ES2131578T5 - Deteccion rapida de resistencia a antibioticos en mycobacterium tuber culosis. - Google Patents
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Abstract
LAS CEPAS RESISTENTES A DROGAS MULTIPLES DEL "MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS" REPRESENTAN UNA AMENAZA CONSIDERABLE PARA LA SALUD HUMANA A LO LARGO DEL MUNDO. FRECUENTEMENTE SE NECESITA DETECTAR LA RESISTENCIA AL ISONIAZID (INH), A LA RIFAMPICINA O A ANALOGOS DE LA MISMA, O LA ESTREPTOMICINA, POR EJEMPLO COMPONENTES CLAVE DE REGIMENES ANTITUBERCULOSIS. LA INVENCION COMPRENDE LA DETECCION DE UNA MUTACION EN EL GEN KATG (RESISTENCIA AL ISONAZID) O EN EL GEN RPOB (RESISTENCIA A LA RIFAMPICINA) O EN EL GEN RPSL (RESISTENCIA A LA ESTREPTOMICINA).
Description
Detección rápida de resistencia a antibióticos
en Mycobacterium tuberculosis.
La presente invención se refiere a la detección
rápida de cepas de Mycobacterium tuberculosis que son
resistentes a antibióticos, particularmente a isoniacida,
rifampicina y estreptomicina. Más particularmente, la presente
invención se refiere a un procedimiento para detectar resistencia a
antibióticos en Mycobacterium tuberculosis, por ejemplo,
como resultado de mutaciones en los genes correspondientes o
mediante hibridación de ácidos nucleicos. La presente invención
también se refiere a una sonda de ácidos nucleicos y a un equipo
para realizar la hibridación de ácidos nucleicos. La invención
además se refiere a la localización cromosómica del gen katG
y su secuencia de nucleótidos.
A pesar del más de un siglo de investigación
desde el descubrimiento de Mycobacterium tuberculosis, el
agente etiológico de la tuberculosis, por Robert Koch, en esta
enfermedad sigue siendo una de las causas principales de morbididad
y mortalidad humanas. Hay unos 3 millones estimados de muertes
atribuibles anualmente a la tuberculosis (Snider, 1989), y aunque
la mayoría de éstas corresponden a países en desarrollo, la
enfermedad está asumiendo una renovada importancia en Occidente
debido al creciente número de personas sin hogar y al impacto de la
epidemia del SIDA (Chaisson y col., 1987; Snider y Roper, 1992).
La hidracida del ácido isonicotínico o
isoniacida (INH) se ha usado en el tratamiento de la tuberculosis
durante los últimos cuarenta años debido a su exquisita potencia
contra los miembros de los grupos de la "tuberculosis" -
Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. africanum (Middlebrook, 1952; Youatt, 1969). No se conocen ni la diana precisa del fármaco ni su modo de acción, y el tratamiento con INH produce la perturbación de varias rutas metabólicas. Hay una evidencia sustancial que indica que la INH puede actuar como un antimetabolito del NAD y el piridoxal fosfato (Bakierkunst y Bricker, 1967; Sriprakash y Ramakrishnan, 1970; Winder y Collins, 1968, 1969, 1970) y otros datos que indican que el fármaco bloquea la síntesis de los ácidos micólicos, que son responsables del carácter ácido rápido de las paredes celulares micobacterianas (Winder y Collins 1970; Quemard y col., 1991). Poco después de su introducción, aparecieron los aislados resistentes a INH de Mycobacterium tuberculosis y, tras su caracterización, a menudo se descubrió que habían perdido la actividad catalasa-peroxidasa y mostraban una virulencia reducida en cobayas (Middlebrook y col., 1954; Kubica y col., 1968; Sriprakash y Ramakrishnan, 1970).
Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. africanum (Middlebrook, 1952; Youatt, 1969). No se conocen ni la diana precisa del fármaco ni su modo de acción, y el tratamiento con INH produce la perturbación de varias rutas metabólicas. Hay una evidencia sustancial que indica que la INH puede actuar como un antimetabolito del NAD y el piridoxal fosfato (Bakierkunst y Bricker, 1967; Sriprakash y Ramakrishnan, 1970; Winder y Collins, 1968, 1969, 1970) y otros datos que indican que el fármaco bloquea la síntesis de los ácidos micólicos, que son responsables del carácter ácido rápido de las paredes celulares micobacterianas (Winder y Collins 1970; Quemard y col., 1991). Poco después de su introducción, aparecieron los aislados resistentes a INH de Mycobacterium tuberculosis y, tras su caracterización, a menudo se descubrió que habían perdido la actividad catalasa-peroxidasa y mostraban una virulencia reducida en cobayas (Middlebrook y col., 1954; Kubica y col., 1968; Sriprakash y Ramakrishnan, 1970).
Muy recientemente, la resistencia a INH ha
adquirido un nuevo significado debido a la epidemia de tuberculosis
en los Estados Unidos, debido a variantes resistentes a múltiples
fármacos (MDR) de M. tuberculosis (CDC, 1990; 1991a, b) y la
demostración de que tales cepas eran responsables de infecciones
nosocomiales extensivas de individuos infectados con HIV y
trabajadores sanitarios (Snider y Roper, 1992). En vista de la
gravedad de este problema, existe la necesidad en la técnica de
determinar la relación entre la resistencia a INH y la producción
de catalasa-peroxidasa.
Más particularmente, existe la necesidad en la
técnica de comprender los mecanismos moleculares implicados en la
sensibilidad a los fármacos. Además, existe la necesidad en la
técnica de crear un ensayo sencillo que permita la rápida
identificación de cepas resistentes a INH. Adicionalmente, existe la
necesidad en la técnica de reactivos para realizar tal ensayo.
Gayatri Devi y col. (Biochem J. 1975) describe
la purificación de de una nueva proteína, enzima Y, en M.
tuberculosis H37Rv, que tiene actividades catalasa y
peroxidasa, y describe que la pérdida de captación de INH, la
pérdida de actividades de catalasa, peroxidasa, enzima Y y la
resistencia a INH están ligadas. No se revela ningún procedimiento
para la detección de una resistencia tal en este documento.
La rifampicina también es un antibiótico
importante usado para el tratamiento de infecciones provocadas por
micobacterias, particularmente Mycobacterium tuberculosis y
Mycobacterium leprae. Como algunas micobacterias crecen
lentamente, tienen que estar disponibles posibles ensayos rápidos y
eficaces para el ensayo de la resistencia a rifampicina o análogos
de la misma. Análogamente, la invención pretende conseguir una
detección rápida de cepas de Mycobacterium tuberculosis que
son resistentes a estreptomicina. A causa del desarrollo de
resistencia a estreptomicina, este último antibiótico se ha usado
junto con otros antibióticos, por ejemplo, isoniacida. Así pues, el
tratamiento adecuado de la tuberculosis debe ir precedido por una
detección rápida y eficaz de resistencias a los tres antibióticos
principales, isoniacida, rifampicina y estreptomicina.
La revelación por Zinder y col. (en "The
biology of Mycobacteria", 1982, Eds. Ratledge & Stanford,
Academic Press, Londres, vol. 1, Capítulo 8) se refiere al modo de
acción de rifampicina y estreptomicina en micobacterias, sin
embargo no revela ni el mecanismo de acción de estos antibióticos,
ni un procedimiento para detección de resistencia a ellos. El
Documento de Zang y col. (Nature, 1992) revela el uso de técnicas de
genética micobacteriana para estudiar la base de la resistencia a
INH, pero no de rifampicina y estreptomicina.
Por consiguiente, la presente invención ayuda a
satisfacer estas necesidades en la técnica proporcionando un
procedimiento para la detección in vitro de la presencia de
células de Mycobacterium tuberculosis resistentes a
isoniacida y a otros fármacos, tales como rifampicina o análogos de
la misma, y estreptomicina.
Por análogos de rifampicina, particularmente se
entiende derivados de
3-formil-rifamicina, particularmente
como resultado de la sustitución del sustituyente presente en el
grupo naftofuranonilo o de la cadena lateral en la posición 7 del
grupo naftofuranonilo por rein, o mediante la introducción o
eliminación de un doble enlace en la cadena
lateral.
lateral.
La invención se refiere a un procedimiento para
la detección de resistencia a un antibiótico en una micobacteria,
que comprende detectar una mutación en un gen seleccionado entre el
grupo compuesto por el gen rpoB o un fragmento del mismo,
gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia
mostrada en la Figura 13, y el gen rpsL o un fragmento del
mismo, gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la
secuencia de Mycobacterium tuberculosis mostrada en la
Figura 14.
De acuerdo con la invención, existe un
procedimiento alternativo para detectar in vitro la presencia
de ácidos nucleicos de una Mycobacterium tuberculosis
resistente a isoniacida, donde el procedimiento comprende las
etapas de:
- poner en contacto dichos ácidos nucleicos, que
previamente se han hecho accesibles a una sonda si se requiere,
bajo condiciones que permiten la hibridación; y
- detectar cualquier sonda que haya hibridado
con dichos ácidos nucleicos;
donde dicha sonda comprende una secuencia de
ácido nucleico que es un fragmento EcoRV-KpnI de 2,5
kb del plásmido pYZ56, y donde dicho fragmento contiene un sitio de
escisión BamHI, donde Mycobacterium tuberculosis
resistente a isoniacida no contiene DNA que hibride con este
fragmento.
Por ejemplo, este procedimiento comprende las
etapas de:
- (A)
- depositar y fijar ácidos nucleicos de las células en un soporte sólido, para hacer a los ácidos nucleicos accesibles a una sonda;
- (B)
- poner en contacto los ácidos nucleicos fijados de la etapa (A) con una sonda, bajo condiciones que permitan la hibridación;
- (C)
- lavar el filtro resultante de la etapa (B), de forma que se elimine toda la sonda no hibridada; y después,
- (D)
- detectar cualquier sonda hibridada en el filtro lavado resultante de la etapa (C).
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La sonda comprende una secuencia de ácido
nucleico que está presente en un fragmento EcoRV-KpnI
de 2,5 kb del plásmido pYZ56, donde dicho fragmento contiene un
sitio de escisión BamHI. Se ha descubierto que este
fragmento está asociado con el ADN intracelular de Mycobacterium
tuberculosis sensible a isoniacida y que es capaz de distinguir
tales microorganismos sensibles a antibióticos de las células de
Mycobacterium tuberculosis resistentes a isoniacida, que no
contienen el ADN que hibrida con este fragmento bajo las condiciones
descritas más adelante.
La presente invención además proporciona
secuencias de nucleótidos, tales como ARN y ADN, de Mycobacterium
tuberculosis resistentes a isoniacida, que codifican la región
del gen katG de Mycobacterium tuberculosis que
imparte la sensibilidad a isoniacida ausente en las células
resistentes a isoniacida.
La presente invención también proporciona una
sonda que consta de un marcador, tal como un radionúclido, unido a
una secuencia de nucleótidos de la invención.
Además, la presente invención proporciona una
molécula híbrida duplex que consta esencialmente de una sonda de la
invención, unida con enlaces de hidrógeno a una secuencia de
nucleótidos con una secuencia de bases complementaria, tal como ADN
o ARN.
Además, la presente invención proporciona un
procedimiento para seleccionar una secuencia de nucleótidos que
codifica un gen de catalasa-peroxidasa de
Mycobacterium tuberculosis, o una porción de tal secuencia de
nucleótidos, de entre un grupo de secuencias de nucleótidos, que
comprende la etapa de determinar la secuencia de nucleótidos que
hibrida con una sonda de la invención. La secuencia de nucleótidos
puede ser una secuencia de ADN o una secuencia de ARN. El
procedimiento puede incluir la etapa de detectar un marcador en la
secuencia de nucleótidos.
La invención también revela compuestos obtenidos
como productos de la acción de la enzima catalasa, o una enzima
similar, sobre la isoniacida. El gen katG o un derivado de
este gen que retiene una actividad similar, puede usarse como
fuente de proteína catalasa. Los nuevos compuestos se seleccionan
mediante la reactividad en cepas de micobacterias resistentes a INH
por el procedimiento del antibiograma, tal como se describe en H.
David y col. "Methodes de laboratoire pour Mycobacteriologie
clinique" editado por el Instituto Pasteur, ISBN Nº
0995-2454.
La presente invención se describirá con mayor
detalle haciendo referencia a los dibujos, en los que:
La Fig. 1 muestra la cepa de M. smegmatis
resistente a INH, BH1 (Gayathri y col., 1975) (un derivado de la
cepa MC^{2}-155), que se transformó con un grupo
de cósmidos lanzadera de M. tuberculosis-H37Rv
(proporcionados amablemente por el Dr. W. R. Jacobs, Nueva York) y
los clones individuales se evaluaron con respecto a la
susceptibilidad a INH. El cósmido pBH4 confirió susceptibilidad al
fármaco de forma consistente y la catalasa transformante
sobreproducida (ensayada como en Heym, 1992). Se muestra el mapa de
restricción del inserto de ADN de pBH4, junto con el del inserto de
pYZ55 - un plásmido que contiene katG de M.
tuberculosis H37Rv, aislado basándose en la hibridación con una
sonda oligonucleotídica
(5'-TTCATCCGCATGGCCTGGCACGGCGCGGGCACCTACCGC-3')
diseñada para emparejarse con la secuencia de aminoácidos de una
región conservada de la hidroperoxidasa I (HPI) de E. coli.
Se indican los sitios de restricción para las siguientes enzimas:
B, BamHI; C, Cla1; E,
EcoRV; H, HindIII, K, Kpn1;
M, Sma1; N, Not1; R,
EcoR1; S, Sac1. La transformación de BH1 con un
plásmido lanzadera micobacteriano, pBAK14, Zhang y col., 1991, que
contenía el inserto de 4,5 kb de pYZ55, confería análogamente
susceptibilidad a INH. También se muestran las MIC para la cepa BH1
transformada con subfragmentos derivados de pYZ55 e insertados en
pBAK14 en una (+) u otra (-) orientación. El gen katG y la
capacidad de conferir susceptibilidad a INH se localizaron en un
fragmento EcoRV-Kpn1 de 2,9 kb
(pBAK-KE+).
La Fig. 2 muestra extractos de M.
tuberculosis H37Rv y de cepas de E. coli transformadas
con una diversidad de construcciones de plásmidos que se prepararon
para el análisis de actividad en gel descrito previamente (Zhang y
col., 1991). Los geles no desnaturalizantes que contenían un 8% de
poliacrilamida se marcaron con respecto a las actividades catalasa
(panel A) y peroxidasa (panel B) como se describe por Wayne y Diaz
(Wayne y col., 1986). Carril 1, M. tuberculosis H37Rv; 2,
E. coli UM2 (katE, katG); 3, E. coli
UM2/pYZ55; 4, E. coli UM2/pYZ56 (el fragmento
EcoRV-Kpn1 de 2,9 kb en pUC19, que corresponde a
pBAK-KE+ en la Fig. 1); 5, E. coli UM2/pYZ57
(pYZ55 con una deleción BamHI-Kpn1, que corresponde a
pBAK-KB+ en la Fig.1). Las actividades catalasa y
peroxidasa de M. tuberculosis migraron como dos carriles bajo
estas condiciones (carril 1); se observó el mismo modelo para la
enzima recombinante expresada por pYZ55 (carril 3). pYZ56 (carril 4)
expresa una proteína de mayor peso molecular debido a una fusión
entre katG y lacZ' desde el vector, como se muestra en
el panel C. El panel C también muestra una alineación parcial de la
secuencia con E. coli HP1.
La Fig. 3 muestra una cepa de E. coli con
mutaciones en katG y katE (UM2, Mulvey y col., 1988)
que se trasformó con el vector pUC19 solo, con pYZ55 que expresa
katG de M. tuberculosis y con pYZ56 con un alto nivel
de expresión de katG de M. tuberculosis. Los cultivos
de una noche en caldo de Luria-Bertani suplementado
con antibióticos apropiados, se cultivaron en presencia de
concentraciones variables de INH y se evaluaron las unidades
formadoras de colonias. Se muestran los resultados de un experimento
representativo indicando las barras de error la desviación típica
observada en muestras por triplicado. La sobreexpresión de
katG de M. tuberculosis confería análogamente
susceptibilidad a altas concentraciones de INH en E. coli
UM255 (katG, katE, Mulvey y col., 1988), pero no tenía
ningún efecto sobre cepas catalasa-positivas tales
como E. coli TG1. En algunos experimentos, las altas
concentraciones de INH tenían un efecto inhibidor detectable sobre
el crecimiento de UM2 y UM255, individualmente, pero en todos los
experimentos, la inhibición de los transformantes con pYZ56 era al
menos de 10 a 100 veces mayor que la observada en los
correspondientes controles de vector.
La Fig. 4 muestra transferencias de Southern
preparadas usando el ADN genómico de diferentes cepas de M.
tuberculosis, digeridas con kpn1, que se trataron con
sondas de (A) katG (el fragmento kpn1 de 4,5 kb) y (B)
el gen SOD (fragmento EcoR1-kpn1 de 1,1 kb, Zhang y
col., 1991). La tinción de las sondas y el procesamiento de las
manchas de transferencia se realizó como se ha descrito previamente
(Eiglmeier y col., 1991; Maniatis y col., 1989) Carril 1, H37Rv; 2,
cepa 12 - MIC 1,6 \mug/ml INH; 3, B1453 - MIC > 50 \mug/ml de
INH (Jackett y col., 1978); 4, cepa 24 - MIC > 50 \mug/ml de
INH; 5, 79112 - sensible a INH (Mitchison y col., 1963); 6, 12646 -
sensible a INH (Mitchison y col., 1963); 7, 79665 - sensible a INH
(Mitchison y col., 1963). Las susceptibilidades a INH se
confirmaron por inoculación de pendientes de
Lowenstein-Jensen que contenían diferentes
concentraciones de INH.
Fig. 5. Organización del locus de katG.
La barra superior corresponde a un tramo del cromosoma de M.
tuberculosis que abarca la región katG y las posiciones
de los cósmidos individuales usados para construir el mapa se
muestran debajo junto con el cósmido lanzadera original pBH4 y
pYZ55. Se muestran las localizaciones de algunos sitios de
restricción clave (B, BamHI; K, KpnI) junto con la
localización aproximada de los marcadores genéticos conocidos:
fbpB que codifica el antígeno alfa u 85-B
(Matsuo y col., 1988); katG,
catalasa-peroxidasa; LL105, un clon \lambdagt11
anónimo suministrado amablemente por A. Andersen; MPTR, repetición
en tándem polimórfica principal (Hermans y col., 1992).
Fig. 6. A. Secuencia de nucleótidos del
fragmento KpnI que lleva katG. Esta secuencia se ha
depositado en la biblioteca de datos EMBL bajo el número de acceso
X68081. La secuencia deducida de la proteína se muestra en el
código de una letra. B. Alineación de las dos copias de la
repetición directa de 700 pb con identidades mostradas como * y -
que denotan capas introducidas para optimizar la alineación. Los
números se refieren a las posiciones en la
Fig. 2A.
Fig. 2A.
Fig. 7. Distribución de katG en
micobacterias. A. Se digirieron muestras de diferentes ADN
bacterianos (1,5 \mug) con RsrII, se separaron por
electroforesis en gel de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio;
carriles 1 y 7, marcadores de tamaño; M. leprae; carril 3,
M. tuberculosis H37Rv; carril 4, M. gordonae; carril
5, M. szulgai; carril 6, M. avium. B. Hibridación del
gel en A, después de transferencia de Southern, con una sonda
específica para katG.
Fig. 8. Alineación de la estructura primaria de
catalasas-peroxidasas. Las secuencias proceden de
M. tuberculosis H37RV, mtkatg; E. coli, eckatg
(Triggs-Raine y col., 1988); S. typhimurium,
stkatg; B. stearothermophilus, bspera (Loprasert y col.,
1988) y peroxidasa de citocromo c de levadura (ccp; Finzel y
col., 1984). La alineación se generó usando PILEUP y PRETTY
(Devereux y col., 1984) y denota huecos introducidos para maximizar
la homología. Los restos clave del sitio activo y los motivos de la
peroxidasa (Welinder, 1991), discutidos en el texto, se indican
debajo del consenso.
Fig. 9. Análisis de transferencia de Western de
katG de M. tuberculosis producido en diferentes
bacterias. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y después se sometieron a
inmunotransferencia, la detección se realizó con antisuero activado
contra BCG, como se describe en Zhang y col., 1991.
Carril 1, extracto soluble de M.
tuberculosis H37Rv; carril 2, M. smegmatis MC^{2}155
que lleva el vector pBAK14; carril 3, MC^{2}155 que lleva
pBAK-KK (katG+); carril 4, E. coli UM2
(katE, katG), carril 5, UM2 que lleva pYZ55
(katG^{+}); carril 6, UM2 que lleva pYZ56
(lacZ'::katG).
La reciente aparición de gran cantidad de cepas
de M. tuberculosis que muestran resistencia a múltiples
fármacos en los Estados Unidos es un hecho muy alarmante dada la
extrema facilidad de contagio de este organismo. Este peligro se ha
ilustrado notablemente por varias epidemias pequeñas de tuberculosis
en las que un solo paciente infectado con MDR M.
tuberculosis ha infectado a individuos HIV positivos, a guardias
de prisión y personal sanitario (CDC 1990; 1991; Daley y col.,
1992; Snider y Roper, 1992). Dada la gravedad de la actual epidemia
de HIV a nivel mundial, es concebible que si se infectaran pacientes
con SIDA en Occidente, como los africanos, con cepas MDR de M.
tuberculosis (en lugar de miembros del complejo M.
avium/M. intracellulare) se produciría una amplia
diseminación de la enfermedad.
La isoniacida (INH) es un fármaco bactericida
que es particularmente potente contra el grupo de micobacterias de
la tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis, M. bovis
y M. africanum - y, por consiguiente, que ha sido
particularmente eficaz en el tratamiento de la tuberculosis. Los
regímenes convencionales contra la tuberculosis generalmente
incluyen INH y rifampicina, a menudo en combinación con los fármacos
más débiles pirazinamida, etambutol o estreptomicina. Además de su
uso en terapia, la INH también se proporciona a las personas en
contacto cercano con los pacientes como una medida
profiláctica.
Los mutantes resistentes a INH de M.
tuberculosis, el agente de la enfermedad humana, muestran dos
niveles de resistencia: bajo (de 1 a 10 \mug/ml) y alto (de 10 a
100 \mug/ml). La resistencia a INH a menudo se asocia con una
pérdida de actividad catalasa y virulencia. Recientemente, debido a
la epidemia del SIDA, a la mayor proporción de personas sin hogar y
a las condiciones sociales decrecientes, la tuberculosis ha vuelto
a surgir como un problema importante para la sanidad pública en los
países desarrollados, particularmente en los Estados Unidos.
Actualmente, una característica alarmante de la enfermedad es la
aparición de organismos resistentes a múltiples fármacos y la
rápida transmisión nosocomial a los trabajadores sanitarios y
pacientes infectados con HIV. Esto ha impulsado al CDC a proponer
nuevas recomendaciones para el tratamiento de cepas resistentes
múltiples (al menos a INH y a rifampicina) y la prevención de la
transmisión. Para obtener una nueva percepción del problema de la
resistencia a INH y desarrollar un ensayo rápido de diagnóstico, se
realizó el siguiente estudio.
Claramente, es esencial entender el mecanismo de
resistencia a INH ya rifampicina, los agentes principales contra la
tuberculosis, ya que esto permitirá crear nuevas estrategias
quimioterapéuticas y facilitará el diseño de nuevos compuestos
activos contra las cepas MDR.
La presente invención demuestra que es la enzima
catalasa-peroxidasa, HPI, la que es la diana de INH,
y se sugiere que esta enzima sola media la toxicidad. Se obtuvo una
evidencia convincente de esta conclusión mediante la expresión del
gen katG de M. tuberculosis en un mutante
catalasa-negativo de E. coli, ya que esto
hizo que esta bacteria se volviera sensible a INH. Además, el
aislamiento del gen de la sensibilidad a INH de M.
tuberculosis, katG, es importante, ya que facilitará la
rápida detección de cepas resistentes a INH por medio de
hibridación y procedimientos basados en PCR. La alta frecuencia de
deleciones de katG en cepas clínicas, como se muestra en
este documento, simplificaría este procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó un procedimiento heterólogo para
aislar el(los) gen(es) de M. tuberculosis
implicados en la sensibilidad a INH. BH1 es un mutante espontáneo
de la cepa de M. smegmatis fácilmente transformable
MC^{2}155 (Snapper y col., 1990), que es resistente a 512
\mug/ml de la INH y carece de actividad
catalasa-peroxidasa (Heym y col., 1992). Como
existe una estricta correlación entre la sensibilidad a INH y estas
actividades enzimáticas, la transformación de BH1 con un plásmido
que lleva el gen apropiado de M. tuberculosis debería
producir su restauración y la sensibilidad concomitante a INH.
Por consiguiente, se preparó ADN a partir de un
grupo de cósmidos lanzadera de M. tuberculosis en
Escherichia coli y se introdujo en BH1 mediante
electro-transformación. Después se puntuaron más de
1000 transformantes resistentes a kanamicina con respecto a la
sensibilidad a INH y se obtuvieron cuatro clones que no crecían en
un medio que contenía 32 g/ml de INH, la MIC de la cepa de tipo
silvestre MC^{2}155.
Después de la re-transformación
de BH1, sólo uno de éstos, pBH4, confería de forma consistente el
fenotipo sensible a INH. Las digestiones de restricción con
BamHI, KpnI, NotI, ClaI y HindIII
demostraron que el ADN cromosómico de M. tuberculosis
llevado por pBH4 tenía un tamaño de aproximadamente 30 kb. En la
Fig. 1 se presenta un mapa producido con las últimas tres
enzimas.
Cuando se usó pBH4 como sonda de hibridación
para detectar clones homólogos en la biblioteca, se aislaron ocho
cósmidos lanzadera más. Tras la transformación de BH1, cinco de
éstos (T35, T646, T673, T79 y T556) restauraron la sensibilidad a
INH y demostraron perfiles de restricción similares a los de pBH4.
En particular, en todos los casos estaba presente un fragmento
kpnI de 4,5 kb.
Los intentos de subclonar fragmentos
BamHI individuales no produjeron transformantes capaces de
complementar la lesión en BH1, lo que sugería que en el gen de
interés podría estar presente un sitio BamHI. Por el
contrario, se construyó pBH5, un derivado de pBH4, mediante
deleción de fragmentos EcoRI, y esto demostró que no se
requería un segmento de 7 kb para la restauración de la
sensibilidad a INH.
Los transformantes que llevaban cósmidos
lanzadera que complementaban la mutación resistente a INH de BH1 se
examinaron cuidadosamente y se establecieron las MIC para varios
antibióticos. En todos los casos, la MIC para INH se había reducido
de 512 a 8 \mu/ml, un valor menor que el de la cepa sensible
MC^{2}155 (32 \mug/ml). Este fenotipo hipersensible sugirió que
los clones recombinantes podrían sobreproducir una enzima capaz de
aumentar la toxicidad a INH. Los estudios enzimológicos demostraron
que todos estos transformantes producían aproximadamente 2 veces
más peroxidasa y catalasa que la cepa MC^{2}155 de tipo silvestre,
que es sensible a INH.
Además de a la INH, muchas cepas MDR de M.
tuberculosis ya no son sensibles a rifampicina, estreptomicina,
etambutol y piracinamida. Para examinar la posibilidad de que
pudiera haber una relación entre resistencia a INH y estos
compuestos, se determinaron las MIC de varios fármacos para diversas
cepas de M. smegmatis y sus transformantes pBH4, pero no se
encontraron diferencias.
Se diseñó una sonda oligonucleotídica
tetrapentamérica basándose en las secuencias primarias de regiones
muy conservadas de las enzimas catalasa-peroxidasa,
HPI, de E. coli (Triggs-Raine y col., 1989),
y Bacillus stearothermophilus (Loprasert y col., 1988).
Cuando se trataron manchas de transferencia genómicas del ADN de
M. tuberculosis con esta sonda oligonucleotídica, se
detectaron carriles específicas en la mayoría de los casos. Como
kpnI generó un fragmento único de 4,5 kb que hibridaba
fuertemente, se usó esta enzima para producir una biblioteca de
tamaño seleccionado en pUC19.
Tras la selección con la sonda
oligonucleotídica, se obtuvo un clon apropiado, pYZ55. En la Fig. 1
se presenta un mapa de restricción del ADN del inserto, donde puede
verse que corresponde exactamente a una parte de pBH4. También se
obtuvo una confirmación independiente mediante hibridación
cruzada.
Por medio de diversos experimentos de
subclonación, se descubrió que el fragmento más pequeño que
expresaba la actividad catalasa-peroxidasa de M.
tuberculosis en E. coli era un fragmento
EcoRV-KpnI de 2,5 kb que, como se esperaba, contenía
un sitio de escisión para BamHI. El análisis parcial de la
secuencia de ADN demostró que el gen katG llevado por pYZ56
codifica una enzima catalasa-peroxidasa que es muy
homóloga a las enzimas HPI de E. coli y B.
stearothermophilus:
(Fig. 2; Triggs-Raine y col.,
1988); (Loprasert y col., 1988). Los asteriscos (*) indican
resultados idénticos. La actividad HPI se detectó tanto en E.
coli como en M. smegmatis mediante tinción (véase más
adelante).
Habiendo clonado el gen katG de M.
tuberculosis, fue de un interés inmediato investigar la base
genética de la asociación entre la negatividad a la catalasa y la
resistencia a isoniacida. Se estableció una serie de construcciones
en el vector lanzadera pBAK14 y se usó para transformar el mutante
BH1 de M. smegmatis resistente a INH. Sólo los plásmidos que
llevaban un gen katG completo producían HPI y restauraban la
sensibilidad a INH. El más pequeño de éstos, pBAK14, llevaba un
fragmento EcoRV-kpnI de 2,5 kb, demostrando así que no
estaba implicada la región de 2 kb cadena arriba de katG, y
que la actividad catalasa-peroxidasa sola era
suficiente para hacer a las micobacterias susceptibles a INH.
Los extractos sin células se separaron por
electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante y se
tiñeron para determinar la presencia de la actividad peroxidasa y
catalasa. Bajo estas condiciones, la enzima de M.
tuberculosis dio dos carriles de actividad peroxidasa (carril 1)
que comigraban con la actividad catalasa (Heym y col., 1992).
Cuando se introdujo en E. coli, el gen
katG dirigió la síntesis de las mismas proteínas, mientras
que pYZ56 producía proteínas con un tamaño ligeramente mayor. Esto
se debe a la construcción de una fusión de genes
lacZ::katG en fase. También se realizaron tinciones de
actividad con extractos de células de M. smegmatis. La
presencia del gen katG de M. tuberculosis en BH1
condujo a la producción de la enzima
catalasa-peroxidasa, que presentaba la misma
movilidad electroforética que la enzima obtenida en M.
tuberculosis o en E. coli y la HPI nativa de M.
smegmatis.
\vskip1.000000\baselineskip
Desde hace muchos años se sabe que una subserie
de cepas resistentes a INH, particularmente las resistentes a las
mayores concentraciones del fármaco, son de menor virulencia en el
cobaya y carecen de actividad catalasa. Se preparó un ADN genómico
a partir de varios aislados clínicos de M. tuberculosis y se
analizó mediante transferencia de Southern usando el fragmento
kpnI de 4,5 kb como sonda. En dos cepas muy resistentes,
B1453 y 24, el gen de la catalasa se ha delecionado del cromosoma,
mientras que en otras cepas (Fig. 3), tales como la cepa 12, que
muestra un bajo nivel de resistencia, aún está presente pero no se
expresa. Otros estudios demostraron que la región inmediatamente
anterior a katG era muy propensa a las redisposiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si la enzima HPI de M.
tuberculosis podía conferir sensibilidad a INH a E. coli,
se transformó una serie de mutantes de catalasa con pYZ56 y se
determinaron las MIC. Las cepas de tipo silvestre no eran
susceptibles a INH, pero los mutantes que carecían de ambas
actividades endógenas de catalasa pero llevaban pYZ56, mostraron
una inhibición del crecimiento cuando estaban presentes altos
niveles de INH (500 \mug/ml), mientras que las cepas no
transformadas eran insensibles.
Para los fines de la presente invención, se
depositó un plásmido que contenía el mapa de endonucleasas de
restricción mostrado en la Fig. 1, en la cepa no. 463, con la
National Collection of Cultures of Microorganisms (C.N.C.M.) del
Instituto Pasteur, en Paris, Francia, el 18 de Mayo de 1992, bajo el
no de acceso de colección de cultivos I-1209. Este
plásmido contiene la secuencia de ácido nucleico de la invención,
particularmente, el fragmento KpnI-KpnI de 4,5 kb del
plásmido pYZ56 que tiene el sitio de escisión BamHI en el
fragmento.
En general, la invención caracteriza un
procedimiento para detectar la presencia de Mycobacterium
tuberculosis resistente a isoniacida en una muestra, que
incluye proporcionar al menos una sonda de ADN o ARN capaz de
hibridar selectivamente con el ADN de Mycobacterium
tuberculosis sensible a isoniacida, para formar complejos
detectables comprendiendo dicha sonda una secuencia de ácidos
nucleicos que es un fragmento EcoRV-KpnI de 2,5 Kb
EcoRV-KpnI de plásmido pY256, y donde dicho fragmento
contiene un sitio de escisión de BamHI. La detección se
realiza con una muestra, bajo condiciones que permiten a la sonda
hibridar con el ADN de Mycobacterium tuberculosis sensible a
isoniacida presente en la muestra para formar complejos híbridos, y
detectar los complejos híbridos como una indicación de la presencia
de Mycobacterium tuberculosis sensible a isoniacida en la
muestra. (El término "hibridar selectivamente", como se usa en
este documento, se refiere a una sonda de ADN o ARN que hibrida
sólo con Mycobacterium tuberculosis sensible a isoniacida y
no con Mycobacterium tuberculosis insensible a isoniacida.)
La muestra puede estar compuesta por células de Mycobacterium
tuberculosis, por una porción de las células o por contenidos
celulares enriquecidos en ácidos nucleicos de Mycobacterium
tuberculosis, especialmente ADN. La hibridación puede
realizarse usando reactivos de hibridación convencionales. Aún no
se ha descubierto que las condiciones de hibridación particulares
sean críticas para la invención.
Una sonda preferida de acuerdo con este aspecto
de la invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica un polipéptido de la fórmula Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro
Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ser Lys Lys
Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser Trp Ala Asp Leu Ile Val.
Más particularmente, las secuencias de ADN de
Mycobacterium tuberculosis pueden analizarse mediante
transferencia de Southern e hibridación. Las técnicas usadas para
la presente invención se describen en Maniatis y col. (1989). Los
fragmentos de ADN pueden separarse en geles de agarosa y
desnaturalizarse in situ. Los fragmentos después pueden
transferirse desde el gel a un sólido insoluble en agua, a un
soporte poroso tal como un filtro de nitrocelulosa, a una membrana
de nylon o a un papel de celulosa activado, donde se inmovilizan,
por ejemplo, puede usarse la membrana Hybond® comercializada por
Amersham. Después de la prehibridación para reducir la hibridación
no específica con la sonda, el soporte sólido se hibrida con la
sonda de ácido nucleico de la invención. El soporte sólido se lava
para eliminar la sonda no unida y unida débilmente, y se examina la
molécula híbrida duplex resultante. Un procedimiento alternativo
conveniente es hibridar oligonucleótidos con el ADN desnaturalizado
en el gel.
La cantidad de sonda marcada que está presente
en la solución de hibridación variará ampliamente dependiendo de la
naturaleza del marcador, de la cantidad de sonda marcada que puede
unirse razonablemente al filtro y de la rigurosidad de la
hibridación. Generalmente, se emplearán excesos sustanciales de la
sonda con respecto a la cantidad estequiométrica, para mejorar la
velocidad de unión de la sonda al ADN fijado.
Pueden emplearse diversos grados de rigurosidad
de hibridación. Cuanto más severas son las condiciones, mayor es la
complementariedad que se requiere para la hibridación entre la sonda
y el polinucleótido para la formación del duplex. La severidad
puede controlarse por la temperatura, la concentración de la sonda,
la longitud de la sonda, la fuerza iónica, el tiempo y similares.
Convenientemente, la rigurosidad de la hibridación varía cambiando
la polaridad de la solución de reactivos. Las temperaturas a emplear
pueden determinarse empíricamente o pueden determinarse a partir de
fórmulas bien conocidas creadas para este fin.
A diferencia de la hibridación de Southern,
donde se transfieren fragmentos de ADN desde un gel de agarosa a un
soporte sólido, el procedimiento de la invención también puede
realizarse mediante hibridación de oligonucleótidos en geles de
agarosa secos. En este procedimiento, el gel de agarosa se seca y la
hibridación se realiza in situ usando una sonda
oligonucleotídica de la invención. Este procedimiento se prefiere
cuando pueden ser deseables la velocidad de detección y la
sensibilidad. El procedimiento puede realizarse en geles de agarosa
que contienen ADN genómico o clonado de Mycobacterium
tuberculosis.
Además, el procedimiento de la presente
invención puede realizarse mediante la transferencia del ADN de
Mycobacterium tuberculosis desde geles de poliacrilamida a
filtros de nylon, mediante electrotransferencia. La
electrotransferencia puede ser deseable cuando sea esencial el
tiempo, a causa de que la electrotransferencia es típicamente más
rápida que la transferencia capilar creada para transferir el ADN
desde geles de agarosa. Este procedimiento puede realizarse junto
con la formación de enlaces cruzados con la ayuda de luz UV. El gel
de poliacrilamida que contiene las muestras a ensayar se pone en
contacto con un filtro de nylon preparado de forma apropiada.
Después, se interpone en un aparato de electrotransferencia y el ADN
se transfiere desde el gel al filtro usando una corriente
eléctrica. Después de un aclarado con tampón, el filtro está listo
para prehibridarse e hibridarse o formar enlaces cruzados con luz
UV.
El procedimiento de la invención puede
realizarse usando la sonda de ácido nucleico de la invención para
detectar Mycobacterium tuberculosis resistentes a
isoniacida. La sonda puede detectarse usando técnicas
convencionales.
Los nucleótidos de la invención pueden usarse
como sondas para la detección de una secuencia de nucleótidos en
una muestra biológica de M. tuberculosis. La sonda
polinucleotídica puede marcarse con un átomo o radical inorgánico,
más comúnmente usando un radionúclido, pero también quizás con un
metal pesado. Los marcadores radioactivos incluyen ^{32}P,
^{3}H, ^{14}C o similares. Puede emplearse cualquier marcador
radioactivo que proporcione una señal adecuada y que tenga una vida
media suficiente. Otros marcadores incluyen ligandos que pueden
servir como miembro de unión específico a un anticuerpo marcado,
fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, anticuerpos que pueden
servir como miembro de pares de unión específicos para un ligando
marcado, y similares. La elección del marcador se regirá por el
efecto del marcador sobre la velocidad de hibridación y la unión de
la sonda al ADN o al ARN. Será necesario que el marcador proporcione
suficiente sensibilidad como para detectar la cantidad de ADN o ARN
disponible para la hibridación.
En realizaciones preferidas de la invención, la
sonda se marca con un isótopo radioactivo, por ejemplo, ^{32}P o
^{125}l, que puede incorporarse en la sonda, por ejemplo, mediante
traducción con muesca.
En otras realizaciones preferidas, la sonda se
marca con biotina, que reacciona con avidina a la que se une una
entidad química que, cuando la avidina se une a la biotina, hace al
complejo de ADN híbrido capaz de detectarse, por ejemplo, un
fluoróforo, que hace al complejo de ADN híbrido detectable
fluorométricamente; un compuesto denso a los electrones capaz de
hacer a los complejos híbridos de ADN detectables por un microscopio
electrónico; un anticuerpo capaz de hacer a los complejos híbridos
de ADN detectables inmunológicamente; o uno de un par de
catalizador/sustrato, capaz de hacer a los complejos de ADN híbridos
detectables enzimáticamente. Antes de poner en contacto las
bacterias con la sonda, las bacterias M. tuberculosis pueden
lisarse para liberar su ADN, que después se desnaturaliza y se
inmoviliza sobre un soporte de unión de ADN sólido apropiado, tal
como una membrana de nitrocelulosa.
Otro procedimiento de detección, que no requiere
la tinción de la sonda, es la denominada técnica de hibridación en
sándwich. En este ensayo, una sonda no marcada, contenida en un
vector de una sola cadena, hibrida con el ADN de Mycobacterium
tuberculosis sensible a isoniacida, y un vector de una sola
cadena, marcado, que no contiene la sonda, hibrida con el vector
que contiene la sonda, marcándose de esta forma el complejo híbrido
entero.
Las secuencias de la invención se obtuvieron por
secuenciación de nucleótidos por el procedimiento didesoxi. Las
secuencias de las bases de los nucleótidos se escriben en la
dirección 5'- - - - - ->3'. Cada
una de las letras mostradas es una denominación convencional para
los siguientes nucleótidos:
- A
- Adenina
- G
- Guanina
- T
- Timina
- C
- Citosina.
Los nucleótidos de la invención pueden
prepararse mediante la formación de enlaces
3'- - - - - ->5' fosfato entre las
unidades de nucleósido usando técnicas de síntesis química
convencionales. Por ejemplo, pueden emplearse las técnicas de
fosfodiéster, fosfotriéster y fosfito triéster bien conocidas, así
como modificaciones conocidas de estos procedimientos. Pueden
prepararse desoxirribonucleótidos con máquinas de síntesis
automáticas, tales como las basadas en el procedimiento de
fosforamidita. También pueden obtenerse oligo- y
polirribonucleótidos con la ayuda de una ARN ligasa, usando técnicas
convencionales.
Los nucleótidos de la invención están en forma
purificada. Por ejemplo, los nucleótidos carecen de proteínas
derivadas de sangre humana, proteínas de suero humano, proteínas
víricas, secuencias de nucleótidos que codifican estas proteínas,
tejidos humanos y componentes de tejidos humanos. Además, se
prefiere que los nucleótidos carezcan de otros ácidos nucleicos,
proteínas extrañas y lípidos, y microorganismos adventicios, tales
como bacterias y virus.
Como puede ser posible aumentar la sensibilidad
de la detección mediante el uso de ARN en lugar de ADN cromosómico
como molde original, la presente invención contempla el uso de
secuencias de ARN que son complementarias a las secuencias de ADN
descritas en este documento. El ARN puede convertirse en ADN
complementario con la transcriptasa inversa y después someterse a
una amplificación del ADN.
La Tabla 1 indica las propiedades de las cepas
bacterianas y plásmidos usados en la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca genómica de M. tuberculosis
H37 RV se construyó en el cósmido lanzadera pYUB18 (Snapper y col.,
1988) y se suministró amablemente por el Dr. W. R. Jacobs. Otros
vectores lanzadera empleados fueron pYUB12 (Snapper y col., 1988) y
pBAK14 (Zhang y col., 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden encontrarse detalles de los antibióticos
usados, las condiciones de crecimiento, la enzimología y las
determinaciones de las MIC en Heym y col., (1992).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron protocolos convencionales para la
subclonación, transferencia de Southern, secuenciación de ADN,
biosíntesis de oligonucleótidos, etc. (Maniatis y col., 1989;
Eiglmeier y col., 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descrito la preparación de extractos sin
células de E. coli y micobacterias (Heym y col., 1992; Zhang
y col., 1991). Se separaron muestras de proteínas nativas por
electroforesis en gel de poliacrilamida como se describe por
Laemmli (1970), con la excepción de que se omitió el SDS de todos
los tampones, las muestras no se hirvieron y no se incluyó
beta-mercaptoetanol en el tampón de muestra. Después
de la electroforesis de 50-100 \mug de muestras
de proteínas sobre geles de poliacrilamida al 7,5%, se detectó la
actividad catalasa sumergiendo el gel en H_{2}O_{2} 3 mM
durante 20 minutos con agitación suave. Se añadió un volumen igual
de cloruro férrico al 2% y ferricianuro potásico al 2% y se
revelaron carriles claras de actividad catalasa por iluminación con
luz. La actividad peroxidasa se detectó como carriles de color pardo
después de sumergir los geles en una solución que contenía de 0,2 a
0,5 mg/ml de diaminobencidina y H_{2}O_{2} 1,5 mM durante
30-120 minutos.
Para generar un compuesto muy tóxico, parece más
probable que la enzima HPI de M. tuberculosis active
peroxidativamente INH (Youatt, 1969; Gayathri-Devi
y col., 1975). Ahora que se ha aislado y caracterizado el gen
katG, sería posible obtener nuevos derivados de INH que
pudieran activarse de una manera similar.
\newpage
(Comparativo)
En un estudio reciente se ha demostrado que la
catalasa-peroxidasa de Mycobacterium
tuberculosis, codificada por el gen katG, está implicada
en la mediación de la toxicidad del potente fármaco contra la
tuberculosis isoniacida o INH. Los mutantes resistentes a niveles
clínicos de INH muestran una actividad
catalasa-peroxidasa reducida y, en algunos casos,
esto resulta de la deleción del gen katG del cromosoma.
La transformación de cepas resistentes a INH de
Mycobacterium smegmatis y M. tuberculosis con el gen
katG clonado produce la restauración de la sensibilidad del
fármaco. La expresión de katG en algunas cepas de
Escherichia coli hace a este organismo naturalmente
resistente, susceptible a altas concentraciones de INH.
Como algunos aislados clínicos resistentes a INH
de M. tuberculosis han retenido un gen katG intacto,
se investigó sobre la base molecular de su resistencia. Este
estudio se facilitó por la disponibilidad de la secuencia de
nucleótidos de un fragmento KpnI de 4,7 kb de la región
katG del cromosoma, ya que esto permitía diseñar cebadores
adecuados para el análisis por PCR. Se sintetizaron once pares de
cebadores oligonucleotídicos (véase la Tabla 2) y se usaron para
generar productos de PCR, de aproximadamente 280 pb, que cubrían el
gen katG completo y algunas de las secuencias flanqueantes.
En los experimentos de control, los once pares de cebadores
generaron productos de PCR del tamaño esperado, muy adecuados para
el análisis por SSCP, de forma que se examinó un panel de 36 cepas
resistentes a INH de M. tuberculosis, de origen alemán o
francés. Muchas de estas cepas son resistentes a múltiples fármacos
y se aislaron de pacientes que eran
HlV-seropositivos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Dos de ellos no dieron fragmentos de PCR con
ninguno de los cebadores usados, lo que indica que katG se
había delecionado. Las 34 cepas restantes produjeron los productos
de PCR esperados y se analizaron sobre geles de SSCP de forma que
pudieran detectarse las posibles mutaciones puntuales. En 20 casos,
se observó una movilidad anormal de las cadenas, en comparación con
la de katG de M. tuberculosis sensible a fármacos,
sugiriendo que efectivamente se habían producido acontecimientos
mutacionales. Las localizaciones aproximadas de las mutaciones,
como se delimitan por los cebadores de PCR, se muestran en la Tabla
3.
\newpage
Tras el examen de un segmento de 200 pb del gen
katG de cinco cepas independientes (9188, 9106, 9441, 9444 y
9363), se observó una sola diferencia de bases. Ésta fue la misma en
todos los casos, una transversión de G a T en la posición 3360,
dando como resultado la sustitución de Arg-461 por
Leu. Así pues, además de la inactivación de katG, la
resistencia a INH puede proceder de estas mutaciones sin sentido que
producen una catalasa peroxidasa alterada. La presente mutación
puede definir un sitio de interacción entre el fármaco y la enzima.
Los resultados de los estudios de la secuencia de ADN con los demás
mutantes se esperan con impaciencia.
Otra conclusión que puede extraerse de este
estudio se refiere a la base molecular de la resistencia a múltiples
fármacos asociada con diversas cepas de M. tuberculosis. Se
encuentran las mismas mutaciones independientemente de si un
paciente dado es seropositivo o seronegativo para HIV. Por ejemplo,
la cepa 9291, aislada de un paciente con tuberculosis
HIV-seropositivo, lleva mutaciones que confieren
resistencia a INH, rifampicina y estreptomicina en los genes
katG (R461L), rpoB (S425L) y rpsL (K42R),
respectivamente. Se han encontrado, por separado o en combinación,
las mismas mutaciones en cepas de individuos
HIV-seronegativos. Esto significa que para la serie
de cepas estudiadas, no hay un mecanismo nuevo y sencillo que
confiera resistencia a varios fármacos, sino que, en su lugar, la
resistencia a múltiples fármacos se produce por la acumulación de
mutaciones en los genes para dianas de fármacos distintas.
Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de
crecimiento. En este estudio, se usaron las siguientes cepas
bacterianas de las colecciones de laboratorio de los presentes
solicitantes: M. tuberculosis H37Rv; M. smegmatis
MC^{2}155 (Snapper y col., 1990); E. coli
K-12 UM2 (katE katG; Mulvey y col.,
1988). Los plásmidos recombinantes, pYZ55 (pUC19,
katG^{+}), pYZ56 (pUC19, lacZ'::katG) y los
clones lanzadera, pBH4 (pYUB18, katG^{+}) y
pBAK-KK-(pBAK14, katG^{+}) se han descrito
recientemente (Zhang y col.. 1992, Nature) y el locus
katG de M. tuberculosis se esquematiza en la Fig. 5.
Se desarrollaron micobacterias a 37ºC en medio Middlebrook 7H9,
mientras que se cultivaban cepas de E. coli en caldo L, con
enriquecimientos y antibióticos apropiados.
Técnicas de ácidos nucleicos. Se
emplearon técnicas convencionales para la preparación, tinción e
hibridación de ADN (Eiglmeier y col. 1991; Zhang y col. 1992,
Infect. Immun.; Zhang y col. 1992; Nature). Se preparó
una biblioteca de perdigonada de fragmentos aleatorios de pYZ55 en
M13mp18 como se ha descrito previamente (Garnier y col., 1986) y se
secuenció usando la técnica didesoxi modificada (Biggin y col.,
1983). Se reunieron las secuencias y se ensamblaron en fragmento
contiguos usando SAP, y se analizaron con NIP, SIP y PIP (Staden
1987) en una estación de trabajo Vax 3100. El cierre del hueco se
obtuvo usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos,
sintetizados en un aparato ABI 381, y la ADN polimerasa de T7
(Pharmacia) para obtener secuencias directamente de pYZ55. Para
buscar las secuencias relacionadas en la base de datos GenBank
(acceso 73.1), se usaron los programas FASTA (Pearson y col., 1988)
y BLAST (Altschul y col., 1990). Se seleccionó el catálogo PROSITE
(Bairoch 1992) para detectar los posibles motivos presentes en las
secuencias de proteínas y se realizaron alineaciones con los
módulos PILEUP y PRETTY del paquete de análisis de secuencias GCG
(Devereux y col., 1984).
Transferencia de Western y tinción de la
actividad catalasa-peroxidasa. La
inmunotransferencia de polipéptidos resueltos por electroforesis en
gel de SDS-poliacrilamida y la detección con
anticuerpos policlonales (adquiridos de DAKO) activados contra
bovis BCG, se realizaron como se ha descrito (Zhang y col.,
1992, Infec. Immun., Nature, Mol. Microbiol.). Recientemente
se han indicado procedimientos para detectar las actividades
catalasa y peroxidasa (Heym y col. 1992; Zhang y col. 1992,
Nature).
\vskip1.000000\baselineskip
En estudios anteriores, el gen katG
completo se clonó independientemente en E. coli en un cósmido
lanzadera, pBH4, y en un fragmento de restricción KpnI de
4,5 kb, produciendo así pYZ55 (Fig 5; Zhang y col. 1992,
Nature). El gen estructural para la
catalasa-peroxidasa posteriormente se localizó en un
fragmento EcoRV - KpnI de 2,5 kb mediante
subclonación. Para deducir la estructura primaria de esta enzima
importante y, por lo tanto, obtener alguna información sobre su
supuesto papel en la conversión de INH en un potente derivado contra
la tuberculosis, se determinó la secuencia de nucleótidos del
inserto completo de pYZ55. Esto se consiguió mediante el
procedimiento de clonación didesoxi-a ciegas
modificado (Biggin y col. 1993) y los huecos entre los fragmentos
contiguos se cerraron usando cebadores específicos.
Tras la inspección de la secuencia resultante
que se muestra en la Fig 6A, se observó que el fragmento de 4,5 kb
contenía 4795 nucleótidos con un contenido global de dG+dC del
64,4%. Cuando se analizó con respecto a la presencia de fases de
lectura abiertas con valores de alta probabilidad de codificación,
se detectó un solo candidato y, por su tamaño, composición y
localización, éste se identificó como katG. La ausencia de
cualquier otra fase de lectura abierta en cualquier cadena del
fragmento KpnI, excluyó la posibilidad de que estuvieran
implicados otros genes distintos de katG en la capacidad de
conferir susceptibilidad a INH.
Otro análisis de la secuencia demostró que
katG estaba precedido por dos copias de una repetición
directa de 700 pb, que tenían una identidad del 68%, comprendiendo
el fragmento de identidad más largo 58 pb (Fig. 6B). Cuando se
seleccionaron las bases de datos con esta secuencia, no se
detectaron homologías significativas. Para ensayar la posibilidad
de que esto pudiera corresponder a un nuevo elemento repetitivo en
M. tuberculosis, se usó una sonda de 336 pb que abarcaba la
repetición de 58 pb, para sondear una biblioteca de cósmidos
ordenada parcialmente. Sólo se obtuvieron señales de hibridación
positivas a partir de clones que se sabía que llevaban katG.
Análogamente, se detectó un solo fragmento de restricción en
transferencias de Southern del ADN de M. tuberculosis
digerido con las enzimas de restricción BamHI, KpnI y
RsrII, indicando de esta forma que esta secuencia repetitiva
no está
dispersada.
dispersada.
Localización cromosómica de katG .
Como parte del proyecto genoma de M. tuberculosis, la mayoría
de los genes para los que se dispone de sondas se han situado en el
mapa contiguo. A partir de la serie de cósmidos solapantes mostrada
en la Fig. 5, puede verse que los marcadores unidos a katG
son LL105 y fdpB, que codifica un antígeno anónimo y la
supuesta proteína de unión a fibronectina, o el antígeno alfa
(Matsuo y col., 1988), respectivamente. Ninguna de las secuencias
de inserción conocidas IS6110 e IS1081 (Collins y col., 1991; McAdam
y col., 1990; Thierry y col., 1990; J. Clin. Microbiol.;
Thierry y col., 1990, Nucleic Acids Res.), se encuentra en
este área del cromosoma, aunque la región cadena arriba de
katG está densamente poblada con copias de la repetición en
tándem polimórfica principal, MPTR (Hermans y col., 1992; Zhang y
Young, 1993).
Presencia de homólogos de katG en
otras micobacterias. INH es exquisitamente potente contra
miembros del complejo de la tuberculosis, aunque muestra poca
actividad, si muestra alguna, contra otras micobacterias. Para
determinar si estaban presentes genes homólogos a katG en
otras micobacterias, se hibridaron manchas de transferencia de
Southern de ADN digerido con RsrII con una sonda preparada a
partir de un fragmento de restricción EcoRV-KpnI de
2,5 kb que llevaba katG de M. tuberculosis. Bajo
condiciones muy rigurosas se obtuvieron buenas señales de M.
leprae y M. avium (Fig. 7), mientras que se observó una
hibridación apenas discernible con M. gordonae y M.
szulgai. Recientemente se ha demostrado que los homólogos de
katG también están presentes en M. smegmatis y M.
aurum (Heym y col., 1992).
Propiedades previstas de la
catalasa-peroxidasa de M. tuberculosis .
La estructura primaria de la catalasa-peroxidasa,
deducida a partir de la secuencia de nucleótidos de katG, se
muestra en la Fig. 6. Se prevé que la enzima contenga 735
aminoácidos y tenga un peso molecular de 80.029 daltons. Se ha
observado una proteína de este tamaño en M. tuberculosis y en
M. smegmatis recombinante y E. coli. (véase más
adelante).
Se pueden adquirir estructuras primarias para
varias catalasas-peroxidasas bacterianas distintas
incluyendo las de E. coli, Salmonella typhimurium y
Bacillus stearothermophilus (Loewen y col., 1990; Loprasert y
col., 1988; Triggs-Raine y col., 1988) y se ha
demostrado que éstas están relacionadas distantemente con la
peroxidasa de citocromo c de levaduras (Welinder 1991). Como
se ha determinado la estructura cristalina de esta última (Finzel y
col., 1984), esto puede usarse para interpretar las secuencias de
las enzimas bacterianas. La enzima de M. tuberculosis
muestra una conservación del 53,3% con las enzimas HPI
enterobacterianas, y comparte una identidad del 45,7% con la
proteína de B. stearothermophilus. En la Fig. 8, se muestra
una alineación de las secuencias de estas cuatro enzimas, junto con
la de la peroxidasa de citrocromo c de levaduras (Welinder,
1991). Es evidente que el extremo NH_{2} terminal, que no tiene
homólogo en la enzima de levadura, es la parte más divergente, lo
que sugiere que este dominio de la proteína puede tolerar una
desviación amplia y no se requiere para la catálisis. La
confirmación experimental para esta interpretación se proporciona en
forma de una proteína de fusión LacZ-KatG
que contiene 40 restos aminoácidos más (Fig. 9, carril 6; Zhang y
col., 1992, Nature). La adición de este segmento NH_{2}
terminal no interfiere notablemente con las reacciones de la
catalasa o peroxidasa efectuadas por katG a juzgar por la
tinción de la actividad (Zhang y col., 1992, Nature).
Se cree que las
catalasas-peroxidasas bacterianas se han producido
por medio de una duplicación génica y constan de dos módulos,
mostrando ambos una homología con la enzima de levadura, fusionada a
una sola secuencia NH_{2} terminal de aproximadamente 50
aminoácidos (Welinder, 1991). La enzima de M. tuberculosis
cumple este modelo y cuando se buscó la homología interna usando
SIP (Staden, 1987), fue evidente que la región entre los restos
55-422 estaba relacionada con el dominio carboxi
terminal, que constaba de los aminoácidos 423-735.
Sólo se encontró uno de los dos motivos de los sitios activos
típicos de las peroxidasas, presentes en el catálogo PROSITE
(Bairoch, 1992) cuando se seleccionó la estructura primaria de la catalasa-peroxidasa de M. tuberculosis, ya que hay dos desviaciones del consenso alrededor de la His^{269} donde debería estar el segundo motivo. (Modelo consenso para la peroxidasa 1:[DET]-[LIVMT]-x(2)-[LIVM]-[LIVMSTAG]-[SAG]-[LIVMSTAG]-H-[STA]-[LIVMFY]; modelo consenso para la peroxidasa 2: [SGAT]-x(3)-[LIVMA]-R-[LIVMA]-x-[FW]-H-x-[SAC]; (Bairoch, 1992). Además, se detectó un posible motivo de unión de ATP (G-x-x-x-x-G-K-T) (Bairoch, 1992), pero como éste solapa parcialmente el sitio activo, su presencia puede ser puramente fortuita (Fig. 8).
(Bairoch, 1992) cuando se seleccionó la estructura primaria de la catalasa-peroxidasa de M. tuberculosis, ya que hay dos desviaciones del consenso alrededor de la His^{269} donde debería estar el segundo motivo. (Modelo consenso para la peroxidasa 1:[DET]-[LIVMT]-x(2)-[LIVM]-[LIVMSTAG]-[SAG]-[LIVMSTAG]-H-[STA]-[LIVMFY]; modelo consenso para la peroxidasa 2: [SGAT]-x(3)-[LIVMA]-R-[LIVMA]-x-[FW]-H-x-[SAC]; (Bairoch, 1992). Además, se detectó un posible motivo de unión de ATP (G-x-x-x-x-G-K-T) (Bairoch, 1992), pero como éste solapa parcialmente el sitio activo, su presencia puede ser puramente fortuita (Fig. 8).
Por analogía con la peroxidasa del citocromo
c de levaduras (Welinder 1991), fue posible predecir varios
restos estructural y catalíticamente importantes que están
localizados en la repetición NH_{2} terminal. La His^{269}
serviría como quinto ligando del hierro del grupo hemo, mientras que
el Asp^{380} podría ser su compañero de enlaces de hidrógeno.
Otros restos que según se predijo estaban implicados en la
modulación del sitio activo y en la unión a H_{2}O_{2} son
Arg^{104}, Trp^{107}, His^{108}, Asn^{138}, Thr^{274} e
His^{275} (Fig. 4). De acuerdo con las predicciones de Welinder
(Welinder, 1991), el Trp^{320} sería un resto clave y sería
necesario para la formación del sitio
proteína-radical (Sivaraja y col., 1989).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Respuesta de anticuerpos contra KatG
de M. tuberculosis . Para evaluar el posible valor de
KatG como inmunógeno, se sondearon transferencias de Western
con antisuero activado contra BCG de M. Bovis en conejos.
Como se muestra en la Fig. 9, la
catalasa-peroxidasa de 80 kD es uno de los antígenos
prominentes reconocidos en extractos sin células de M.
tuberculosis y M. smegmatis que expresan el gen
katG clonado (carriles 1 y 3). Análogamente, tras la
introducción del gen en E. coli, se produjeron niveles
significativos de catalasa-peroxidasa, obteniéndose
un aumento notable en la expresión por la fusión génica
LacZ'-katG que dirigía la síntesis de una proteína de
fusión de 85 kD (Fig. 9, carril 6).
El objeto del presente estudio fue determinar la
secuencia de nucleótidos del gen katG y usar la información
obtenida para intentar y entender cómo media su producto la
susceptibilidad a INH de M. tuberculosis y, posiblemente,
explicar la inestabilidad aparente de la región katG del
genoma. El ADN repetitivo a menudo es una fuente de redisposiciones
cromosómicas, y el análisis de la secuencia de ADN cadena arriba de
katG reveló dos copias de una repetición directa de 700 pb.
Como este elemento parece estar limitado a este sitio, es poco
probable que sirva como diana para un acontecimiento, tal como la
recombinación homóloga, que conduciría a la deleción del gen que se
observa tan frecuentemente (Zhang y col., 1992, Nature, Zhang y
Young, 1993). Análogamente, como un tramo de 70 kb del cromosoma de
M. tuberculosis H37Rv, que incluye katG, carece de
copias de IS6110 e IS1081, estas secuencias de inserción no parecen
fuentes probables de inestabilidad. En su lugar, la presencia de un
grupo de repeticiones en tándem polimórficas principales, MPTR, (Fig
5; Hermans y col., 1992) situadas cadena arriba de katG,
sugiere que éstas podrían actuar como puntos calientes de
recombinación. Puede eliminar tanto el conjunto MPTR como
katG (Zhang y Young, 1993). La disponibilidad de la secuencia
de la región katG permitirá diseñar cebadores adecuados para
la región en cadena con polimerasa y, por lo tanto, facilitar los
estudios dirigidos a la detección rápida de la resistencia a INH y
la comprensión de la base molecular de la inestabilidad
cromosómica.
Quizás, la característica más intrigante de la
peroxidasa-catalasa de M. tuberculosis es su
capacidad de mediar la susceptibilidad a INH. En la presente
hipótesis de trabajo, el fármaco interacciona con la enzima y se
convierte por la actividad peroxidasa en un derivado tóxico que
actúa en un segundo sitio, aún desconocido, (Zhang y col. 1992,
Nature). Aunque la peroxidasa de rábano picante puede
realizar esta reacción (Parson y col. 1988; Shoeb y col. 1985) y
producir radicales libres hidroxilo y orgánicos, muy pocas
bacterias, incluyendo otras micobacterias, son sensibles a INH.
Esto es intrigante, ya que contienen genes homólogos a katG
(Fig. 7).
Se podría proporcionar una explicación de esto
por el hecho de que la mayoría de las bacterias contienen dos
catalasas, una de las cuales es una enzima de amplio espectro dotada
de actividad peroxidasa, y que la segunda catalasa, eliminando
preferentemente H_{2}O_{2}, limita la capacidad de la
catalasa-peroxidasa de oxidar INH. Como M.
tuberculosis carece de esta última actividad, su enzima
KatG puede convertir INH en la forma letal sin competición
por el aceptor de electrones.
Alternativamente, puede haber algunas
características únicas de la enzima de M. tuberculosis que
promueven la toxicidad o favorecen la interacción con el fármaco.
El examen de las estructuras primarias de las
catalasas-peroxidasas bacterianas no era
instructivo a este respecto, ya que todas ellas comparten
identidades de secuencia extensivas y contienen dos motivos
característicos de los sitios activos de las peroxidasas. Además,
recientemente se ha demostrado que la expresión del gen katG
de E. coli puede restaurar parcialmente la susceptibilidad a
INH a los mutantes resistentes a fármacos de M.
tuberculosis, lo que sugiere que la enzima endógena puede no
poseer ninguna propiedad específica para el fármaco (Zhang y col.
1993). La comparación de la secuencia con la peroxidasa del
citocromo c de levadura ha proporcionado una importante
información acerca de la organización estructural y funcional de la
proteína KatG, y condujo a la identificación de los restos
catalíticos supuestamente importantes (Fig. 8).
Ahora que se dispone de la secuencia completa de
katG, será posible ensayar algunas de estas hipótesis
mediante mutagénesis de localización dirigida y sobreproducir la
enzima de forma que pueda realizarse in vitro el análisis
detallado de la reacción enzimática y sus productos. Análogamente,
sería un objetivo relativamente sencillo aislar mutantes que
hubieran retenido la actividad enzimática pero que no pueden unirse
u oxidar INH. Es de un particular interés la estructura repetitiva
de la enzima y la predicción de que la repetición
NH_{2}-terminal contiene el sitio activo para las
peroxidasas. Esto proporciona la posibilidad de que puedan aparecer
genes katG mutados o truncados en el extremo 3'. Es
concebible que sus productos, que carecen del extremo COOH normal
que puede ser necesario para las interacciones
subunidad-subunidad (Welinder 1991), sean
inestables, pero aún retengan una baja actividad enzimática. Así
pues, conferirían un nivel intermedio de susceptibilidad a INH
entre la de las cepas katG+ y los mutantes que carecen
completamente del gen, como se observa a menudo en establecimientos
clínicos.
La invención también se refiere a un equipo para
detectar variantes resistentes a múltiples fármacos de M.
tuberculosis, donde el equipo comprende:
(a) un medio recipiente que contiene una sonda
para el gen que codifica resistencia al fármaco; y
(b) un medio recipiente que contiene una
preparación de control de ácido nucleico.
Un procedimiento alternativo preferido
(oligotipificación) para la detección de resistencia al antibiótico
seleccionado comprende:
- fragmentar el gen correspondiente o una parte
del mismo que es probable que lleve la mutación en una pluralidad
de fragmentos, tal como mediante digestión de dicho gen
correspondiente con enzimas de restricción seleccionadas,
\global\parskip1.000000\baselineskip
- hibridar esos fragmentos con sondas
oligonucleotídicas complementarias, preferiblemente una serie de
sondas marcadas que reconocen, bajo condiciones rigurosas, todas
las partes del gen correspondiente de un ADN de control
correspondiente de una cepa no resistente al antibiótico
correspondiente,
- y relacionar la ausencia de hibridación de al
menos una de dichas sondas oligonucleotídicas con cualquiera de los
fragmentos de ADN del gen correspondiente de la micobacteria bajo
estudio, como se demuestra por la presencia de una mutación y,
posiblemente, de una resistencia al antibiótico correspondiente,
particularmente en comparación con los resultados obtenidos tras
realizar el ensayo bajo las mismas condiciones con los mismos
oligonucleótidos sobre
el(los) gen(es) correspondiente(s) obtenido(s) de una cepa(cepas) no resistente(s) a dicho antibiótico, donde dicho gen correspondiente es el gen rpoB o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia mostrada en la Figura 13, o el gen rpsL o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia de Mycobacterium tuberculosis mostrada en la Figura 14.
el(los) gen(es) correspondiente(s) obtenido(s) de una cepa(cepas) no resistente(s) a dicho antibiótico, donde dicho gen correspondiente es el gen rpoB o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia mostrada en la Figura 13, o el gen rpsL o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia de Mycobacterium tuberculosis mostrada en la Figura 14.
Otro procedimiento alternativo (análisis SSCP,
es decir, análisis de Polimorfismos de Conformación de Una sola
Cadena) comprende:
- digerir el ADN a analizar, particularmente del
gen correspondiente,
- amplificar los fragmentos obtenidos, por
ejemplo, por PCR,
- recuperar los fragmentos amplificados, y
- separarlos entre sí de acuerdo con los
tamaños, por ejemplo, haciéndoles migrar, por ejemplo, en un gel
electroforético,
- comparar los tamaños de los diferentes
fragmentos con los obtenidos a partir de ADN de una o varias cepas
de control no resistentes al antibiótico, que se han sometido a un
ensayo similar, y
- relacionar el polimorfismo posiblemente
detectado con la existencia de una mutación en el gen
correspondiente, de acuerdo con una posible resistencia al
correspondiente antibiótico de la cepa de la que se ha obtenido el
ADN bajo estudio; donde dicho gen correspondiente es el gen
rpoB o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo que
es capaz de hibridar con la secuencia mostrada en la Figura 13, o el
gen rpsL o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo
que es capaz de hibridar con la secuencia de M. tuberculosis
mostrada en la Figura 14.
No es necesario decir que puede recurrirse a
cualquier otro procedimiento, incluyendo las técnicas clásicas de
secuenciación, para conseguir el mismo propósito.
Este procedimiento incluye el conocido bajo la
expresión "oligotipificación" para la detección de
polimorfismos, ventajosamente se hace referencia al procedimiento
descrito por Orita y col. (ya se hizo referencia al mismo
anteriormente) para la detección de polimorfismos basados en la
conformación de cadenas sencillas.
En el caso de resistencia a rifampicina, el gen
correspondiente será el gen rpoB, que codifica la subunidad
\beta de las ARN polimerasas de dichas micobacterias, o cuando se
usa sólo parte de ese gen, preferiblemente se usa la parte que
incluye los codones 400 a 450 de ese gen rpoB.
Finalmente, en el caso de resistencia a
estreptomicina, el gen correspondiente contemplado es el gen
rpsL, que codifica la proteína S12 de la subunidad pequeña
del ribosoma o, cuando sólo se usa parte de dicho fragmento,
preferiblemente se usa la parte que incluye el codón en la posición
43.
Más adelante se describe un procedimiento
preferido, particularmente en relación con el procedimiento
alternativo que hace uso de la amplificación de PCR.
El ADN se obtiene a partir de una muestra
biológica (por ejemplo, sangre o esputos) después de la eliminación
de los desechos celulares y la lisis de las células bacterianas con
un tampón de lisis apropiado. La amplificación por PCR puede
realizarse por procedimientos clásicos, usando un par de cebadores
cuyas secuencias son respectivamente complementarias a fragmentos
de cada una de las cadenas de ADN a amplificar.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden emplearse en un procedimiento de amplificación de
ADN conocido como reacción en cadena con polimerasa (PCR). Véase,
por ejemplo, Kwok y col. (1987). La PCR es ventajosa a causa de que
esta técnica es rápida.
Pueden prepararse pares de cebadores de ADN de
secuencia conocida, colocados a una distancia de
10-300 pares de bases, que son complementarios a
las cadenas más y menos del ADN a amplificar, por técnicas bien
conocidas para la síntesis de oligonucleótidos. Un extremo de cada
cebador puede prolongarse y modificarse para crear sitios de
endonucleasas de restricción cuando el cebador se temple con el ADN
de PBMC. La mezcla de reacción de PCR puede contener el ADN de
PBMC, los pares de cebadores de ADN, cuatro desoxirribonucleósido
trifosfatos, MgCl_{2}, ADN polimerasa y tampones convencionales.
El ADN puede amplificarse por varios ciclos. Generalmente, es
posible aumentar la sensibilidad de la detección mediante el uso de
una multiplicidad de ciclos, constando cada ciclo de un corto
período de desnaturalización del ADN de PBMC a una temperatura
elevada, enfriando la mezcla de reacción y realizando una
polimerización con la ADN polimerasa.
Las secuencias amplificadas pueden detectarse
mediante el uso de una técnica denominada restricción de oligómeros
(OR). Puede usarse un análisis de polimorfismo de conformación de
una sola cadena (SSCP) para detectar polimorfismos de ADN y
mutaciones puntuales en una diversidad de posiciones en fragmentos
de ADN. Véase, Saiki y col. (1985); Orita y col. (1989). Por
ejemplo, después de la amplificación, una porción de la mezcla de
reacción de PCR puede separarse y someterse a hibridación con una
sonda nucleotídica marcada terminalmente, tal como una sonda de
marcada terminalmente con ^{32}P-adenosina
trifosfato. En la OR, una sonda oligonucleotídica marcada
terminalmente hibrida en solución con una región de la secuencia
amplificada y, en el proceso, reconstituye un sitio específico de
endonucleasas.
El procedimiento puede realizarse adicionalmente
como se indica a continuación:
- los productos de amplificación (que
comprenden, por ejemplo, de 100 a 300 nucleótidos) se digieren por
medio de una endonucleasa de restricción adecuada,
- las cadenas de ADN obtenidas del medio de
amplificación se someten a desnaturalización,
- las cadenas de ADN de una sola cadena se
depositan en un gel de poliacrilamida al 5%,
- las cadenas de ADN de una sola cadena se hacen
migrar sobre dicho gel por medio de electroforesis,
- los fragmentos de ADN que migran en el gel de
poliacrilamida se transfieren sobre una membrana de nylon de
acuerdo con una técnica de transferencia electroforética habitual y
se hibridan con sondas marcadas, por ejemplo, sondas marcadas con
^{32}P, y
- las distancias de migración de los fragmentos
de ADN sometidos a análisis se comparan con los obtenidos a partir
de controles obtenidos bajo las mismas condiciones de amplificación,
digestión, desnaturalización, electroforesis y transferencia sobre
una membrana de nylon, con lo que dicho ADN se ha obtenido a partir
de una cepa bacteriana idéntica aún sensible al antibiótico bajo
estudio.
Para la producción de los cebadores de PCR así
como de las sondas oligonucleotídicas usadas en los procedimientos
de "oligotipificación" descritos anteriormente, ventajosamente
se hace uso de las complementarias al gen rpoB de M.
tuberculosis silvestre insertado en un plásmido depositado bajo
el número I-12167 en la CNCM el 15 de Septiembre de
1992.
La invención también se refiere, más
particularmente, a la secuencia nucleotídica de un fragmento del gen
rpsL de Mycobacterium tuberculosis que codifica la
proteína S12 de la subunidad ribosómica pequeña, así como a la
secuencia de nucleótidos de un fragmento del gen rpsL mutado
considerado responsable de la resistencia a estreptomicina.
Mediante amplificación se esa secuencia
nucleotídica, puede obtenerse la secuencia de nucleótidos del gen
rpsL completo.
En la siguiente descripción de ejemplos
adicionales, se proporcionará una ilustración adicional de la
invención, con respecto a los dibujos en los que:
- la figura 10 representa diagramáticamente la
estrategia de PCR usada para el estudio de diferentes aislados de
M. leprae, que muestra la secuencia codificante de la
secuencia rpoB, con lo que las regiones secuenciadas se
muestran por partes sombreadas, estando indicadas la posición y la
referencia de los cebadores de amplificación en la línea superior,
mientras que los cebadores de secuenciación están indicados
debajo;
- la figura 11 representa (A) la secuencia
nucleotídica de una región corta de rpoB que lleva las
mutaciones que confieren resistencia a rifampicina con una
indicación de los cambios de bases en los correspondientes alelos y
(B) una comparación entre las secuencias de aminoácidos del dominio
I de la región II de la subunidad \beta de la ARN polimerasa de
E. coli y M. leprae, con lo que se han indicado los
números de los restos y las diferencias en los aminoácidos mutados;
habiéndose representado también los restos aminoácidos mutados
asociados con la resistencia a rifampicina así como la frecuencia de
sus apariciones;
- la figura 12 muestra una secuencia completa
del gen rpoB de M. leprae;
- la figura 13 representa la secuencia de parte
del gen rpoB de M. tuberculosis;
- la figura 14 representa la secuencia de una
parte del gen rpsL de M. tuberculosis; tanto la
secuencia del gen rpsL completa de M. leprae como la
de su producto de expresión, que es la proteína S12 (cuyo aminoácido
inicial se indica por 1). Las posiciones de los cebadores ML51 y
ML52, así como de las secuencias de parte del gen rpsL de
M. tuberculosis se proporcionan debajo de las de M.
leprae. Sólo se indican las posiciones que son diferentes y los
correspondientes cambios de aminoácidos.
- la figura 15 representa la secuencia de ADN
silvestre del fragmento del gen rpsL que codifica la proteína
S12 de la subunidad ribosómica pequeña que es responsable de la
resistencia a estreptomicina, así como la correspondiente secuencia
de aminoácidos de la proteína S12.
\vskip1.000000\baselineskip
La sensibilidad a rifampicina se ha determinado
en ratones como se describe por Grosset y col (e Int. J. Lepr.
57:607-614). Las células de M. leprae
se obtuvieron a partir de patas de ratón de acuerdo con
procedimientos clásicos. Todas las cepas resistentes pudieron
crecer en ratones que recibieron dosis diarias de 20 mg/kg de
rifampicina, mientras que las cepas sensibles se destruyeron a bajas
concentraciones de rifampicina, menores de 2 mg/kg.
Se iniciaron regiones correspondientes del gen
rpoB del ADN extraído usando dos pares de cebadores
biotinilados, cuyas secuencias aparecen en la siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tras el uso de técnicas convencionales, se
obtuvieron respectivamente productos de amplificación que
comprendían 310 y 710 pb como se muestra en la figura 1. La
localización de las secuencias de los diferentes cebadores usados
en la tabla también se indica en la figura 10.
Los ADN obtenidos se han secuenciado basándose
en la secuencia de rpoB de aislados sensibles a rifampicina.
Un plásmido que contiene la secuencia de ese gen se ha depositado en
la CNCM el 15 de Septiembre de 1992, bajo el número
I-1266. Los productos de PCR biotinilados se
concentraron a partir de las mezclas de reacción de PCR poniéndolos
en contacto con perlas recubiertas con estreptavidina bajo
agitación. Las cadenas biotiniladas unidas a las perlas después se
recuperaron y se secuenciaron. Las secuencias obtenidas se
compararon con la secuencia del gen rpoB de una cepa de tipo
silvestre. Se obtuvieron resultados significativos como resultado
de la secuenciación del gen silvestre (de una micobacteria sensible
a rifampicina) y de las correspondientes secuencias de la subunidad
\beta de cuatro cepas mutantes resistentes a rifampicina (figura
11).
Se obtuvieron resultados a partir de 102 cadenas
obtenidas de pacientes infectados con M. tuberculosis. Entre
estas 102 cepas, 53 fueron sensibles a rifampicina y 49 resistentes
a rifampicina. La mutación se localizó en la región
400-450 en 43 de los mutantes y, entre estos
últimos, la mutación apareció en la región de ^{425}Ser en
Leu.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de capas de M. tuberculosis y
el ensayo de su sensibilidad a estreptomicina se han realizado por
el procedimiento de las proporciones en un medio
Lowenstein-lerva (Laboratory Method for Clinical
Mycobacteriology - Hugo David - Véronique Lévy Frébault, M.F.
Thorel, publicado por el Instituto Pasteur).
\newpage
La secuencia de nucleótidos del gen rpsL
de M. leprae condujo, por analogía de secuencia, a la
construcción de dos cebadores, ML51 (CCCACCATTCAGCAGCTGGT) y ML52
(GTCGAGCGAACCGCGAATGA) que rodean ciertas regiones incluyendo los
supuestos sitios de mutación que podrían ser responsables de la
resistencia a la estreptomicina y adecuados para la reacción de
PCR. El ADN de M. tuberculosis usado como matriz a permitido
obtener un fragmento de rpsL de 306 pb. La secuencia de
nucleótidos de los fragmentos secuenciados presentó 28 diferencias
con la de
M. leprae.
M. leprae.
Se amplificaron los genes rpsL de 43
cepas de M. tuberculosis, de las cuales 28 eran resistentes,
tanto por PCR como por la técnica de SSCP.
El ADN se extrajo a partir de alícuotas de 200
\mul de muestras de M. tuberculosis (en un promedio de
10^{4} a 10^{5} bacterias) cubiertas por 100 \mul de aceite
mineral por una técnica de
congelación-descongelación (Woods y Cole, 1989
FEBS. Mlcrobiol. Lett, 65: 305-308).
Después de la electroforesis de las cadenas de
ADN ensayadas, se mostró una mutación en 16 de los mutantes. Para
establecer la naturaleza de la mutación en las 16 cadenas bajo
consideración, se amplificaron los correspondientes fragmentos del
gen rpsL por PCR usando los cebadores ML51 y ML52 y se
determinaron sus respectivas secuencias de nucleótidos.
Las secuencias obtenidas se compararon con la
secuencia del gen rpsL de tipo silvestre. La única diferencia
se encontró con la secuencia silvestre; el codón 43, AAG, se mutó a
AGG y, por consiguiente, el aminoácido lys-42 se
reemplazó por Arg.
La invención además se refiere a equipos para la
resistencia de micobacterias a isoniacida, rifampicina o análogos
de la misma, y estreptomicina.
La invención además se refiere a un equipo para
el diagnóstico in vitro de la resistencia de una bacteria
del género Mycobacterium a isoniacida, caracterizado porque
comprende:
- medios para realizar una amplificación génica
del ADN del gen katG o de un fragmento del mismo, gen o
fragmento del mismo que es capaz de hibridar con un fragmento
EcoRV-KpnI de 2,5 kb del plásmido pYZ56,
- medios para hacer evidente una o varias
mutaciones en los productos de amplificación así obtenidos,
- una preparación del ADN de control de un gen
katG de una cepa de dicha bacteria sensible a isoniacida o
de un fragmento de la misma, y
- opcionalmente, una preparación de control de
un ADN del gen katG de una cepa de micobacteria resistente a
isoniacida.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención además se refiere a un equipo para
el diagnóstico in vitro de la resistencia de una bacteria
del género mycobacterium a rifampicina o sus análogos, caracterizado
porque comprende:
- medios para realizar una amplificación génica
del ADN del gen rpoB o de la subunidad \beta de la ARN
polimerasa de dicha micobacteria, o de un fragmento del mismo, gen
o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia
mostrada en la figura 13,
- medios para hacer evidente una o varias
mutaciones en los productos de amplificación así obtenidos,
- una preparación de ADN de control de un gen
rpoB que codifica la subunidad \beta de la ARN polimerasa
de una cepa de dicha bacteria sensible a rifampicina o de un
fragmento de la misma, y
- opcionalmente, una preparación de control de
un ADN del gen rpoB de una cepa de micobacteria resistente a
isoniacida.
\vskip1.000000\baselineskip
Análogamente, la invención se refiere a un
equipo para los diagnósticos in vitro de la resistencia de
M. tuberculosis a estreptomicina, caracterizado porque
incluye:
- medios para realizar una amplificación génica
del gen rpsL que codifica la proteína S12 de la subunidad
ribosómica pequeña o un fragmento del mismo, gen o fragmento del
mismo que es capaz de hibridar con la secuencia de Mycobacterium
tuberculosis mostrada en la figura 14,
- medios que permiten hacer evidente una o
varias mutaciones en los productos de amplificación obtenidos,
- una preparación de control de una secuencia de
ADN del gen rpsL que codifica la proteína S12 de la subunidad
pequeña del ribosoma de una cepa de M. tuberculosis sensible
a estreptomicina, y
- opcionalmente, una preparación de control de
una secuencia de ADN de un gen rpsL que codifica la proteína
S12 de la subunidad pequeña del ribosoma de una cepa de M.
tuberculosis resistente a estreptomicina.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención además se refiere a una secuencia
de ácidos nucleicos que comprende un fragmento
EcoRV-KpnI de 2,5 kb del plásmido pYZ56 o una
secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con dicho
fragmento.
La invención además se refiere a una secuencia
de ácido nucleico que comprende un fragmento KpnI de 4,5 kb
del plásmido pYZ55, donde dicho fragmento contiene un sitio de
escisión BamHI.
La invención se refiere además a una secuencia
de nucleótidos que es la secuencia de 3447 bases como se describe
en la figura 12, o una parte de la misma, siendo dicha porción:
- -
- la secuencia ilustrada en la figura 11A;
- -
- el fragmento de 710 pares de bases obtenible por amplificación de la secuencia ilustrada en la figura 12 con los cebadores CAGGACGTCGAGGCGATCAC y AACGACGACGTGGCCAGCGT;
- -
- la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 1195 hasta el 1293 en la figura 12, que codifica la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 11B.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere además a una secuencia
de nucleótidos que es la secuencia de 432 bases como se describe en
la figura 13, o una parte de la misma, siendo dicha porción:
- -
- una secuencia que incluye los codones 400-450 del gen rpoB;
- -
- la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 169 hasta el 267 en la figura 13, que codifica la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 11B.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere al uso de una
secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de cualquiera
de las reivindicaciones 21 a 28, para la detección de resistencia a
antibióticos en micobacterias.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (29)
1. Un procedimiento para la detección de la
resistencia a un antibiótico en una micobacteria, que comprende
detectar una mutación en un gen seleccionado entre el grupo
compuesto por
el gen rpoB o un fragmento del mismo, gen
o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia
mostrada en la Figura 13, y
el gen rpSL o un fragmento del mismo, gen
o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia de
Mycobacterium tuberculosis mostrada en la Figura 14.
2. Un procedimiento para detectar in
vitro la presencia de ácidos nucleicos de Mycobacterium
tuberculosis resistente a isoniacida, donde el procedimiento
comprende las etapas de:
- poner en contacto dichos ácidos nucleicos, que
previamente se han hecho accesibles a una sonda, si es necesario,
bajo condiciones que permitan la hibridación; y
- detectar cualquier sonda que haya hibridado
con dichos ácidos nucleicos;
donde dicha sonda comprende una secuencia de
ácido nucleico, que es un fragmento EcoRV-KpnI de 2,5
kb del plásmido pYZ56, y donde dicho fragmento contiene un sitio de
escisión BamHI, donde una Mycobacterium tuberculosis
resistente a isoniacida no contiene DNA que hibride con este
fragmento.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, que comprende las etapas de:
(A) depositar y fijar ácidos nucleicos de
Mycobacterium tuberculosis en un soporte sólido, para hacer
los ácidos nucleicos accesibles a una sonda;
(B) poner en contacto dichos ácidos nucleicos
fijados de la etapa (A) con la sonda, como se define en la
reivindicación 2, bajo condiciones que permiten la hibridación;
(C) lavar dicho filtro resultante de la etapa
(B), para eliminar cualquier sonda no hibridada; y después
(D) detectar cualquier sonda hibridada sobre
dicho filtro lavado resultante de la etapa (C).
4. El procedimiento de la reivindicación 2 ó 3,
en la que dicha sonda comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido de la fórmula Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro
Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ser Lys Lys
Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser Trp Ala Asp Leu Ile Val.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 4, en la que la sonda tiene un marcador
seleccionado entre el grupo compuesto por marcadores radioactivos,
enzimáticos, fluorescentes y luminiscentes.
6. El uso del procedimiento de una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 5, para la detección de la presencia de
Mycobacterium tuberculosis resistentes a isoniacida en una
muestra que contiene bacterias de la que se sospecha que contiene
Mycobacterium tuberculosis resistente a isoniacida.
7. El uso de la reivindicación 6, en la que
antes de poner en contacto de dicho ADN con dicha sonda, dicha
bacteria se ha separado de dicha muestra y se ha inmovilizado sobre
un soporte de unión a ADN, que es una membrana de nitrocelulosa.
8. Una sonda de ácido nucleico para detectar
Mycobacterium tuberculosis resistente a isoniacida, donde
dicha sonda consta de un fragmento EcoRV-KpnI de 2,5
kb del plásmido pYZ56, donde dicho fragmento contiene un sitio de
escisión BamHI, o de una parte de dicho fragmento que
codifica un polipéptido de la fórmula APLNSWPDNASLD
KARRLLWPSKKKYGKKLSWADLIV.
KARRLLWPSKKKYGKKLSWADLIV.
9. Una molécula híbrida duplex que consta
esencialmente de la sonda de la reivindicación 8 unida por medio de
enlaces de hidrógeno a una secuencia de nucleótidos con una
secuencia de bases complementaria.
10. Un procedimiento para seleccionar una
secuencia de nucleótidos de Mycobacterium tuberculosis
resistente a isoniacida de entre un grupo de secuencias de
nucleótidos, que comprende la etapa de determinar cuál de dichas
secuencias de nucleótidos hibrida con una sonda de acuerdo con la
reivindicación 8 ó 9.
11. El procedimiento de la reivindicación 1 para
la detección de resistencia al antibiótico seleccionado, que
comprende:
- fragmentar el gen correspondiente o una parte
del mismo que es probable que lleve la mutación en una pluralidad
de fragmentos,
- hibridar estos fragmentos con una serie de
sondas oligonucleotídicas marcadas que reconocen bajo condiciones
rigurosas, todas las partes del gen correspondiente de un ADN de
control correspondiente de una cepa no resistente al antibiótico
correspondiente,
- y relacionar la ausencia de hibridación de al
menos una de dichas sondas oligonucleotídicas con cualquiera de los
fragmentos de ADN del gen correspondiente de la micobacteria bajo
estudio, como evidencia de la presencia de una mutación y,
posiblemente, de resistencia al correspondiente antibiótico, en
particular en comparación con los resultados obtenidos tras la
realización del ensayo bajo las mismas condiciones con los mismos
oligonucleótidos sobre el(los) gen(es)
correspondiente(s) obtenido(s) de una cepa/cepas no
resistente(s) a dicho antibiótico, donde dicho gen
correspondiente es el rpoB o un fragmento del mismo, gen o
fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia
mostrada en la Figura 13, o el gen rpSL o un fragmento del
mismo, gen o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la
secuencia de Mycobacterium tuberculosis mostrada en la Figura
14.
12. El procedimiento de la reivindicación 11 que
comprende la fragmentación mediante digestión de dicho gen
correspondiente con enzimas de restricción seleccionadas.
13. El procedimiento de la reivindicación 1 que
comprende:
- digerir el ADN a analizar,
- amplificar los fragmentos obtenidos,
- recuperar los fragmentos amplificados, y
- separarlos entre sí según los tamaños
haciéndoles migrar,
- comparar los tamaños de los diferentes
fragmentos con los obtenidos a partir del ADN/de los ADN de una o
varias cepas de control no resistentes al antibiótico, que se han
sometido a un ensayo similar, y
- relacionar el polimorfismo posiblemente
detectado con la existencia de una mutación en el gen
correspondiente, de acuerdo con una posible resistencia al
antibiótico correspondiente de la cepa de la que se había obtenido
el ADN bajo estudio, donde dicho gen correspondiente es el gen
rpoB o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo que
es capaz de hibridar con la secuencia mostrada en la Figura 13, o el
gen rpSL o un fragmento del mismo, gen o fragmento del mismo
que es capaz de hibridar con la secuencia de Mycobacterium
tuberculosis mostrada en la
Figura 14.
Figura 14.
14. El procedimiento de la reivindicación 13 que
comprende:
- amplificar los fragmentos por PCR, y
- separar los fragmentos amplificados entre sí
haciéndoles migrar sobre un gel electroforético.
15. Un equipo para el diagnóstico in
vitro de la resistencia de una bacteria del género mycobacterium
a isoniacida, caracterizado porque comprende:
- medios para realizar una amplificación génica
del ADN del gen katG o de un fragmento del mismo, gen o
fragmento del mismo que es capaz de hibridar con un fragmento
EcoRV-KpnI de 2,5 kb del plásmido pYZ56,
- medios para hacer evidente una o varias
mutaciones en los productos de amplificación así obtenidos, y
- una preparación de ADN de control de un gen
katG de una cepa de dicha bacteria sensible a isoniacida o de
un fragmento del mismo.
16. Un equipo de acuerdo con la reivindicación
15, caracterizado porque además comprende una preparación de
control de un ADN del gen katG de una cepa de micobacterias
resistente a isoniacida.
17. Un equipo para el diagnóstico in
vitro de la resistencia de una bacteria del género mycobacterium
a rifampicina o sus análogos, caracterizado porque
comprende:
- medios para realizar una amplificación génica
del ADN del gen rpoB o de la subunidad \beta de la ARN
polimerasa de dicha micobacteria, o de un fragmento del mismo, gen
o fragmento del mismo que es capaz de hibridar con la secuencia
mostrada en la Figura 13,
- medios para hacer evidente una o varias
mutaciones en los productos de amplificación así obtenidos, y
- una preparación de ADN de control de un gen
rpoB que codifica la subunidad \beta de la ARN polimerasa
de una cepa de dicha bacteria sensible a rifampicina o de un
fragmento del mismo.
18. Un equipo de acuerdo con la reivindicación
17, caracterizado porque además comprende una preparación de
control de un ADN del gen rpoB de una cepa de mycobacterium
resistente a isoniacida.
19. Un equipo para los diagnósticos in
vitro de la resistencia de M. tuberculosis a
estreptomicina, caracterizado porque incluye:
- medios para realizar una amplificación génica
del gen rpsL que codifica la proteína S12 de la subunidad
ribosómica pequeña, o un fragmento del mismo, gen o fragmento del
mismo que es capaz de hibridar con la secuencia de Mycobacterium
tuberculosis mostrada en la Figura 14,
- medios que permiten hacer evidente una o
varias mutaciones sobre los productos de amplificación obtenidos,
y
- una preparación de control de una secuencia de
ADN del gen rpsL que codifica la proteína S12 de la subunidad
pequeña del ribosoma de una cepa de M. tuberculosis sensible
a estreptomicina.
20. Un equipo de acuerdo con la reivindicación
19, caracterizado porque incluye una preparación de control
de una secuencia de ADN de un gen rpsL que codifica la
proteína S12 de la subunidad pequeña del ribosoma de una cepa de
M. tuberculosis resistente a estreptomicina.
21. Una secuencia de nucleótidos que es la
secuencia de 263 bases como se describe en la Figura 15.
22. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la reivindicación 21, que comprende una mutación del codón 43, AAG,
que se muta a AGG.
23. Una secuencia de nucleótidos que es la
secuencia de 3447 bases como se describe en la figura 12, o una
porción de la misma, siendo dicha porción:
- -
- la secuencia ilustrada en la figura 11A;
- -
- el fragmento de 710 pares de bases obtenible por amplificación de la secuencia ilustrada en la figura 12 con los cebadores CAGGACGTCGAGGCGATCAC y AACGACGACGTGGGCAGCGT;
- -
- la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 1195 hasta el 1293 en la figura 12, que codifica la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 11B.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Una secuencia de nucleótidos que es la
secuencia de 432 bases como se describe en la Figura 13 o una
porción de la misma, siendo dicha porción:
- -
- una secuencia que incluye los codones 400-450 del gen rpoB;
- -
- la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 169 hasta el 267 en la figura 13, que codifica la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 11B.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
las reivindicaciones 23 ó 24, que comprende una mutación localizada
en la región 400-450.
26. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la reivindicación 25, que comprende una mutación del codón 425.
27. Secuencia de ácido nucleico que comprende un
fragmento EcoRV-KpnI de 2,5 kb del plásmido pYZ56.
28. Secuencia de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 27, que comprende un fragmento KpnI de 4,5
kb del plásmido pYZ55, donde dicho fragmento contiene un sitio de
escisión BamHI.
29. Uso de una secuencia de ácido nucleico que
comprende la secuencia de cualquiera de las reivindicaciones 21 a
28 para la detección de resistencia a antibióticos en
micobacterias.
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