung von JuBel2-ähnlicher DNA (d. h. DNA, deren Expressionsprodukt funktionell homolog zu dem Expressionsprodukt des JuBel2-Gens ist) oder von Ab schnitten einer solchen aus einer cDNA-Bibliothek und/oder genomischen Bibliothek von DNA eines andersartigen Orga nismus als Gerste ermöglichen; hinsichtlich der erwähnten PCR-Standardbedingungen wird auf die Ausführungen im expe rimentellen Teil verwiesen; beispielsweise können als Re ferenzbedingungen Bedingungen herangezogen werden, unter denen eine spezifische PCR-Amplifizierung der JuBel2-DNA oder eines Abschnitts von dieser aus einer cDNA-Bibliothek und/oder genomischen Bibliothek von Gersten-DNA mittels der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäureausgangsmole küle erzielt werden kann;
- Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzähnlichkeit, deren Nu kleinsäuresequenz als Vorlage für Oligonukleotide mit dazu komplementärer Sequenz dienen kann, die als Hybridisie rungssonden und/oder Sequenzierungsprimer dienen können, um mit JuBel2-ähnlicher DNA (d. h. DNA, deren Expressions produkt funktionell homolog zu dem Expressionsprodukt des JuBel2-Gens ist) oder der zugehörigen RNA oder Abschnitten davon, insbesondere unter stringenten Bedingungen, bei spielsweise auf Northern- oder Southern-Blots, bzw. unter Sequenzierungsbedingungen spezifisch zu hybridisieren.

Beispielsweise für eine Verwendung als Sonden können die Nu kleinsäuremoleküle der Erfindung auch radioaktive Atome, wie beispielsweise ³²P, enthalten, die einen Nachweis von Hybridi sierungskomplexen mittels Autoradiographie ermöglichen.

Die Sequenzidentitäten und Sequenzähnlichkeiten von Nuklein säure- und Aminosäuresequenzen, auf die in der vorliegenden Anmeldung verwiesen wird, verstehen sich bezogen auf eine Aus wertung mittels des "BLAST"-Programms ("Basic Local Alignment Search Tool"; http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST; siehe auch J. Mol. Biol. 1990, 215(3): 403-410; "Basic local alignment search tool", Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J., National Center of Biotechnology Informa tion, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20894, USA; Altschul, S. F., Madden, T. L., Schffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of prote in database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) unter Zugrundelegung der Standardparameter.

Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet in Zusammenhang mit der Erfindung isoliert aus dem genetischen Kontext, in dem sich ein Nukleinsäuremolekül in seiner biologischen Umgebung normalerweise befindet. Ein im wesentlichen reines Nukleinsäu re-Präparat wird in der Regel allenfalls einen geringen Bruch teil der Nukleinsäuremoleküle, die zusätzlich zu dem Nuklein säuremolekül in einem Organismus, aus dem das Nukleinsäuremo lekül gewonnen wird, vorhanden sind, enthalten. Gleiches wird in der Regel für Proteine und andere Bestandteile des Aus gangsorganismus gelten. Präparationen von erfindungsgemäßen im wesentlichen reinen Nukleinsäuremolekülen können jedoch ohne weiteres weitere Bestandteile, wie Salze, Mediumsubstanzen oder auch geringere Mengen von Bestandteilen der Produzenten zellen, wie z. B. diverse Proteine, enthalten.

In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfaßt der Be griff "Nukleinsäuremolekül" sowohl aus Desoxyribonukleotiden wie Ribonukleotiden aufgebaute Moleküle, d. h. z. B. sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle, sowie Nukleinsäuremoleküle, die aus synthetischen, d. h. in vivo nicht vorkommenden Nukleotidanalo ga, wie beispielsweise Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), gebildet werden. Entscheidend ist im vorliegenden Zusammenhang nur, daß die als Nukleinsäuren bezeichneten Moleküle in vivo und/oder in experimentellen Systemen aufgrund gleicher "Funktionsfähig keit" austauschbar mit den in vivo vorkommenden Nukleinsäuren eingesetzt werden können.

Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", der sich auch auf die spä ter erläuterten Fragmente von erfindungsgemäßen Nukleinsäure molekülen bezieht, umfaßt dabei auch Molekülspezies, die mit Nicht-Nukleotid-Molekülen derivatisiert worden sind, z. B. mit Markierungsmolekülen, wie Biotin, oder fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Substanzen, wie Digoxigenin-Molekülen, die einen einfachen Nachweis der so derivatisierten Nukleinsäure moleküle erlauben. Eine solche Derivatisierung/Markierung ist speziell bei einer Verwendung von erfindungsgemäßen Nuklein säuremolekülen als Hybridisierungssonden vorteilhaft.

Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", der sich auch auf die spä ter erläuterten Fragmente von erfindungsgemäßen Nukleinsäure molekülen bezieht, umfaßt des weiteren auch "modifizierte Nu kleinsäuremoleküle", die Modifizierungen aufweisen, wie sie im Folgenden in Zusammenhang mit "modifizierten Oligonukleotiden" in Verbindung mit erfindungsgemäßen sense- und antisense- Nukleinsäuremolekülen detaillierter erläutert werden.

Des weiteren umfaßt die Erfindung Fragmente der oben erläuter ten cDNA- und Nukleinsäuremoleküle. Erfindungsgemäße Fragmente umfassen typischerweise mindestens 8 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide und mehr bevorzugt mehr als 25 Nu kleotide bis zu mehreren hundert und mehr Nukleotiden.

Spezielle bevorzugte Aspekte der erfindungsgemäßen Fragmente sind

- Fragmente, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das ei ne DNA-Bindungsfähigkeit entsprechend den Expressionspro dukten der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäuremolekü le aufweist;
- Fragmente, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das ei ne Fähigkeit zur Interaktion mit anderen Proteinen, z. B. verschiedenen KNOX-Proteinen, entsprechend den Expressi onsprodukten der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäure moleküle aufweist; hinsichtlich einer Interaktion, hier Assoziierung, mit verschiedenen KNOX-Proteinen können ins besondere Fragmente erwähnt werden, die Expressionsproduk te kodieren, die die Aminosäuren 122 bis 341 des JuBel2- Proteins (SEQ ID NOS. 2 & 5, Fig. 2, Fig. 6) umfassen bzw. daraus bestehen; der Aminosäuresequenzabschnitt des JuBel2-Proteins mit den Aminosäuren 122 bis 341 umfaßt die mutmaßliche "coiled coil"-Domäne, so daß des weiteren hier jegliche Fragmente erwähnt werden sollen, deren Expressi onsprodukte zumindest diese mutmaßliche "coiled coil"- Domäne umfassen bzw. daraus bestehen;
- Fragmente, welche ein Expressionsprodukt kodieren, das bei ektopischer Expression beispielsweise in Pflanzen eine de finierte Phänotypbeeinflussung entsprechend den Expressi onsprodukten der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäure moleküle bewirkt;
- Fragmente, deren Expressionsprodukte von Antikörpern, die gegen die Expressionsprodukte der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäuremoleküle erzeugt worden sind, ebenfalls spezifisch erkannt und gebunden werden;
- Fragmente, welche bei einer Verwendung als PCR-Primer un ter Standardbedingungen eine spezifische Amplifizierung der JuBel2-DNA oder eines Abschnitts von dieser aus einer cDNA-Bibliothek und/oder genomischen Bibliothek von Ger sten-DNA ermöglichen; hinsichtlich der erwähnten PCR- Standardbedingungen wird auf die Ausführungen im experi mentellen Teil verwiesen; beispielsweise können als Refe renzbedingungen Bedingungen herangezogen werden, unter de nen eine spezifische PCR-Amplifizierung der JuBel2-DNA oder eines Abschnitts von dieser aus einer cDNA-Bibliothek und/oder genomischen Bibliothek von Gersten-DNA mittels der oben erläuterten cDNA- bzw. Nukleinsäureausgangsmole küle erzielt werden kann;
- Fragmente, deren Nukleinsäuresequenz als Vorlage für Oli gonukleotide mit dazu komplementärer Sequenz dienen kann, die als Hybridisierungssonden und/oder Sequenzierungspri mer dienen können, um mit JuBel2-DNA oder -RNA oder Ab schnitten von dieser, insbesondere unter stringenten Be dingungen, beispielsweise auf Northern- oder Southern- Blots, bzw. unter Sequenzierungsbedingungen spezifisch zu hybridisieren.

Insbesondere für eine Verwendung als Sonden können die Frag mente der Erfindung auch radioaktive Atome, wie beispielsweise ³²p, enthalten, die einen Nachweis von Hybridisierungskomplexen mittels Autoradiographie ermöglichen.

Im Falle der beiden erstgenannten bevorzugten Fragmenttypen, deren Expressionsprodukte eine biologische Aktivität, die der biologischen Aktivität der Expressionsprodukte der Ausgangs cDNA- und -Nukleinsäure-Moleküle entspricht, d. h. "funktionel le Homologie" zu den Expressionsprodukten der Ausgangs-cDNA- und -Nukleinsäure-Moleküle, aufweisen, ist anzumerken, daß die biologische Aktivität eines solchen Fragments sich trotz qua litativer Gleichartigkeit, d. h. z. B. gleicher DNA-Bindungs spezifität des jeweiligen Expressionsprodukts, gleicher Fähig keit des jeweiligen Expressionsprodukts zur Interaktion mit anderen Proteinen, z. B. verschiedenen KNOX-Proteinen, gleich artiger Phänotypmodifizierung bei ektopischer Expression z. B. in Pflanzen, quantitativ durchaus von der biologischen Aktivi tät des Ausgangsnukleinsäuremoleküls unterscheiden kann. So kann bei gleicher Sequenzspezifität der DNA-Bindung die DNA- Bindungsaffinität beispielsweise höher oder niedriger sein als jene der Ausgangsnukleinsäure bzw. von dessen Expressionspro dukt, bei gleicher Interaktionsfähigkeit mit einem bestimmten Protein die Affinität zu diesem Protein höher oder niedriger sein als jene der Ausgangsnukleinsäure bzw. von dessen Expres sionsprodukt oder eine Phänotypmodifizierung, die beispiels weise wie im Falle des JuBel2-Gens zu verstärkter Verzweigung einer Pflanze bei ektopischer Expression dieses Gens führt, kann im Falle einer ektopischen Expression eines Fragments dieses Gens stärker oder schwächer ausgeprägt sein, d. h. es kann eine noch stärkere Verzweigung oder eine etwas weniger verstärkte Verzweigung im Vergleich zu einer Pflanze mit ekto pischer Expression der JuBel2-Ausgangsnukleinsäure zu beobach ten sein.

Gleiches gilt für jegliche Nukleinsäuremoleküle (z. B. bestimm te bevorzugte, oben erwähnte Aspekte der Nukleinsäuren mit Se quenzähnlichkeit), die bzw. deren Expressionsprodukt in Zusam menhang mit der Erfindung als ähnlich oder funktionell homolog zu dem JuBel2-Gen, der JuBel2-cDNA bzw. deren Expressionspro dukt beschrieben wird.

Die Erfindung umfaßt des weiteren im wesentlichen reine Nu kleinsäuremoleküle, insbesondere Konstrukte, die die Nuklein säuresequenz der oben erläuterten cDNA-Sequenzen, Nukleinsäü remoleküle oder Fragmente davon zusätzlich zu anderen Nuklein säuresequenzabschnitten umfassen. Derartige Nukleinsäuremole küle können beispielsweise die in SEQ ID NO. 1 oder 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebene cDNA-Sequenz oder die entsprechende in SEQ ID NO. 3 (Fig. 3) angegebene genomische Sequenz im kor rekten Leserahmen fusioniert an eine ein andersartiges Protein kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, so daß bei einer Ex pression dieses Nukleinsäuremoleküls ein Fusionsprotein des Genprodukts mit der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäuresequenz mit dem andersartigen Protein produziert wird. Alternativ kann in einem solchen Nukleinsäu remolekül beispielsweise die in SEQ ID NO. 1 oder 4 (Fig. 1, Fig. 6) angegebene cDNA-Sequenz oder die zugehörige, in SEQ ID NO. 3 (Fig. 3) angegebene genomische Sequenz verknüpft mit passenden Transkriptionsregulationselementen enthalten sein. Im Falle von Fragmenten können beispielsweise PCR-Primer er wähnt werden, die das erfindungsgemäße Fragment an einem Ende verlängert durch eine kurze Nukleotidsequenz, die eine oder mehrere zusätzliche Schnittstelle(n)/Erkennungssequenz(en) für ausgewählte Restriktionsendonukleasen bereitstellt, enthalten.

In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht sich der Begriff "Konstrukt" allgemein als ein jegliches syntheti sches Nukleinsäuremolekül, in dem die cDNA, eines der Nuklein säuremoleküle oder ein Fragment, wie sie oben erläutert wur den, mit einer Nukleinsäuresequenzumgebung oder genetischen Umgebung, in der sie normalerweise nicht vorkommen, verknüpft sind bzw. sich innerhalb einer solchen Nukleinsäuresequenzum gebung oder genetischen Umgebung befinden. Spezielle, aber keineswegs beschränkende Beispiele für derartige Konstrukte sind Vektoren, Plasmide, Cosmide, Bacmide, Phagemide, YACs ("yeast artificial chromosomes"), BACs ("bacterial artificial chromosomes"), Virus- oder Phagengenome, die eine cDNA, eines der Nukleinsäuremoleküle oder ein Fragment, wie sie oben er läutert wurden, oder die oben erwähnten Fusionen mit andersar tige Proteine kodierenden Nukleinsäuresequenzen enthalten.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf Nukleinsäuremoleküle, die eine zu den Nukleinsäuresequenzen aller im Zuge dieser An meldung erwähnten cDNA-Sequenzen, Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente komplementäre Sequenz aufweisen. Somit umfaßt die Erfindung unter einem speziellen Aspekt auch alle Nukleinsäu remoleküle, die mit einem der cDNA-Moleküle, Nukleinsäuremole küle oder Fragmente der Erfindung aufgrund ihrer komplementä ren Nukleinsäuresequenz hybridisieren.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung sind Nukleinsäure moleküle, die eine von der Nukleinsäuresequenz von einem der vorstehend erläuterten cDNA-Moleküle, Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente durch Nukleinsäuresubstitution, -addition, -in sertion, -deletion und/oder -modifizierung abgeleitete Sequenz aufweisen. Speziell bevorzugte abgeleitete Nukleinsäuremolekü le sind solche, die unter stringenten Bedingungen mit den er wähnten Ausgangsnukleinsäuremolekülen hybridisieren. Vorzugs weise erfolgt eine solche Hybridisierung unter niedrig strin genten Bedingungen, in einer weiteren Ausführungsform auch bei hochstringenten Bedingungen. Im Rahmen dieser Beschreibung wird unter niedrig stringenten Bedingungen eine Hybridisierung in 3 × SSC bei Raumtemperatur bis 65°C und unter hochstringen ten Bedingungen eine Hybridisierung in 0,1 × SSC bei 68°C ver standen. SSC steht als Abkürzung für einen 0,15 M Natriumchlo rid, 0,015 M Trinatriumcitrat-Puffer.

Die Erfindung erstreckt sich des weiteren auch auf sense- und antisense-Nukleinsäuremoleküle mit einer sense- bzw. antisen se-Nukleinsäuresequenz bezüglich der Nukleinsäuresequenz der cDNA, eines der Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragments, die vorstehend erläutert worden sind. Derartige Moleküle sind Oli gonukleotide, die an ein JuBel2-Nukleinsäuremolekül binden, um dessen Transkription und/oder Translation durch einen Mecha nismus, der als "homology-dependent gene silencing" bezeichnet wird, zu verringern oder gar vollständig zu unterbinden. Mit tels derartiger Moleküle kann die Expression eines JuBel2-Gens in einem Zielorganismus selektiv verringert oder unterbunden werden. Für den Fachmann ist ersichtlich, daß die genaue Länge und das Ausmaß an Komplementarität des sense- oder antisense- Oligonukleotids von der speziell ausgewählten Zielsequenz in nerhalb der Nukleinsäuresequenzen der erfindungsgemäßen cDNA, Nukleinsäuremoleküle bzw. Fragmente abhängen wird. Allgemein wird das sense- oder antisense-Oligonukleotid so gestaltet sein, daß dieses die Zielsequenz in einer Zielzelle unter phy siologischen Bedingungen selektiv bindet, d. h. unter physiolo gischen Bedingungen in höherem Ausmaß mit der Zielsequenz als mit jeder anderen Sequenz in der Zielzelle hybridisiert. Im allgemeinen umfassen sense- bzw. antisense-Oligonukleotide mindestens 7, vorzugsweise mindestens 15 und am meisten bevor zugt 20 bis 30 oder sogar mehr aufeinanderfolgende Basen, die zu der Zielsequenz komplementär sind. Im Falle von antisense- Oligonukleotiden werden bevorzugte Spezies N-terminalen oder stromaufwärts liegenden 5'-Bereichen, wie Translationsinitia tions-, Transkriptionsinitiations- oder Promotorbereichen bzw. -stellen, des Zielgens entsprechen. Zusätzlich können diese z. B. auch gegen 3'-untranslatierte Bereiche oder mRNA-Spleiß stellen für den Fall, daß ein alternatives Spleißen der mRNA auftritt, gerichtet sein. Allgemein werden antisense-Oligonu kleotide auf Stellen gerichtet sein, die mutmaßlich keine mRNA-Sekundärstruktur aufweisen und an die mit hoher Wahr scheinlichkeit keine Proteine binden.

Insbesondere im Bereich von sense- und antisense-Oligonukleo tiden werden zu deren Synthese neben natürlicherweise vorkom menden Desoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden und einer jeglichen Kombination von diesen auch bevorzugt sogenannte "modifizierte" Oligonukleotide, die in der Natur so nicht vor kommen, verwendet. Diese Oligonukleotide können auf verschie dene Weise so modifiziert werden, daß eine Hybridisierung mit der Zielsequenz nicht verhindert wird, aber z. B. deren Stabi lität und/oder deren Bindungsaffinität zu der Zielsequenz er höht wird.

"Modifizierte Oligonukleotide" können Oligonukleotide sein, in denen (1) mindestens zwei Nukleotide mittels einer syntheti schen Internukleosidverknüpfung anstelle einer Phosphodiester verknüpfung zwischen dem 5'-Ende eines Nukleotids und dem 3'- Ende eines anderen Nukleotids miteinander verbunden sind. Bei spiele für synthetische Internukleosidverknüpfungen sind Phos phorothioate, Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Phosphat - ester, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Carbamate, Phosphattriester, Acetamidate, Peptide und Carboxymethylester.

Weitere "modifizierte Oligonukleotide" können Oligonukleotide sein, an die (2) eine chemische Gruppe, die normalerweise nicht mit Nukleinsäuren assoziiert ist, kovalent angefügt wor den ist. Dies kann eine kovalente Modifizierung einer Base und/oder eines Zuckers umfassen. Beispielsweise umfassen der artige modifizierte Oligonukleotide solche, die Rückgrat zuckereinheiten aufweisen, an die in 3'-Position kovalent or ganische Gruppen mit niedriger relativer Molekülmasse außer oder anstelle einer Hydroxylgruppe gebunden sind und/oder an die in 5'-Position eine andere Gruppe als eine Phosphatgruppe gebunden ist. Solche modifizierten Oligonukleotide können bei spielsweise eine 2'-O-alkylierte Ribosegruppe umfassen oder auch andersartige Zucker als Ribose, wie Arabinose. Modifi zierte Oligonukleotide können auch Basenanaloga, wie C-5- Propin-modifizierte Basen (Wagner et al., Nature Biotechnology 14: 840-844, 1996), umfassen.

Neben Nukleinsäuremolekülen bezieht sich die Erfindung auch auf die Proteine und Polypeptide, die von einer erfindungsge mäßen cDNA, einem der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder einem erfindungsgemäßen Fragment, wie sie oben erläutert worden sind, kodiert werden. Wie bereits erwähnt, können aus den Nukleinsäuresequenzen der zwei unterschiedlichen JuBel2- cDNAs (SEQ. ID NOS. 1 und 4, Fig. 1 und 6), die ausgehend von den Gerstenvarietäten K-Atlas und CalC15 isoliert wurden, zwei Expressionsprodukte mit geringfügig unterschiedlichen Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOS. 2 und 5, Fig. 2) abgeleitet werden. Die abgeleitete Proteinsequenz aus der Varietät CalC15 enthält insgesamt 3 zusätzliche Aminosäuren gegenüber der ab geleiteten Proteinsequenz aus der K-Atlas-Varietät, und zwar in den Aminosäuresequenzpositionen 323 sowie 521 und 522; dar über hinaus weicht die abgeleitete Proteinsequenz aus der Va rietät CalC15 von der Proteinsequenz aus der K-Atlas-Varietät in Aminosäuresequenzposition 65 (Thr anstelle von Ala) ab. Im Rahmen der Erfindung muß dementsprechend auch ein gewisses Ausmaß an Sequenzvariabilität auf Aminosäuresequenzebene Be rücksichtigung finden.

Unter einem speziellen Aspekt betrifft die Erfindung dement sprechend ein Protein oder Polypeptid mit einer der in SEQ ID NOS. 2 und 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäuresequen zen oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 75% Sequenz ähnlichkeit, insbesondere mindestens 80%, speziell mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäuresequenz.

Ein spezieller Aspekt der Erfindung sind Proteine und Polypep tide mit den angegebenen Sequenzähnlichkeiten, die funktionel le Homologie zu den jeweiligen Ausgangsproteinen oder -poly peptiden mit den in SEQ ID NO. 2 und 5 (Fig. 2, Fig. 6) an gegebenen Aminosäuresequenzen aufweisen. Dementsprechend sind Gegenstand der Erfindung gleichfalls Proteine und Polypeptide mit Sequenzähnlichkeit,

- die eine zumindest qualitativ/hinsichtlich der Sequenzspe zifität der Ausgangsproteine oder -polypeptide entspre chende DNA-Bindungsfähigkeit aufweisen;
- die eine zumindest qualitativ/d. h. hinsichtlich des jewei ligen spezifischen Interaktionspartners den Ausgangspro teinen oder -polypeptiden entsprechende Fähigkeit zur In teraktion mit anderen Proteinen, z. B. bestimmten KNOX- Proteinen, auf weisen;
- die bei ektopischer Expression beispielsweise in Pflanzen eine definierte Phänotypbeeinflussung entsprechend derje nigen, die bei ektopischer Expression eines der Ausgangs proteine oder -polypeptide beobachtet wird, bewirken. Da bei sollte die Phänotypbeeinflussung zumindest qualitativ derjenigen, die aufgrund der Expression eines der Aus gangsproteine bzw. -polypeptide beobachtet wird, entspre chen; dies bedeutet, daß im Falle einer Phänotypmodifizie rung, die beispielsweise im Falle der ektopischen Expres sion des JuBel2-Genexpressionsprodukts in Pflanzen sich in Form einer verstärkten Verzweigung einer Pflanze manife stiert, bei einer ektopischen Expression eines Fragments dieses Genexpressionsprodukts diese Phänotypmodifizierung stärker oder schwächer ausgeprägt sein kann, d. h. es kann eine noch stärkere Verzweigung oder eine etwas weniger verstärkte Verzweigung im Vergleich zu einer Pflanze mit ektopischer Expression der JuBel2-Ausgangsproteins zu be obachten sein;
- die zur Erzeugung von monoklonalen oder polyklonalen Anti körpern, die auch ein Ausgangsprotein oder -polypeptid mit einer der in SEQ ID NO. 2 und 5 (Fig. 2, Fig. 6) angege benen Aminosäuresequenzen spezifisch erkennen und binden, geeignet sind und/oder
- die von Antikörpern, die gegen das Ausgangsprotein bzw. -polypeptid mit einer der in SEQ ID NO. 2 und 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Aminosäuresequenzen erzeugt worden sind, ebenfalls spezifisch erkannt und gebunden werden.

Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff "Polypep tid" Moleküle, die typischerweise mindestens 18 Aminosäuren, insbesondere mindestens 25 Aminosäuren und besonders bevorzugt mehr als 40 Aminosäuren umfassen. Ein Polypeptid kann auch weit mehr als 100 oder 150 Aminosäuren umfassen.

Gegenstand der Erfindung sind gleichfalls Fragmente der erfin dungsgemäßen Proteine oder Polypeptide. Besonders bevorzugte Fragmente der erfindungsgemäßen Proteine und Polypeptide sind solche,

- die eine zumindest qualitativ/hinsichtlich der Sequenzspe zifität den Ausgangsproteinen oder -polypeptiden entspre chende DNA-Bindungsfähigkeit aufweisen;
- die eine zumindest qualitativ/d. h. hinsichtlich des jewei ligen spezifischen Interaktionspartners den Ausgangspro teinen oder -polypeptiden entsprechende Fähigkeit zur In teraktion mit anderen Proteinen, z. B. bestimmten KNOX-Pro teinen, aufweisen; hinsichtlich einer Interaktion, hier Assoziierung, mit verschiedenen KNOX-Proteinen können ins besondere Fragmente erwähnt werden, die die Aminosäuren 122 bis 341 des JuBel2-Proteins (SEQ ID NOS. 2 & 5, Fig. 2, Fig. 6) umfassen bzw. daraus bestehen; der Aminosäure sequenzabschnitt des JuBel2-Proteins mit den Aminosäuren 122 bis 341 umfaßt die mutmaßliche "coiled coil"-Domäne, so daß des weiteren hier jegliche Fragmente erwähnt werden sollen, die zumindest diese mutmaßliche "coiled coil"- Domäne umfassen bzw. daraus bestehen;
- die bei ektopischer Expression beispielsweise in Pflanzen eine definierte Phänotypbeeinflussung entsprechend derje nigen, die bei ektopischer Expression eines der Ausgangs proteine oder -polypeptide beobachtet wird, bewirken. Da bei sollte die Phänotypbeeinflussung zumindest qualitativ derjenigen, die aufgrund der Expression der Ausgangspro teine bzw. -polypeptide beobachtet wird, entsprechen; dies bedeutet, daß im Falle einer Phänotypmodifizierung, die beispielsweise im Falle der ektopischen Expression des Ju Bel2-Genexpressionsprodukts in Pflanzen sich in Form einer verstärkten Verzweigung einer Pflanze manifestiert, bei einer ektopischen Expression eines Fragments dieses Genex pressionsprodukts diese Phänotypmodifizierung stärker oder schwächer ausgeprägt sein kann, d. h. es kann eine noch stärkere Verzweigung oder eine etwas weniger verstärkte Verzweigung im Vergleich zu einer Pflanze mit ektopischer Expression der JuBel2-Ausgangsproteins zu beobachten sein;
- die zur Erzeugung von monoklonalen oder polyklonalen Anti körpern, die das Protein oder Polypeptid mit einer der in SEQ ID NO. 2 und 5 (Fig. 2, Fig. 6) angegebenen Amino säuresequenz oder einer Aminosäuresequenz mit mindestens 75% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 (Fig. 2, Fig. 61 angegebenen Aminosäuresequenz spezifisch erkennen und binden, geeignet sind und/oder
- die von Antikörpern, die gegen eines der Ausgangsproteine bzw. -polypeptide erzeugt worden sind, spezifisch erkannt und gebunden werden.

Die erfindungsgemäßen Fragmente umfassen neben Polypeptiden auch Peptide, die definitionsgemäß mindestens 8 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 12 Aminosäuren umfassen sollen.

Außerdem umfaßt die Erfindung Proteine oder Polypeptide, ins besondere Fusionsproteine, die eines der erfindungsgemäßen Proteine, Polypeptide oder Fragmente davon neben weiteren Ami nosäuresequenzabschnitten umfassen.

Weitere Aminosäuresequenzabschnitte, die neben den erfindungs gemäßen Proteinen, Polypeptiden oder Fragmenten in derartigen Proteinen oder Polypeptiden enthalten sein können, können bei spielsweise der Isolierung solcher Proteine aus proteinhalti gen Zusammensetzungen, z. B. nach einer Expression in einem ge wünschten Organismus, dienen. Beispiele hierfür ist eine C terminale Sequenzverlängerung, die den Affinitätsmarker AWRHPQFGG ("Strep-tag"; Schmidt und Skerra, Prot. Engineering 6: 109-122 (1993)) umfaßt, über welchen die genannten Protein moleküle spezifisch an eine Streptavidin-derivatisierte Matrix binden und so isoliert werden können. Sieht man zusätzlich ei ne Erkennungsstelle für eine Protease, z. B. einen Aminosäure sequenzabschnitt mit der Sequenz IEGR, zwischen der Affini tätsmarkersequenz und den übrigen Aminosäuresequenzabschnitten vor, können mittels der die Aminosäuresequenz IEGR spezifisch erkennenden Protease Faktor Xa die übrigen Aminosäuresequenz abschnitte von der Affinitätsmatrix freigesetzt werden. Alter nativ kann das vollständige Proteinmolekül auch mittels Biotin oder Biotinderivaten von der Affinitätsmatrix abgelöst werden.

Ein weiteres Beispiel für einen weiteren Aminosäuresequenzab schnitt, der für die Isolierung bzw. Reinigung des Zielpro teins eingesetzt werden kann, stellt ein Aminosäuresequenzab schnitt mit einer Abfolge von mehreren, z. B. 10, N-terminal angefügten Histidin-Resten ("His-tag") dar. Eine Isolierung bzw. Reinigung des Zielproteins kann aufgrund der N-terminalen Histidinreste leicht durch Metall-Chelat-Affinitätschromato graphie (z. B. Ni-Sepharose) erfolgen.

Weitere Aminosäuresequenzabschnitte, die neben den erfindungs gemäßen Proteinen, Polypeptiden oder Fragmenten in derartigen Proteinen oder Polypeptiden enthalten sein können, können aber auch beispielsweise dem vereinfachten Nachweis dieser Proteine dienen. In diesem Falle stellen die weiteren Aminosäurese quenzabschnitte häufig ein weiteres Protein dar, das mit dem erfindungsgemäßen Protein, Polypeptid oder Fragment in Form eines Fusionsproteins vorliegt. Beispiele hierfür sind Protei ne mit enzymatischer Aktivität, wie beispielsweise das β- Glucuronidase-Reporterprotein, fluoreszierende oder phospho reszierende Proteine, wie GFP ("green fluorescent protein"), oder auch Proteine, die durch leicht verfügbare Antikörper spezifisch erkannt und gebunden werden.

Die erfindungsgemäßen Proteine, Polypeptide und Fragmente kön nen des weiteren Nicht-Aminosäure-Bestandteile aufweisen, z. B. mit Nicht-Aminosäure-Molekülen derivatisiert sein. Derartige Moleküle können beispielsweise Zuckerreste sein, die z. B. in Form einer gegebenenfalls in vivo auftretenden Glykosylierung an aus Gerste isolierten JuBel2-Genprodukten vorhanden sein können.

Die Erfindung umfaßt des weiteren Antikörper, die ein Protein, Polypeptid oder Fragment davon, wie oben erläutert, spezifisch erkennen und binden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Verfahren zur.Erzeugung mono klonaler wie polyklonaler Antikörper gegen ein gewünschtes Protein oder Polypeptid unter Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen, Polypeptiden oder Fragmenten zur Immunisierung ei nes Wirtsorganismus sind dem Fachmann bekannt und benötigen auch aufgrund überaus zahlreicher Fachpublikationen zu diesem Thema keiner weiteren Erläuterung.

Erfindungsgemäße Antikörper können Komponenten aufweisen, die ihrem Nachweis dienen, wie beispielsweise in Konjugation mit alkalischer Phosphatase vorliegen.

Die erfindungsgemäßen cDNAs, Nukleinsäuremoleküle, Fragmente davon, Proteine, Polypeptide, Protein- oder Polypeptidfragmen te sowie Antikörper können auch in Form von Zusammensetzungen vorliegen, in denen sie zusammen mit üblichen weiteren Be standteilen, z. B. Puffersubstanzen, Salzen, physiologisch an nehmbaren Trägersubstanzen, Stützproteinen, Proteaseinhibito ren oder sonstigen Additiven, vorliegen.

Unter einem weiteren wichtigen Aspekt erstreckt sich die Er findung auch auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen cDNA, eines der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Fragmente oder Konstrukte oder auch eines dazu funktionell analogen Nu kleinsäuremoleküls zur Modifizierung des Phänotyps von Orga nismen, insbesondere von Pflanzen.

Eine Phänotypmodifizierung, die speziell in Pflanzen bei ekto pischer Expression des JuBel2-Gens erzielt werden kann, ist eine vermehrte Sproßbildung, d. h. eine vermehrte Verzweigung. Zusätzlich kann ein Verlust der apikalen Dominanz und damit ein vermindertes Längenwachstum der Pflanze zu beobachten sein.

Verfahren, um eine ektopische Expression des JuBel2-Gens in Pflanzen, wie sie oben detaillierter erläutert wurde, zu be wirken, beispielsweise eine Transformation oder Transfektion einer Zielzelle mit einem ein JuBel2-Transgen in exprimierba rer Form enthaltenden Konstrukt, sind dem Fachmann wohlbekannt und bedürfen hier keiner weiteren Erläuterung.

Die Erfindung erstreckt sich schließlich auch auf Organismen, einschließlich transgenen Organismen, insbesondere Mikroorga nismen, Pflanzen oder Tiere, oder Teile, insbesondere Zellen, oder Vermehrungsmaterial solcher Organismen, die eine ektopi sche Expression eines JuBel2-Gens oder eines dazu funktionell analogen Nukleinsäuremoleküls aufweisen.

Diese Organismen umfassen alle Arten von Organismen, wie Mi kroorganismen, z. B. Bakterien, Viren, Protozoen, Pilze und He fen, Algen, Pflanzen oder Tiere, einschließlich Insekten, z. B. Drosophila, Würmern, z. B. Nematoden, Fischen, Reptilien und Säugetieren, ausschließlich des Menschen. Des weiteren werden auch Teile, z. B. Zellen, und Vermehrungsmaterial, z. B. Samen, von solchen Organismen mit umfaßt, wobei hier auch menschliche Zellen und Gewebekulturen mit umfaßt sein sollen.

Im Falle von Pflanzen umfaßt der Begriff "Teile von Pflanzen" hoch differenzierte Pflanzenteile, wie Pflanzenorgane, z. B. Wurzeln, Blätter u. s. w., wie auch schlecht differenzierte Pflanzenteile, wie Pflanzengewebe, Kallus, Pflanzenzellen oder Pflanzenprotoplasten. Vermehrungsmaterial umfaßt im Falle von Pflanzen beispielsweise Samen, Sämlinge u. s. w.

Pflanzen von Interesse in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können natürliche Pflanzen (Wildtyp- oder aus her kömmlichen Pflanzenzüchtungsprozessen hervorgegangene Pflan zen), hybride Pflanzen (die erhalten werden infolge einer Hy bridisierung, d. h. einem genetischen Rekombinationsprozeß, zwischen Genomen von Pflanzen, die von unterschiedlichen Popu lationen abgeleitet sind, und die ohne Verlust irgendwelcher Merkmale nicht stabil vermehrt werden können) oder transgene Pflanzen (d. h. Pflanzen, die bereits mindestens ein Transgen enthalten) sein.

In Zusammenhang mit der Erfindung interessierende Pflanzen sind zahlreiche Pflanzen von landwirtschaftlichem, gartenbau lichem, zierpflanzenbaulichem, waldbaulichem oder obstbauli chem Interesse, monokotyledone wie auch dikotyledone Pflanzen.

Nicht-einschränkende Beispiele für derartige Pflanzen sind di verse Zierpflanzen, Nutzpflanzen, wie Tabak, Sonnenblume, Baumwolle, Futter- bzw. Weidegräser, Getreide (z. B. Gerste, Weizen, Mais, Hafer, Roggen, . . .), Beerensträucher (z. B. Him beeren, Brombeeren, Stachelbeeren, Johannisbeeren), sowie Bäu me für die Cellulosegewinnung/Holzproduktion (z. B. Weide, Pap pel) oder auch Zierbäume und -sträucher, die im Bereich der Gestaltung von Gärten und Grünflächen eingesetzt werden.

Ein spezieller, besonders wichtiger Aspekt der Erfindung be trifft erfindungsgemäße transgene Pflanzen, die einen aufgrund der Transformation mittels einer cDNA, einem der Nukleinsäure moleküle, einem Fragment oder Konstrukt nach der Erfindung oder einem dazu funktionell analogen Nukleinsäuremolekül ver änderten Phänotyp aufweisen, insbesondere eine vermehrte An zahl von Sprossen oder vermehrte Verzweigung, ggf. in Kombina tion mit einem Verlust von apikaler Dominanz und damit einem verminderten Längenwachstum der Pflanze.

Verfahren zum Erzeugen der erfindungsgemäßen Organismen, ins besondere Pflanzen, Teile von Organismen bzw. Vermehrungsmate rial sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. Bei spielsweise können erfindungsgemäße transgene Pflanzen mittels einer Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen mit einem JuBel2-Gen der Erfindung herge stellt werden.

Schließlich betrifft die Erfindung auch Organismen, insbeson dere Pflanzen, die genetisch modifiziert worden sind, so daß ein im jeweiligen Wildtyp vorkommendes JuBel2-Gen, wie es oben definiert wurde, beispielsweise durch gezielte "Knockout"- Mutation oder sogenanntes "homology dependent gene silencing" unter Verwendung von sense- oder antisense-Nukleotiden, zer stört vorliegt und/oder keinerlei oder lediglich ein nicht funktionsfähiges Expressionsprodukt des im jeweiligen Wildtyp vorkommenden JuBel2-Gens exprimiert werden kann. Ein speziel ler Aspekt sind dabei Organismen, die aufgrund dieser geneti schen Modifizierung einen besonderen Phänotyp aufweisen.

Erläuterung der Figuren

Fig. 1 cDNA des JuBel2-Gens aus Gerste. In Fig. 1A ist die JuBel2-cDNA-Sequenz aus der Gerstenvarietät K-Atlas, in Fig. 1B diejenige aus der Gerstenvarietät CalC15 gezeigt. Die cDNA- Sequenz aus der Varietät CalC15 enthält insgesamt 10 zusätzli che Nukleotide gegenüber der cDNA-Sequenz aus der K-Atlas-Va rietät, und zwar innerhalb des kodierenden Bereichs 1 × 3 Ba senpaare und 1 × 6 Basenpaare sowie im 3'-nicht-translatierten Bereich ein Basenpaar; darüber hinaus gibt es eine Reihe von Nukleotidaustauschen, die jedoch mit Ausnahme eines Basenaus tauschs (Nukleotid-Position 203) stumm sind, d. h. keine Verän derung der abgeleiteten Aminosäuresequenz bewirken.

Das längste offene Leseraster der cDNA-Sequenz aus der Varie tät K-Atlas umfaßt die Nukleotide 11 bis 1834, dasjenige der cDNA-Sequenz aus der Varietät CalC15 umfaßt die Nukleotide 11 bis 1843.

Fig. 2 Abgeleitete Proteinsequenz von JuBel2 aus Gerste. In Fig. 2A ist die abgeleitete Proteinsequenz aus der Gerstenva rietät K-Atlas, in Fig. 2B diejenige aus der Gerstenvarietät CalC15 gezeigt. Die Proteinsequenz aus der Varietät CalC15 enthält insgesamt 3 zusätzliche Aminosäuren gegenüber der Pro teinsequenz aus der K-Atlas-Varietät, und zwar in den Ami nosäuresequenzpositionen 323 sowie 521 und 522; darüber hinaus weicht die Proteinsequenz aus der Varietät CalC15 von der Pro teinsequenz aus der K-Atlas-Varietät in Aminosäuresequenzposi tion 65 (Thr anstelle von Ala) ab. Die mutmaßliche "coiled coil"-Domäne befindet sich in dem Aminosäuresequenzabschnitt mit den Aminosäuren 217 bis 264, das mutmaßliche Kernlokali sierungssignal im Aminosäuresequenzabschnitt mit den Aminosäu ren 233 bis 247 und die Homöodomäne im Aminosäuresequenzab schnitt mit den Aminosäuren 344 bis 405 (Varietät K-Atlas) bzw. 345 bis 406 (Varietät CalC15).

Fig. 3 Genomische Sequenz des JuBel2-Gens aus Gerste (Varie tät CalC15).

Fig. 4 Schematische Darstellung des für die Konstruktion ei nes im "Two-Hybrid"-System einsetzbaren Köders als Ausgangsgen verwendeten Gens BKn3 sowie des schließlich eingesetzten Kö derkonstrukts BKn3A2.

Kästen kennzeichnen die konservierten Domänen des Proteins. b: basische Domäne; ELK: ELK-Domäne; GSE: GSE-Box; HD: Homöo domäne; KNOX: KNOX-Domäne

Fig. 5 Schematische Darstellung der durch Two-Hybrid- bzw. cDNA-Screening und 5'-RACE isolierten cDNA-Abschnitte von Ju Bel2 im Vergleich zu BEL-1 aus Arabidopsis thaliana.

Kästen zeigen die vermutlich translatierten Bereiche der Tran skripte von JuBel2 und BEL1, wobei die Homöobox und der für die vermutliche "coiled coil"-Domäne kodierende Abschnitt ge kennzeichnet wurden. Balken unter den cDNA-Abschnitten von Ju Bel2 kennzeichnen die durch Two-Hybrid- bzw. cDNA-Screening und 5'-RACE isolierten Bereiche der cDNA. Pfeile geben die Po sitionen der für die 5'-RACE verwendeten Primer an. HB: Homöo box.

Fig. 6 cDNA-Sequenz des JuBel2-Gens aus Gerste und davon ab geleitete Aminosäuresequenz.

Dargestellt ist das mutmaßliche JuBel2-Transkript aus der Ger stenvarietät K-Atlas, zusammengesetzt aus dem 5'-RACE-Klon 37 und dem cDNA-Klon. Das längste offene Leseraster ist unter der cDNA-Sequenz angegeben und umfaßt die Nukleotide 11 bis 1834. Die Homöodomäne wurde dunkelgrau gekennzeichnet und umfaßt die Aminosäuren 344 bis 405 der gezeigten abgeleiteten Aminosäure sequenz (kodiert von den Nukleotiden 1040 bis 1225). Die mut maßliche "coiled coil"-Domäne ist hellgrau gekennzeichnet und umfaßt die Aminosäuren 217 bis 264 der gezeigten abgeleiteten Aminosäuresequenz (kodiert von den Nukleotiden 659 bis 802). Das postulierte Kernlokalisierungssignal wurde mittels eines Balkens unter der Aminosäuresequenz markiert und umfaßt die die Aminosäuren 233 bis 247 der gezeigten abgeleiteten Ami nosäuresequenz (kodiert von den Nukleotiden 707 bis 751).

Fig. 7 Genomische Struktur von JuBel2:
Transkribierte Sequenzen sind als Kästen dargestellt, wobei die vermutlichen "coiled coil"- bzw. Homöoboxdomänen hellgrau bzw. dunkelgrau unterlegt hervorgehoben sind. Die zur Subklo nierung verwendeten Restriktionsschnittstellen und ihre rela tiven Positionen auf den sequenzierten genomischen Abschnitten sind angegeben. Unter dem Gen sind die zur Sequenzierung her angezogenen Plasmidsubklone mit ihren flankierenden Restrikti onsschnittstellen abgebildet. (5) bezeichnet dabei die SalI- Schnittstelle des Lambda-Polylinkers und entspricht keiner ge nomischen Erkennungssequenz. Die für Southern-Hybridisierungen und Bank-Screen verwendeten Sonden sind als Balken über dem Gen dargestellt. Zahlen über diesen Balken bezeichnen die zur Erzeugung der Sonden verwendeten Primerpaare. E: EcoRI, S. SalI, X: Xbal.

Fig. 8
Tabelle: Exon/Intron-Struktur der BEL1-homologen Gene aus Ara bidopsis im Vergleich zu JuBel2 aus Gerste

Dargestellt sind die Exon-/Intron-Übergänge und -Größen von Vertretern der BEL1-ähnlichen Homöoboxgene aus Arabidopsis und des JuBel2-Gens aus Gerste. Die mit BEL1-hom1-8 bezeichneten Sequenzen wurden der GenBank-Datenbank entnommen, wobei die dort angenommenen Exon/Intron-Grenzen übernommen wurden. Die Kennnummern der Sequenzen sind in Klammern angegeben. Exons wurden durch graue Unterlegung hervorgehoben.
* Zahlen in Klammern geben die Längen der translatierten Be reiche der cDNAs vom AT6 bis zu Intron I bzw. von Intron III bis zum Stop-Kodon an.
** Die genomische Sequenz von BEL1 wurde noch nicht veröf fentlicht.
*** ATHI besitzt 2 Introns im 5'-nicht-translatierten Bereich der mRNA.

Fig. 9 Phänotyp der Nachkommen zweier unabhängiger, JuBel2- überexprimierender Primärtransformanten (Tabakpflanzen; Nico tiana tabacum) (35S-JuBel2-1 und 35S-JuBel2-2) im Vergleich zum Wildtyp (WT).

Fig. 10 Phänotyp verschiedener JuBel2-überexprimierender Pri märtransformanten von Arabidopsis thaliana.

JuBel2 überexprimierende Arabidopsis-Pflanzen produzieren im Vergleich zum Wildtyp eine vermehrte Anzahl von Sprossen, de ren Länge innerhalb einer Pflanze konstant ist, von Pflanze zu Pflanze aber stark variiert. Die Bandbreite reicht von Wild typ-Länge (Fig. 10, Pflanze links außen) bis zum beinahe vollständigen Verlust des Längenwachstums der Sproßachse (Fig. 10, Pflanze rechts außen). Die Fertilität der Blüten und die allgemeine Fitness der Pflanzen wird durch das Transgen nicht beeinträchtigt.

Experimenteller Teil Materialien Chemikalien

Chemikalien, Antibiotika und Phytohormone wurden von den Fir men Biomol (Hamburg, DE), Bio-Rad (München, DE), Merck (Darm stadt, DE), New England Biolabs GmbH (Schwalbach, DE); Plano (Marburg, DE), Roth (Karlsruhe, DE), Serva (Heidelberg, DE), Sigma (München, DE) und Hoechst (Frankfurt, DE) bezogen. Ra dionukleotide, Röntgenfilme und Nylonmembranen wurden von Amersham Buchler (Braunschweig, DE), Nitrocellulosemembranen von Schleicher & Schüll (Dassel, DE) erworben. Enzyme stammen von Boehringer (Mannheim, DE), Gibco-BRL (Neu Isenburg, DE), New England Biolabs (Schwalbach, DE), Pharmacia (Uppsala, Schweden) und Stratagene (Heidelberg, DE).

Kits

Das Hefe-Two-Hybrid-System wurde mit Komponenten des Hybri- Zap™-Systems von Stratagene (Heidelberg, DE) durchgeführt. Für RACE-Amplifikationen wurde der SMART™ RACE cDNA Amplification Kit von Clontech (Heidelberg, DE) verwendet. PCR-Produkte wur den teilweise mittels des Original TA Cloning® Kits von Invi trogen kloniert. RNA-Präparationen aus Pflanzenmaterial er folgten mit dem RNeasy™ Plant Mini Kit von Qiagen (Hilden, DE), und Plasmidpräparationen aus E. coli mit dem Qiagen Plas mid Kit. Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten erfolgte mit QIAEX® oder über QIAquick™-Säulen von Qiagen.

Bakterienstämme

Für alle Klonierungen wurde der E. coli-Stamm DH10B (Stratage ne, Heidelberg, DE) verwendet. Für die Propagation der λ-Phagen wurden K803 (für λEMBL3 und λEMBL4; Fedoroff, N. V. (1983). Comparison of host strains for cloning maize DNA into bacte riophage lambda. Plant Mol. Biol. Rep. 1; 27-29) und POP13 (für λNM1149; Murray, N. E. (1983). In Lambda II: Phage Lambda and molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, USA, 395-432) eingesetzt. Für die Pflanzentransformation wurde A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J. und Schilperoort, R. A. (1983). A binary plant transformation vector strategy based upon separation of vir- and T-region of A. tumefaciens. Nature 303, 179-180) verwendet.

Lösungen und Medien

Standardlösungen wie SSPE, SSC, TBE etc. und die Medien zur Kultivierung von E.coli wie NZCYM, LB und DYT sind in Sambrook et al. (1989; a. a. 0.) beschrieben. A. tumefaciens wurde kulti viert in YEB-Medium: Casaminosäuren, Fleischextrakt, Saccharo se (je 5 g/l), Hefeextrakt (1 g/l) und 2 mM MgSO₄. Für A. tu mefaciens LBA4404 (s. u.) wurde aufgrund des Plasmids pAI4404 mit Rifampicin (100 mg/l) und Streptomycin (300 mg/l) selek tiert, pBin19-Transformanten wurden auf Kanamycin (100 mg/l) selektiert.

Zur Regeneration und Kultivierung transgener Pflanzen wurden nach Murashige und Skoog (1962) modifizierte MS-Medien be nutzt: Allgemeine Komponenten sind MS-Basalsalzmedium (Sigma; 4,5 g/l) sowie Myo-Inositol (100 mg/l), Thiaminhydrochlorid (0,1 mg/l), Glycin (2 mg/l), Nikotinsäure (0,5 mg/l) und Pyri doxinhydrochlorid (0,5 mg/l). MSI und MSII-Medium enthalten zusätzlich Glucose (30 g/l). MSII enthält ferner Kanamycin (100 mg/l), Claforan (500 mg/l), sowie die Phytohormone Zeatin (2 mg/l), Gibberelinsäure A₃ (GA₃; 20 mg/l) und Naphthylessig säure (NAA; 20 mg/l). In MSIII fehlen die Phytohormone und an stelle von Glucose wird Saccharose (20 g/l) zugesetzt. Der pH- Wert der MS-Medien wird mit NaOH auf 5,8 eingestellt.

Allg. Methoden Klonierungstechniken, Elektrophoresen, u. s. w.

Alle nicht näher beschriebenen molekularbiologischen Techniken wurden nach den Protokollen in Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) durchge führt.

Präparation von Nukleinsäuren

DNA-Fragmente aus Agarosegelen wurden mit QIAEX® oder über QIAquick™-Säulen aufgereinigt (Qiagen, 1995). Plasmidpräpara tionen aus E. coli erfolgten nach der Methode von Birnboim und Doly (Birnboim, H. C. und Doly, J. (1979): A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) und nach der Qiagen-Midiprä parations-Methode (QIAGEN (1995). Handbooks QIAquick™, QIAEX® und QIAGEN®Plasmid. Firmeneigene Publikationen). λ-DNA wurde nach der Methode von Benton und Davis (Benton, W. D. und Davis, R. W. (1977): Screening lambda gt recombinant clones by hybridisation to single plaques in situ. Science 196, 180-182) präpariert. Präparation von Gesamt-RNA aus Pflanzen erfolgte nach dem Protokoll von Logeman et all. (Logemann, J., Schell, J. und Willmitzer, L. (1987): Improved method for the isolati on of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16-29) oder mit dem RNeasy™ Plant Mini Kit von Qiagen.

DNA-Transfer und Hybridisierungen

DNA-Transfer aus Agarosegelen (Southern, E. (1975): Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98; 503-517) auf Nylonfilter wurde mit SSPE als mobiler Phase durchgeführt. DNA-DNA- Hybridisierungen erfolgten im SSPE-Puffersystem bei unter schiedlichen Temperaturen (siehe Sambrook et al., 1989, a. a. O.). Radioaktive DNA-Sonden wurden nach der Methode von Feinberg und Vogelstein (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983): Technique for radiolabeling DNA restriction endo nuclease fragments to high specific activity. Anti. Biochem. 132; 6-13) synthetisiert. Das Screening von Genbibliotheken mit radioaktiv markierten Sonden und die Filterhybridisierung wurden nach Benton und Davis (Benton, W. D. und Davis, R. W. (1977): Screening lambda gt recombinant clones by hybridisati on to single plaques in situ. Science 196, 180-182) durchge führt.

PCR-Amplifikationen, allgemein

PCR-Amplifikationen, deren Produkte für Klonierungen bestimmt waren, wurden mit Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, DE) durchgeführt. Diese zeichnet sich im Vergleich zu Taq- Polymerase durch eine geringe Fehlerrate aus. Die doppelsträn gigen Amplifikationsprodukte der Pfu-Polymerase besitzen stumpfe Enden, über die sie bei Bedarf nach Phosphorylierung direkt in SmaI-geschnittene Vektoren kloniert wurden. Für die übrigen PCR-Amplifikationen wurde Taq-DNA-Polymerase (Gibco BRL, Neu-Isenburg, DE) verwendet. Die Reaktionen wurden im Triblock von Biometra (Göttingen, DE) durchgeführt.

PCR-Standardprotokoll

1-10 ng	DNA-Matrize
1x	PCR-Puffer (enthält 1,5-2,5 mM MgCl₂)
0-10%	DMSO
2 pmol/µl	Primer 1
2 pmol/µl	Primer 2
200 µM	dNTPs
1 U	Polymerase*

Die Anzahl der Amplifikationszyklen, Dauer der einzelnen Schritte und Annealing-Temperaturen wurden in Abhängigkeit von den zu amplifizierenden DNA-Fragmenten und den Primersequenzen bestimmt. Bei der Verwendung von Primern mit integrierten, zur Matrize nicht homologen Restriktionsschnittstellen wurden Am plifikationen mit zwei unterschiedlichen Annealing-Temperatu ren durchgeführt. Nach 5 Amplifikationszyklen bei einer Tempe ratur, die 2-4°C unter der für das Primerpaar errechneten An nealing-Temperatur lag, folgten 25 Zyklen bei der errechneten Temperatur.

5'-RACE

Die 5'-RACE-Amplifikationen wurden nach dem Protokoll des SMARTE RACE cDNA Amplification Kit von Clontech (Heidelberg, DE) durchgeführt. Als Pflanzenmaterial für die Gewinnung von Gesamt-RNA zur Durchführung der 5'-RACE dienten Deckspelzen der Gerstenvarietät Bonus. Die RNA-Präparation erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit von Qiagen (Hilden, DE). Primer NUP und UP2: siehe SMART™ RACE cDNA Amplification Kit von Clontech.

Sequenzierungen und Sequenzdateien

DNA-Sequenzen wurden auf PE/Applied Biosystems 377- und 3700- Sequenzern ermittelt. Oligonukleotide wurden von den Firmen MWG-Biotech (Ebersberg, DE) und Life Technologies (Rockville, U.S.A) bezogen. Sequenzdateien wurden mittels Programmen der GCG-Software erstellt (Devereux, J., Haeberli, P. and Smit hies, O. (1984): A comprehensive set of sequence analysis pro grams for the vAX. Nucleic Acids Res. 12, 387-395). Sequenz vergleiche in Datenbanken wurden mit BLAST durchgeführt (siehe http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov / BLAST; Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. and Lipman, D. J. (1990): Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul, S. F., Madden, T. L., Schffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Mil ler, W. & Lipman, D. J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).

Arbeiten mit Hefe

Alle Arbeiten mit Hefe wurden ebenfalls nach den in Sambrook et al. (1989; a. a. O.) enthaltenen Protokollen durchgeführt.

Hefetransformationen und Plasmidpräparationen wurden nach den Protokollen der verwendeten Kits, Hefe-Proteinextraktionen nach dem Clontech-Produktprotokoll zu den monoklonalen GAL4- Antikörpern durchgeführt. β-Galaktosidase-Tests erfolgten nach Essers und Kunze (Essers, L. und Kunze, R. (1996), A sensiti ve, quick and semi-quantitative LacZ-assay for the twohybrid system. TIG 12, 449-450).

Zusammenstellung der verwendeten Primer

Zufallsprimer für die cDNA-Synthese:
AGA TCT CGA GNN NNN N

Isolierung von JuBel2 Verwendung von BKn3Δ2 als Köder im "Two-Hybrid"-System

Der Phänotyp der Kapuzengerste ("Hooded") wird durch die loka le Überexpression des Homöoboxgens BKn3 in der Deckspelze der Gerstenblüte verursacht (Müller, K. J., Romano, N., Gerstner, O., Garcia-Maroto, F., Pozzi, C., Salamini, F., Rohde, W. (1995). The barley Hooded mutation is caused by a duplication in a homeobox gene intron. Nature 374, 727-730). BKn3 gehört zur Klasse 1 der KNOX-Gene, deren bekanntesten und namensge benden Vertreter das Gen Knotted1 aus Mais (Vollbrecht, E., Veit, Bruce, Sinha, N. und Hake, S. (1991): The developmental gene knotted-1 is a member of a maize homeobox gene family. Nature 350, 241-243) darstellt. BKn3 weist den typischen Auf bau der Mitglieder dieser Genfamilie auf. Nahe des C-termi nalen Endes des Proteins befindet sich die Homöodomäne. Durch einen kurzen basischen Bereich davon getrennt trägt es außer dem die sogenannte ELK-Domäne, der eine mögliche Rolle in Pro tein-Protein-Interaktionen zugeschrieben wird (Vollbrecht, E.; Kerstetter, R.; Lowe, B.; Veit, B. und Hake, S. (1993). Homeo box genes in plant development: Mutational and molecular ana lysis. Evolutionary Conservation of Developmental Mechanisms. (Hrsg. Spading, A. C.); 111-123 (New York: Wiley-Liss)). Wei tere konservierte Bereiche, die KNOX-Domäne und die sogenannte GSE-Box (Bürglin, T. R. (1997): Analysis of TALE superclass ho meobox genes (MEIS, PBC, KNOX, Iroquois, TGIF) reveals a novel domain conserved between plants and animals. Nucleic Acids Re search 25, 4173-4180), befinden sich weiter N-terminal (Fig. 4).

Zur Durchführung von "Two-Hybrid"-Studien (Chien, C.-T., Bar tel, P. L., Sternglanz, R. und Fields, S. (1991): The two hybrid system: A method to identify and clone genes for pro teins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582; Fields, S. & Song, O. (1989): A novel genetic system to detect protein-protein interactions. NATURE 340, 245-246) muß gewährleistet sein, daß die Konstruk te nicht in der Lage sind, einzeln, d. h. als solche die Tran skription der Reportergene des verwendeten Hefestammes zu ak tivieren. Insbesondere Fusionen an die DNA-bindende Domäne ("Köder" in Two-Hybrid-Screens) haben durch interne Transakti vierungsdomänen der untersuchten Proteine häufig diese Fähig keit. Auch die Fusion des Wildtyp-BKN3-Proteins voller Länge an die DNA-bindende Domäne von GAL4 induziert die Reporter genexpression in Hefe. Im Rahmen der Suche nach geeigneten Konstrukten wurden N-terminalen Deletionsderivaten entspre chende cDNA-Abschnitte von BKn3 in die Vektoren des "Two- Hybrid"-Systems kloniert (Fig. 4). Mit dem N-terminal um 108 AS verkürzten BKN3-Derivat BKn3Δ2 fusioniert an die DNA bindende Domäne des GAL4-Transkriptionsfaktors wurde ein ge eignetes Köderkonstrukt identifiziert. Das Konstrukt wurde als Fusion des cDNA-Fragments an die DNA-bindende Domäne von GAL4 im entsprechenden Leseraster hergestellt. Das cDNA-Fragment BKn3Δ2 wurde mittels PCR von einem cDNA-Klon unter Verwendung der Primer JM34 und JM4 (siehe obige Zusammenstellung) ampli fiziert. Über in den Primer enthaltene Restriktionsschnitt stellen wurde das DNA-Fragment gerichtet in die EcoRI- und XhoI-Schnittstellen von pBD-GAL4 Cam (BD: Aminosäuren 1-147 (DNA-bindende Domäne) von GAL4) ligiert. Die Vektor-Insert- Übergänge und mögliche PCR-Fehler wurden durch Sequenzanalyse überprüft.

In dem resultierenden Köderkonstrukt pBD-BKn3Δ2 blieben die KNOX-, GSE-, ELK-, basische und Homöodomäne und der vollstän dige C-Terminus des Proteins erhalten. Die Expression des Fu sionsproteins in Hefe wurde durch Western-Blot mit einem mono klonalen Maus-Antikörper gegen die DNA-bindende Domäne von GAL4 immunologisch nachgewiesen.

Zur Vereinfachung beziehen sich die meisten Angaben auf Fusi onsproteine und nicht auf die zur Transformation verwendeten Konstrukte. BD-XYZ bezeichnet Fusionen an die DNA-bindende Do mäne von GAL4 (kodiert durch Konstrukte in den Vektoren pAS2 oder pBD-GAL4Cam), AD-XYZ benennt Fusionen an die GAL4- Aktivierungsdomäne (kodiert durch Konstrukte in den Vektoren pACT2 oder pAD-GAL4).

"Two-Hybrid-Screen" zur Identifizierung neuer Interaktions partner von BKN3

Nachdem das Köderkonstrukt durch "Two-Hybrid"-Interaktions studien mit bekannten Homöodomänenproteinen aus Gerste auf seine Fähigkeit zu Protein-Protein-Interaktionen getestet wor den war, wurde es in einem "Two-Hybrid-Screen" zur Identifi zierung weiterer Interaktionspartner von BKN3 eingesetzt.

Konstruktion einer HybriZAP-cDNA-Bank

Zur Herstellung einer Phagemid-cDNA-Bank wurde das HybriZAP™ System von Stratagene (Heidelberg, DE) verwendet. Die RNA zur Herstellung der cDNA für die Stratagene HybriZAP™-Bank wurde aus jungen Hooded-Infloreszenzen nach Logemann et al. (Loge mann, J., Schell, J. und Willmitzer, L. (1987) Improved me thod for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Bio chem. 163, 16-29) isoliert. Die Aufreinigung der PolyA(+)-RNA erfolgte über Oligo-dT-Cellulose nach Angaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach, DE).

Für die Erststrangsynthese mittels MMLV-Reverser Transkriptase (Gibco BRL, Neu Isenburg, DE) wurden 5 µg PolyA(+)-RNA einge setzt. Dabei wurde ein Zufallsprimer (siehe obige Zusammen stellung) verwendet, der zur Erleichterung der späteren Klo nierung eine XhoI-Restriktionsschnittstelle trägt. Die Erst strangsynthese fand in Gegenwart von methyliertem dCTP statt. Außerdem wurde zur Erleichterung der Mengenabschätzung α³²P dCTP inkorporiert. Nach Zweitstrangsynthese mittels DNA- Polymerase, RNAse-Verdau und Auffüllen überhängender Enden durch T4-DNA-Polymerase wurden EcoRI-Adaptoren an die glatten Enden der doppelsträngigen cDNA ligiert. Durch Restriktions verdau mit XhoI entstanden cDNA-Fragmente mit EcoRI- bzw. XhoI-Überhängen an den 5'- bzw. 3'-Enden. Nach Größenfraktio nierung über Sephacell-Säulen wurde die cDNA in die mittels EcoRI und XhoI geschnittenen Vektorarme des HybriZAP™-Systems ligiert. Für die cDNA-Ligation, Verpackung, Amplifizierung und in vivo-Excision des pAD-GAL4-Phagemid-Vektors (zirkuläres Phagemid; AD: Aminosäuren 761-881 (Aktivierungsdomäne) von GAL4) wurden die Protokolle des STRATAGEN HybriZAP™-Two-Hybrid Vektor-Kits befolgt. Die Bank wurde in Form der amplifizierten Primärbibliothek aufbewahrt.

Die Lambda-Primärbank hatte eine Komplexität von etwa 2 × 10⁶ pfu. Um diese Anzahl an Primärklonen zu erreichen, mußten fünf unabhängige Ligationen und Verpackungen durchgeführt werden. Nach der Amplifikation wurde ein Titer von 4,5 × 10⁸ pfu er reicht. PCR-Analysen einzelner Plaques zeigten, daß mehr als 90% der Phagen rekombinant waren. Die Insertgrößen bewegten sich zwischen 300 bp und etwa 2 kb, wobei der Durchschnitt im Bereich von 400-800 bp lag.

Identifizierung möglicher Interaktionspartner von BKN3 durch "Two-Hybrid-Screening"

Der verwendete Hefestamm Y190 (Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K. and Elledge, S. J. (1993): The p21 Cdk interacting protein CIP1 is a potent inhibitor of GI cyclin dependent kinases. Cell 75, 805-816) weist eine geringe Ba salexpression des HIS3-Reportergens auf, die durch Zugabe von 3AT (3-Aminotriazol (SIGMA, München, DE)) eliminiert werden kann. Dabei sollte die Konzentration des Inhibitors so niedrig wie möglich gehalten werden, da sonst das Wachstum von Hefe klonen mit schwach interagierenden Proteinpaaren zu sehr ver langsamt wird. Andererseits besteht bei einer zu niedrigen Do sierung die Gefahr starken Hintergrundwachstums. Die geeignete 3AT-Konzentration muß für jede Kombination aus Köder-Konstrukt und Hefestamm neu ausgetestet werden, da DNA-Bindedomänenfu sionen die Expression des HIS3-Reportergens geringfügig beein flussen können, selbst wenn sie keine nachweisbare β-Galaktosi daseexpression verursachen. Für pBD-BKn3Δ2 in Kombination mit Y190 wurde eine 3AT-Konzentration von 25-35 mM als geeignet ermittelt.

Köder-Plasmid und cDNA-Bank wurden sequenziell in die Hefen eingebracht, d. h. für die Bank-Transformation großen Maßstabs wurden Y190-Zellen verwendet, in denen pBD-BKn3Δ2 bereits epi somal vorlag. In vier unabhängigen Transformationsexperimenten wurden insgesamt etwa 10⁶ transgene Hefeklone untersucht, wobei die transformierten Hefen zur Hälfte auf Selektivmedium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin mit 25 bzw. 35 mM 3AT ausplat tiert wurden. Potentiell positive Kolonien, die sich in Kolo niegröße und/oder -morphologie vom Hintergrundwachstum unter schieden, konnten in der Regel nach vier bis vierzehn Tagen Inkubation bei 30°C identifiziert werden. Sie wurden auf Se lektivmedium vereinzelt und β-Galaktosidasetests unterzogen. Ein Großteil der etwa fünfhundert gepickten Kolonien zeigte im LacZ-Test keine Blaufärbung und wurde in den weiterführenden Analysen nicht berücksichtigt. Vier Bankplasmide verliehen den Hefen in Kombination mit pBD-BKn3Δ2 sowohl Histidin-Autotro phie als auch β-Galaktosidaseaktivität. Diese Eigenschaften konnten durch Retransformation mittels der isolierten Plasmide reproduziert werden. Dabei trat eine Aktivierung der Reporter genexpression nur in Anwesenheit des Köder-Fusionsproteins auf. Eine Sequenzanalyse ergab, daß es sich bei dreien der isolierten Plasmide um identische Klone handelte, die das als JuBel2 bezeichnete Gen repräsentieren.

Isolierung und Charakterisierung der cDNA- und genomischen Se quenzen von JuBel2

Laut Datenbank-Suchergebnissen unter Verwendung des BLAST- Programms (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. und Lipman, D. J. (1990): Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul, S. F., Madden, T. L., Schffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of prote in database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) weist das oben erwähnte, im "Two-Hybrid-Screen" identifizierte cDNA-Fragment Sequenzähnlichkeiten zu Mitgliedern einer in Gerste bisher unbekannten Gruppe von Homöoboxgenen auf und scheint ein neues Mitglied dieser Familie zu repräsentieren.

BELL1 (BEL-1) ist der am besten charakterisierte Vertreter dieser bislang in Arabidopsis thaliana beschriebenen Genfami lie (Reiser, L., Modrusan, Z., Margossian, L. Samach, A., Ohad, N., Haughn, G. W. und Fischer, R. L. (1995): The BELL1 gene encodes a homeodomain protein involved in pattern forma tion in the Arabidopsis ovule primordium. Cell 83, 735-742). Das dem im "Two-Hybrid-Screen" dreifach isolierten Klon ent sprechende Gen wurde, wie bereits erwähnt, mit JuBel2 (Judith Bel1 Homolog2) bezeichnet.

Die Gene der HD-BEL-Familie sind eng mit der Klasse 1 der KNOX-Gene verwandt. Die Sequenzähnlichkeiten beschränken sich allerdings auf die Homöodomänen der Genprodukte. Die BEL1- ähnlichen Proteine besitzen keine ELK-Domäne. In ihrer N terminalen Hälfte befindet sich ein Bereich, der neben einem Kernlokalisierungssignal möglicherweise eine amphipathische α- Helix enthält (Reiser et al., 1995, a. a. O.). Dieser Abschnitt konnte in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als es sentiell für Protein-Protein-Interaktionen mit KNOX-Proteinen ermittelt werden. Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung des JuBel2 repräsentierenden Klons im Vergleich zu BEL-1 aus Arabidopsis.

Sequenzanalyse der JuBel2-cDNA Screening einer Gersten-cDNA-Bank

Für die Isolierung von JuBel2-homologen cDNAs wurde das im "Two-Hybrid-System" isolierte Genfragment als Sonde einge setzt. Die cDNA-Inserts der nach drei Hybridisierungsrunden identifizierten positiven Einzelplaques wurden mit Hilfe von PCR (Phagenprimer FP1149 und BP1149) amplifiziert. Siebzehn von einundzwanzig analysierten Phagen enthielten hybridisie rende Fragmente von etwa 2 kb, vier Phagen resultierten in Banden von etwa 800 bp Länge. Je ein Vertreter beider Banden kategorien wurde über die flankierenden EcoRI-Schnittstellen in pBluescript kloniert und sequenziert. Der längere der bei den cDNA-Klone ergänzt sowohl das fehlende 3'-Ende von JuBel2 einschließlich der Homöobox und des Translationsendpunktes als auch weitere 5'-Sequenzen (Fig. 5). Der im "Two-Hybrid- Screen" isolierte Klon III.1 stimmt über seine gesamte Länge von 656 bp zu 100% mit dem entsprechenden Bereich des λ-Inserts überein.

5'-RACE

5'-RACE-Amplifikationen zur Charakterisierung des 5'-Endes der JuBel2-cDNA wurden wie im Abschnitt "allg. Methoden" beschrie ben durchgeführt. Versuche mit dem Marathon™ Kit mit den gen spezifischen Primern JM93 (nested) und JM94 blieben erfolglos. Durch 5'-RACE mit dem SMART™ RACE cDNA Amplification Kit konn ten mittels der Primerkombination JM94 × UP2 Banden von 590 bzw. 400 bp und mittels der Primerkombination JM93 × NUP um 115 bp kürzere DNA-Fragmente amplifiziert werden. Diese wurden in den Vektor pCR®2.1 kloniert und sequenziert.

Der Klon 32 liefert 202 bp zusätzlicher Sequenzinformation, enthält aber kein Startkodon im Leseraster der bereits aus den zuvor beschriebenen Experimenten bekannten JuBel2-Sequenz. Mit Klon 37 konnten weitere 166 bp 5'-Sequenz, die drei potentiel le Translationsstartpunkte enthält, identifiziert werden. cDNA-Klon und 5'-RACE-Fragment ergeben insgesamt ein Tran skript von 2170 bp, das allerdings keine Hinweise auf einen PolyA-Schwanz aufweist. Der längstmögliche offene Leserahmen umfaßt 608 AS (Fig. 6). Nimmt man das dritte ATG-Codon, des sen benachbarte Basen am ehesten der für monokotyle Pflanzen ermittelten Konsensussequenz für die Translationsinitiation entsprechen (Joshi, C. P., Zhou, H., Huang, X. und Chiang, V. L. (1997): Context sequences of translation initiation codon in plants. Plant Molecular Biology 35, 993-1001), als Transla tionsstartpunkt an, so erhält man ein Protein von 581 AS.

Genomische Organisation von JuBel2

Um festzustellen, ob JuBel2 Introns in entsprechenden Positio nen wie seine Verwandten aus Arabidopsis besitzt, wurden geno mische Sequenzen mittels PCR-Amplifikation von DNA der Varie tät K-Atlas isoliert. Die Primer wurden dabei so gewählt, daß sie erwartete Exon-Intron-Grenzen flankieren (Fig. 7). Die Größen der genomischen PCR-Produkte im Vergleich zu den ent sprechenden Bereichen der cDNAs lieferten einen ersten Hinweis auf die Existenz von Introns im kodierenden Bereich des Gens. Durch Klonierung und Sequenzierung der PCR-Fragmente konnte dies bestätigt werden.

Das Primerpaar JM84 und JM85 amplifiziert einen Großteil der JuBel2-cDNA-Sequenz einschließlich der drei erwarteten Intron positionen (vgl. Fig. 7). Eine PCR mit der JuBel2-cDNA ergibt eine Bande von 1,6 kb. Die Amplifikation genomischer DNA lie fert ein Fragment von etwa 3,8 kb, entsprechend 2,2 kb Intron sequenzen. Dieses genomische DNA-Fragment wurde über die flan kierenden BamHI- bzw. SalI-Schnittstellen der Oligonukleotide in pBluescript integriert. Die Sequenzanalysen zeigen, daß Ju Bel2 in den konservierten Positionen I, II und III Introns be sitzt.

Mit den Primerpaaren JM121 und JM122 bzw. JM123 und JM124 wur den durch PCR DNA-Fragmente aus Intron I (450 bp) bzw. Intron II (670 bp) von JuBel2 amplifiziert und als gemischte Sonde für das Screening der genomischen Bank verwendet (vgl. Fig. 7). In drei Hybridisierungsrunden wurden vier stark hybridi sierende Einzelplaques isoliert. Nach DNA-Präparation, Re striktions- und Southern-Analyse konnten zwei der Phagen-Klone als identisch identifiziert werden. Überlappende DNA-Fragmente wurden in pBlueskript ligiert und sequenziert, wobei die Sub klone pJuBel2/1-2, pJuBel2/13-1 und pJuBel2/48-0 die kodieren de Region und flankierende Sequenzen von JuBel2 vollständig umfassen. Eine schematische Darstellung der genomischen Stru kur von JuBel2 findet sich in Fig. 7, die Sequenz wurde in Fig.7533 00070 552 001000280000000200012000285910742200040 0002010043902 00004 07414L< 3 sowie unter SEQ ID NO. 3 angegeben. Der Vergleich der cDNA- und genomischen Sequenzen von JuBel2 zeigt, daß es drei Introns in der translatierten Region be sitzt (Fig. 7). Sie befinden sich innerhalb des den vermute ten "coiled coil" kodierenden Abschnittes (Intron I) und zwi schen Helix 1 und Helix 2 (Intron II) bzw. innerhalb der Helix 3 (Intron III) der Homöobox. In der Tabelle von Fig. 8 werden die bisher publizierten Daten zur Organisation der BEL1-ähnli chen Gene aus Arabidopsis und die im Rahmen der Erfindung er haltenen Daten zum JuBel2-Gen aus Gerste schematisch zusammen gefaßt. Von den Arabidopsis-Genen wurde nur für BEL1 und ATHI die Iso lierung von cDNA-Klonen beschrieben. BEL1 wurde bisher als cDNA-Sequenz einschließlich der Intronpositionen, nicht aber als genomische Sequenz veröffentlicht. Die hier als BEL1-hom1 bis BEL1-hom7 bezeichneten Sequenzen stammen aus Datenbanken (Altschul et al., 1990, 1997 a. a. O.). Die Gene wurden durch verschiedene Computer-Programme identifiziert; zu Transkripten oder möglichen biologischen Funktionen dieser vermuteten Gene liegen keine experimentellen Daten vor. Die Exon/Intron-Über gänge sind in allen untersuchten Genen konserviert. Die Kopienzahl JuBel2-ähnlicher Sequenzen im Gerstengenom wur de durch Southern-Blot-Analyse bestimmt. Das Bandenmuster zeigt, daß die verwendete Sonde III.1 spezifisch für das Ju Bel2-Gen ist. Zusätzliche schwächere Signale nach Hybridisie rung bei geringer Stringenz (60°C) lassen auf die Existenz weiterer verwandter Sequenzen im Gerstengenom schließen. Herstellung des Konstruktes zur Pflanzentransformation Zur Herstellung eines Konstruktes zur Überexprimierung von Ju Bel2 in trangenen Pflanzen wurde eine Klonierung in zwei Schritten vorgenommen: zunächst wurde cJuBel2 mittels der Pri mer JM108 und JM109 (siehe obige Zusammenstellung) durch PCR amplifiziert und über in den Primern enthaltene Restriktions schnittstellen gerichtet in sense-Orientierung zwischen 35S- Promotor und Poly-A-Signal in die XhoI- und XbaI-Schnittstel len von pRT101 (Töpfer, R., Matzeit, V., Gronenborm, B., Schell, J., Steinbiss, H. H. (1987): A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions. Nucleic Acids Res. 15, 5890) ligiert. Die gesamte Kassette, bestehend aus Promotor, cDNA, und Poly-A-Signal, wurde dann in die Hin dIII-Schnittstelle im T-DNA-Bereich von pBIN19 (Bevan, M. (1984): Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research 12, 8711-8721) integriert. Das Kon strukt wurde durch Elektroporation in den Agrobakterienstamm LB4404 eingebracht, der zur Transformation sowohl von Tabak als auch von Arabidopsis eingesetzt wurde. Tabaktransformation (vgl. Horsch, R. B.; Klee, H. J.; Stachel, S.; Winans, S. C.; Nester, E. W.; Rogers, S. G.; Fraley, R. T. (1986). Analysis of Agrobacterium tumefaciens virulence mutants in leaf discs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83; 2571-2575) Transformierte Agrobakterien-Kulturen wurden bei 28°C über Nacht in YEB-Medium angezogen und mit einem Kulturvolumen von 10 mM MgSO₄ und MSI-Medium gewaschen. Die Zellsuspension (ca. 30 ml) wurde auf eine OD = 1 eingestellt und mit leicht ver wundeten Blattscheibchen inkubiert. Nachfolgend wurden die Blattscheiben 2 Tage bei 26°C im Dunkelraum auf MSI-Agar kul tiviert. Die weitere Kultivierung erfolgte unter Langtag- Bedingungen (16 Std. Licht, 25°C; 8 Std. Dunkelheit, 18°C; 55% rel. Luftfeuchte). Vor dem Transfer und der Kultivierung auf MSII-Medium wurden die Blattscheiben in Claforan (1 g/l in MSI) gewaschen. Nach der Entwicklung von Kalli und nachfolgen den Sproßachsen auf MSII-Medium (nach ca. 1-3 Monaten; Medien wechsel ca. alle 2 Wochen) wurden die Sproßachsen auf MSIII- Medium überführt. Nach der Wurzelbildung auf MSIII (ca. 2-4 Wochen) erfolgte der Transfer der transgenen Klone in Erde und nach einer Woche in der Phytokammer wurden die Pflanzen ins Gewächshaus gestellt. Arabidopsis-Transformation Zur Transformationen wurden Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps Col-0 (Columbia, Arabidopsis Stock Centre (NASC)/ Seed List, Juni 1995: NASC# N1090)) verwendet. Die Pflanzen wurden für 5 Wochen unter Kurztagbedingungen herangezogen (9 Std. Licht) und dann auf Langtagbedingungen (16 Std. Licht) umgestellt. Die Primärinfloreszenz wurde entfernt. Nach der Entwicklung multipler Sekundärsprosse wurde eine Vakuuminfiltration durch geführt. Eine Einzelkolonie des entsprechenden Agrobakterienstammes wurde bei 28°C über Nacht in 3 ml YEB-Medium mit den entspre chenden Antibiotika unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Kul tur wurden 50 ml Selektivmedium angeimpft und wie zuvor inku biert. Diese Kultur wiederum wurde mit Selektivmedium auf 500 ml aufgefüllt und erneut bei 28°c über Nacht geschüttelt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren (5K, 10 Min) pelletiert und mit Infiltrationsmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,8-1,2 ge bracht: Infiltrationsmedium 1/2 × Murashige & Skoog 1 × B5-Vitamine 5% Saccharose 0,044 µM Benzylaminopurin 50 µl/l Silwet (Union Carbide, Düsseldorf, DE) pH 5,7 Die oberirdischen Teile der Pflanzen wurden in Agrobakterien suspension getaucht und 5 Minuten einem Vakuum von etwa 16 mbar ausgesetzt. Nach der Infiltration wurden die Pflanzen bis zur Samenreife weiterhin unter Langtagbedingungen gehalten. Nach dem Abernten wurden die Samen mit 5% (w/w) Calciumhypochlorit, 0,15% (v/v) Tween 20 sterilisiert und auf MS-Medium mit 25 µg/l Kanamycin und 500 mg/l Claforan ausplattiert. Vermutlich transgene Keim linge wurden aufgrund ihrer Resistenz gegen Kanamycin identi fiziert.

Claims

1. Im wesentlichen reine cDNA des Hömoboxgens JuBel2 aus Ger ste mit einer der in SEQ ID NOS. 1 und 4 angegebenen Se quenzen, Nukleinsäuremolekül mit der in SEQ ID NO. 3 ange gebenen genomische Sequenz des Hömoboxgens JuBel2 aus Ger ste oder Nukleinsäuremolekül mit gleicher oder einer dazu ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähnlichkeit auf Nukleinsäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 1, 4 bzw. 3 angegebenen Sequenz aufweist.

2. Nukleinsäuremolekül, einschließlich Gen, das das Genpro dukt des JuBel2-Gens aus Gerste mit einer der in SEQ ID NOS. 2 und 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder einer dazu ähnlichen Sequenz, die mindestens 75% Sequenzähnlich keit auf Aminosäuresequenzebene zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 angegebenen Sequenz aufweist, kodiert.

3. Fragment der cDNA oder eines Nukleinsäuremoleküls nach ei nem der Ansprüche 1 oder 2.

4. Fragment nach Anspruch 3, welches ein Expressionsprodukt kodiert, das eine DNA-Bindungsfähigkeit entsprechend dem Expressionsprodukt der cDNA oder eines Nukleinsäuremole küls nach einem der Ansprüche 1 oder 2 und/oder eine Fä higkeit zur Interaktion mit anderen Proteinen entsprechend dem Expressionsprodukt der cDNA oder eines Nukleinsäuremo leküls nach einem der Ansprüche 1 oder 2 aufweist.

5. Im wesentlichen reines Nukleinsäuremolekül, das die Nu kleinsäuresequenz der cDNA-Sequenz, eines der Nukleinsäu remoleküle oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.

6. Nukleinsäuremolekül, das eine zu der Nukleinsäuresequenz der cDNA-Sequenz, eines der Nukleinsäuremoleküle oder ei nes Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 5 komplemen täre Sequenz aufweist.

7. Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül mit einer zu der Nukleinsäuresequenz der cDNA, Nukleinsäuremo leküle oder des Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 6 komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisiert.

8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 7, das eine von der Nu kleinsäuresequenz der cDNA, eines der Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 6 durch Nukleinsäuresubstitution, -addition, - insertion, -deletion und/oder -modifizierung abgeleitete Sequenz auf weist.

9. Sense- oder antisense-Nukleinsäuremolekül mit einer sense- bzw. antisense-Nukleinsäuresequenz bezüglich der Nuklein säuresequenz der cDNA, eines der Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Konstrukt, insbesondere Vektor, Plasmid, Cosmid, Bacmid, Phagemid, YAC, BAC, Virus- oder Phagengenom, das eine cDNA, eines der Nukleinsäuremoleküle oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.

11. Protein oder Polypeptid, das von einer cDNA, einem der Nu kleinsäuremoleküle oder einem Fragment nach einem der An sprüche 1 bis 8 kodiert wird.

12. Protein oder Polypeptid mit einer der in SEQ ID NOS. 2 und 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder einer Aminosäurese quenz mit mindestens 75% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID NO. 2 bzw. 5 angegebenen Aminosäuresequenz.

13. Fragment des Proteins oder Polypeptids nach einem der An sprüche 11 oder 12.

14. Fragment nach Anspruch 13, das eine DNA-Bindungsfähigkeit entsprechend dem Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 oder 12 und/oder eine Fähigkeit zur Interak tion mit anderen Proteinen entsprechend dem Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 oder 12 aufweist.

15. Protein oder Polypeptid, insbesondere Fusionsprotein, das ein Protein, Polypeptid oder Fragment nach einem der An sprüche 11 bis 14 umfaßt.

16. Antikörper, der ein Protein, Polypeptid oder Fragment da von nach einem der Ansprüche 11 bis 15 spezifisch erkennt und bindet.

17. Organismus, insbesondere Mikroorganismus, Pflanze oder Tier, oder Teil, insbesondere Zelle, oder Vermehrungsmate rial eines Organismus, der bzw. das eine ektopische Ex pression eines JuBel2-Gens aufweist.

18. Transgener Organismus, insbesondere Mikroorganismus, Pflanze oder Tier, oder Teil, insbesondere Zelle, oder Vermehrungsmaterial eines transgenen Organismus, der bzw. das mit einer cDNA, einem der Nukleinsäuremoleküle, einem Fragment oder Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einem dazu funktionell analogen Nukleinsäuremolekül transformiert worden ist.

19. Transgener Organismus nach Anspruch 17 oder 18 in Form ei ner transgenen Pflanze.

20. Transgene Pflanze nach Anspruch 19, die einen aufgrund der Transformation mittels einer cDNA, einem der Nukleinsäure moleküle, einem Fragment oder Konstrukt nach einem der An sprüche 1 bis 10 oder einem dazu funktionell analogen Nu kleinsäuremolekül veränderten Phänotyp aufweist.

21. Transgene Pflanze nach Anspruch 20, die einen im Vergleich zu einer Pflanze, die keine Transformation mittels einer cDNA, einem der Nukleinsäuremoleküle, einem Fragment oder Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einem da zu funktionell analogen Nukleinsäuremolekül aufweist, ver mehrte Anzahl von Sprossen oder vermehrte Verzweigung auf weist.

22. Verwendung einer cDNA, eines der Nukleinsäuremoleküle, ei nes Fragments oder eines Konstrukts nach einem der Ansprü che 1 bis 10 oder eines dazu funktionell analogen Nuklein säuremoleküls zur Modifizierung des Phänotyps einer Pflan ze.

23. Organismus, insbesondere Pflanze, der hinsichtlich eines im Wildtyp vorkommenden JuBel2-Gens genetisch modifiziert worden ist, so daß keinerlei oder lediglich ein nicht funktionsfähiges Expressionsprodukt des im Wildtyp vorkom menden JuBel2-Gens exprimiert werden kann.