JPH11503310A

JPH11503310A - 植物病原体耐性遺伝子及びその使用

Info

Publication number: JPH11503310A
Application number: JP8529099A
Authority: JP
Inventors: スチュワートディクソン，マーク; アレンジョンズ，デビッド; ダラスジョージジョンズ，ジョナサン
Original assignee: ジョンインズセンターイノベイションズリミティド
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 1999-03-26
Also published as: AU5157696A; GB9506658D0; EP0817850A1; WO1996030518A1; NZ304401A; CA2215496A1; AU709028B2

Abstract

(57)【要約】トマトCf −２遺伝子がクローンされ、その配列が、コードされるアミノ酸配列と共に供される。そのポリペプチドをコードするDNA 、並びにその対立遺伝子、変異体及び誘導体が植物細胞に導入され、コードされたポリペプチドが発現され、上述の細胞及びその子孫を含む植物に病原体耐性を供し得る。Cf −２配列は、ロイシンの豊富な繰り返しを含み、このような繰り返しの存在が、他の植物病原体耐性遺伝子の同定を可能にする。Cf −９に対する相同性は、他の植物病原体耐性遺伝子の同定に役立つモチーフを表す。

Description

【発明の詳細な説明】植物病原体耐性遺伝子及びその使用本発明は、植物における病原体耐性、並びに特に病原体耐性遺伝子の同定及び使用に関する。それはトマトCf −２遺伝子のクローニングに基づく。植物は、潜在的に病原性の微生物により絶え間なく攻撃される。作物は、通常遺伝的に均一な単一栽培として成長するので特に攻撃されやすく；病気が襲った時、損失が激しくあり得る。しかしながら、ほとんどの植物はほとんどの植物病原体に対して耐性がある。自分自身を守るために、植物は予め存在する及び誘導される両方の一連の防御を発達させている。病原体、特に生きている植物細胞との親密な関連から栄養を得る生物栄養要求性（biotrophic）病原体は、宿主の防御機構を回避するよう特殊化しなければならない。病原体が病気を引きおこすことができるのなら、その相互作用は適合可能であると呼ばれるが、植物が耐性を有するなら、その相互作用は適合不能であると呼ばれる。品種特異的耐性は、植物が病原体の侵入した部位における局所的な細胞死により生きている宿主細胞の病原体をそれにより拒む誘導される応答である（仮説である）過敏性応答（HR）に強く相互に関連する。 HR関連の病気耐性はしばしば（排他的ではないが）優性遺伝子（Ｒ遺伝子）により規定されることが長い間、知られている。Florは、病原体がこのようなＲ遺伝子に打ち勝つために変異する場合、これらの変異が劣性であることを示した。 Florは、Ｒ遺伝子が機能するためには、病原体内の対応する遺伝子、即ち言及される無毒性遺伝子（Avr遺伝子）も存在しなければならない。毒性となるために、病原体はこれによりＲ遺伝子依存性防御機構を活性化する産物の産生を停止させなければならない（Flor，1971）。しばしばエリシター／レセプターモデルと呼ばれる広く受けいれられている現在の仮説は、病原体が対応するAvr 遺伝子を有するなら、植物が前記病原体の存在を検出するのを可能にする産物をＲ遺伝子がコードすることである(Gabriel and Rolfe，1990)。次にこの認識が防御応答の活性化に変換される。特定の相互作用は異なる遺伝特性を示す。毒素（Hc毒素）を発現するヘルミントスポリウム・カルボヌム(Helminthosporium carbonum)品種は、Hm １耐性遺伝子を欠如するトウモロコシ系に感染する。Hc毒素の発現の損失への変異は劣性であり、毒性への変異が劣性である遺伝子−遺伝子相互作用と対照的に、毒性の損失と相関関係がある。主要な業績はHm１遺伝子の標識による単離で、1992年に報告された（Johal 及びBriggs，1992）。もっともらしい議論が、いかにして遺伝子−遺伝子相互作用が毒素依存毒性から誘発されるかについて行われた。例えば、その産物が毒素の標的である遺伝子は、HRを導く毒素への更に大きなセンシティビティー、及び耐性遺伝子へのセンシティビティー遺伝子の転化を供するよう変異し得よう。しかしながら、これは、その遺伝子産物がHc毒素を不活性化するHm １の作用の態様ではないようである。病原体無毒性遺伝子はなおほとんど理解されていない。いくつかのバクテリアのAvr 遺伝子は、他のクラスの蛋白質と相同性のない親水性蛋白質をコードし、他方他のものはその数が無毒性を示す植物の範囲を変化させるよう変えられ得る繰り返し単位を有する。(Keen，1992；Long and Staskawicz，1993)。更なるバクテリア遺伝子(hrp遺伝子はHRを誘導するためにバクテリアのAvr 遺伝子に、そして病原性にも要求される(Keen，1992；Long and Staskawicz，1 993)。植物が病原体を検出するのを可能にする産物を病原体がなぜ作るのかは明らかでない。特定の容易に捨てられるAvr 遺伝子が病原性に関与するが、それには要求されず、他方他のAvr 遺伝子はほとんど重要でないことは広く確信される (Keen，1992；Long and Staskawicz，1993)。１つの真菌の無毒性遺伝子のキャラクタリゼーションも報告されている；Cf −９遺伝子を有するトマト変種を攻撃しようとするＣ．フルブム（C.fulvum）品種に無毒性を供するクラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)のAvr ９遺伝子は、28アミノ酸の最終的に処理された大きさを有する分泌されるシステインが豊富なペプチドを分泌するが、その適合性の相互作用における役割は明らかでない（De Wit，1992）。主に遺伝的基準に基づく遺伝子単離のための技術は近年劇的に改良されており、多くの研究者が種々のＲ遺伝子のクローニングを試みている。標的は、（とりわけ）（トランスポゾン標識による）トウモロコシ−アンチルリヌム(Antirrhin um )及び亜麻におけるサビ病耐性遺伝子；（マップベースのクローニング及びＴ −DNA 標識による）レタス及びアラビドプシス(Arabidopsis)におけるべと病耐性遺伝子；（標識、マップベースのクローニング及び無毒性遺伝子産物でのアフィニティーラベリングによる）トマトにおけるクラドスポリウム・フルブム(Cla dosporium fulvum)（Cf）耐性遺伝子；（マップベースのクローニング及び標識による）トマト及びタバコにおけるウイルス耐性遺伝子；（マップベースのクローニングによる）トマトにおける線虫耐性遺伝子；並びに（マップベースのクローニングによる）アラビドプシス及びトマトにおけるバクテリア病原体に対する耐性のための遺伝子を含む。バクテリア斑点病原体シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae） pvトマト(Psc)に対する“遺伝子−遺伝子(gene-for- gene)”耐性を供するトマトPto 遺伝子のマップに基づくクローニングが報告されている（Martinら、1993）。その遺伝子に極めて密着して連結した制限フラグメント長多形性（RFLP）マーカーを有するYAC(イースト人工染色体)クローンが同定された。このYAC は相同なcDNAクローンを単離するのに用いられた。これらのcDNAの２つは強力なプロモーターに融合され、そして病気にセンシティブなトマト変種の形質転換の後、これらの遺伝子融合物の１つは対応する無毒性遺伝子AvrPto を有するPst 株に対する耐性を供することが示された。これら２つのcDNA は互いに相同性を示す。実際、Pto cDNAプローブは、その５つがPto が単離されたYAC で見い出すことができ、そしてこれにより他のＲ遺伝子座の遺伝子分析から推論される局所的多重遺伝子ファミリーの種類を正確に含む少くとも６つのメンバーの小さな遺伝子ファミリーを示す。 Pto 遺伝子cDNA配列は、単純なエリシター／レセプターモデルの提案者らを困惑させる。それは、シグナル変換における役割で一貫しているセリン／トレオニンキナーゼに対する明白な相同性を示す。興味をそそることに、遺伝子型で規定される花粉管の成長を防ぐためにそれらが要求される点で、同様の役割を行うアブラナ類における自己適合不能性に関連するキナーゼと強い相同関係がある。しかしながら、アブラナSRK キナーゼ（Stein ら1991）と対照的に、Pto 遺伝子はキナーゼ触媒ドメイン及び膜との結合を促進することができる潜在的なＮ末端ミリストイル化部位程度をコードするようである。AvrPto遺伝子が、侵入する微生物中に検出される場合にのみ、防御応答を開始するのに要求される特異的認識を行うよう遺伝子産物が単独で作用し得るなら驚くべきことであろう。AvrPtoを有するPst 株により作られる品種特異的エリシター分子はまだ知られておらず、Pt o 遺伝子産物によるこの分子の認識の可能性が研究され得る前にキャラクタライズされることが必要とされる。 Pto 遺伝子の単離以来、いくつかの他の耐性遺伝子が単離されている。タバコからのタバコモザイク耐性遺伝子Ｎの単離がWhitham ら（1994）により報告された。シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）RPS ２に対する耐性のためのアラビドプシスタリアナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子の単離がBent ら（1994）により及びMindrinos ら（1994）により報告された。これらの遺伝子はおそらくＰ−ループ及びロイシンが豊富な繰り返しを有する細胞質蛋白質をコードする。それらが相互作用するリガンドはキャラクタライズされておらず、防御応答を行うためにそれらが相互作用する他の植物蛋白質が何かは知られていない。我々自身の研究室は、真菌クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulv um )に対する耐性を供するトマトCf −９の単離を報告している。これは、以前の特許出願（WO95/18230として公開されたPCT/GB94/02812）の主題であり、Jones ら（１994）に報告されている。Cf −９及びAvr ９配列、並びにコードされるポリペプチドの配列はWO95/18320及びJones ら（1994）に供される。我々は、ここでCf−２遺伝子をクローンした。 WO93/1124 は、Cf −９及び我々がここで発見したようなCf −２（本発明の対象物）といくらか相同性を有するポリガラクツロナーゼインヒビター蛋白質（PGIP ）をコードする遺伝子の配列を報告する。Cf −９，Cf −２及び他のもの（Cf −４，５等）は当業者に“病原体耐性遺伝子”又は“病気耐性遺伝子”と呼ばれる。 PGIPをコードする遺伝子は病原体耐性遺伝子ではない。病原体耐性遺伝子（Ｒ）は、植物が対応する無毒性遺伝子(Avr)を発現する病原体の存在を検出することを可能にする。病原体が検出される場合、過敏性応答（HR）のような防御応答が活性化される。このような手段により、植物は病原体の進入した部位における局所的な細胞死により、生きている細胞の病原体を拒むことができる。他方、（例えば）WO93/11241のPGIP遺伝子は、Ｒ遺伝子による病原体の検出から生ずる植物防御応答において誘導される種類の遺伝子である。これにより、病原体耐性遺伝子は、病原体由来のAvr 依存性分子に対するレセプターをコードするものとして考えることができる。この道筋において、それは病原体の検出のための植物のレーダー(RADAR)であり得、他方RGIPは検出した後に植物が病原体に攻撃を開始する防御に関連し、病原体耐性遺伝子ではない。植物における病原体耐性遺伝子の発現は、植物において防御応答の活性化を引きおこす。これは、エリシターの欠損下における耐性遺伝子の過剰発現により活性化を引きおこす可能性が報告されているが、病原体又は対応するエリシター分子との植物の接触に基づき得る。防御応答は、局所的に、例えば病原体もしくはエリシター分子との植物の接触の部位で、又は全身的に活性化され得る。病原体耐性遺伝子を発現する植物における防御応答の活性化は、例えば議論されるようなクラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）avr遺伝子により産生されるような適切な、対応するエリシター分子との植物の接触により引きおこされ得る。エリシターは、クラドスポリウム・フルブムのような病原体の抽出液中に含まれ、又は全体的もしくは部分的に精製され、全体的又は部分的に合成され得る。エリシター分子は、防御応答の活性化を誘発するためにＲ遺伝子産物のための適切なリガンドであるなら、“対応する（correspond）”と言われ得る。 “Cf−ｘ”／“Avrx”という用語は当該技術で標準的なものである。Cf耐性遺伝子及び対応する真菌の無毒性遺伝子(Avr)は、その測定可能な活性が相互に排他的に相互作用する対にある遺伝子の相互作用する対として遺伝的に原始的に定義された。Avr９は、Cf −９を含むトマトにおいて壊死的応答を誘発するが、Cf −２を含むトマトには応答を誘発せず、ここでCf−２により認識される成分はCf−９により認識されるそれと異なる。植物におけるCf−２機能の発現は、種々のＣ．フルブム(C ．fulvum)品種の適合性を研究することにより、決定することができる。全ての周知のAvr 遺伝子の機能的複製を有するＣ．フルブムの品種（品種０）は、全てのCf遺伝子を欠如するトマトにおいてのみ増殖する（適合する）であろう。いずれかの機能的Cf遺伝子を有する植物では増殖しない（不適合）であろう。Ｃ．フルブム品種が機能的 Avr ２遺伝子を欠如する（品種２）なら、それはいずれのCf遺伝子も欠如する植物ばかりでなく、Cf −２遺伝子を有する植物でも増殖することができるであろう。機能的 Avr ４遺伝子も欠如する品種（品種２，４）もCf −４遺伝子を有する植物で増殖することができるであろう。機能的 Avr ４遺伝子のみを欠如する品種（品種４）は、Cf −２を有する植物で増殖することができないであろう。同様に、（機能的 Avr ５遺伝子を欠如する）Ｃ．フルブム品種５は、Cf −２遺伝子を有する植物で増殖することができないであろう。品種４も品種２，４もいずれかの他のCf遺伝子を有する植物で増殖することができないであろう。例えばResearch Institute for Plant Protection(IPO−DLO)，PO Bo x 9060，6700 GW Wageningen，The Netherlandsから、種々の品種が当該技術において市販される。品種４は、受託番号IPO10379下で利用でき、品種２，４は受託番号IPO50379で利用できる。我々はここで、真菌クラドスポリウム・フルブムに対して耐性を供する２つのほとんど同一のトマト遺伝子Cf−2.1 及びCf−2.2 を単離し、我々はそのDNA を配列決定してこれらの遺伝子からアミノ酸配列を予測した。（両方の遺伝子はほとんど同一であり、その１方についての本明細書のいずれの記載も、その文脈が要求しない限り、両方に適用されると考えられるはずである。）トマトCf −2.1 ゲノム遺伝子のDNA 配列を図２（配列番号：１）に示し、（両方の遺伝子についての）その予想されるアミノ酸配列を図３Ａ及びＢ（配列番号：２及び３）に示す。以下により詳細に記載されるように、トマトCf −２遺伝子をマップベースのクローニングにより単離した。この技術において、耐性を供する座は、耐性遺伝子に結合した制限フラグメント長多形性（RFLP）マーカーに関して高い分解能でマッピングされる。我々は、耐性遺伝子、及びCf −２遺伝子座を有する保存液からバイナリーベクターコスミドクローンを単離するためにこのマーカーに対応して用いたプローブに絶対的に結合することが明らかなマーカーを同定した。２つの独立したオーバーラップクローンは病気耐性を供し、オーバーラップの領域はCf −９遺伝子に著しい構造的類似を示す読み枠を含む。この配列は、相補的である２つのクローンをオーバーラップするDNA の第１の構成物であるので、我々は、この配列がCf −２遺伝子に相当しなければならないと確信する。そのコスミドの１つ上の第２のほとんど同一の領域は病気耐性も供することができ、このことは２つの機能的Cf−２遺伝子が存在することを示唆する。１つの態様によれば、本発明は、病原体耐性遺伝子をコードする核酸単離物であって、前記遺伝子が配列番号：２もしくは配列番号：３に示されるアミノ酸配列又はそれらのフラグメントをコードする核酸を含むことを特徴とする核酸単離物を提供する。その核酸単離物はDNA を含み得、そして配列番号：１に示される配列又は（例えば開始メチオニンコドンから、枠下流の停止コドンの最初までの）要求されるポリペプチドをコードするのに十分な部分を含み得る。１つの実施形態において、DNA は、配列番号：１のヌクレオチド1677〜5012、又はその変異体、誘導体もしくは対立遺伝子であるヌクレオチドの配列を含む。本発明の更なる態様は、配列番号：１のヌクレオチド1677〜5012、又はそのフラグメント、誘導体、変異体もしくは対立遺伝子を含むプローブで核酸ライブラリーをスクリーニングし、そして（例えば Avr ２を発現する）クラドスポリウム・フルブムに対する耐性のような植物に対して病原体耐性を供することができるポリペプチドをコードするDNA を単離することにより得ることができる。病原体耐性遺伝子をコードする核酸単離物又はそのフラグメントを提供する。その植物はトマトであり得る。適切な技術は当該技術で公知である。本発明による核酸は、配列番号：２に示されるアミノ酸、又は供される配列、例えば配列番号：３の変異体、誘導体もしくは対立遺伝子をコードし得る。好ましい変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされる蛋白質の機能的特徴、特に病原体耐性を供する能力、とりわけ、Avr ２エリシター分子を発現する病原体に対して耐性を供する能力を保持するものである。変異体又は誘導体を作るための配列の変換は、１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く１又は複数回の核酸内の１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換によって行うことができる。もちろん、コードされたアミノ酸配列に対して差を生じない核酸の変換も含まれる。図３（配列番号：２及び３）に示されるアミノ酸をコードする核酸の好ましい実施形態は、各々図２及び４に示されるコーディング配列を含む。配列番号：３のアミノ酸（図３ｂ）をコードするために、DNA は図４に示されるヌクレオチド配列（配列番号：５）を含み得る。本明細書に供されるいずれかのコーディング配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドの配列を含む核酸も本発明の態様により供される。これを調べる他の方法は、本明細書に供されるいずれかのコーディング配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるこの態様による核酸についてであろう。もちろん、DNは一般に二本鎖であり、サザンハイブリダイゼーションのようなブロッティング技術が、それらの鎖間がハイブリダイズする区別のない鎖の分離を行った後に、しばしば行われる。好ましくは、ハイブリダイズすることができる核酸又はその構成物は、ポストに病原体耐性を供することができるポリペプチドをコードし、即ち病原体耐性遺伝子を含む。ハイブリダイゼーションのための好ましい条件は、当業者によく知られているが、一般には、他の配列を排除して関心の配列間の積極的なハイブリダイゼーションをそこで行うのに十分なストリンジェントである。 Cf −２及びCf −９遺伝子によりコードされるポリペプチドは高い程度のホモロジーを有するが、その遺伝子自体は60℃における２×SSC のストリンジェンシーを用いるゲノムのサザンブロッティングで互いを同定するのに十分に相同でない。BLASTN調査において、Cf −２とCf −９とのDNA 配列間の同一性の最も高いレベルは428 塩基領域にわたって69％である。本発明による核酸、例えば本明細書に開示される特定の配列の変異体、誘導体及び対立遺伝子は、以下の１又は複数によりCf −９から区別することができる。 − 60℃における２×SSC のストリンジェンシーを用いるサザンブロッティングにおいて互いを同定するのに、本発明の核酸及びCf −９についてCf −９と十分な相同性を有さず； − ヌクレオチド1677〜5012として図２に示されるコーディング配列と70％超、好ましくは約75％超、約80％超、約90％超又は約95％超、相同性を有し； − 例えば Avr２を発現するクラドスポリウム・フルブム品種により供されるような Avr２エリシター分子との植物の接触に基づいて、前記核酸を発現する植物において防御応答を誘発し； − 受託番号IPO10379下でResearch Institute for Plant Protection(IPO−D LO)，PO Box 9060，6700 GW Wageningen，The Netherlandsに寄託され、そこから利用できるＣ．フルブム品種４又はその抽出物との植物の接触に基づいて、前記核酸を発現する植物において防御応答を誘発するが、受託番号IPO50379下で同機関に寄託され、そこから利用できるＣ．フルブム品種２，４又はその抽出物との接触に基づいて前記植物において防御応答を誘発せず、 − 例えばクラドスポリウム・フルブム品種又は Avr９を発現する他の生物（ de Wit．1992）により供されるような Avr９エリシター分子、例えばWO95/18230 に配列番号：３として、及びWO95/31564に配列番号：４として供されるキメラ形態のアミノ酸及びコードする核酸配列との植物の接触に基づいて、前記核酸を発現する植物において防御応答を引きおこさず； − 38のロイシンが豊富な繰り返し(LRR's)を含む。ゲノムDNA 又はcDNAとして配列番号：２又は配列番号：３のアミノ酸配列をコードするDNA を含み得る核酸単離物は、組換えベクター、例えばファージ又はコスミドベクターの形態であり得る。前記DNA は、ホスト細胞、例えば植物細胞中での発現のための適切なプロモーター及び調節因子の制御下であり得る。ゲノム DNA の場合、これはそれ自体のプロモーター及び調節因子を含むことができ、cD NAの場合、これはホスト細胞における発現のための適切なプロモーター及び調節因子の制御下であり得る。当業者は十分に、ベクターを作り、組換え遺伝子発現のためのプロトコルをデザインすることができる。プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切な調節因子を含む適切なベクターを選択し、又は作製することができる。更に詳しくは、例えば、Molecular Cloning : a Laboratory Manual : ２nd edi tion，Sambrookら、1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。本発明による核酸分子及びベクターは、実質的に純粋なもしくは均一な形態で、又は要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の関心の種もしくは起源の核酸もしくは遺伝子を含まないもしくは実質的に含まない形態で、それらの天然の環境から単離及び／又は精製されて供され得る。本発明による核酸は、cDNA，RNA 、ゲノムDNA を含み得、そして全体的又は部分的に合成され得る。“単離”という用語は、全てのこれらの可能性を含む。選択された遺伝子構成物を細胞内に導入する場合、当業者に公知である特定の考慮が払われなければならない。挿入されるべき核酸は、転写を誘発するであろう有効な調節因子を含む構成物内でアセンブルし得る。その構成物を細胞内に輸送する方法が利用できなければならない。構成物を細胞膜内に入れた後、内因性染色体材料内への一体化は、本発明の異なる実施形態により、おこったりおこらなかったりし得る。最終的には、植物が考慮される限り、標的細胞型は、細胞が全体の植物内に再生し得るようでなければならない。前記配列を含むDNA 断片で形質転換された植物は、植物の遺伝操作について既に周知である普通の技術により生産することができる。その天然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリア(Agrobacterium)が有するジスアームド（disarmed）Tiプラスミドベクター(EP−Ａ−270355，EP−Ａ −0116718，NAR12（22）8711〜87215，1984)、粒子もしくはマイクロプロジェクティルボンバードメント（US 5100792，EP−Ａ−444882，EP−Ａ−434616）、微量注入（WO92/09696，WO94/00583，EP331083，EP175966）、エレクトロポレーション(EP290395，WO8706614)又は他の直接的DNA 取込みの形態(DE4005152，WO901 2096，US4684611)のようないずれかの適切な技術を用いて、DNA を植物細胞内に形質転換することができる。特定の双子葉植物種を形質転換するために、アグロバクテリア形質転換が当業者により広く用いられている。アグロバクテリアは外来DNA を特定の双子葉植物種内に形質転換することができると報告されている（ WO92/14828）が、アグロバクテリアが効能がない又は有効でない場合、マイクロインジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的DNA 取込みが好ましい。あるいは、形質転換過程の効能を増加させるために、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリア被覆した微粒子でのバンバードメント（EP −Ａ−486234）又は創傷を誘導するためのマイクロプロジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリアとの同時培養（EP−Ａ−486233）を用いることができる。特定の形質転換技術の選択は、特定の植物種を形質転換する効率並びに特定の選択された方法で本発明を実施する人の経験及び好みにより決定されよう。核酸を植物細胞内に導入するための特定の形質転換システムの選択は、本発明に本質的でないか本発明を限定するものではないことは当業者に明らかであろう。本明細書に供されるCf −２遺伝子及びその変形形態（対立遺伝子、変異体及びそれらの誘導体）、並びに他の核酸は、Ｃ．フルブムのような病原体に対して、植物、特にトマトにおいて耐性を供するのに用いることができる。これは、Cf −２遺伝子又はそのいずれかのサブクローンされたフラグメントと同じ染色体の位置を有するリマペルシコン・ピンピネルリホリウム(L ycopersicon pimpinellifolium )からのクローンされたDNA を含み得る。この目的のために、上述のようなベクターは、トランスジェニック植物の生産のために用いることができる。このような植物は、Cf −２遺伝子により供される病原体耐性を有し得る。これにより本発明は、上述のベクターで形質転換されたホスト細胞、特に植物又は微生物細胞を更に含む。これにより、本発明による核酸を含む植物細胞のようなホスト細胞が供される。細胞内では、核酸は染色体内に組み込まれ得る。本発明による核酸を含むベクターは、特に該ベクターがゲノム内への組換えのために細胞内に核酸を導入するのに用いられる場合、プロモーターを含む必要はない。また、本発明によれば、例えばコードされるポリペプチドの発現の制御のためのプロモーターの作用的制御下で、本発明により供されるヌクレオチドの配列をそのゲノム内に組み込んで含む植物細胞が供される。本発明の更なる態様は、ヌクレオチドの配列を含むベクターの、植物細胞内への導入を含む上述の植物細胞を作製する方法を提供する。その導入の後に、ゲノム内にヌクレオチドの配列を導入するためのベクターと植物細胞との間の組換えを行うことができる。導入された核酸によりコードされるポリペプチドを次に発現させることができる。本発明による植物細胞を含む植物も、該植物のいずれか一部もしくはクローン、種子、自己もしくはハイブリッド子孫及び後代、並びに切り取り物、種子のようなこれらのいずれか一部と共に供される。本発明は、切り取り物及び種子等を含む有性又は無性の再生又は繁殖に用いられ得るいずれか一部であるいずれかの植物零余子を提供する。本発明は、更に、アミノ酸配列、配列番号：２又は配列番号：３をコードする核酸又はそのいずれかの配列の変異体、対立遺伝子もしくは誘導体を植物の細胞又はその祖先内に導入する先のステップの後に、植物の細胞内で前記核酸を発現させる（それによりコードされたポリペプチドを産生する）ことを含む方法を更に提供する。該方法は植物に病原体耐性を供し得る。これは、WO91/15585(Mogen )、もしくはより好ましくはPCT/GB95/01075（WO95/31564）に記載される方法による Avr ２遺伝子、又は病原体耐性を供することに関するいずれかの他の遺伝子と組合せて用いることができる。 Cf −２及びCf −９遺伝子は、トマト葉カビＣ．フルブムの増殖を防ぐトマトに耐性を供する点で同様に機能する。しかしながらそれらは、異なるAvr 産物の認識により、病原体の増殖を停止し、耐性応答を刺激する速度において微妙な差を有する（Hammond-Kosack and Jones 1994 ; Ashfieldら、1994）。これらの差は本明細書に開示される適用を最適にするために活用され得る。植物のゲノム内に安定に組み込まれた遺伝子は、世代を通して該植物の子孫に渡り、その子孫の細胞はコードされたポリペプチドを発現することができ、増強された病原体耐性を有し得る。病原体耐性は、病原体（例えばクラドスポリウム・フルブム）の適合性を評価し、又は Avr −２又は Avr −２遺伝子産物の輸送のような病原体無毒性遺伝子の組換え発現を用いることにより決定することができる。 Cf −２遺伝子の配列決定は、Cf −９遺伝子のように、それがロイシンの豊富な繰り返し（LRR）領域をコードするDNA 配列を含むことを示し、相同性調査は、LRR を含む他の遺伝子に対する強い相同性を示す。Cf − ２及びCf −９遺伝子は、全ての同じ遺伝的特徴を含み、それ自体、現在までキャラクタライズされた他の病気耐性遺伝子から別個の新しいクラスの病気耐性遺伝子を形成する。WO95/18230で議論され、本明細書で確認されるように、LRR の存在は、多くの病原体耐性遺伝子の特徴であり得、LRR の存在は更なる病原体耐性遺伝子を同定するのに用いることができる。更に、Cf −９とCf −２との間にいくつかの目立つ相同性がある。これらは、例えばCf −９とCf −２遺伝子の間の（好ましくはアミノ酸レベルで）保存された配列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドを用いて、このクラスの更なる耐性遺伝子を同定するのにも用いることができる。更なる態様によれば、本発明は、新しい耐性遺伝子を調査するためにCf −９及びCf −２のような病原体耐性遺伝子間に保存された配列を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む植物病原体耐性遺伝子を同定する方法を提供する。これにより、（病原体耐性を供することができるポリペプチドをコードする）病原体耐性遺伝子を含む核酸を得る方法であって、標的／候捕核酸への、オリゴヌクレオチド（その詳細は本明細書で議論される）又は該オリゴヌクレオチドを含む核酸分子のハイブリダイゼーションを含む方法を提供する。標的又は候補核酸は、例えば病原体耐性遺伝子をコードすることが知られている生物から得ることができるゲノム又はcDNAライブラリーを含み得る。成功したハイブリダイゼーションは同定され得、そして標的／候補核酸は、更なる研究及び／又は使用のために単離され得る。ハイブリダイゼーションは、核酸をプロービングし、（周知の技術に従って）適切なストリンジェント条件下で陽性ハイブリダイゼーションを同定し、及び／又はPCR のような核酸増幅の方法においてプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いることを含み得る。プロービングするための好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定されたハイブリダイゼーションの少数で単純なパターンであるのに十分にストリンジェントである条件である。少い陽性クローンのみが残るまで次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることが当該技術で公知である。プロービングにかわるものとして、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、DNA 配列を増幅するようデザインされたオリゴヌクレオチドを、PCR 反応又は慣用的手順を用いる核酸の増幅に関する他の方法に用いることができる。例えば、“PCR プロトコル；A Guide to Methods and Applications”〔Eds．Innis ら1990，Academic Press，New York）。プローブ又はPCR プライマーのデザインに用いるのに適した好ましいアミノ酸配列は、Cf −２及びCf −９によりコードされるような病原体耐性を供することができるポリペプチド間に（完全に、実質的に又は部分的に）保存された配列である。アミノ酸配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーをデザインすることができ、遺伝コードの退縮を説明することができ、そして適切な場合、候補の核酸からの生物のコドン利用が得られる。好ましいヌクレオチド配列は、アミノ酸（ｉ）SGEIPOO ；（ii）YE／OGNDG ；（iii）FEGHIPS ；又は（iv）SGEIPOOLASLTSLE をコードする配列又はこれらのコーディング配列に相補的な配列を含む又は有するものを含み得る。これらの適切なフラグメントを用いることができる。好ましいオリゴヌクレオチド配列は次のものを含む。（ｉ）TCX-GGX-GAA/G-AAT.C.A-CCX-CAA/G-CA；（ii）TAT/C-G/CAA/G-GGX-AAT/C-GAT/C-GGX-CTX-CG；及び（iii）CG-XAG-XCC-A/GTC-A/GTT-XCC-T/CTC/G-A/GTA。（配列は全て５’から３’へ供される；図６を参照のこと）。配列（ii）及び（iii）は相補的であり；（iii）はPCR において後方（逆）プライマーとして役立つ。好ましくは本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば核酸増幅に用いるために、約10以下のコドン（例えば６，７又は８）を有し、即ち約30以下のヌクレオチド長（例えば18，21又は24）である。 PCR 生成物が耐性遺伝子に相当するか否かの評価は種々の方法で行うことができる。PCR バンドは生成物の複合混合物を含み得る。個々の生成物はクローンされ得、そして各々は、このプローブのための多形性を示す子孫において分離する周知の病気耐性遺伝子への結合についてスクリーニングされる。あるいは、PCR 生成物は、クローニングの前に予め選択された耐性遺伝子に結合した特定のバンドと共に変性ポリアクリルアミドDNA シーケンシングゲルで多形性を示すことを可能にする方法で処理することができる。候補のPCR バンドをクローンして周知の耐性遺伝子への結合を示した後、それは、他の特徴及びCf −９，Cf −２又は他の関連する遺伝子への相同性について検査することができるクローンを単離するのに用いることができる。次にそれは、関心の病気にセンシティブな種々の植物内への導入に基づくその機能を評価するために、形質転換により分析することができる。あるいは、PCR バンド又はそれを分析することにより得られた配列は、役立つ耐性遺伝子の分離をモニターすることにおいて植物育種家を助けるのに役立ち得る。これらの技術は、植物における病原体耐性遺伝子を同定するのに一般に適用されるものである。この方法で同定することができる遺伝子のタイプの例は、ポテトにおけるフィトフトフトラ耐性、大麦及びトウモロコシのような穀類におけるウドンコ病耐性及びサビ病耐性、アンチルリヌム(Antirrhinum)及びアマにおけるサビ病耐性、レタス及びアラビドプシス(Arabidopsis)におけるベト病耐性、ポテト、トマト及びタバコにおけるウイルス耐性、トマトにおける線虫類耐性、アラビドプシス及びトマトにおけるバクテリア病原体に対する耐性並びにコショウにおけるキサントモナス(Xanthomonas )耐性を含む。病原体耐性遺伝子を同定した後、トランスジェニック植物を生産するために当業者に公知である技術を用いる植物細胞に再導入することができる。更なる態様によれば、本発明は、LRR がその中に存在することを用いることにより、又は特に上述の技術により同定されている植物病原体耐性遺伝子の蛋白質産物をコードするDNA 単離物を提供する。なお更なる態様によれば、本発明は、LRR の存在により又は開示されるような核酸ハイブリダイゼーションにより同定された病原体耐性遺伝子を有するように操作されたトランスジェニック植物、特に作物を提供する。適切な植物の例は、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、アブラナ、レタス、イチゴ、脂肪種子アブラナ、テンサイ、小麦、大麦、トウモロコシ、コメ、大豆、エンドウ、穀実用モロコシ、ヒマワリ、トマト、ポテト、コショウ、キク、カーネーション、ポプラ、ユーカリノキ及びマツを含む。本発明のこれら及び更なる態様並びに実施形態に対する改良は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全ての文献は引用により組み込まれる。既に示した通り、本発明は、トマトCf −２遺伝子のクローニング及び配列決定に基づき、本実験研究は、以下の図面を参照して以下により詳細に記載される。図１は、Cf −２／Cf −９コスミドライブラリーから単離されたオーバーラッピングコスミド（38，82，89，90，92，94，96及び141）から形成されたトマトCf −２座の物理的地図を示す。また、コスミド94（2.2 としても知られるもの）から得られた配列を含む改良されたコスミド（112Ｂ、及び112Ｂ₂）も含む。各々のコスミドの範囲及びCf −２遺伝子の位置を概略的に示す。また転写の予想される方向も示す（矢印）。中抜きの囲みは、配列決定されていない領域を示し、閉じた囲いは配列決定された領域を示す。図２は、Cf −2.1 遺伝子のゲノムDNA 配列を示す。特徴：核酸配列−ヌクレオチド1677で翻訳開始；ヌクレオチド5012で翻訳停止；共通ポリアデニル化シグナル（AATAAA）がヌクレオチド3586において始まる翻訳停止の下流の特徴的な配列内に存在する。予想される蛋白質配列−第１翻訳産物1112アミノ酸；シグナルペプチド配列アミノ酸１〜26；成熟ペプチドアミノ酸27〜1112。図３Ａ、Cf −2.1 で示されるCf −２蛋白質アミノ酸を示す（配列番号：２）。図３Ｂは、Cf −2.2 遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を示す（配列番号：３）。２つのCf −２遺伝子間で異なるアミノ酸を下線で示す。図４は、Cf −2.2 遺伝子に相当するほぼ全長のcDNAクローン（配列番号：４）の配列を示す。図５は、Cf −２及びCf −９遺伝子のカルボキシ末端領域の比較を示す（各々配列番号：５及び６）。蛋白質配列を予想される蛋白質ドメインに従ってアラインする。同一のアミノ酸残基をボールドで示す。図６は、Cf −２及びCf−９蛋白質の一部のアラインメントを示す（各々配列番：７及び８）。２つの同一な領域をボールドで示し、各々PEP SEQ １（配列番号：９）及びPEP SEQ ２（配列番号： 10）として示す。OLIGO １（配列番号：11）及びOLIGO ２（配列番号：12）は蛋白質の類似するこれらの領域をコードする縮重オリゴヌクレオチドの配列を示す。図７は、予想される異なる機能のドメインに分割されたCf −２（配列番号：２）の主なアミノ酸配列を示す。トマトCf −２遺伝子のクローニング Cf −２遺伝子を、早に簡単に記載されるトマトPto 遺伝子の単離のために用いられるものと原則的に同様のマップベースのクローニングストラテジーを用いてクローンした。（ｉ）Cf−遺伝子マップ位置のアサインメント我々は、Cf −２を含むいくつかのCf遺伝子をそれの染色体の位置にマッピングした（Dickinson ら1993；Jones ら1993；Balint−Kurti ら1994）。我々は、Cf −４及びCf −９が染色体１の短いアーム上のほぼ同じ位置に位置し、そしてCf − ２及びCf −５が染色体６上のほぼ同じ位置に位置することを示した。（ii）Cf −２遺伝子の物理的位置の高分解能マッピング我々は、組換えトマト植物から単離されたDNA を検査することにより、いくつかの制限フラグメント長多形性（RFLP）マーカーを順序づけた。この方法において、我々は、トマト染色体６上のCf −２遺伝子の位置の詳細な結合マップをアセンブルし(Dixonら1995)。我々は、RFLPマーカーMG112AとCT119 との間のCf −２遺伝子マップを決定した。これらのRFLPマーカーは、S．Tanksley（Cornell）の研究室から利用できた。Tankey研究室によっても利用できるYAC を用いて、我々は、トマト(L ．esculentum)において、マーカーMG112AとCT119 との間の物理的距離が40kbだけであることも示した。我々は、この領域に位置することが示され、それ自体候補のCf −２遺伝子を示す２つの更なるRFLPマーカー、MG112Ｂ（MG1 12Ａと少し相同である）及びSC３−８を単離した。 Cf −２遺伝子の位置をより正確に決定するために、Cf −２及びCf −５耐性遺伝子の間の組換えを捜すためにトマト交雑を準備した。Cf −２及びCf −５の両方についてヘテロ接合である植物をＣ．フルブムセンシティブトマト系に交雑した。Ｃ．フルブムに対する耐性について約12,000の結果として生ずるＦ１子孫をスクリーニングし、単一のセンシティブな植物を同定した。この植物からのDNA をCf −２遺伝子に近く位置した分子マーカーで分析し、この植物がMG11 2AとCT119 との間の組換え体である染色体を有することが見い出された。この分析結果は、RFLPマーカー MG112Ｂが、Cf −２遺伝子に極めて近くに結合して位置したDNA を同定し、又はCf −２遺伝子自体であることを強く示唆した(Dixonら19 96)。（iii）ゲノムCf −２遺伝子を有するバイナリーコスミドベクタークローンの単離分子マーカー MG112Ｂにより同定されたDNA がCf −２遺伝子を有するか否かを決定するために、Cf−２遺伝子を有する植物からDNA 配列を単離し、Cf −０トマト植物に形質転換した。そのライブラリーが両方の遺伝子を単離するのに用いることができるように、染色体１上のCf −９遺伝子と染色体６上のCf −２遺伝子との両方を有する保存物からゲノムDNA ライブラリーを作製した。そのライブラリーは、Pr．C．Dean（J ohn Innes Centre，Colney Lane，Norwich）から得たバイナリーコスミドクローニングベクターpCLD04541 内に作製した（Bentら1994を参照のこと）。このベクターはpOCA18と本質的に同様である(Olszewskiら1988)。それは、ベクターをラムダ充填抽出液により充填可能にするためのバクテリオファージλcos 部位を含み、これによりコスミドである（Hohn and Gellins，1980）。それはバイナリーベクターでもある（van den Elzen ら1985）ので、単離されたいずれのコスミドクローンも、クローンされた遺伝子の機能についてテストするために植物内に直接導入することができる。高分子量DNA を、当業者に公知である技術（Thomasら1994）により６週を経た温室で成長した植物の葉から単離し、MboＩ制限酵素で部分的に消化した。その部分的消化産物をスクロース勾配を用いてサイズ分画し、20〜25キロベース（kb ）の範囲の大きさのDNA を当業者に公知である技術を用いてBamHＩで消化したpC LD04541 DNA に連結した。Stratageneパッケージング抽出液を用いて試験管内でパッケージングした後、Stratagene大腸菌株SURE^TMの（Stratageneから得た）テトラサイクリンセンシティブバージョンにコスミドを導入した。pCLD04541 上のテトラサイクリン耐性遺伝子を用いて、組換え体を選択した。そのライブラリーを、プール当り約1500のクローンを含む144 のプール内に無作為に分配し、各々のプールから、細胞10mlから細胞を増殖させ、バルクプラスミドDNA 抽出のために９mlを用い、そして凍結保存液を調製するために、0.2ml のグリセロールを加えた後、１mlを用いた。そのプールからのプラスミドDNA を、アルカリ溶解(Birnboim and Doly，1979)により単離し、そしてDNA サンプルを、分子マーカー MG112Ｂとの“スロットブロット（slot blots）”におけるハイブリダイゼーションにより分析した。プール38，82，89，90，92，94，96及び 141 がこのアッセイにより陽性であることが判明した。“94”は“2.2 ”としても知られている。各々のプールについて、約10,000のコロニーをプレートに出し、放射能 MG112 Ｂプローブとのコロニーハイブリダイゼーションにより MG112Ｂ相同性について検査し、各々のプールから、前記の相同性を有する単一コロニーを単離した。これらの技術は全て当業者に公知である。これらのクローンは、MG112Ｂプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーション、及び制限酵素マッピングにより更にキャラクタライズされる。これらのオーバーラップするコスミドにより規定される MG112Ｂの周囲の隣接するDNA の範囲の我々の現在の測定結果を図１に示す。これらのコスミドは、MG112Ｂにハイブリダイズする極めて類似した制限マップでの２つの領域を示した（各々 MG112Ｂ₁及びＢ₂で標識）。次にこれらのコスミドの４つ(82，89 ，94，141)を、当該技術で公知である技術を用いて、カナマイシン耐性に形質転換された植物細胞について選択する植物形質転換実験に用いた。コスミド82，89 ，94及び141 の各々の少くとも１つを有するトランスジェニックトマト及びタバコ植物を生産した（Fillattiら1987；Horschら1985）。（iv）トランスジェニックトマトにおけるコスミド機能の評価推定されるクローンされたCf −２遺伝子の機能を、Avr−２を有するＣ．フルブムに対する耐性について形質転換体をテストすることにより、形質転換されたトマトにおいて評価した。コスミド94（16のうち11）及びコスミド82（４の全て）はAvr ２を有するＣ．フルブムに対して耐性であった。コスミド89又は141 を含む全てのトランスジェニック植物はＣ．フルブムに対してセンシティブであった。これらのデータは、Cf −２遺伝子を有するゲノムDNA がコスミド82及び94の間のオーバーラップに相当する断片であることを示す。これにより、Cf −２遺伝子はマーカー MG112Ｂ₁ により同定される領域の１つにある。 MG112Ｂ₂により同定されたコスミド94上の領域は、コスミド82／94オーバーラップと多くの類似性を有する。この領域をコスミド 112Ｂ₂を作るためにサブクローンし（図１）、これもセンシティブなトマト系に形質転換した。コスミド 1 12Ｂ₂を有するトランスジェニックトマト植物の18のうち16は Avr ２を有するＣ．フルブムに耐性であった。コスミド82と 112Ｂ₂との間のオーバーラップは極めて小さく、Cf −２遺伝子を有さないようである。更に、MG112Ｂ₁として同定された領域をコスミド 112Ｂ₁を作るためにサブクローンして（図１）、それをセンシティブなトマト系に形質転換した。唯一コスミド 112Ｂ₁が、図２（配列番号：１）を特徴とする配列を含む。コスミド 112Ｂ₁を有するトランスジェニックトマトの全て（５以外の５）は Avr −２を有するＣ．フルブムに耐性であった。それゆえ、これらのデータは、分子プローブ MG112Ｂを特徴とする２つの機能的Cf −２遺伝子(各々Cf −2.1 及びCf −2.2)の存在を示す(Dixonら1996)。全ての形質転換実験の結果を表１に要約する。全ての耐性非倍数体形質転換植物からの子孫を、Avr −２を有するか又はそれを欠如するかのいずれかのＣ．フルブムの適合品種でスクリーニングした（品種２，５，９と比較した品種５，９）。Ｃ．フルブムの品種を、それらが克服することができる耐性遺伝子の後に示す。全ての子孫は、Avr −２を欠如するＣ．フルブム（品種２，５，９）に感受性があったが、各々の形質転換体からの子孫の約75％が Avr −２を有するＣ．フルブム（品種５，９）に耐性であった。これらのデータは、Cf −２としてクローンされた耐性遺伝子の品種特異的性質を確認する。（ｖ）MG112Ｂによりキャラクタライズされた領域のDNA 配列分析コスミド82／94オーバーラップの中心のコアを表す 6.5kb領域のDNA 配列を決定した。コスミドオーバーラップの先端に相当する2.3 及び 1.1kbの２つの小さな領域を配列決定した（図１）。中央のコア配列は、概念上の翻訳がCf −９遺伝子について上述されるような他の耐性遺伝子の特徴であり得る興味あるモチーフ(ロイシンの豊富な繰り返し又はLRR)を表す単一の主要なオープンリーディングフレームを有する（WO95/18320）。そのオープンリーディングフレームは位置1677における翻訳開始コドン(ATG)で始まり、1112アミノ酸蛋白質をコードする3336bp 配列を介して位置5012における翻訳終了コドンTAG で終わる。これはCf −2.1 遺伝子である。コスミド 112Ｂ₂上に有する領域標識された MG112Ｂ₂の配列も決定した。この配列は、Cf −2.1 遺伝子配列から３ヌクレオチドだけ異なる単一のオープンリーディングフレームも有する。概念上の翻訳に基づいて、これはCf −2.1 蛋白質から３アミノ酸だけ異なる1112アミノ酸蛋白質もコードする。これらのアミノ酸の差は、蛋白質のカルボキシ末端領域に全て密集しており、図３Ｂ（配列番号：３）に下線の残基として示される。それゆえ我々は、これをCf −2.2 と命名する。 Cf −２遺伝子に相当するほとんど全ての全長cDNAクローン（配列番号：４）を単離した（図４）。これは、全オープンリーディングフレームを通してゲノム配列が共直線上に並ぶようなCf −２遺伝子の予想されるアミノ酸配列を確認する。そのcDNAクローンは、いずれの非翻訳リーダー配列及びイニシエーターメチオニンをコードするコドンを含むほとんどの５’配列を欠如する。このcDNAの最初の全てのコドンは、アミノ酸番号４であるバリンをコードする。185 ベースの１つのイントロンが３’非翻訳配列中に存在する(Dixonら1996)。その中に報告される配列についてのGenbank アクセッション番号はCf −2.1 についてU42444，Cf −2.2 についてU42445である。（vi）Cf −２内のロイシンの豊富な繰り返し領域の同定 Cf −2.1 遺伝子のゲノム配列を図２に示す（配列番号：１）。予測されるCf− ２蛋白質のアミノ酸配列を図３Ａ（配列番号：２）に示す。 US National Centre of Biological Information（NCBI）におけるデータベースにおける配列に対する結果として生ずる配列の相同性調査は、ロイシンの豊富な繰り返し領域（LRRs）を含む他の遺伝子に対する強い相同性を示す。Cf −２遺伝子は、483 のブラスト・スコアー(blast score)でCf−９との同一性を有する。他の相同体は、アラビドプシス遺伝子 TMK１(Changら1992)、TMKL１(Valonら1 993)、RLK５（Walker，1993）、並びに不完全配列及び未知の機能を有する発現された配列（例えばアラビドプシスタリアナ転写配列（ATTS）1447）を含む。LR R の存在が、その多くがおそらくレセプターとして機能する他の遺伝子内で観察された（更なる引用文献についてChang ら（1992）を参照のこと）。 TMK１及び RLK５遺伝子は、それらがトランスメンブランセリン／トレオニンキナーゼをコードし、広いLRR 領域を有することを示唆する構造を有する。まだ未知である機能としてそれらを割り当てた。病気耐性遺伝子は病原体産物を認識し、後にシグナルトランスダクション鎖が防御応答を導くのを開始する遺伝子産物をコードすることが知られている。他のキャラクタライズされた病気耐性遺伝子(Pto)はプロテインキナーゼであることが知られている(Martinら1993)。しかしながら、Cf −２において、ゲノムDNA 及びcDNA配列分析に基づく明らかなプロテインキナーゼドメインはない。予測されたCf −２アミノ酸配列は７つのドメインに分けることができる（図７）。ドメインＡは、シグナルペプチドと予想される26アミノ酸である。ドメインＢは、ポリガラクツロナーゼインヒビター蛋白質といくらか相同性のある37アミノ酸領域である。ドメインＣは、24アミノ酸のロイシンの豊富な繰り返し(LRR)の33の完全なコピー及び５の不完全なコピーを含む930アミノ酸である。ドメインＤは、ポリガラクツロナーゼインヒビター蛋白質といくらか相同性のある30アミノ酸ドメインである。ドメインＥは、負電荷の残基の豊富な28アミノ酸ドメインである。ドメインＦは、予想されるトランスメンブランドメインをコードする24アミノ酸の疎水性ドメインである。ドメインＧは、正電荷の残基が豊富な37アミノ酸ドメインである。ドメインＥ，Ｆ及びＧは一緒にもっともらしいメンブランアンカーを含む。 Cf−２及びCf−９蛋白質は、それらが両方上述の７つのドメインに再分することができる点で同じ一般的特徴を有すると予想される。しかしながらそれらは、各々1112対863 アミノ酸であり長さにおいて極めて異なる。この大きさの差の大部分はドメインＣにおけるLRR の数にある。LRR は特定の保存されたアミノ酸（主にロイシン）を特徴とするが、それらは、保存されたアミノ酸のブロックが存在しないように一般に離れて位置する。更に、ロイシンは６の異なるコドンによりコードされ得、結果として新しい関連する遺伝子を同定するためのDNA ハイブリダイゼーションのレベルにおいてLRR 中の保存されたアミノ酸の類似性を利用することは困難であろう。実際、ゲノムサザンハイブリダイゼーションのレベルにおいて、Cf −２及びCf −９遺伝子は、我々が用いた条件下で互いに同一でなかった。（vii）Cf −２とCf −９とのアミノ酸配列の比較 Cf −２とCf −９のアミノ酸配列の比較は、ドメインＣの終り及びドメインＤにおいて著しい程度の相同性を示す。これらを図６にボールドで示す。位置915 で始まる配列FEGHIPS(配列番号：13)及び位置965 で始まる配列SGEIPQQLASTLSLE( 配列番号：14)のようなCf −２の領域はCf −９と全く同一である。Cf −２及びCf −９は異なる染色体上にあるので、それらは最近分かれたのではないようである。次にこの保存性は、Cf −９及びCf −２並びに病気耐性を供するためにCf −９又はCf −２に要求される特定の他の蛋白質のアミノ酸の間の関連性の維持の選択による機能的保存を示唆する。従って、これらの相同性は、更なる病気耐性遺伝子の単離に用いることができる。当業者に公知である技術を用いて、これらの配列及びそれらのフラグメントは、これらのアミノ酸配列モチーフを有する更なる病気耐性遺伝子を単離する目的のためのオリゴヌクレオチドプローブ／プライマーをデザインするのに用いることができる。例えば、Cf −２とCf −９遺伝子の同一性に基づいて（図５及び６）、図６に示されるもののような合成縮重オリゴヌクレオチドプライマーを作ることができよう。これらのプライマーは、Cf −２とCf −９ポリペプチドとの間に保存されたアミノ酸を潜在的にコードする異なるDNA 配列に相当する。これらの合成オリゴヌクレオチドプライマーは、それらを含むいずれかの種から、関連する配列を同定するためにPCR において用いることができる。異なるコスミドを有するトランスジェニックトマト植物（第１形質転換体）の応答。トマト形質転換体を、Avr −２を有するＣ．フルブムの品種（品種４ GUS ）に対する耐性（Ｒ）又は感受性（Ｓ）についてテストした。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月２７日【補正内容】請求の範囲７．植物における発現が該植物における防御応答の活性化を引きおこすことができる病原体耐性遺伝子を含む核酸単離物であって、60℃における２×SSC のストリンジェンシーを用いるサザンブロットにおいて図１又は図４に示されるコード化配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドの配列を含むことを特徴とする核酸単離物。８．前記活性化が、病原体又は対応するエリシター分子との前記植物の接触に基づくことを特徴とする請求項７に記載の核酸。９．請求項１〜８のいずれか一に記載の核酸を含むベクターであることを特徴とする核酸。 10．前記ポリペプチドの発現のための調節配列を更に含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸。 11．トランスジェニック植物の生産における先の請求項のいずれか一に記載の核酸の使用。 12．請求項１〜10のいずれか一に記載の外生の核酸を含むホスト細胞。 13．微生物であることを特徴とする請求項12に記載のホスト細胞。 14．植物細胞であることを特徴とする請求項13に記載のホスト細胞。 15．請求項14に記載の細胞を含む植物又はそのいずれか一部分。 16．請求項15に記載の植物の種子、自家もしくは雑種後代もしくは子孫、又はそれらのいずれか一部分。 17．請求項１〜10のいずれか一に記載の核酸をホスト細胞に導入することを含む方法。 18．前記ホスト細胞が植物又は微生物細胞であることを特徴とする請求項17に記載の方法。 19．植物に病原体耐性を供する方法であって、植物の細胞又はその祖先に、請求項１〜10のいずれか一に記載の核酸を導入するステップの後に、前記植物の細胞内で、前記核酸から発現させることを含むことを特徴とする方法。 20．前記核酸が、図３に示されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項19に記載の方法。 21．病原体耐性遺伝子間に維持されたアミノ酸配列をコードする配列又は前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的な配列を有する約30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。 22．前記病原体耐性遺伝子がトマトのCf −２（図３Ａ又は３Ｂのアミノ酸配列）及びCf −９（WO95/18230）であることを特徴とする請求項21に記載のオリゴヌクレオチド。 23．次のアミノ酸配列：（ｉ）SGEIPQQ；（ii）YE／QGNDG；（iii）FEGHIPS；（iv）SGEIPQQLASLTSLE のいずれかをコードするヌクレオチド配列、又はそのコード化配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。 24．（ｉ）TCX-GGX-GAA/G-AAT/C/A-CCX-CAA/G-CA；（ii）TAT/C-G/CAA/G-GGX-AAT/C-GAT/C-GGX-CTX-CG；及び（iii）CG-XAG-XCC-A/GTC-A/GTT-XCC-T/CTC/G-A/GTA から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド。 25．請求項21〜24のいずれか一に記載のオリゴヌクレオチドの配列の１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換による変異体又は誘導体である配列を含むオリゴヌクレオチド。 26．植物における発現が該植物における防御応答の活性化を引きおこすことができる植物病原体耐性遺伝子を含む核酸を得る方法であって、請求項21〜25のいずれか一に記載のオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドを含む核酸分子であって、トマトのCf −９遺伝子（WO95/18230）でないものを、標的核酸にハイブリダイズすることを含むことを特徴とする方法。 27．核酸増幅を用いることを含む請求項26に記載の方法。 28．請求項26又は27に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションの後に、成功したハイブリダイゼーションの同定及び標的核酸の単離を行うことを特徴とする方法。 29．請求項26〜28のいずれかに記載の方法を用いて核酸を得た後に、該得られた核酸の配列の全部又は一部を含む核酸分子を、トランスジェニック植物の生産に用いることを特徴とする方法。 30．前記核酸分子を、前記植物に病原体耐性を供するのに用いることを特徴とする請求項29に記載の方法。 31．植物における発現が該植物における防御応答の活性化を引きおこすことができる植物病原体耐性遺伝子を含む核酸を得るための請求項21〜24のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョンズ，デビッドアレンイギリス国，ノーウィッチエヌアール４６ピーディー，イートン，グリーンウェイズ 139 (72)発明者ジョンズ，ジョナサンダラスジョージイギリス国，ノーフォークエヌアール４６エスジー，ノーウィッチ，ウェイバリーロード 19

Claims

【特許請求の範囲】１．植物における発現が該植物における防御応答の活性化を引きおこすことができる病原体耐性遺伝子をコードする核酸単離物であって、図３Ａ又は図３Ｂに示されるアミノ酸の配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含むことを特徴とする核酸単離物。２．前記活性化が、病原体又は対応するエリシター分子との植物の接触に基づくことを特徴とする請求項１に記載の核酸。３．前記ヌクレオチドの配列が、図２又は図４に示されるコード化配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸。４．前記ヌクレオチドの配列が、図２又は図４に示されるコード化配列の１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換による対立遺伝子、誘導体又は変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸。５．植物における発現が該植物における防御応答の活性化を引きおこすことができる病原体耐性遺伝子をコードする核酸であって、該核酸が、図３Ａ又は図３Ｂに示されるアミノ酸の１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換による対立遺伝子、誘導体又は変異体を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含み；但し前記核酸が次の特徴： 60℃における２×SSC のストリンジェンシーを用いるサザンブロッティングにおいて互いを同定するのにそれとCf −９とについてCf −９と十分に相同でなく；図２のヌクレオチド1677〜5012に示されるコード化配列と少くとも70％の相同性を有し； Avr ２分子との接触に基づいて前記防御応答の活性化を引きおこすことができ；受託番号IPO10379下で寄託されたクラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum )品種４又はその抽出物との前記植物の接触に基づいて前記防御応答の活性化を引きおこすことができるが、受託番号IPO50379下で寄託されたクラドスポリウム・フルブム品種２，４又はその抽出物との前記植物の接触に基づいて前記防御応答の活性化を引きおこさず； Avr ９分子との接触に基づいて前記防御応答を活性化せず；そのコードされたポリペプチドが38のロイシンの豊富な繰り返し(LRR's)を含むの１又は複数を有することを特徴とする核酸。６．前記活性化が、病原体又は対応するエリシター分子との前記植物の接触に基づくことを特徴とする請求項５に記載の核酸。７．植物における発現が該植物における防御応答の活性化を引きおこすことができる病原体耐性遺伝子を含む核酸単離物であって、60℃における２×SSC のストリンジェンシーを用いるサザンブロットにおいて図１又は図４に示されるコード化配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドの配列を含むことを特徴とする核酸単離物。８．前記活性化が、病原体又は対応するエリシター分子との前記植物の接触に基づくことを特徴とする請求項７に記載の核酸。９．請求項１〜８のいずれか一に記載の核酸を含むベクターであることを特徴とする核酸。 10．前記ポリペプチドの発現のための調節配列を更に含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸。 11．トランスジェニック植物の生産における先の請求項のいずれか一に記載の核酸の使用。 12．請求項１〜10のいずれか一に記載の核酸を含むホスト細胞。 13．微生物であることを特徴とする請求項12に記載のホスト細胞。 14．植物細胞であることを特徴とする請求項13に記載のホスト細胞。 15．請求項14に記載の細胞を含む植物又はそのいずれか一部分。 16．請求項15に記載の植物の種子、自家もしくは雑種後代もしくは子孫、又はそれらのいずれか一部分。 17．請求項１〜10のいずれか一に記載の核酸をホスト細胞に導入することを含む方法。 18．前記ホスト細胞が植物又は微生物細胞であることを特徴とする請求項17に記載の方法。 19．植物に病原体耐性を供する方法であって、植物の細胞又はその祖先に、請求項１〜10のいずれか一に記載の核酸を導入するステップの後に、前記植物の細胞内で、前記核酸から発現させることを含むことを特徴とする方法。 20．前記核酸が、図３に示されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項19に記載の方法。 21．病原体耐性遺伝子間に維持されたアミノ酸配列をコードする配列を含むか、又は前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド。 22．前記病原体耐性遺伝子がトマトのCf −２及びCf −９であることを特徴とする請求項21に記載のオリゴヌクレオチド。 23．請求項22に記載のオリゴヌクレオチドであって、次のアミノ酸配列：（ｉ）SGEIPQQ；（ii）YE／QGNDG；（iii）FEGHIPS；（iv）SGEIPQQLASLTSLE のいずれかをコードするヌクレオチド配列、又はそのコード化配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。 24．（ｉ）TCX-GGX-GAA/G-AAT/C/A-CCX-CAA/G-CA；（ii）TAT/C-G/CAA/G-GGX-AAT/C-GAT/C-GGX-CTX-CG；及び（iii）CG-XAG-XCC-A/GTC-A/GTT-XCC-T/CTC/G-A/GTA から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド。 25．請求項21〜24のいずれか一に記載のオリゴヌクレオチドの配列の１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換による変異体又は誘導体である配列を含むオリゴヌクレオチド。 26．病原体耐性遺伝子を含む核酸を得る方法であって、請求項21〜25のいずれか一に記載のオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドを含む核酸分子を、標的核酸にハイブリダイズすることを含むことを特徴とする方法。 27．核酸増幅を用いることを含む請求項26に記載の方法。 28．請求項26又は27に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションの後に、成功したハイブリダイゼーションの同定及び標的核酸の単離を行うことを特徴とする方法。 29．請求項26〜28のいずれかに記載の方法を用いて核酸を得た後に、該得られた核酸の配列の全部又は一部を含む核酸分子を、トランスジェニック植物の生産に用いることを特徴とする方法。 30．前記核酸分子を、前記植物に病原体耐性を供するのに用いることを特徴とする請求項29に記載の方法。