JP5904432B2

JP5904432B2 - 結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片

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Publication number: JP5904432B2
Application number: JP2010519088A
Authority: JP
Inventors: 切替　照雄; 照雄切替; 弘樹安藤; 寿紀末竹; 中村　友彦; 友彦中村
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Current assignee: Nipro Corp; National Center for Global Health and Medicine
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2009-07-01
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Description

本発明は、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片に関する。

現在、日本では年間数千人が、地球規模では年間数百万人が結核により死亡しているといわれている。結核の治療は、基本的には化学療法を中心とする内科的療法であり、内科的療法では治療の目的を達成することが不可能な場合に外科療法が考慮される。

内科的療法で使用される結核治療の薬剤としては、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、エタンブトール（ＥＢ）、ピラジナミド（ＰＺＡ）などの多くの種類の薬剤が知られている。しかし、薬剤を患者に投与した場合、突然変異によって、投与した薬剤に対する耐性を獲得した耐性菌が生じることが問題となっている。

薬剤耐性菌は、特定遺伝子が変異することにより薬剤耐性を獲得することが報告されている。そのため、特定遺伝子の変異を検出することによる薬剤耐性菌の検出法が開発されている。例えば、結核治療用薬剤に感受性である野生型結核菌およびいずれかの薬剤に耐性を有する変異型結核菌における結核菌ゲノム上の結核治療用薬剤耐性関連遺伝子の塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを固定化した基板を含む結核菌診断キットが開示されている（特許文献１）。現在開発されているＤＮＡマイクロアレイキット「Oligo Array」（日清紡績株式会社）は、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＳＭ、カナマイシン（ＫＭ）、およびＥＢの５薬剤に対する耐性に関与する遺伝子変異を検出し得るキットである。

イソニアジド（ＩＮＨ）は、結核の治療における最も代表的な薬剤である。ＩＮＨ耐性菌の多くは、ｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子に変異を有する。これらの変異を検出する方法については、種々検討されている（例えば、特許文献２および３）。しかし、ＩＮＨ耐性菌の約８割は、ｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子の公知の変異によるため、耐性菌として検出されるが、残りの約２割のＩＮＨ耐性菌については、検出することができない。そのため、このような検出不可能なＩＮＨ耐性菌を保有する結核患者に対しても、ＩＮＨが投与されている。

特開２００１−１０３９８１号公報特許第３５７９０４９号明細書特表平９−５０１８２３号公報

Parishら、J. Bact.，2007年，189巻，10号，p.3721-3728 Cohen-Gonsaudら、J. Mol. Biol.，2002年，320巻，2号，p.249-261 Marrakchiら、Microbiology，2002年，148巻(Pt4)，p.951-960 A.S. Pymら、Molecular Microbiology，2001年，40巻，p.879-889

本発明は、結核菌のＩＮＨ感受性、すなわち、結核菌がＩＮＨ耐性菌であるか否かを、より確実に検出するための、新たな手段を提供することを目的とする。

本発明者らは、ｆａｂＧ１遺伝子もイソニアジド感受性遺伝子の１つであり、ｆａｂＧ１遺伝子が変異を有し、この変異によって結核菌がＩＮＨ耐性菌となり得ることを新たに見いだした。

本発明は、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法を提供し、該方法は、
検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、および
該取得したｆａｂＧ１遺伝子について、イソニアジド耐性に関与する変異を検出する工程
を含む。

１つの実施態様では、上記変異は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異である。

本発明はまた、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片を提供し、該試験片は、少なくとも１つのプローブが固定されており、
該少なくとも１つのプローブが、結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる。

１つの実施態様では、上記ｆａｂＧ１遺伝子の変異は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異である。

さらなる実施態様では、上記野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなる。

ある実施態様では、上記試験片は、さらに、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該ｆｕｒＡ遺伝子の領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるプローブが固定されている。

１つの実施態様では、上記ｆｕｒＡ遺伝子の変異は、配列表の配列番号８に記載の塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異、またはその相補配列の変異である。

さらなる実施態様では、上記ｆｕｒＡ遺伝子の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列からなる。

本発明はまた、上記いずれかの試験片を含む、結核菌におけるイソニアジド感受性の検出用キットを提供する。

本発明はさらに、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法を提供し、該方法は、
検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、
該取得したｆａｂＧ１遺伝子を上記のいずれかの試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合したｆａｂＧ１遺伝子を発色させる工程
を含む。

１つの実施態様では、上記方法は、
上記検体中の結核菌のｆｕｒＡ遺伝子を取得する工程、
該取得したｆｕｒＡ遺伝子を上記のいずれかの試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合したｆｕｒＡ遺伝子を発色させる工程
をさらに含む。

本発明によれば、これまでＩＮＨ耐性菌として同定されなかった一部のＩＮＨ耐性菌についても、正確にＩＮＨ耐性菌と同定することができる。したがって、既存のｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子における変異を検出する方法と組み合わせることによって、ＩＮＨ耐性菌のうちの約９割について、ＩＮＨ耐性菌であると同定することができる。このように、より確実にＩＮＨ感受性を検出することができる。その結果、イソニアジド耐性結核菌を保有する結核患者に対して、適切な治療を提供することができる。

（ｆａｂＧ１およびｆｕｒＡ遺伝子遺伝子の変異）
本発明において、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のイソニアジド（ＩＮＨ）感受性遺伝子とは、結核治療用薬剤イソニアジド（ＩＮＨ）の作用に関連する遺伝子をいう。ＩＮＨ耐性菌では、この野生型のＩＮＨ感受性遺伝子に変異が生じ、ＩＮＨの作用に対する薬剤耐性が獲得されている。具体的には、変異を持つＩＮＨ感受性遺伝子から発現した酵素では、構成するアミノ酸配列において置換、挿入および／または欠落が生じているため、酵素活性の低下や薬剤結合部位の構造変化が生じ、ＩＮＨの効果が抑制される。

結核菌のＩＮＨ耐性は、上記のように、ｋａｔＧ遺伝子、ｉｎｈＡ遺伝子などのＩＮＨの作用に関連する種々の遺伝子の変異により生じ得る。このような変異は、例えば、特許文献１〜３に開示されている。これらの変異のうち、いずれか１つの変異があれば、ＩＮＨ耐性結核菌となり得る。

本発明においては、上記の遺伝子以外に、ｆａｂＧ１遺伝子が変異を有し、この変異によって結核菌がＩＮＨ耐性菌となり得ることを新たに見いだした。ｆａｂＧ１遺伝子は、ｆａｂＧ１−ｉｎｈＡオペロンの先頭遺伝子であって、ミコール酸合成酵素をコードする遺伝子である（非特許文献１〜３）。

具体的には、ｆａｂＧ１遺伝子の変異は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異およびその相補配列における塩基ＣからＴまたはＡへの変異である。本発明においては、この変異をまとめて、「塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへの変異、またはその相補配列の変異」と表現する。この変異は、ｆａｂＧ１遺伝子によりコードされるＦａｂＧ１（配列表の配列番号２）の２０３位のロイシン（Ｌｅｕ）のサイレント変異である。

本発明においてはさらに、ｆｕｒＡ遺伝子の変異によっても結核菌がＩＮＨ耐性菌となり得ることも新たに見いだした。カタラーゼ−ペルオキシダーゼをコードする上記のｋａｔＧ遺伝子は、ｆｕｒＡを先頭遺伝子とするｆｕｒＡ−ｋａｔＧオペロンを構成し、そしてｆｕｒＡ遺伝子が、このオペロンの負の転写遺伝子であるという報告がある（非特許文献４）。ｆｕｒＡ遺伝子は、ｋａｔＧ発現を調節するので、ＩＮＨ耐性に関与する。非特許文献４においては、ｆｕｒＡ遺伝子の機能は、ｆｕｒＡ遺伝子全体を欠損させることによって確認されるのみであり、ｆｕｒＡ遺伝子の変異については何ら記載されていない。

具体的には、ｆｕｒＡ遺伝子の変異は、配列表の配列番号８に記載の塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異およびその相補配列における塩基ＧからＡへの変異が挙げられる。本発明においては、この変異をまとめて、「塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異、またはその相補配列の変異」と表現する。この変異により、ｆｕｒＡ遺伝子によりコードされるＦｕｒＡ（配列表の配列番号９）の１４位のアラニン（Ａｌａ）がバリン（Ｖａｌ）に変異する。

ｆａｂＧ１遺伝子およびｆｕｒＡ遺伝子上の上記変異を検出する方法としては、Nollauら, Clin. Chem., 43, 1114-1120 (1997)、「突然変異検出のための研究室プロトコル」（Landegren, U.ら, Oxford University Press (1996)）、および「ＰＣＲ」第２版（Newtonら, BIOS Scientific Publishers Limited (1997)）などに記載されている通常用いられる手段が適用できる。具体的には、例えば、ＰＣＲ断片シークエンシング法、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Orita, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(8), 2766-2770 (1989)）、ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Sheffield, V. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(1), 232-236 (1989)）、インベーダー法（Griffin, T. J.ら, Trend Biotech, 18, 77 (2000)）、ＳｎｉＰｅｒＴＭ法（Amersham pharmacia biotech）、タックマンＰＣＲ法（Livak, K. J., Genel. Anal., 14, 143 (1999)；Morris, T.ら, J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Griffin, T. J.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96(11), 6301-6 (1999)）、制限酵素長多型解析法（ＲＦＬＰ：Murray, J. C.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80(19), 5951-5955 (1983)）、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Kokoris, K.ら, J. Med. Genet., 36, 730 (1999)）、Ｍａｓｓｃｏｄｅ^ＴＭ法（Qiagen Genomics）などに例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではない。遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。例えば、ＰＣＲ−配列特異的オリゴプローブ（ＳＳＯＰ：sequence-specific oligonucleotide probes）法を用いることもできる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法とは、変異部位を含む約１０〜約３０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、変異部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した後、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。

（プローブ）
本発明の結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するために用いられるプローブとしては、結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する領域と結合（ハイブリダイズ）し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆａｂＧ１変異プローブ」という場合がある）、ならびにこのｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する領域において、変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆａｂＧ１野生型プローブ」という場合がある）が挙げられる。

さらに、プローブとして、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する領域と結合（ハイブリダイズ）し得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆｕｒＡ変異プローブ」という場合がある）、ならびにこのｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する領域において、変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ｆｕｒＡ野生型プローブ」という場合がある）が挙げられる。

各プローブの長さは、結合（ハイブリダイズ）させる時の温度にもよるが、一般的には１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２６ヌクレオチド長である。

本発明において、変異プローブは、ｆｕｒＡ遺伝子またはｆａｂＧ１遺伝子の上記の各変異を有する領域に結合（ハイブリダイズ）可能である。このような変異を有する領域は、変異以外の塩基の配列は野生型である。この領域が野生型である場合には、変異プローブはこの領域に結合できない。また、確実に変異を検出するために、変異プローブを構成するオリゴヌクレオチドの中程に変異の位置が存在するように設計することが好ましい。

本発明において、野生型プローブは、野生型のｆｕｒＡ遺伝子またはｆａｂＧ１遺伝子において、上記の変異を有する領域に対応する任意の領域と結合（ハイブリダイズ）し得る。

上記の各プローブは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。

さらに、各プローブは、例えば、試験片に固定するために、５’または３’末端のいずれか一方が修飾されていてもよい。

各プローブは、検出が可能であればどのような形態で提供されてもよく、溶液の形態であってもよく、あるいは担体に固定されていてもよい。検出を容易にするために、試験片に固定されていることが好ましい。

（試験片）
本発明の、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片には、少なくとも１つのプローブが固定されている。固定されている少なくとも１つのプローブは、上記ｆａｂＧ１変異プローブまたはｆａｂＧ１野生型プローブである。ｆａｂＧ１変異プローブおよびｆａｂＧ１野生型プローブは、試験片のそれぞれ異なる位置に固定されることがより好ましい。ｆａｂＧ１遺伝子が変異を有する場合、ｆａｂＧ１遺伝子はｆａｂＧ１変異プローブと結合するが、ｆａｂＧ１野生型プローブとは結合しない。一方、変異がない場合には、ｆａｂＧ１野生型プローブと結合する。したがって、ＩＮＨ感受性の場合はｆａｂＧ１野生型プローブにのみ結合し、ＩＮＨ耐性の場合は、ｆａｂＧ１野生型プローブには結合せずにｆａｂＧ１変異プローブに結合する。

さらに、本発明の試験片には、発色を確認するためのコントロールまたはマーカーが固定されていてもよい。

本発明の、結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片には、さらに、上記ｆｕｒＡ変異プローブまたはｆｕｒＡ野生型プローブである。ｆｕｒＡ変異プローブおよびｆｕｒＡ野生型プローブが、試験片のそれぞれ異なる位置に固定されることが好ましい。ｆｕｒＡ遺伝子が変異を有する場合、ｆｕｒＡ遺伝子はｆｕｒＡ変異プローブと結合するが、ｆｕｒＡ野生型プローブとは結合しない。一方、変異がない場合には、ｆｕｒＡ野生型プローブと結合する。したがって、ＩＮＨ感受性の場合はｆｕｒＡ野生型プローブにのみ結合し、ＩＮＨ耐性の場合は、ｆｕｒＡ野生型プローブには結合せずにｆｕｒＡ変異プローブに結合する。

さらに、本発明の試験片には、ｆａｂＧ１遺伝子およびｆｕｒＡ遺伝子以外の、ＩＮＨ感受性またはＩＮＨ耐性を検出可能な公知のプローブが固定されていてもよい。

本発明の試験片は、上記プローブを担体表面上に物理的または化学的に固定して作成することができる。担体としては、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されない。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。これらの担体は、発色法での検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。

上記プローブは、種類ごとに一定間隔で上記担体に配置されることが好ましい。これらの担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法がある。この方法によれば、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる。プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定化の効率を上げる方法もある。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液をディスペンサからニトロセルロース膜上に吐出して、紫外線を照射することによって、比較的容易に種々のプローブを固定化することができる。具体的には、各プローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５〜１．０μＬ／分の量を吐出させながら２．５〜８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが、一定の間隔で並んだ約１〜２ｍｍの幅のストライプとして塗布される。このプローブのストライプが塗布された担体に紫外線を照射することによって、プローブが担体上に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に配置された多数の試験片を一挙に得ることができる。

担体表面が金などの金属材料である場合には、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理することにより、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を介して固定化の効率がよくなることも知られている。

プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、プローブの末端をトリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基などのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法があり、このように修飾されたプローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより試験片が得られる。あるいは、ガラス、シリコンなどの無機材料担体をアミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、担体の表面をアミノ化し、次いで、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることにより、プローブを固定化する方法もある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、この修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することにより固定化することができる。

また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られている。

（試験片を用いたＩＮＨ感受性検出方法）
１．検体
本発明において、「検体」は、通常、結核菌検査に必要な検体であればよい。例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、ならびにこれらから培養して得られた培養物が挙げられる。

２．検体の前処理（ＤＮＡの抽出）
上記検体からのＤＮＡの抽出は、公知の方法で行うことができる。例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。

３．核酸の増幅
得られたＤＮＡから目的の遺伝子を取得する。ＰＣＲ法で目的の遺伝子を増幅する場合、例えば、以下の工程で行われる：（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程；（２）該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程；（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程；ならびに（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返す工程。

ｆａｂＧ１遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマー対として、変異部位を含むｆａｂＧ１遺伝子を増幅し得るように、該変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいプライマー対の例としては、配列表の配列番号６（ggctacatcg acaccgatat gacc）および配列番号７（gcgtccttgt gttgtgtcag tgg）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。一方、ｆｕｒＡ遺伝子をＰＣＲで増幅するために用いられるプライマー対として、変異部位を含むｆｕｒＡ遺伝子を増幅し得るように、該変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいプライマー対の例としては、配列表の配列番号１３（gccatcccac gatccagcgg）および配列番号１４（gtcgggcagc gcaaaacgca c）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

また、測定の感度を向上させるために、例えば、検体から直接ＤＮＡを増幅させる場合、上記ＰＣＲ反応の前にさらにNestedＰＣＲ法（特公平６−８１６００号公報）などで核酸を増幅してもよい。NestedＰＣＲ法におけるプライマーは、上記ＰＣＲ反応において用いたプライマーよりも外側の配列を選択することができる。例えば、ｆａｂＧ１遺伝子の場合は、配列表の配列番号４（gtcgaaggca aacgtgaccg cg）および配列番号５（gtccagcagt cctgtcatgt g）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、そしてｆｕｒＡ遺伝子の場合は、配列表の配列番号１１（ggctcatcgg aacatacgaa ggctg）および配列番号１２（gtcgtacacg gcttgccgg）のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

上記のプローブおよびプライマーの配列は、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社製）を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。

４．結核菌のＩＮＨ感受性検出方法
本発明において、結核菌のＩＮＨ感受性は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法によって検出することができる。より簡便には、固定されたプローブの位置と、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットの位置とを比較することにより検出することもできる。例えば、上記のプローブが固定された試験片を使用する場合、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法におけるハイブリダイズは、非特異的な結合反応が起きにくい点で、約６０〜６５℃の温度で行うことが好ましい。検出されたスポットの位置が、ｆａｂＧ１野生型プローブの位置であれば、結核菌は変異を有さない、すなわちＩＮＨ感受性であり、一方、検出されたスポットの位置がｆａｂＧ１変異プローブの位置であれば、結核菌はＩＮＨ耐性であると判断することができる。また、検出されたスポットの位置がｆｕｒＡ野生型プローブの位置であれば、結核菌はＩＮＨ感受性であると判断され、一方、検出されたスポットの位置がｆｕｒＡ変異プローブの位置であれば、結核菌はＩＮＨ耐性であると判断できる。

ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出されたスポットを容易に検出するためには、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質を修飾したプライマー対を用いて遺伝子を増幅することが好ましい。上記標識物質を用いた検出方法のうち、比較的安価で容易に実施できる点で、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が好ましい。具体的には、以下のとおりに行われる。まず、上記プライマーの３’末端または５’末端にビオチンを修飾したプライマー対を用いて、末端にビオチンを有する遺伝子を増幅する。次いで、増幅した遺伝子と試験片に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによってプローブに結合させ、さらにアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンに接触させて、プローブと結合している遺伝子の末端に存在するビオチンに結合させる。さらに、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えてアルカリホスファターゼと反応させることにより、プローブに結合しているアルカリホスファターゼが存在する位置で発色させる。この発色は視認可能である。

（試験片を含む検出用キット）
本発明の検出用キットは、上記の試験片を含む。好適には、結核菌のイソニアジド感受性を検出するために適切な任意の試薬類を含み得る。例えば、上記のＤＮＡの抽出のための試薬、遺伝子増幅用試薬、プローブへの遺伝子の結合を検出するための試薬などが挙げられる。具体的なキットとして、上記のＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を実施するためのキットを例示する。

本発明のキットに含まれ得るＤＮＡの抽出のための試薬は、上記の任意の手法で用いられる試薬である。

ｆａｂＧ１遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマー対も、本発明のキットに含まれ得る。プライマー対は、任意の変異部位を含むｆａｂＧ１遺伝子を増幅し得るように、変異部位を含む配列部位よりも上流の配列と、該部位よりも下流の配列とを含む、同一または相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ＩＮＨ感受性の検出のために、ｆａｂＧ１遺伝子増幅用の好ましいプライマー対の例としては、上記の配列表の配列番号６および７のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。一方、ｆｕｒＡ遺伝子については、上記の配列表の配列番号１３および１４のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。測定の感度を向上させるためのNestedＰＣＲ法におけるプライマー対はとしては、例えば、ｆａｂＧ１遺伝子については、上記の配列表の配列番号４および５のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、一方、ｆｕｒＡ遺伝子については、上記の配列表の配列番号１１および１２のオリゴヌクレオチドまたはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

さらに、上記プライマー対は、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法において検出を容易にするために、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などで修飾されていることが好ましい。

また、遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法以外にも、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の技術が挙げられる。本発明においては、これらのいずれかの手法を用いてもよく、本発明にはこれらの手法で用いられる任意の試薬を含むキットも含まれる。

さらに、本発明のキットは、検出のための試薬類を含み得る。例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法を採用する場合は、ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼ、ＮＢＴ、およびＢＣＩＰが挙げられる。

（実施例１：ＩＮＨ耐性結核菌の結核菌の遺伝子解析）
本実施例では、ＩＮＨ含有溶液（ＭＧＩＴ９６０：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）またはＩＮＨ含有寒天培地（小川培地、７Ｈ１０）における発育の確認によりＩＮＨ耐性結核菌と判定された９２検体を入手し、これらの９２検体からフェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出し精製した。

１．ｆａｂＧ１遺伝子の解析
以下に示すプライマー対を用いてｆａｂＧ１遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。
ｆａｂＧ１プライマー１ ggctacatcg acaccgatat gacc （配列番号６）
ｆａｂＧ１プライマー２ gcgtccttgt gttgtgtcag tgg （配列番号７）

増幅された９２例のｆａｂＧ１遺伝子の塩基配列をシークエンサーで調べた。その結果、新たな変異：Ｌｅｕ２０３Ｌｅｕ［ｃｔＧ→ｃｔＡ／Ｔ］が９２例中１５例において発見された。この変異は、塩基が置換されているにもかかわらずコードされるアミノ酸が変化しないサイレント変異であった。

２．ｆｕｒＡ遺伝子の解析
以下に示すプライマー対を用いてｆｕｒＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルにより、増幅を行った。
ｆｕｒＡプライマー１ gccatcccac gatccagcgg （配列番号１３）
ｆｕｒＡプライマー２ gtcgggcagc gcaaaacgca c （配列番号１４）

増幅された９２例のｆｕｒＡ遺伝子の塩基配列をシークエンサーで調べた。その結果、新たな変異：Ａｌａ１４Ｖａｌ［ｇＣｃ→ｇＴｃ］が９２例中１４例において発見された。

３．既知の変異の検出
上記９２検体について、既知の変異を有するｋａｔＧ遺伝子およびｉｎｈＡ遺伝子をそれぞれ増幅して、既知の変異の有無を検出した。

ｋａｔＧに関しては、ｆｕｒＡ−ｋａｔＧオペロンに対し、ｆｕｒＡ開始コドンを基点に１２９塩基上流に結合するプライマー（gctcatcgga acatacgaag：配列番号１５）とｋａｔＧ終止コドンを基点に５０塩基下流に結合するプライマー（gtgctgcggc gggttgtggt tgatcggcgg：配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシークエンシング法にて全塩基配列を決定した。既報論文で報告されていない変異を新規変異とした。

ｉｎｈＡに関しては、ｆａｂＧ１−ｉｎｈＡオペロンに対し、ｆａｂＧ１開始コドンを基点に２００塩基上流に結合するプライマー（ttcgtagggc gtcaatacac：配列番号１７）とｉｎｈＡ終止コドンを基点に４０塩基下流に結合するプライマー（ccgaacgaca gcagcaggac：配列番号１８）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシークエンシング法にて全塩基配列を決定した。既報論文で報告されていない変異を新規変異とした。

上記１〜３の解析結果を、以下の表１にまとめる。

表１からわかるように、既知の変異を有するＩＮＨ耐性菌は、９２検体中６７検体であったが、ｆａｂＧ１遺伝子およびｆｕｒＡ遺伝子の変異も考慮すると、９２検体中８３検体（９０．２％）の耐性菌について、ＩＮＨ耐性であると容易に判定できる。したがって、より確実かつ簡便な検出が可能となる。

（実施例２：試験片の作製）
１．プローブの設計
結核菌のＩＮＨ感受性を検出し得るプローブとして、以下の２つのプローブ（プローブ１および２：それぞれｆａｂＧ１野生型プローブおよびｆｕｒＡ野生型プローブ）を設計した。これらはいずれも、変異がある場合には結合せず、野生型の遺伝子とのみ結合（ハイブリダイズ）する野生型プローブである。

プローブ１ ggggcgctgc aatttatccc （配列番号３）
プローブ２ gctccggacg gccgacctgc g（配列番号１０）

２．プローブの固定化
上記プローブ１および２（それぞれ配列番号３および１０）のそれぞれの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃で４時間反応させた後、１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを加えることにより、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブ１ｐｍｏｌ／μＬを得た。

次いで、ポリチミン付加された野生型プローブ（プローブ１および２）をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量を吐出させながら２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布した。次いで、これらのニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブを固定化した。次いで、ニトロセルロース膜を、全てのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片を作成した。

本発明によれば、これまでＩＮＨ感受性について判定できなかったＩＮＨ耐性菌についても同定することができる。したがって、既存のｋａｔＧ遺伝子またはｉｎｈＡ遺伝子における変異を検出する方法と組み合わせることによって、ＩＮＨ耐性菌のうちの約９割について、培養することなく簡便にＩＮＨ耐性菌であると同定することができ、イソニアジドで治療不可能であることが容易に診断され得る。その結果、このような患者に、適切な治療を提供することができる。したがって、不要な薬剤投与や検査を防ぐことができ、患者の負担が軽減化され、さらに無駄な医療費を削減することができる。

Claims

結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法であって、
検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、および
該取得したｆａｂＧ１遺伝子について、イソニアジド耐性に関与する変異を検出する工程
を含み、
該変異が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへのサイレント変異、またはその相補配列の変異である、方法。
結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための試験片であって、
少なくとも１つのプローブが固定されており、
該少なくとも１つのプローブが、結核菌のｆａｂＧ１遺伝子のサイレント変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆａｂＧ１遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該サイレント変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、
該ｆａｂＧ１遺伝子の変異が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の６０９位の塩基ＧからＡまたはＴへサイレントの変異、またはその相補配列の変異である、試験片。
前記野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項２に記載の試験片。
さらに、結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるか、あるいは該結核菌のｆｕｒＡ遺伝子の変異を有する塩基配列の領域において、該変異を有する塩基配列の領域とはハイブリダイズし得ないが、該ｆｕｒＡ遺伝子の領域に対応する野生型塩基配列からなる領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなるプローブが固定されている、請求項２または３のいずれかに記載の試験片。
前記ｆｕｒＡ遺伝子の変異が、配列表の配列番号８に記載の塩基配列の４１位の塩基ＣからＴへの変異、またはその相補配列の変異である、請求項４に記載の試験片。
前記ｆｕｒＡ遺伝子の野生型塩基配列の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項５に記載の試験片。
請求項２から６のいずれかの項に記載の試験片を含む、結核菌におけるイソニアジド感受性の検出用キット。
結核菌におけるイソニアジド感受性を検出する方法であって、
検体中の結核菌のｆａｂＧ１遺伝子を取得する工程、
該取得したｆａｂＧ１遺伝子を請求項２から６のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合したｆａｂＧ１遺伝子を発色させる工程
を含む、方法。
請求項８に記載の方法であって、
前記検体中の結核菌のｆｕｒＡ遺伝子を取得する工程、
該取得したｆｕｒＡ遺伝子を請求項４から６のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブに結合させる工程、および
該プローブに結合したｆｕｒＡ遺伝子を発色させる工程
をさらに含む、方法。