WO2010001924A1 - 結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片 - Google Patents

結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片 Download PDF

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切替　照雄
弘樹 安藤
寿紀 末竹
中村　友彦
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ニプロ株式会社
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    • G01N2800/44—Multiple drug resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method and a test piece for detecting sensitivity to isoniazid in Mycobacterium tuberculosis.
  • tuberculosis is basically a medical therapy centered on chemotherapy, and surgical therapy is considered when it is impossible to achieve the purpose of treatment with medical therapy.
  • drugs for treating tuberculosis used in medical therapy many kinds of drugs such as isoniazid (INH), rifampicin (RFP), streptomycin (SM), ethambutol (EB), pyrazinamide (PZA) and the like are known.
  • IH isoniazid
  • RFP rifampicin
  • SM streptomycin
  • EB ethambutol
  • PZA pyrazinamide
  • a drug is administered to a patient, there is a problem that a resistant bacterium that has acquired resistance to the administered drug is generated due to the mutation.
  • the currently developed DNA microarray kit “Oligo® Array” (Nisshinbo Co., Ltd.) is a kit that can detect gene mutations involved in resistance to 5 drugs of INH, RFP, SM, kanamycin (KM), and EB. .
  • Isoniazid is the most representative drug in the treatment of tuberculosis.
  • Many of the INH resistant bacteria have mutations in the katG gene or the inhA gene.
  • Various methods for detecting these mutations have been studied (for example, Patent Documents 2 and 3).
  • Patent Documents 2 and 3 about 80% of INH-resistant bacteria are detected as resistant bacteria because of known mutations in the katG gene or inhA gene, but the remaining about 20% of INH-resistant bacteria cannot be detected. Therefore, INH is also administered to tuberculosis patients who have such undetectable INH-resistant bacteria.
  • JP 2001-103981 A Japanese Patent No. 3579049 Japanese National Patent Publication No. 9-501823
  • An object of the present invention is to provide a new means for more reliably detecting the INH sensitivity of M. tuberculosis, that is, whether or not M. tuberculosis is an INH-resistant bacterium.
  • the present inventors have newly found that the fabG1 gene is also an isoniazid-susceptible gene, and that the fabG1 gene has a mutation, and that this mutation can make a tuberculosis bacterium into an INH-resistant bacterium.
  • the present invention provides a method for detecting isoniazid susceptibility in Mycobacterium tuberculosis, the method comprising: A step of obtaining a FabG1 gene of Mycobacterium tuberculosis in a specimen, and a step of detecting a mutation involved in isoniazid resistance in the obtained fabG1 gene.
  • the mutation is a mutation from base G to A or T at position 609 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a complementary sequence thereof.
  • the present invention also provides a test strip for detecting sensitivity to isoniazid in Mycobacterium tuberculosis, wherein the test strip has at least one probe immobilized thereon.
  • the at least one probe consists of an oligonucleotide capable of hybridizing with a region of a base sequence having a mutation in the FabG1 gene of Mycobacterium tuberculosis, or the mutation in a region of the base sequence having a mutation in the FabG1 gene of Mycobacterium tuberculosis It consists of an oligonucleotide that cannot hybridize with a region of a base sequence having, but can hybridize with a region of a wild type base sequence corresponding to the region.
  • the mutation in the fabG1 gene is a mutation from base G at position 609 to A or T in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a complementary sequence thereof.
  • the oligonucleotide capable of hybridizing with the wild-type base sequence region comprises the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or a complementary sequence thereof.
  • the test piece further comprises an oligonucleotide that can hybridize with a region of a base sequence having a mutation of the furA gene of Mycobacterium tuberculosis, or of a base sequence having a mutation of the furA gene of Mycobacterium tuberculosis.
  • a probe composed of an oligonucleotide that cannot hybridize with the region of the base sequence having the mutation but can hybridize with a region composed of the wild-type base sequence corresponding to the region of the furA gene is fixed. .
  • the mutation of the furA gene is a mutation from base C to T at position 41 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, or a complementary sequence thereof.
  • the oligonucleotide capable of hybridizing with the region of the wild type base sequence of the furA gene consists of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or a complementary sequence thereof.
  • the present invention also provides a kit for detecting isoniazid sensitivity in Mycobacterium tuberculosis, comprising any of the above test pieces.
  • the present invention further provides a method for detecting isoniazid sensitivity in Mycobacterium tuberculosis, the method comprising: Obtaining a FabG1 gene of Mycobacterium tuberculosis in a specimen; The step of bringing the obtained fabG1 gene into contact with any one of the above test pieces to bind to the probe fixed to the test piece, and the step of developing the color of the fabG1 gene bound to the probe.
  • the method comprises Obtaining a furA gene of Mycobacterium tuberculosis in the sample, The method further includes the step of bringing the obtained furA gene into contact with any one of the above test pieces to bind to the probe fixed to the test piece, and the step of causing the furA gene bound to the probe to develop color.
  • INH-resistant bacteria that have not been identified as INH-resistant bacteria can be accurately identified as INH-resistant bacteria. Therefore, by combining with a method for detecting a mutation in the existing katG gene or inhA gene, about 90% of INH-resistant bacteria can be identified as INH-resistant bacteria. Thus, INH sensitivity can be detected more reliably. As a result, an appropriate treatment can be provided for tuberculosis patients carrying isoniazid-resistant tuberculosis bacteria.
  • the isoniazid (INH) susceptibility gene of Mycobacterium tuberculosis refers to a gene related to the action of the drug for treating tuberculosis isoniazid (INH).
  • INH resistant bacterium a mutation occurs in this wild type INH susceptibility gene, and drug resistance to the action of INH is acquired.
  • substitution, insertion and / or deletion occurs in the constituent amino acid sequence, resulting in a decrease in enzyme activity and a structural change in the drug binding site. The effect of is suppressed.
  • INH resistance of Mycobacterium tuberculosis can be caused by mutation of various genes related to the action of INH such as katG gene and inhA gene. Such mutations are disclosed in, for example, Patent Documents 1 to 3. Any one of these mutations can be an INH-resistant tuberculosis bacterium.
  • the fabG1 gene has a mutation, and it has been newly found that this mutation can make tuberculosis bacteria become INH resistant bacteria.
  • the fabG1 gene is the first gene of the fabG1-inhA operon and encodes mycolic acid synthase (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the mutation of the fabG1 gene is a mutation from base G to A or T at position 609 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a base C to T or A mutation in its complementary sequence. is there.
  • these mutations are collectively expressed as “mutation from base G at position 609 to A or T, or a mutation of its complementary sequence”.
  • This mutation is a silent mutation of leucine (Leu) at position 203 of FabG1 (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) encoded by the fabG1 gene.
  • tubercle bacilli can become INH-resistant bacteria also by mutation of the furA gene.
  • the above-mentioned katG gene encoding catalase-peroxidase constitutes the furA-katG operon starting with furA, and there is a report that the furA gene is a negative transcriptional gene of this operon (Non-patent Document 4).
  • the furA gene regulates katG expression and is therefore involved in INH resistance.
  • the function of the furA gene is only confirmed by deleting the entire furA gene, and there is no description of mutations in the furA gene.
  • examples of the mutation of the furA gene include a mutation from base C to T at position 41 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing and a base G to A mutation in its complementary sequence.
  • these mutations are collectively expressed as “mutation from base C to T at position 41 of the base sequence, or mutation of its complementary sequence”.
  • alanine (Ala) at position 14 of FurA (SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) encoded by the furA gene is mutated to valine (Val).
  • Methods for detecting the above mutations on the fabG1 gene and the furA gene include Nollau et al., Clin. Chem., 43, 1114-1120 (1997), “Laboratory protocol for mutation detection” (Landegren, U. et al. , Oxford University Press (1996)), and “PCR” 2nd edition (Newton et al., BIOS Scientific Publishers Limited (1997)) can be used.
  • PCR fragment sequencing method single-stranded conformation polymorphism method (SSCP method: Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • PCR-sequence-specific oligonucleotide probes can be used.
  • a probe that is completely complementary to one allele sequence of about 10 to about 30 bases including a mutation site is prepared, DNA containing the mutation site is amplified by the PCR method, and then hybridization is performed. This is a method for discriminating gene polymorphism based on the presence of hybridization.
  • an oligonucleotide probe that can bind (hybridize) to a region having a mutation in the FabG1 gene of Mycobacterium tuberculosis (hereinafter referred to as “fabG1 mutant probe”)
  • fabG1 mutant probe an oligonucleotide that cannot hybridize with the region of the base sequence having the mutation but can hybridize with the region consisting of the wild-type base sequence corresponding to the region
  • a probe hereinafter sometimes referred to as “fabG1 wild-type probe”.
  • an oligonucleotide probe that can bind (hybridize) to a region having a mutation in the furA gene of Mycobacterium tuberculosis (hereinafter sometimes referred to as “furA mutation probe”), and a region having a mutation in this furA gene
  • furA mutation probe an oligonucleotide probe that cannot hybridize to a region having a base sequence having a mutation, but can hybridize to a region consisting of a wild-type base sequence corresponding to the region (hereinafter referred to as “furA wild-type probe”) ).
  • each probe depends on the temperature at the time of binding (hybridization), but is generally 10 to 30 nucleotides, preferably 12 to 26 nucleotides.
  • the mutation probe is capable of binding (hybridizing) to a region having the above mutations of the furA gene or the fabG1 gene.
  • the base sequence other than the mutation is a wild type. If this region is wild type, the mutant probe cannot bind to this region.
  • the wild-type probe can bind (hybridize) to any region corresponding to the region having the mutation in the wild-type furA gene or the fabG1 gene.
  • Each of the above probes can be obtained using standard programs and primer analysis software such as Primer Express (Perkin Elmer) and can be synthesized using standard methods such as automated oligonucleotide synthesizers. .
  • each probe may be modified at either the 5 'or 3' end, for example, in order to fix it to the test piece.
  • Each probe may be provided in any form as long as detection is possible, may be in the form of a solution, or may be fixed to a carrier. In order to facilitate detection, it is preferably fixed to a test piece.
  • At least one probe is fixed to the test piece for detecting isoniazid sensitivity in Mycobacterium tuberculosis according to the present invention.
  • At least one probe immobilized is the fabG1 mutant probe or the fabG1 wild type probe. More preferably, the fabG1 mutant probe and the fabG1 wild-type probe are immobilized at different positions on the test strip.
  • the fabG1 gene has a mutation, the fabG1 gene binds to the fabG1 mutant probe but does not bind to the furA wild type probe.
  • there is no mutation it binds to the fabG1 wild type probe. Therefore, in the case of INH sensitivity, it binds only to the fabG1 wild type probe, and in the case of INH resistance, it binds to the fabG1 mutant probe without binding to the fabG1 wild type probe.
  • control or marker for confirming color development may be fixed to the test piece of the present invention.
  • the test piece for detecting sensitivity to isoniazid in Mycobacterium tuberculosis is the furA mutant probe or the furA wild type probe. It is preferable that the furA mutant probe and the furA wild type probe are immobilized at different positions on the test piece.
  • the furA gene has a mutation, the furA gene binds to the furA mutant probe but does not bind to the furA wild type probe.
  • the furA wild type probe when there is no mutation, it binds to the furA wild type probe. Therefore, in the case of INH sensitivity, it binds only to the furA wild type probe, and in the case of INH resistance, it binds to the furA mutant probe without binding to the furA wild type probe.
  • a known probe capable of detecting INH sensitivity or INH resistance other than the fabG1 gene and the furA gene may be immobilized on the test piece of the present invention.
  • the test piece of the present invention can be prepared by physically or chemically fixing the probe on the surface of the carrier.
  • the carrier include organic materials such as vinyl polymer, nylon, polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, and nitrocellulose; inorganic materials such as glass and silica; metal materials such as gold and silver, and the like.
  • An organic material is preferable in terms of easy molding processability, and polyesters such as polyethylene terephthalate are more preferable.
  • These carriers are preferably white in order to make the color development easily visible in the detection by the color development method.
  • the probes are arranged on the carrier at regular intervals for each type.
  • various known methods are used. For example, there is a method of coating the carrier surface with a polycationic polymer such as polylysine. According to this method, the efficiency of immobilization can be increased by electrostatic interaction with a probe that is a polyanion.
  • an irrelevant base sequence such as a polythymine chain
  • various probes can be immobilized relatively easily by discharging a solution containing a polythymine-added oligonucleotide probe from a dispenser onto a nitrocellulose membrane and irradiating with ultraviolet rays.
  • each probe is placed in a dispenser equipped with a 24-gauge needle, and is applied at a coating speed of 2.5 to 8.5 mm / sec while discharging an amount of 0.5 to 1.0 ⁇ L / min.
  • each probe When applied on the nitrocellulose membrane at regular intervals, each probe is applied as a stripe having a width of about 1 to 2 mm arranged at regular intervals.
  • the probe is fixed on the carrier by irradiating the carrier coated with the stripe of the probe with ultraviolet rays. Furthermore, if necessary, if a thin cut is made so as to cross these stripes, a large number of test pieces in which the probes are arranged in sequence can be obtained at a time.
  • the carrier surface is a metal material such as gold
  • the surface of the carrier is treated with a thiol having an amino group such as 2-aminoethanethiol or a disulfide compound, thereby causing electrostatic interaction with the probe that is a polyanion. It is also known that the efficiency of immobilization is improved.
  • a method for chemically immobilizing a probe by introducing a functional group various known methods are used.
  • the carrier material is an inorganic material such as glass or silicon
  • a functional group capable of silane coupling reaction such as trimethoxysilyl group or triethoxysilyl group.
  • the test piece is obtained by immersing the carrier in a solution containing the probe modified in this manner for 24 to 48 hours, removing it, and washing it.
  • an inorganic material carrier such as glass or silicon
  • a silane coupling agent having an amino group such as aminoethoxysilane
  • the surface of the carrier is aminated, and then a probe having an carboxylic acid introduced at the terminal and an aminocup
  • the carrier material is a metal material such as gold or silver
  • the end of the probe is modified with a functional group capable of binding to a metal such as a thiol group or a disulfide group, and the carrier is added to a solution containing the modified probe. It can be fixed by immersing for ⁇ 48 hours, taking out and then washing.
  • the “specimen” may generally be a specimen necessary for the tubercle bacillus test.
  • bodily fluids such as sputum, throat swab, gastric fluid, bronchoalveolar lavage fluid, intratracheal aspirate, throat wipes and / or tissue biopsy, and cultures obtained from these cultures It is done.
  • Sample pretreatment Extraction of DNA from the specimen can be performed by a known method. Examples thereof include a phenol extraction method, a guanidine thiocinate extraction method, and a vanadyl ribonucleoside complex extraction method.
  • a target gene is obtained from the obtained DNA.
  • a target gene is amplified by the PCR method, for example, it is carried out in the following steps: (1) Heat treatment of double-stranded genomic DNA under a reaction condition of about 92 to 95 ° C. for about 30 seconds to 1 minute Step of denaturation to make a double strand; (2) PCR reaction is started by binding at least two kinds of amplification primers to each of the single-stranded DNA at about 50 to 65 ° C. for about 20 seconds to 1 minute. An annealing step for producing a double-stranded portion to be a point; (3) a strand extension step in which a DNA polymerase is reacted at about 70 to 75 ° C. under reaction conditions for about 20 seconds to 5 minutes; and (1) to (3 Step) is repeated 20 to 40 times by a conventional method.
  • a sequence upstream from the sequence site containing the mutation site and a sequence downstream from the site so that the fabG1 gene containing the mutation site can be amplified.
  • oligonucleotides having the same or complementary base sequence examples include oligonucleotides having SEQ ID NO: 6 (ggctacatcg acaccgatat gacc) and SEQ ID NO: 7 (gcgtccttgt gttgtgtcag tgg) in the sequence listing or an oligonucleotide having a complementary sequence thereof.
  • a primer pair used to amplify the furA gene by PCR a sequence upstream from the sequence site containing the mutation site and a sequence downstream from the site so that the furA gene containing the mutation site can be amplified.
  • oligonucleotides having the same or complementary base sequence examples include the oligonucleotides of SEQ ID NO: 13 (gccatcccac gatccagcgg) and SEQ ID NO: 14 (gtcgggcagc gcaaaacgca c) of the sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof.
  • the nucleic acid may be further amplified by the Nested PCR method (Japanese Patent Publication No. 6-81600) before the PCR reaction.
  • a primer in the Nested PCR method a sequence outside the primer used in the PCR reaction can be selected.
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 (gtcgaaggca aacgtgaccg cg) and SEQ ID NO: 5 (gtccagcagt cctgtcatgt g) in the sequence listing or an oligonucleotide having a complementary sequence thereof can be mentioned.
  • the above probe and primer sequences can be obtained using standard programs and primer analysis software such as Primer Express (Perkin Elmer) and synthesized using standard methods such as automated oligonucleotide synthesizers. can do.
  • the INH sensitivity of Mycobacterium tuberculosis can be detected by the PCR-SSOP method. More simply, the detection can be performed by comparing the position of the fixed probe with the position of the spot detected by the PCR-SSOP method. For example, when using a test strip to which the above probe is immobilized, hybridization in the PCR-SSOP method is preferably performed at a temperature of about 60 to 65 ° C. in that nonspecific binding reaction is unlikely to occur. If the position of the detected spot is the position of the fabG1 wild-type probe, M.
  • tuberculosis has no mutation, that is, is sensitive to INH, while the position of the detected spot is the position of the fabG1 mutant probe. It can be judged that M. tuberculosis is INH resistant. Further, if the detected spot position is the position of the furA wild type probe, it is determined that the tubercle bacillus is INH-sensitive. On the other hand, if the detected spot position is the position of the furA mutant probe, the tuberculosis bacteria is determined. Can be determined to be INH resistant.
  • a primer pair in which a labeling substance such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a chemiluminescent substance is modified.
  • a labeling substance such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a chemiluminescent substance is modified.
  • NBT nitroblue tetrazolium
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidinyl salt
  • the method is preferred. Specifically, it is performed as follows.
  • a gene having biotin at the end is amplified using a primer pair in which biotin is modified at the 3 'end or 5' end of the primer.
  • the amplified gene and the probe fixed to the test piece are bound to the probe by hybridization, and further contacted with alkaline phosphatase-labeled streptavidin to bind to biotin present at the end of the gene bound to the probe.
  • NBT / BCIP is added and reacted with alkaline phosphatase to develop color at a position where alkaline phosphatase bound to the probe is present. This color development is visible.
  • the detection kit of the present invention includes the above-described test piece.
  • any reagent suitable for detecting Mycobacterium tuberculosis isoniazid sensitivity may be included.
  • a reagent for extracting the above DNA, a reagent for gene amplification, a reagent for detecting the binding of the gene to the probe, and the like can be mentioned.
  • a kit for carrying out the PCR-SSOP method is exemplified.
  • the reagent for DNA extraction that can be included in the kit of the present invention is a reagent used in any of the above-described methods.
  • a primer pair for amplifying the fabG1 gene by PCR can also be included in the kit of the present invention.
  • the primer pair includes the same or complementary nucleotide sequence including a sequence upstream from the sequence site including the mutation site and a sequence downstream from the site so that the fabG1 gene including any mutation site can be amplified.
  • examples of a preferable primer pair for amplifying the fabG1 gene include the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 6 and 7 in the above sequence listing or an oligonucleotide having a complementary sequence thereof.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 13 and 14 in the above sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof can be mentioned.
  • the primer pair in the Nested PCR method for improving the measurement sensitivity include, for the fabG1 gene, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 4 and 5 in the above sequence listing or an oligonucleotide having a complementary sequence thereof.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 11 and 12 in the above sequence listing or oligonucleotides having complementary sequences thereof can be mentioned.
  • the primer pair is preferably modified with a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance or the like in order to facilitate detection in the PCR-SSOP method.
  • gene amplification may include known techniques such as the LAMP method and the ICAN method.
  • any of these methods may be used, and the present invention also includes a kit containing any reagent used in these methods.
  • kit of the present invention may contain reagents for detection.
  • reagents for detection For example, when the NBT / BCIP color development method is employed, streptavidin-modified alkaline phosphatase, NBT, and BCIP are exemplified.
  • Example 1 Gene analysis of Mycobacterium tuberculosis of INH-resistant Mycobacterium tuberculosis of INH-resistant Mycobacterium tuberculosis
  • 92 samples determined to be INH-resistant Mycobacterium tuberculosis were obtained by confirming growth in an INH-containing solution (MGIT 960: Nihon Becton Dickinson Co., Ltd.) or INH-containing agar medium (Ogawa Medium, 7H10), Genomic DNA was extracted from these 92 samples by the phenol extraction method and purified.
  • fabG1 gene was amplified using the primer pairs shown below. PCR reaction conditions were 94 ° C. and 30 seconds for the denaturation process, 55 ° C. and 20 seconds for the annealing process, and 72 ° C. and 20 seconds for the chain extension process, and amplification was performed in 30 cycles of this process.
  • fabG1 primer 2 gcgtccttgt gtgtgtgtcag tgg SEQ ID NO: 7.
  • furA gene was amplified using the primer pairs shown below. PCR reaction conditions were 94 ° C. and 30 seconds for the denaturation process, 55 ° C. and 20 seconds for the annealing process, and 72 ° C. and 20 seconds for the chain extension process, and amplification was performed in 30 cycles of this process.
  • furA primer 1 gccatcccac gatccagcgg SEQ ID NO: 13
  • furA primer 2 gtcgggcagc gcaaaacgca c SEQ ID NO: 14
  • a primer that binds to the furA-katG operon 129 bases upstream from the furA initiation codon (gctcatcgga acatacgaag: SEQ ID NO: 15) and a primer that binds 50 bases downstream from the katG stop codon (gtgctgcggc gggttgtggt tgatcggcgg) PCR was performed using SEQ ID NO: 16), and the entire nucleotide sequence was determined by DNA sequencing. Mutations not reported in published papers were designated as new mutations.
  • a primer that binds 200 bases upstream from the fabG1 initiation codon (ttcgtagggc gtcaatacac: SEQ ID NO: 17) and a primer that binds 40 bases downstream from the inhA stop codon (ccgaacgaca gcagcaggac: PCR was performed using SEQ ID NO: 18), and the entire nucleotide sequence was determined by DNA sequencing. Mutations not reported in published papers were designated as new mutations.
  • INH-resistant bacteria having known mutations were 67 specimens out of 92 specimens, but considering the mutations of the fabG1 gene and furA gene, 83 specimens out of 92 specimens (90.2%) A resistant bacterium can be easily determined to be INH resistant. Therefore, more reliable and simple detection is possible.
  • Probe design The following two probes (probe 1 and 2: a fabG1 wild type probe and a furA wild type probe, respectively) were designed as probes that can detect the INH sensitivity of Mycobacterium tuberculosis. All of these are wild-type probes that do not bind when there is a mutation but only bind (hybridize) with a wild-type gene.
  • each of the wild type probes (probes 1 and 2) added with polythymine was placed in a dispenser equipped with a 24 gauge needle, and 2 mm was applied at a coating speed of 2.5 mm / second while discharging an amount of 0.7 ⁇ L / min. It was applied in a vertical direction at intervals of 2 mm on a nitrocellulose film (length 75 mm ⁇ width 150 mm: Whatman) so as to form a stripe having a width of 1 mm.
  • the probes were immobilized by irradiating these nitrocellulose membranes with ultraviolet rays of 312 nm for 2 minutes.
  • the nitrocellulose membrane was cut so as to include all the stripes, thereby preparing a test piece of 5 mm ⁇ 150 mm.
  • INH-resistant bacteria that could not be determined for INH sensitivity so far. Therefore, by combining with a method for detecting a mutation in the existing katG gene or inhA gene, about 90% of INH resistant bacteria can be easily identified as INH resistant bacteria without culturing, and isoniazid Can be easily diagnosed as being incurable. As a result, appropriate treatment can be provided to such patients. Therefore, unnecessary drug administration and testing can be prevented, the burden on the patient can be reduced, and unnecessary medical expenses can be reduced.

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Abstract

　本発明によれば、結核菌のＩＮＨ感受性、すなわち、結核菌がＩＮＨ耐性菌であるか否かを、より確実に検出するための、新たな手段が提供される。本発明の結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法は、検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、および該取得したｆａｂＧ１遺伝子について、イソニアジド耐性に関与する変異を検出する工程を含む。本発明の方法は、必要に応じて、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を検出する工程を含んでもよく、好ましくは、他の公知のイソニアジド感受性検出方法と組み合わせてもよい。

Description

結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片
　本発明は、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片に関する。
　現在、日本では年間数千人が、地球規模では年間数百万人が結核により死亡しているといわれている。結核の治療は、基本的には化学療法を中心とする内科的療法であり、内科的療法では治療の目的を達成することが不可能な場合に外科療法が考慮される。
　内科的療法で使用される結核治療の薬剤としては、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、エタンブトール（ＥＢ）、ピラジナミド（ＰＺＡ）などの多くの種類の薬剤が知られている。しかし、薬剤を患者に投与した場合、突然変異によって、投与した薬剤に対する耐性を獲得した耐性菌が生じることが問題となっている。
　薬剤耐性菌は、特定遺伝子が変異することにより薬剤耐性を獲得することが報告されている。そのため、特定遺伝子の変異を検出することによる薬剤耐性菌の検出法が開発されている。例えば、結核治療用薬剤に感受性である野生型結核菌およびいずれかの薬剤に耐性を有する変異型結核菌における結核菌ゲノム上の結核治療用薬剤耐性関連遺伝子の塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを固定化した基板を含む結核菌診断キットが開示されている（特許文献１）。現在開発されているＤＮＡマイクロアレイキット「Oligo Array」（日清紡績株式会社）は、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＳＭ、カナマイシン（ＫＭ）、およびＥＢの５薬剤に対する耐性に関与する遺伝子変異を検出し得るキットである。
　イソニアジド（ＩＮＨ）は、結核の治療における最も代表的な薬剤である。ＩＮＨ耐性菌の多くは、ｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子に変異を有する。これらの変異を検出する方法については、種々検討されている（例えば、特許文献２および３）。しかし、ＩＮＨ耐性菌の約８割は、ｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子の公知の変異によるため、耐性菌として検出されるが、残りの約２割のＩＮＨ耐性菌については、検出することができない。そのため、このような検出不可能なＩＮＨ耐性菌を保有する結核患者に対しても、ＩＮＨが投与されている。
特開２００１－１０３９８１号公報 特許第３５７９０４９号明細書 特表平９－５０１８２３号公報
Parishら、J. Bact.，2007年，189巻，10号，p.3721-3728 Cohen-Gonsaudら、J. Mol. Biol.，2002年，320巻，2号，p.249-261 Marrakchiら、Microbiology，2002年，148巻(Pt4)，p.951-960 A.S. Pymら、Molecular Microbiology，2001年，40巻，p.879-889
　本発明は、結核菌のＩＮＨ感受性、すなわち、結核菌がＩＮＨ耐性菌であるか否かを、より確実に検出するための、新たな手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ｆａｂＧ１遺伝子もイソニアジド感受性遺伝子の１つであり、ｆａｂＧ１遺伝子が変異を有し、この変異によって結核菌がＩＮＨ耐性菌となり得ることを新たに見いだした。
　本発明は、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法を提供し、該方法は、
　検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、および
　該取得したｆａｂＧ１遺伝子について、イソニアジド耐性に関与する変異を検出する工程
を含む。
　１つの実施態様では、上記変異は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異である。
　本発明はまた、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片を提供し、該試験片は、少なくとも１つのプローブが固定されており、
　該少なくとも１つのプローブが、結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる。
　１つの実施態様では、上記ｆａｂＧ１遺伝子の変異は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異である。
　さらなる実施態様では、上記野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなる。
　ある実施態様では、上記試験片は、さらに、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該ｆｕｒＡ遺伝子の領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるプローブが固定されている。
　１つの実施態様では、上記ｆｕｒＡ遺伝子の変異は、配列表の配列番号８に記載の塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異、またはその相補配列の変異である。
　さらなる実施態様では、上記ｆｕｒＡ遺伝子の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列からなる。
　本発明はまた、上記いずれかの試験片を含む、結核菌におけるイソニアジド感受性の検出用キットを提供する。
　本発明はさらに、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法を提供し、該方法は、
　検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、
　該取得したｆａｂＧ１遺伝子を上記のいずれかの試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
　該プローブに結合したｆａｂＧ１遺伝子を発色させる工程
を含む。
　１つの実施態様では、上記方法は、
　上記検体中の結核菌のｆｕｒＡ遺伝子を取得する工程、
　該取得したｆｕｒＡ遺伝子を上記のいずれかの試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
　該プローブに結合したｆｕｒＡ遺伝子を発色させる工程
をさらに含む。
　本発明によれば、これまでＩＮＨ耐性菌として同定されなかった一部のＩＮＨ耐性菌についても、正確にＩＮＨ耐性菌と同定することができる。したがって、既存のｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子における変異を検出する方法と組み合わせることによって、ＩＮＨ耐性菌のうちの約９割について、ＩＮＨ耐性菌であると同定することができる。このように、より確実にＩＮＨ感受性を検出することができる。その結果、イソニアジド耐性結核菌を保有する結核患者に対して、適切な治療を提供することができる。
　（ｆａｂＧ１およびｆｕｒＡ遺伝子遺伝子の変異）
　本発明において、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のイソニアジド（ＩＮＨ）感受性遺伝子とは、結核治療用薬剤イソニアジド（ＩＮＨ）の作用に関連する遺伝子をいう。ＩＮＨ耐性菌では、この野生型のＩＮＨ感受性遺伝子に変異が生じ、ＩＮＨの作用に対する薬剤耐性が獲得されている。具体的には、変異を持つＩＮＨ感受性遺伝子から発現した酵素では、構成するアミノ酸配列において置換、挿入および／または欠落が生じているため、酵素活性の低下や薬剤結合部位の構造変化が生じ、ＩＮＨの効果が抑制される。
　結核菌のＩＮＨ耐性は、上記のように、ｋａｔＧ遺伝子、ｉｎｈＡ遺伝子などのＩＮＨの作用に関連する種々の遺伝子の変異により生じ得る。このような変異は、例えば、特許文献１～３に開示されている。これらの変異のうち、いずれか１つの変異があれば、ＩＮＨ耐性結核菌となり得る。
　本発明においては、上記の遺伝子以外に、ｆａｂＧ１遺伝子が変異を有し、この変異によって結核菌がＩＮＨ耐性菌となり得ることを新たに見いだした。ｆａｂＧ１遺伝子は、ｆａｂＧ１－ｉｎｈＡオペロンの先頭遺伝子であって、ミコール酸合成酵素をコードする遺伝子である（非特許文献１～３）。
　具体的には、ｆａｂＧ１遺伝子の変異は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異およびその相補配列における塩基ＣからＴまたはＡへの変異である。本発明においては、この変異をまとめて、「塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異」と表現する。この変異は、ｆａｂＧ１遺伝子によりコードされるＦａｂＧ１（配列表の配列番号２）の２０３位のロイシン（Ｌｅｕ）のサイレント変異である。
　本発明においてはさらに、ｆｕｒＡ遺伝子の変異によっても結核菌がＩＮＨ耐性菌となり得ることも新たに見いだした。カタラーゼ－ペルオキシダーゼをコードする上記のｋａｔＧ遺伝子は、ｆｕｒＡを先頭遺伝子とするｆｕｒＡ－ｋａｔＧオペロンを構成し、そしてｆｕｒＡ遺伝子が、このオペロンの負の転写遺伝子であるという報告がある（非特許文献４）。ｆｕｒＡ遺伝子は、ｋａｔＧ発現を調節するので、ＩＮＨ耐性に関与する。非特許文献１においては、ｆｕｒＡ遺伝子の機能は、ｆｕｒＡ遺伝子全体を欠損させることによって確認されるのみであり、ｆｕｒＡ遺伝子の変異については何ら記載されていない。
　具体的には、ｆｕｒＡ遺伝子の変異は、配列表の配列番号８に記載の塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異およびその相補配列における塩基ＧからＡへの変異が挙げられる。本発明においては、この変異をまとめて、「塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異、またはその相補配列の変異」と表現する。この変異により、ｆｕｒＡ遺伝子によりコードされるＦｕｒＡ（配列表の配列番号９）の１４位のアラニン（Ａｌａ）がバリン（Ｖａｌ）に変異する。
　ｆａｂＧ１遺伝子およびｆｕｒＡ遺伝子上の上記変異を検出する方法としては、Nollauら, Clin. Chem., 43, 1114-1120 (1997)、「突然変異検出のための研究室プロトコル」（Landegren, U.ら, Oxford University Press (1996)）、および「ＰＣＲ」第２版（Newtonら, BIOS Scientific Publishers Limited (1997)）などに記載されている通常用いられる手段が適用できる。具体的には、例えば、ＰＣＲ断片シークエンシング法、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Orita, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(8), 2766-2770 (1989)）、ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Sheffield, V. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(1), 232-236 (1989)）、インベーダー法（Griffin, T. J.ら, Trend Biotech, 18, 77 (2000)）、ＳｎｉＰｅｒＴＭ法（Amersham pharmacia biotech）、タックマンＰＣＲ法（Livak, K. J., Genel. Anal., 14, 143 (1999)；Morris, T.ら, J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)）、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法（Griffin, T. J.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96(11), 6301-6 (1999)）、制限酵素長多型解析法（ＲＦＬＰ：Murray, J. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80(19), 5951-5955 (1983)）、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Kokoris, K.ら, J. Med. Genet., 36, 730 (1999)）、ＭａｓｓｃｏｄｅＴＭ法（Qiagen Genomics）などに例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではない。遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。例えば、ＰＣＲ－配列特異的オリゴプローブ（ＳＳＯＰ：sequence-specific oligonucleotide probes）法を用いることもできる。ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法とは、変異部位を含む約１０～約３０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、変異部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した後、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。
　（プローブ）
　本発明の結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するために用いられるプローブとしては、結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する領域と結合（ハイブリダイズ）し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆａｂＧ１変異プローブ」という場合がある）、ならびにこのｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する領域において、変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆａｂＧ１野生型プローブ」という場合がある）が挙げられる。
　さらに、プローブとして、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する領域と結合（ハイブリダイズ）し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆｕｒＡ変異プローブ」という場合がある）、ならびにこのｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する領域において、変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆｕｒＡ野生型プローブ」という場合がある）が挙げられる。
　各プローブの長さは、結合（ハイブリダイズ）させる時の温度にもよるが、一般的には１０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１２～２６ヌクレオチド長である。
　本発明において、変異プローブは、ｆｕｒＡ遺伝子またはｆａｂＧ１遺伝子の上記の各変異を有する領域に結合（ハイブリダイズ）可能である。このような変異を有する領域は、変異以外の塩基の配列は野生型である。この領域が野生型である場合には、変異プローブはこの領域に結合できない。また、確実に変異を検出するために、変異プローブを構成するオリゴヌクレオチドの中程に変異の位置が存在するように設計することが好ましい。
　本発明において、野生型プローブは、野生型のｆｕｒＡ遺伝子またはｆａｂＧ１遺伝子において、上記の変異を有する領域に対応する任意の領域と結合（ハイブリダイズ）し得る。
　上記の各プローブは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
　さらに、各プローブは、例えば、試験片に固定するために、５’または３’末端のいずれか一方が修飾されていてもよい。
　各プローブは、検出が可能であればどのような形態で提供されてもよく、溶液の形態であってもよく、あるいは担体に固定されていてもよい。検出を容易にするために、試験片に固定されていることが好ましい。
　（試験片）
　本発明の、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片には、少なくとも１つのプローブが固定されている。固定されている少なくとも１つのプローブは、上記ｆａｂＧ１変異プローブまたはｆａｂＧ１野生型プローブである。ｆａｂＧ１変異プローブおよびｆａｂＧ１野生型プローブは、試験片のそれぞれ異なる位置に固定されることがより好ましい。ｆａｂＧ１遺伝子が変異を有する場合、ｆａｂＧ１遺伝子はｆａｂＧ１変異プローブと結合するが、ｆｕｒＡ野生型プローブとは結合しない。一方、変異がない場合には、ｆａｂＧ１野生型プローブと結合する。したがって、ＩＮＨ感受性の場合はｆａｂＧ１野生型プローブにのみ結合し、ＩＮＨ耐性の場合は、ｆａｂＧ１野生型プローブには結合せずにｆａｂＧ１変異プローブに結合する。
　さらに、本発明の試験片には、発色を確認するためのコントロールまたはマーカーが固定されていてもよい。
　本発明の、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片には、さらに、上記ｆｕｒＡ変異プローブまたはｆｕｒＡ野生型プローブである。ｆｕｒＡ変異プローブおよびｆｕｒＡ野生型プローブが、試験片のそれぞれ異なる位置に固定されることが好ましい。ｆｕｒＡ遺伝子が変異を有する場合、ｆｕｒＡ遺伝子はｆｕｒＡ変異プローブと結合するが、ｆｕｒＡ野生型プローブとは結合しない。一方、変異がない場合には、ｆｕｒＡ野生型プローブと結合する。したがって、ＩＮＨ感受性の場合はｆｕｒＡ野生型プローブにのみ結合し、ＩＮＨ耐性の場合は、ｆｕｒＡ野生型プローブには結合せずにｆｕｒＡ変異型プローブに結合する。
　さらに、本発明の試験片には、ｆａｂＧ１遺伝子およびｆｕｒＡ遺伝子以外の、ＩＮＨ感受性またはＩＮＨ耐性を検出可能な公知のプローブが固定されていてもよい。
　本発明の試験片は、上記プローブを担体表面上に物理的または化学的に固定して作成することができる。担体としては、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されない。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。これらの担体は、発色法での検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。
　上記プローブは、種類ごとに一定間隔で上記担体に配置されることが好ましい。これらの担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法がある。この方法によれば、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる。プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定化の効率を上げる方法もある。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液をディスペンサからニトロセルロース膜上に吐出して、紫外線を照射することによって、比較的容易に種々のプローブを固定化することができる。具体的には、各プローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５～１．０μＬ／分の量を吐出させながら２．５～８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが、一定の間隔で並んだ約１～２ｍｍの幅のストライプとして塗布される。このプローブのストライプが塗布された担体に紫外線を照射することによって、プローブが担体上に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に配置された多数の試験片を一挙に得ることができる。
　担体表面が金などの金属材料である場合には、２－アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理することにより、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を介して固定化の効率がよくなることも知られている。
　プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、プローブの末端をトリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基などのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法があり、このように修飾されたプローブを含む溶液に担体を２４～４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより試験片が得られる。あるいは、ガラス、シリコンなどの無機材料担体をアミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、担体の表面をアミノ化し、次いで、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることにより、プローブを固定化する方法もある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、この修飾プローブを含む溶液に担体を２４～４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより固定化することができる。
　また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られている。
　（試験片を用いたＩＮＨ感受性検出方法）
　１．検体
　本発明において、「検体」は、通常、結核菌検査に必要な検体であればよい。例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、ならびにこれらから培養して得られた培養物が挙げられる。
　２．検体の前処理（ＤＮＡの抽出）
　上記検体からのＤＮＡの抽出は、公知の方法で行うことができる。例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。
　３．核酸の増幅
　得られたＤＮＡから目的の遺伝子を取得する。ＰＣＲ法で目的の遺伝子を増幅する場合、例えば、以下の工程で行われる：（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２～９５℃、約３０秒～１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程；（２）該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０～６５℃を約２０秒～１分間の反応条件で、少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程；（３）約７０～７５℃を約２０秒～５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程；ならびに（１）～（３）の工程を通常の方法により２０～４０回繰り返す工程。
　ｆａｂＧ１遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマー対として、変異部位を含むｆａｂＧ１遺伝子を増幅し得るように、該変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいプライマー対の例としては、配列表の配列番号６（ggctacatcg acaccgatat gacc）および配列番号７（gcgtccttgt gttgtgtcag tgg）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。一方、ｆｕｒＡ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマー対として、変異部位を含むｆｕｒＡ遺伝子を増幅し得るように、該変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいプライマー対の例としては、配列表の配列番号１３（gccatcccac gatccagcgg）および配列番号１４（gtcgggcagc gcaaaacgca c）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　また、測定の感度を向上させるために、例えば、検体から直接ＤＮＡを増幅させる場合、上記ＰＣＲ反応の前にさらにNestedＰＣＲ法（特公平６－８１６００号公報）などで核酸を増幅してもよい。NestedＰＣＲ法におけるプライマーは、上記ＰＣＲ反応において用いたプライマーよりも外側の配列を選択することができる。例えば、ｆａｂＧ１遺伝子の場合は、配列表の配列番号４（gtcgaaggca aacgtgaccg cg）および配列番号５（gtccagcagt cctgtcatgt g）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、そしてｆｕｒＡ遺伝子の場合は、配列表の配列番号１１（ggctcatcgg aacatacgaa ggctg）および配列番号１２（gtcgtacacg gcttgccgg）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　上記のプローブおよびプライマーの配列は、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社製）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
　４．結核菌のＩＮＨ感受性検出方法
　本発明において、結核菌のＩＮＨ感受性は、ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法によって検出することができる。より簡便には、固定されたプローブの位置と、ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの位置とを比較することにより検出することもできる。例えば、上記のプローブが固定された試験片を使用する場合、ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法におけるハイブリダイズは、非特異的な結合反応が起きにくい点で、約６０～６５℃の温度で行うことが好ましい。検出されたスポットの位置が、ｆａｂＧ１野生型プローブの位置であれば、結核菌は変異を有さない、すなわちＩＮＨ感受性であり、一方、検出されたスポットの位置がｆａｂＧ１変異プローブの位置であれば、結核菌はＩＮＨ耐性であると判断することができる。また、検出されたスポットの位置がｆｕｒＡ野生型プローブの位置であれば、結核菌はＩＮＨ感受性であると判断され、一方、検出されたスポットの位置がｆｕｒＡ変異プローブの位置であれば、結核菌はＩＮＨ耐性であると判断できる。
　ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法において検出されたスポットを容易に検出するためには、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質を修飾したプライマー対を用いて遺伝子を増幅することが好ましい。上記標識物質を用いた検出方法のうち、比較的安価で容易に実施できる点で、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスファターゼｐ－トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が好ましい。具体的には、以下のとおりに行われる。まず、上記プライマーの３’末端または５’末端にビオチンを修飾したプライマー対を用いて、末端にビオチンを有する遺伝子を増幅する。次いで、増幅した遺伝子と試験片に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによってプローブに結合させ、さらにアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンに接触させて、プローブと結合している遺伝子の末端に存在するビオチンに結合させる。さらに、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えてアルカリホスファターゼと反応させることにより、プローブに結合しているアルカリホスファターゼが存在する位置で発色させる。この発色は視認可能である。
　（試験片を含む検出用キット）
　本発明の検出用キットは、上記の試験片を含む。好適には、結核菌のイソニアジド感受性を検出するために適切な任意の試薬類を含み得る。例えば、上記のＤＮＡの抽出のための試薬、遺伝子増幅用試薬、プローブへの遺伝子の結合を検出するための試薬などが挙げられる。具体的なキットとして、上記のＰＣＲ－ＳＳＯＰ法を実施するためのキットを例示する。
　本発明のキットに含まれ得るＤＮＡの抽出のための試薬は、上記の任意の手法で用いられる試薬である。
　ｆａｂＧ１遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマー対も、本発明のキットに含まれ得る。プライマー対は、任意の変異部位を含むｆａｂＧ１遺伝子を増幅し得るように、変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と、該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ＩＮＨ感受性の検出のために、ｆａｂＧ１遺伝子増幅用の好ましいプライマー対の例としては、上記の配列表の配列番号６および７のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。一方、ｆｕｒＡ遺伝子については、上記の配列表の配列番号１３および１４のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。測定の感度を向上させるためのNestedＰＣＲ法におけるプライマー対はとしては、例えば、ｆａｂＧ１遺伝子については、上記の配列表の配列番号４および５のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、一方、ｆｕｒＡ遺伝子については、上記の配列表の配列番号１１および１２のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　さらに、上記プライマー対は、ＰＣＲ－ＳＳＯＰ法において検出を容易にするために、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などで修飾されていることが好ましい。
　また、遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法以外にも、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の技術が挙げられる。本発明においては、これらのいずれかの手法を用いてもよく、本発明にはこれらの手法で用いられる任意の試薬を含むキットも含まれる。
　さらに、本発明のキットは、検出のための試薬類を含み得る。例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法を採用する場合は、ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼ、ＮＢＴ、およびＢＣＩＰが挙げられる。
　（実施例１：ＩＮＨ耐性結核菌の結核菌の遺伝子解析）
　本実施例では、ＩＮＨ含有溶液（ＭＧＩＴ　９６０：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）またはＩＮＨ含有寒天培地（小川培地、７Ｈ１０）における発育の確認によりＩＮＨ耐性結核菌と判定された９２検体を入手し、これらの９２検体からフェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出し精製した。
　１．ｆａｂＧ１遺伝子の解析
　以下に示すプライマー対を用いてｆａｂＧ１遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。
　ｆａｂＧ１プライマー１　　ggctacatcg acaccgatat gacc　（配列番号６）
　ｆａｂＧ１プライマー２　　gcgtccttgt gttgtgtcag tgg　（配列番号７）
　増幅された９２例のｆａｂＧ１遺伝子の塩基配列をシークエンサーで調べた。その結果、新たな変異：Ｌｅｕ２０３Ｌｅｕ［ｃｔＧ→ｃｔＡ／Ｔ］が９２例中１５例において発見された。この変異は、塩基が置換されているにもかかわらずコードされるアミノ酸が変化しないサイレント変異であった。
　２．ｆｕｒＡ遺伝子の解析
　以下に示すプライマー対を用いてｆｕｒＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。
　ｆｕｒＡプライマー１ 　　gccatcccac gatccagcgg （配列番号１３）
　ｆｕｒＡプライマー２ 　　gtcgggcagc gcaaaacgca c （配列番号１４）
　増幅された９２例のｆｕｒ遺伝子の塩基配列をシークエンサーで調べた。その結果、新たな変異：Ａｌａ１４Ｖａｌ［ｇＣｃ→ｇＴｃ］が９２例中１４例において発見された。
　３．既知の変異の検出
　上記９２検体について、既知の変異を有するｋａｔＧ遺伝子およびｉｎｈＡ遺伝子をそれぞれ増幅して、既知の変異の有無を検出した。
　ｋａｔＧに関しては、ｆｕｒＡ－ｋａｔＧオペロンに対し、ｆｕｒＡ開始コドンを基点に１２９塩基上流に結合するプライマー（gctcatcgga acatacgaag：配列番号１５）とｋａｔＧ終止コドンを基点に５０塩基下流に結合するプライマー（gtgctgcggc gggttgtggt tgatcggcgg：配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシークエンシング法にて全塩基配列を決定した。既報論文で報告されていない変異を新規変異とした。
　ｉｎｈＡに関しては、ｆａｂＧ１－ｉｎｈＡオペロンに対し、ｆａｂＧ１開始コドンを基点に２００塩基上流に結合するプライマー（ttcgtagggc gtcaatacac：配列番号１７）とｉｎｈＡ終止コドンを基点に４０塩基下流に結合するプライマー（ccgaacgaca gcagcaggac：配列番号１８）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシークエンシング法にて全塩基配列を決定した。既報論文で報告されていない変異を新規変異とした。
　上記１～３の解析結果を、以下の表１にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１からわかるように、既知の変異を有するＩＮＨ耐性菌は、９２検体中６７検体であったが、ｆａｂＧ１遺伝子およびｆｕｒＡ遺伝子の変異も考慮すると、９２検体中８３検体（９０．２％）の耐性菌について、ＩＮＨ耐性であると容易に判定できる。したがって、より確実かつ簡便な検出が可能となる。
　（実施例２：試験片の作製）
　１．プローブの設計
　結核菌のＩＮＨ感受性を検出し得るプローブとして、以下の２つのプローブ（プローブ１および２：それぞれｆａｂＧ１野生型プローブおよびｆｕｒＡ野生型プローブ）を設計した。これらはいずれも、変異がある場合には結合せず、野生型の遺伝子とのみ結合（ハイブリダイズ）する野生型プローブである。
　プローブ１　　ggggcgctgc aatttatccc　（配列番号３）
　プローブ２　　gctccggacg gccgacctgc g（配列番号１０）
　２．プローブの固定化
　上記プローブ１および２（それぞれ配列番号３および１０）のそれぞれの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃で４時間反応させた後、１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを加えることにより、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブ１ｐｍｏｌ／μＬを得た。
　次いで、ポリチミン付加された野生型プローブ（プローブ１および２）をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量を吐出させながら２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布した。次いで、これらのニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブを固定化した。次いで、ニトロセルロース膜を、全てのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片を作成した。
　本発明によれば、これまでＩＮＨ感受性について判定できなかったＩＮＨ耐性菌についても同定することができる。したがって、既存のｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子における変異を検出する方法と組み合わせることによって、ＩＮＨ耐性菌のうちの約９割について、培養することなく簡便にＩＮＨ耐性菌であると同定することができ、イソニアジドで治療不可能であることが容易に診断され得る。その結果、このような患者に、適切な治療を提供することができる。したがって、不要な薬剤投与や検査を防ぐことができ、患者の負担が軽減化され、さらに無駄な医療費を削減することができる。

Claims (11)

  1. 　結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法であって、
    　検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、および
    　該取得したｆａｂＧ１遺伝子について、イソニアジド耐性に関与する変異を検出する工程
    を含む、方法。
  2. 　前記変異が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異である、請求項１に記載の方法。
  3. 　結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片であって、
    　少なくとも１つのプローブが固定されており、
    　該少なくとも１つのプローブが、結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる、
    試験片。
  4. 　前記ｆａｂＧ１遺伝子の変異が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異である、請求項３に記載の試験片。
  5. 　前記野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項４に記載の試験片。
  6. 　さらに、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該ｆｕｒＡ遺伝子の領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるプローブが固定されている、請求項３から５のいずれかの項に記載の試験片。
  7. 　前記ｆｕｒＡ遺伝子の変異が、配列表の配列番号８に記載の塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異、またはその相補配列の変異である、請求項６に記載の試験片。
  8. 　前記ｆｕｒＡ遺伝子の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項７に記載の試験片。
  9. 　請求項３から８のいずれかの項に記載の試験片を含む、結核菌におけるイソニアジド感受性の検出用キット。
  10. 　結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法であって、
    　検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、
    　該取得したｆａｂＧ１遺伝子を請求項３から８のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
    　該プローブに結合したｆａｂＧ１遺伝子を発色させる工程
    を含む、方法。
  11. 　請求項１０に記載の方法であって、
    　前記検体中の結核菌のｆｕｒＡ遺伝子を取得する工程、
    　該取得したｆｕｒＡ遺伝子を請求項６から８のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
    　該プローブに結合したｆｕｒＡ遺伝子を発色させる工程
    をさらに含む、方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0681600B2 (ja) 1991-06-20 1994-10-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト 核酸増幅のための改善された方法
JPH09501823A (ja) 1993-05-13 1997-02-25 アール．，ジュニア ヤコブス，ウィリアム ｉｎｈＡ遺伝子を用いるミコバクテリア感染の検出および処置のための方法および組成物
JP2001103981A (ja) 1999-08-03 2001-04-17 Nisshinbo Ind Inc 結核菌診断キット
JP2004215542A (ja) * 2003-01-14 2004-08-05 Japan Science & Technology Agency 結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、ｐｃｒ用プライマーペアセット、塩基配列決定用プライマーセット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キット
JP3579049B2 (ja) 1992-04-30 2004-10-20 インスティチュート・パスツール Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける抗生物質耐性の迅速検出法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1341752A (zh) * 2000-09-05 2002-03-27 华东理工大学 检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的dna芯片

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0681600B2 (ja) 1991-06-20 1994-10-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト 核酸増幅のための改善された方法
JP3579049B2 (ja) 1992-04-30 2004-10-20 インスティチュート・パスツール Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける抗生物質耐性の迅速検出法
JPH09501823A (ja) 1993-05-13 1997-02-25 アール．，ジュニア ヤコブス，ウィリアム ｉｎｈＡ遺伝子を用いるミコバクテリア感染の検出および処置のための方法および組成物
JP2001103981A (ja) 1999-08-03 2001-04-17 Nisshinbo Ind Inc 結核菌診断キット
JP2004215542A (ja) * 2003-01-14 2004-08-05 Japan Science & Technology Agency 結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、ｐｃｒ用プライマーペアセット、塩基配列決定用プライマーセット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キット

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.S. PYM ET AL., MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 40, 2001, pages 879 - 889
COHEN-GONSAUD ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 320, no. 2, 2002, pages 249 - 261
DOUSTDAR, F. ET AL.: "Molecular Analysis of Isoniazid Resistance in Different Genotypes of Mycobacterium tuberculosis Isolates from Iran", MICROB. DRUG RESIST., vol. 14, no. 4, December 2008 (2008-12-01), pages 273 - 279, XP008139086 *
GRIFFIN, T. J. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 96, no. 11, 1999, pages 6301 - 6
KOKORIS, K. ET AL., J. MED. GENET., vol. 36, 1999, pages 730
LANDEGREN, U. ET AL.: "Laboratory Protocols for Mutation Detection", 1996, OXFORD UNIVERSITY PRESS
LIVAK, K. J., GENEL. ANAL., vol. 14, 1999, pages 143
MARRAKCHI ET AL., MICROBIOLOGY, vol. 148, 2002, pages 951 - 960
MORRIS, T. ET AL., J. CLIN. MICROBIOL., vol. 34, 1996, pages 2933
MURRAY, J. C. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 80, no. 19, 1983, pages 5951 - 5955
NEWTON ET AL.: "PCR", 1997, BIOS SCIENTIFIC PUBLISHERS LIMITED
NOLLAU ET AL., CLIN. CHEM., vol. 43, 1997, pages 1114 - 1120
ORITA, M. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 86, no. 8, 1989, pages 2766 - 2770
PARISH ET AL., J. BACT., vol. 189, no. 10, 2007, pages 3721 - 3728
RAMASWAMY, S., V. ET AL.: "Single Nucleotide Polymorphisms in Genes Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis", ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER., vol. 47, no. 4, 2003, pages 1241 - 1250, XP008139084 *
See also references of EP2322659A4 *
SEKIGUCHI, J. ET AL.: "Detection of Multidrug Resistance in Mycobacterium tuberculosis", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 45, no. 1, 2007, pages 179 - 192, XP008139017 *
SHEFFIELD, V. C. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 86, no. 1, 1989, pages 232 - 236
ZHANG, M. ET AL.: "Detection of Mutations Associated with Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from China", J. CLIN. MICROBIOL., vol. 43, no. 11, 2005, pages 5477 - 5482, XP008139011 *

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