WO2023282179A1 - マイクロアレイキット、マイクロアレイを用いたターゲット検出方法 - Google Patents

マイクロアレイキット、マイクロアレイを用いたターゲット検出方法 Download PDF

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WO2023282179A1
WO2023282179A1 PCT/JP2022/026290 JP2022026290W WO2023282179A1 WO 2023282179 A1 WO2023282179 A1 WO 2023282179A1 JP 2022026290 W JP2022026290 W JP 2022026290W WO 2023282179 A1 WO2023282179 A1 WO 2023282179A1
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WO
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nucleic acid
target nucleic
base
target
probe
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Application number
PCT/JP2022/026290
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English (en)
French (fr)
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有希華 竹口
光芳 大場
稔也 津田
俊昭 湯尻
Original Assignee
東洋鋼鈑株式会社
国立大学法人山口大学
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a microarray kit including a microarray equipped with a detection probe for detecting a target nucleic acid to be detected and a detection probe for detecting a non-target nucleic acid, and also relates to a method for detecting a target nucleic acid using the microarray.
  • Target nucleic acids are detected using microarrays in various fields such as clinical medicine, food, and the environment.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • Patent Document 1 discloses a microarray having detection spots to which nucleic acid probes used for detecting target nucleic acids are immobilized and reference spots to which two or more types of nucleic acid probes are immobilized. According to the microarray and the detection method disclosed in Patent Document 1, degradation of the microarray and defects in the detection procedure such as nucleic acid amplification reaction can be detected based on the signal of the reference spot.
  • nucleic acid probe In addition, in the hybridization between a target nucleic acid and a nucleic acid probe, which is the detection principle of microarrays, it is important that the nucleic acid probe accurately recognizes the target nucleic acid in order to accurately detect the target nucleic acid to be measured. Therefore, conventionally, when performing hybridization, a method of appropriately adjusting the salt concentration and reaction temperature of the reaction solution, or a blocking agent that suppresses non-specific hybridization between the nucleic acid probe and nucleic acid molecules other than the target of measurement is used. method is used.
  • Blocking agents include, for example, nucleic acid components that do not have a complementary base sequence, SDS (sodium dodecyl sulfate), N-lauroyl sarcosine (N-lauroyl sarcosine (N -LS), and proteins such as bovine serum albumin (BSA) and casein.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • N-lauroyl sarcosine N-lauroyl sarcosine
  • proteins such as bovine serum albumin (BSA) and casein.
  • Patent Document 2 a blocking nucleic acid that specifically hybridizes to a non-target nucleic acid is added to a buffer composition containing a target nucleic acid containing an allele to be detected in a genetic polymorphism and a non-target nucleic acid containing an allele other than the allele to be detected.
  • a method for detecting a target nucleic acid with high accuracy by mixing is disclosed.
  • Patent Document 3 discloses a method of using a common probe that hybridizes to both target nucleic acids and non-target nucleic acids when detecting a target nucleic acid with a nucleic acid probe.
  • This common probe is a nucleotide consisting of a base sequence complementary to a region that exists in common between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid. That is, when a target nucleic acid and a non-target nucleic acid are simultaneously amplified by an amplification nucleic acid reaction, the common probe specifically hybridizes to the amplified nucleic acid regardless of whether the target nucleic acid is present in the reaction solution. do.
  • the presence or absence of a mutation is determined using a value obtained by dividing the signal intensity from a nucleic acid probe that detects a non-target nucleic acid corresponding to the wild type by the signal intensity from a common probe.
  • the presence or absence of mutations can be determined with high accuracy when multiple mutations other than the wild type may exist.
  • the target nucleic acid can be detected with high accuracy even if the amount of target nucleic acid present is small compared to non-target nucleic acids.
  • the signal intensity from nucleic acid probes detecting non-target nucleic acids is reduced compared to systems without blocking nucleic acids.
  • a signal derived from a nucleic acid probe that detects a non-target nucleic acid can be used, for example, to determine the target nucleic acid, or to determine whether the amplification reaction of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid was performed normally. can.
  • the present invention provides a microarray kit containing a microarray capable of determining even when the signal intensity derived from a nucleic acid probe that detects a non-target nucleic acid is reduced due to the presence of a blocking nucleic acid, and a target nucleic acid It is an object of the present invention to provide a detection method for
  • the present invention which has achieved the above objects, includes the following. (1) A nucleotide sequence complementary to the region containing the detection target base of the target nucleic acid containing the gene mutation associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia in the MYD88 gene as the detection target base a target nucleic acid detection probe for the MYD88 gene; and a non-target nucleic acid containing the wild type corresponding to the genetic mutation of the MYD88 gene as a non-detectable base.
  • a microarray comprising a probe for detecting a non-target nucleic acid for the MYD88 gene; and a buffer containing a blocking nucleic acid for the MYD88 gene having a base sequence complementary to a region containing a non-target base in the non-target nucleic acid of the MYD88 gene.
  • a microarray kit comprising:
  • the microarray has a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and the non-target nucleic acid of the MYD88 gene and does not overlap with the common region containing the non-detection target base.
  • the microarray is complementary to a region of a target nucleic acid containing a gene mutation associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia in the CXCR4 gene as a base to be detected.
  • a CXCR4 gene target nucleic acid detection probe having a base sequence
  • a CXCR4 gene non-target nucleic acid detection probe having a sequence, wherein the buffer has a base sequence complementary to a region containing non-detectable bases in the non-target nucleic acid of the CXCR4 gene.
  • the microarray kit according to (1) further comprising a blocking nucleic acid.
  • the microarray has a sequence complementary to a common region common to the target nucleic acid and the non-target nucleic acid of the CXCR4 gene and does not overlap with the common region containing the non-detection target base.
  • CXCR4 gene having a sequence
  • the presence or absence of the target nucleic acid is determined based on the signal intensity from the target nucleic acid detection probe and the signal intensity from the non-target nucleic acid detection probe (5).
  • the base to be detected contained in the target nucleic acid is a gene mutation associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia in the MYD88 gene and/or lymphoplasmacytic lymphoma/Walden in the CXCR4 gene.
  • the method for detecting a target nucleic acid according to (5) which is a gene mutation associated with Ström's macroglobulinemia.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2021-111911, which is the basis of priority of this application.
  • the microarray kit according to the present invention can accurately determine genetic mutations associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia in the MYD88 gene.
  • the method for detecting a target nucleic acid according to the present invention, even if the signal from the non-target nucleic acid detection probe is low in the presence of the blocking nucleic acid, the target nucleic acid and the non-target nucleic acid are detected based on the signal intensity from the common probe. It can be accurately judged whether the amplification reaction of the target nucleic acid was performed normally.
  • FIG. 10 is a characteristic diagram showing the results of comparing the degree of separation when the length of the wild-type probe is changed. It is a characteristic diagram showing the results of measuring the fluorescence intensity from the common probe, (a) showing the results measured in the presence of the blocking nucleic acid, and (b) showing the results measured in the absence of the blocking nucleic acid. It is a result of measuring the fluorescence intensity from a wild-type probe, (a) shows the result of measurement in the presence of a blocking nucleic acid, and (b) is a characteristic diagram showing the result of measurement in the absence of a blocking nucleic acid. .
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of calculating the degree of separation for each gene mutation in the presence of blocking nucleic acids.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of calculating the degree of separation for each gene mutation in the absence of blocking nucleic acids.
  • a target nucleic acid containing a base to be detected and a non-target nucleic acid containing a non-detectable base corresponding to the base to be detected are amplified by an amplification reaction, and the target nucleic acid contained in the reaction solution is amplified.
  • a detection method using a microarray comprising a target nucleic acid detection probe that hybridizes to a target nucleic acid and a non-target nucleic acid detection probe that hybridizes to a non-target nucleic acid.
  • the microarray according to the present invention is a target nucleic acid contained in a reaction solution obtained by amplifying a target nucleic acid containing a base to be detected and a non-target nucleic acid containing a non-detectable base corresponding to the base to be detected by an amplification reaction. and a non-target nucleic acid detection probe for detecting non-target nucleic acids.
  • a reaction solution obtained by a nucleic acid amplification reaction and a hybridization buffer containing a blocking nucleic acid containing a base sequence complementary to a region containing a non-detectable base in a non-target nucleic acid are combined into the above microarray. come into contact with
  • the reaction solution and the hybridization buffer may be mixed in advance and the obtained mixture may be brought into contact with the microarray, or the reaction solution and the hybridization buffer may be brought into contact with the microarray. Also good.
  • this hybridization buffer By using this hybridization buffer, a portion of the non-target nucleic acid is hybridized with the blocking nucleic acid, thereby preventing non-specific hybridization of the non-target nucleic acid to the target nucleic acid detection probe. be able to.
  • the microarray used in this method comprises common probes having sequences complementary to common regions common to target nucleic acids and non-target nucleic acids.
  • the common region is a region of base sequences common to the target nucleic acid and the non-target nucleic acid, and is a region that does not overlap with the region in the non-target nucleic acid to which the aforementioned blocking nucleic acid hybridizes. That is, the common region is a region that does not overlap with the region where the target nucleic acid detection probe hybridizes, nor with the region where the non-target nucleic acid detection probe hybridizes.
  • a common probe defined in this way can hybridize to a common region in a target nucleic acid and can hybridize to a common region in a non-target nucleic acid even in the presence of a blocking nucleic acid.
  • the target nucleic acid means a nucleic acid molecule containing a base to be detected, that is, a nucleic acid fragment.
  • the target nucleic acid may be a nucleic acid molecule comprising DNA, a nucleic acid molecule comprising RNA, or a nucleic acid molecule comprising DNA and RNA (DNA-RNA complex).
  • Nucleic acid also includes artificial nucleic acids such as adenine, cytosine, guanine, thymine, uracil, and peptide nucleic acid (PNA) and locked nucleic acid (LNA).
  • the base to be detected means, for example, one or more nucleic acid residues at a predetermined position of a chromosome, and is not particularly limited, but means a specific type of base in a base sequence such as a single nucleotide polymorphism (SNP). are doing.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a given single nucleotide polymorphism can have A (adenine) or C (cytosine)
  • either one of the bases, that is, A (adenine) in the single nucleotide polymorphism can be used as the base to be detected.
  • the base to be detected may be either a major allele or a minor allele in a genetic polymorphism, and may or may not be a risk allele.
  • a target nucleic acid containing a base to be detected can be adjusted by amplifying a predetermined region containing the base to be detected by a nucleic acid amplification method.
  • the target nucleic acid may be cDNA obtained by reverse transcription reaction from transcripts collected from individual organisms, tissues, or cells.
  • the base length of the target nucleic acid is not particularly limited, but can be, for example, 60 to 1000 bases, preferably 60 to 500 bases, more preferably 60 to 200 bases.
  • a nucleic acid molecule (nucleic acid fragment) containing a non-detection target base corresponding to a target nucleic acid containing a detection target base is referred to as a non-target nucleic acid.
  • a non-target nucleic acid For example, when one of a plurality of bases that can be taken at a predetermined position in a chromosome is set as a base to be detected, the bases other than the base to be detected are set as non-detected bases.
  • a single nucleotide polymorphism at a predetermined position can be A (adenine) or C (cytosine)
  • a (adenine) in the single nucleotide polymorphism is the base to be detected
  • the single nucleotide polymorphism C (cytosine) in is the non-detectable base.
  • a non-target nucleic acid containing a non-detection target base is obtained at the same time as obtaining a target nucleic acid containing a detection target base as described above, if there is a non-detection target base on the chromosome.
  • a target nucleic acid is obtained by a nucleic acid amplification reaction such as a polymerase chain reaction, if one allele is a non-detectable base, the non-target nucleic acid will be amplified along with the target nucleic acid.
  • a step of extracting genomic DNA from a sample derived from a subject A range of nucleic acid amplification methods can be applied, including the step of amplifying the region.
  • Subjects are usually humans, and patients suspected of having lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia, as detailed in the examples, and other cancers can be diagnosed by testing for genetic polymorphisms. Patients suffering from various diseases can be mentioned. In addition, it is good also considering a healthy person as a subject.
  • Subject-derived samples are not particularly limited. Examples thereof include blood-related samples (blood, serum, plasma, etc.), lymph, feces, cancer cells, tissue or organ lysates and extracts, and the like.
  • the extraction means for extracting genomic DNA from samples collected from subjects is not particularly limited.
  • DNA extraction methods using phenol/chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB and the like can be used.
  • an amplification reaction is performed using the obtained genomic DNA as a template to amplify the target nucleic acid and the non-target nucleic acid.
  • amplification reaction polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids) method, and the like can be applied.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • ICAN Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids
  • the method for labeling the amplified target nucleic acid and non-target nucleic acid is not particularly limited. Methods using nucleotides as substrates may also be used. Labeling substances are not particularly limited, but radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) and biotin can be used.
  • DIG digoxigenin
  • this reaction system includes a buffer necessary for nucleic acid amplification and labeling, a thermostable DNA polymerase, a pair of primers designed based on the base sequences of the target nucleic acid and non-target nucleic acid, and a labeled nucleotide triphosphate (specifically, (nucleotide triphosphate with a fluorescent label, etc.), nucleotide triphosphate, magnesium chloride, and the like.
  • the blocking nucleic acid contained in the hybridization buffer is designed to have a base sequence complementary to the region containing non-detectable bases in the non-target nucleic acid. Therefore, the blocking nucleic acid can hybridize to a region of the non-target nucleic acid containing non-detection target bases under conditions in which the target nucleic acid and the probe for detecting the target nucleic acid can hybridize.
  • the blocking nucleic acid is not particularly limited, but preferably has a length of 60% or more of the base length of the target nucleic acid detection probe. Also, the blocking nucleic acid preferably has a length shorter than the base length of the target nucleic acid detection probe. For example, if the target nucleic acid detection probe has a length of 25 bases, the blocking nucleic acid preferably has a base length of 15 to 24 bases.
  • the base complementary to the non-detectable base is preferably positioned at the center of the character string when the bases constituting the blocking nucleic acid are viewed as a character string.
  • the center of the character string includes the case where the blocking nucleic acid consisting of an even number of bases is shifted by one base toward the 5' end or 3' end.
  • the blocking nucleic acid may contain mismatched bases (non-complementary bases) at positions corresponding to bases other than non-detectable bases contained in non-target nucleic acids.
  • the number of mismatched bases can be 1-3, preferably 1-2.
  • the number of mismatched bases can be 1 to 3, preferably 1 to 2.
  • the concentration of the blocking nucleic acid is not particularly limited, but can be set as appropriate according to, for example, the concentration of the non-target nucleic acid and/or the concentration of the target nucleic acid.
  • the concentration of the blocking nucleic acid in the composition can be 0.01 to 1 ⁇ M, preferably 0.05 to 0.75 ⁇ M, more preferably 0.125 to 0.5 ⁇ M. .
  • blocking nucleic acids may be prepared for all non-target nucleic acids, or blocking nucleic acids may be prepared for some of the non-target nucleic acids. good.
  • the blocking nucleic acid is more preferably single-stranded DNA, which can be chemically synthesized, for example, using a nucleic acid synthesizer.
  • a nucleic acid synthesizer an apparatus called a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, an automatic nucleic acid synthesizer, or the like can be used.
  • the hybridization buffer configured as described above contains the blocking nucleic acid, it is possible to suppress non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the target nucleic acid detection probe. Inhibition of specific hybridization with the probe can be prevented. Therefore, by using the hybridization buffer, the target nucleic acid can be detected with high accuracy using the target nucleic acid detection probe even when the concentration of the target nucleic acid is low. In addition, by using a hybridization buffer containing a blocking nucleic acid, even if there is a non-target nucleic acid that differs from the target nucleic acid by only one base, the target nucleic acid can be detected using the target nucleic acid detection probe. Nucleic acids can be detected with high accuracy.
  • a microarray is a method in which target nucleic acid detection probes, non-target nucleic acid detection probes, and common probes are immobilized on a carrier (including substrates, hollow fibers, and microparticles), and target nucleic acids are detected using the immobilized target nucleic acid detection probes (including qualitative and quantitative).
  • noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductive materials such as carbon represented by graphite and carbon fiber; single crystal silicon, amorphous Silicon materials such as silicon, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride; composite materials of these silicon materials such as SOI (silicon on insulator); glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, foil Inorganic materials such as stellite and photosensitive glass; polyethylene, ethylene, polypropylene, cyclic polyolefin, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal , acrylic resin, polyacrylonitrile, polysty
  • the carrier preferably has a carbon layer such as diamond-like carbon (DLC) on the surface and a chemical modification group such as an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group and an active ester group.
  • DLC diamond-like carbon
  • a carrier is used.
  • Carriers having a carbon layer and chemically modifying groups on the surface include those having a carbon layer and chemically modifying groups on the surface of a substrate and those having a substrate consisting of a carbon layer and chemically modifying groups on the surface.
  • the material for the substrate those known in the art can be used without particular limitation, and the same materials as those listed above as the carrier material can be used.
  • the 5' end of the target nucleic acid detection probe, non-target nucleic acid detection probe, and common probe described above may be directly fixed to the carrier, or may be fixed to the carrier via a linker.
  • the target nucleic acid detection probe is designed to have a base sequence complementary to the region containing the detection target base in the target nucleic acid containing the detection target base.
  • the target nucleic acid detection probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, preferably 15 to 25 bases long.
  • the base complementary to the base to be detected is preferably located at the center of the character string when the bases constituting the target nucleic acid detection probe are viewed as a character string.
  • the center of the character string includes the case where the target nucleic acid detection probe consisting of an even number of bases is shifted by one base toward the 5' end or the 3' end.
  • the non-target nucleic acid detection probe detects a non-target nucleic acid containing non-detection target bases, and has a base sequence complementary to a region containing at least the non-detection target bases in the non-target nucleic acid.
  • the non-target nucleic acid detection probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, preferably 15 to 25 bases long.
  • the base complementary to the non-detection target base is preferably located at the center of the character string when the bases constituting the non-target nucleic acid detection probe are viewed as a character string. Note that the center of the character string includes the case where the non-target nucleic acid detection probe consisting of an even number of bases is shifted by one base toward the 5' end or 3' end.
  • the microarray used in this method comprises common probes having sequences complementary to common regions common to target nucleic acids and non-target nucleic acids.
  • the common probe is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 bases long, preferably 15 to 25 bases long.
  • the microarray is brought into contact with the hybridization buffer containing the above-described blocking nucleic acid.
  • the series of nucleic acid amplification methods described above was performed normally. Specifically, when the signal from the common probe exceeds a predetermined value (threshold value), it is determined that the series of nucleic acid amplification methods described above was performed normally. After determining that the series of nucleic acid amplification methods described above has been performed normally, it is possible to determine whether or not the target nucleic acid is present based on the signals from the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe. .
  • the series of nucleic acid amplification methods described above was performed normally by the signal from the non-target nucleic acid detection probe instead of the common probe, a sufficient signal cannot be obtained, and the series of nucleic acid amplification described above is performed. It may not be possible to accurately determine whether the method was successful. For example, when the amount of genomic DNA used as a template is small, or when a blocking nucleic acid is present, a sufficient signal cannot be obtained from the non-target nucleic acid detection probe.
  • the method of the present invention utilizes a signal from a common probe that can hybridize with both a target nucleic acid and a non-target nucleic acid hybridized with a blocking nucleic acid, the amount of genomic DNA used as a template is small, or the blocking nucleic acid is present. Even if it does, it can be accurately determined whether the series of nucleic acid amplification methods described above was performed normally.
  • target nucleic acids are detected in the reaction solution after the amplification reaction based on the signals from the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe. can determine if it exists.
  • the blocking nucleic acid can suppress non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe.
  • the hybridization reaction using the hybridization buffer is preferably performed under stringent conditions.
  • Stringent conditions refer to conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. °C for 10 minutes and 2xSSC at 25°C for 5 minutes.
  • the hybridization buffer may contain a salt necessary for the hybridization reaction, such as SSC, and a known blocking agent, such as SDS.
  • SSC salt necessary for the hybridization reaction
  • SDS a known blocking agent
  • the chain length of the probe it is more preferable to set the hybridization temperature lower than this, and when the chain length of the probe is long, it is more preferable to set the hybridization temperature higher than this.
  • the higher the salt concentration the higher the specific hybridization temperature, and conversely, the lower the salt concentration, the lower the specific hybridization temperature.
  • reaction solution containing the target nucleic acid and non-target nucleic acid after the amplification reaction is premixed with other compositions (blocking nucleic acid, etc.) to specifically hybridize the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid.
  • the reaction solution is brought into contact with the microarray to proceed with hybridization between the target nucleic acid and non-target nucleic acid and the common probe, hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe, and hybridization between the non-target nucleic acid and the non-target nucleic acid detection probe. You can let me.
  • the reaction solution containing the target nucleic acid and non-target nucleic acid after the amplification reaction is mixed with other compositions (blocking nucleic acid, etc.) on a microarray to specifically hybridize the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid.
  • the hybridization of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid to the common probe, the hybridization of the target nucleic acid and the nucleic acid probe, and the hybridization of the non-target nucleic acid and the non-target nucleic acid detection probe may proceed simultaneously.
  • the fluorescence signal from each probe is detected using a fluorescence scanner, and the signal intensity can be quantified by analyzing this with image analysis software.
  • the signals from the target nucleic acid detection probe and the non-target nucleic acid detection probe each intensity is measured, and a judgment value for evaluating the signal intensity from the target nucleic acid detection probe is calculated.
  • An example of calculating the determination value is the formula: [signal intensity from target nucleic acid detection probe]/([signal intensity from target nucleic acid detection probe]+[signal intensity from non-target nucleic acid detection probe]). is used.
  • [Intensity of signal from probe for detecting target nucleic acid]/[Intensity of signal from common probe] is also known as a formula for calculating the determination value.
  • the non-target nucleic acid is a wild type corresponding to the gene mutation
  • the above formula: [signal intensity from target nucleic acid detection probe] / ([signal intensity from target nucleic acid detection probe] + [non-target Signal intensity from nucleic acid detection probes]) is preferable because of its high mutation detection sensitivity.
  • the determination value calculated by the above formula is compared with a predetermined threshold (cutoff value), and if the determination value exceeds the threshold, it is determined that the amplified nucleic acid contains the target nucleic acid, and the determination value is If it is below the threshold, it is determined that the amplified nucleic acid does not contain the target nucleic acid.
  • a predetermined threshold cutoff value
  • the threshold value is not particularly limited. It can be specified based on the judgment value obtained. More specifically, a plurality of judgment values are calculated using a plurality of specimens that have been confirmed not to have a base to be detected such as each gene mutation, and the average value + 3 ⁇ ( ⁇ : standard deviation) value is calculated. can be a threshold. It should be noted that the average value +2 ⁇ or the average value + ⁇ can also be used as the threshold value.
  • the amplification reaction can be performed normally even when the amount of genomic DNA in the template used for amplifying the target nucleic acid and the non-target nucleic acid is small. It is possible to accurately determine whether the procedure has been performed and to accurately detect the presence of the target nucleic acid.
  • the amount of the genomic DNA that serves as the template is not particularly limited, but even if the amount is, for example, 100 to 800 fg, the success or failure of the nucleic acid amplification reaction can be accurately determined.
  • the method according to the present invention can be applied to the aspect of acquiring data for definitive diagnosis of lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström's macroglobulinemia.
  • a predetermined single nucleotide polymorphism in the MYD88 gene when detecting a predetermined single nucleotide polymorphism in the MYD88 gene when a B-cell lymphoma patient with IgM type M proteinemia deteriorates (increase in M protein, etc.), and predicting the effect of ibrutinib as a therapeutic drug
  • gene mutations associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia in the MYD88 gene include gene mutations encoding amino acid substitution mutations such as L265P.
  • Gene mutations associated with lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom's macroglobulinemia in the CXCR4 gene include gene mutations encoding amino acid substitution mutations such as S338X and R334X.
  • Example 1 In this example, analysis of the MYD88 and CXCR4 genes is effective as a definitive diagnosis and medical aid for WM/LPL patients when the condition of B-cell lymphoma patients with IgM-type M proteinemia worsens (increase in M protein, etc.) did Table 1 shows the target test mutations of MYD88/CXCR4. Table 2 shows the primer set for amplifying the site to be analyzed.
  • nucleotide sequences of the primers MYD_F, IC5-MYD_R, CXCR_F and IC5-CXCR_R shown in Table 2 are SEQ ID NOS: 1-4, respectively.
  • Hybridization reaction was performed using a MYD88/CXCR4 analysis chip (WM chip) prepared in advance.
  • Prepared hybridization buffer (2.25 ⁇ SSC, 0.23% SDS) PCR product was removed from freezer and allowed to come to room temperature.
  • Hybridization buffer (2.25 ⁇ SSC, 0.23% SDS) was supplemented with blocking nucleic acids shown in Table 5. The blocking nucleic acid is added for the purpose of suppressing non-specific hybridization of the mutation detection probe so that sufficient detection sensitivity can be obtained even if the mutation rate of the gene to be analyzed is small. It was designed to specifically hybridize with the derived amplification product.
  • ICHIhyb is an oligonucleotide that hybridizes with the positional probe (ICHI) shown in Table 8 below. Hybridization between the ICHIhyb and the positional probe (ICHI) can indicate the presence or absence of deterioration of the microarray and the position of the probe on the microarray.
  • ICHIhyb consists of a sequence unrelated to the mutation to be detected and is added to the hybridization buffer along with blocking nucleic acid.
  • the nucleotide sequences of the blocking nucleic acids MYD_B, CXCR_1012B, CXCR_1000B, CXCR_952B and ICHIhyb shown in Table 5 are SEQ ID NOS:5-9.
  • Table 7 shows the mutation probe corresponding to the mutation of MYD88 and the wild-type probe against this.
  • the nucleotide sequences of probes MYD_W1, MYD_W2, and MYD_M01 shown in Table 7 are SEQ ID NOS: 10-12, respectively.
  • a determination value which is an intensity ratio, was calculated from the fluorescence intensity of each probe using the following formula.
  • Judgment value Intensity of mutant probe/(Intensity of wild-type probe + Intensity of mutant probe)
  • a blocking nucleic acid with a sequence complementary to the wild-type target is used.
  • the blocking nucleic acid prevents the wild-type target from hybridizing to the mutant probe by hybridizing to the wild-type target that non-specifically hybridizes to the mutant probe. This can increase the sensitivity of detection of lower abundance mutant targets.
  • common probes were designed that can hybridize to wild-type and mutant targets even in the presence of blocking nucleic acids. From this common probe, fluorescence intensity is detected depending on the product amount (total amount of wild-type target and mutant-type target) regardless of the presence or absence of target mutation. Therefore, by using the signal from the common probe as an indicator of amplification, even specimens that did not meet the standard for fluorescence intensity with the wild-type probe could be judged, and the minimum DNA detection amount could be improved.
  • Table 8 shows the sequences of the mutant probe corresponding to the mutant target, the wild-type probe corresponding to the wild-type target, and the common probe.
  • test condition 1 is a condition in which a blocking nucleic acid is present and evaluation of wild-type, mutant-type and common probes.
  • Test results Table 10 shows the results of evaluating the fluorescence intensity from each probe in the presence of the blocking nucleic acid
  • Table 11 shows the results of evaluating the fluorescence intensity from each probe in the absence of the blocking nucleic acid.
  • the condition where the fluorescence intensity became 1000 or more was evaluated as ⁇ , and the other conditions as x.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the fluorescence intensity from the common probe.
  • FIG. 2(a) shows the results measured in the presence of the blocking nucleic acid
  • FIG. 2(b) shows the results measured in the absence of the blocking nucleic acid.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the fluorescence intensity from the wild-type probe.
  • FIG. 3(a) shows the results measured in the presence of the blocking nucleic acid
  • FIG. 3(b) shows the results measured in the absence of the blocking nucleic acid.
  • the common probe detected fluorescence intensity at 100 fg or more of template DNA
  • the wild-type probe detected fluorescence intensity with all probes at 800 fg or more of template DNA.
  • the fluorescence intensity could be detected with the template DNA of 200 fg or more for both the common probe and the wild-type probe.
  • Table 12 shows the results of evaluating the degree of separation in the presence of blocking nucleic acids
  • Table 13 shows the results of evaluating the degree of separation in the absence of blocking nucleic acids.
  • Conditions where the degree of separation was 0.25 or higher were evaluated as ⁇ , and other conditions as x.
  • FIG. 4 shows the results of calculating the degree of separation for each gene mutation in the presence of the blocking nucleic acid
  • FIG. 5 shows the result of calculating the degree of separation for each gene mutation in the absence of the blocking nucleic acid.
  • Table 14 shows the test results for evaluating each fluorescence intensity and degree of separation.
  • Table 14 shows the conditions under which the fluorescence intensity was 1000 or more and the separation was 0.25 or more: ⁇ , and the others were indicated by ⁇ .

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Abstract

ブロッキング核酸の存在下でも増幅反応の成否を正確に判定する。　共通プローブを備えるマイクロアレイに反応液を接触させ共通プローブからのシグナル強度に基づいて増幅反応の成否を判断する。また、マイクロアレイキットによれば、ＭＹＤ８８遺伝子変異を正確に判定することができる。

Description

マイクロアレイキット、マイクロアレイを用いたターゲット検出方法
　本発明は、検出目的のターゲット核酸を検出する検出プローブ及び非ターゲット核酸を検出する検出プローブを備えるマイクロアレイを含むマイクロアレイキットに関し、また、当該マイクロアレイを用いたターゲット核酸の検出方法に関する。
　臨床医療、食品、環境等の様々な分野においてマイクロアレイを用いたターゲット核酸の検出が行われている。中でも、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）は、疾患に対する罹患リスクや、薬剤に関する薬効の個人差に関連するため、マイクロアレイを用いて優れた感度及び特異度で多型を検出することが求められている。
　例えば、特許文献１には、ターゲット核酸の検出に使用する核酸プローブを固定した検出スポットと、２種以上の核酸プローブを固定した基準スポットを有するマイクロアレイが開示されている。特許文献１に開示されたマイクロアレイや検出方法によれば、マイクロアレイの劣化や、核酸増幅反応等の検出手順の不良を基準スポットのシグナルに基づいて検出することができる。
　また、マイクロアレイの検出原理であるターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションにおいて、測定対象のターゲット核酸を正確に検出するには、核酸プローブがターゲット核酸を正確に認識することが重要である。よって従来、ハイブリダイゼーションを行う際は、反応液の塩濃度や反応温度を適宜調節する方法や、核酸プローブと測定対象以外の核酸分子との非特異的なハイブリダイズを抑制するブロッキング剤を使用する方法が用いられている。ブロッキング剤としては、例えば、サケ精子ＤＮＡや酵母ｔＲＮＡなどの測定対象の核酸分子や核酸プローブに対して、相補的な塩基配列を有しない核酸成分、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｎラウロイルサルコシン（Ｎ－ＬＳ）などの界面活性剤、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどのタンパク質が知られている。
　特許文献２には、遺伝子多型における検出対象アレルを含むターゲット核酸と当該検出対象アレル以外のアレルを含む非ターゲット核酸と含むバッファー組成物に、非ターゲット核酸に特異的にハイブリダイズするブロッキング核酸を混合することで、ターゲット核酸を高精度に検出する方法が開示されている。
　また、特許文献３には、核酸プローブによりターゲット核酸を検出するに際して、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の両方にハイブリダイズする共通プローブを使用する方法が開示されている。この共通プローブは、ターゲット核酸と非ターゲット核酸とに共通して存在する領域に相補的な塩基配列からなるヌクレオチドである。すなわち、共通プローブは、増幅核酸反応によりターゲット核酸と非ターゲット核酸とを同時に増幅する場合、反応液にターゲット核酸が存在するか、存在しないかに拘わらず当該増幅核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特許文献３に開示された方法では、野生型に対応する非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナル強度を、共通プローブ由来のシグナル強度で割った値を用いて、変異の有無を判定している。特許文献３に開示された方法では、上記値を使用することで、野生型以外に複数の変異が存在しうる場合に、変異の有無を精度良く判定することができる。
特許第５６０７３７３号 特許第６６４４２９７号 ＷＯ２０１９／００４３３４
　従来の技術においてブロッキング核酸を使用する場合、非ターゲット核酸に比べてターゲット核酸の存在量が僅かであっても高精度にターゲット核酸を検出すできる利点がある。しかしながら、非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナル強度は、ブロッキング核酸を使用しない系と比較して低下する。非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナルは、例えば、ターゲット核酸の判定に利用したり、また、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたかを判定する際に利用することができる。
　そこで、本発明は、このような実情に鑑み、非ターゲット核酸を検出する核酸プローブ由来のシグナル強度がブロッキング核酸の存在によって低下した場合であっても判定可能なマイクロアレイを含むマイクロアレイキット、及びターゲット核酸の検出方法を提供することを目的とする。
　上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
　（１）ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を検出対象塩基として含むターゲット核酸の当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用ターゲット核酸検出用プローブと；上記ＭＹＤ８８遺伝子の遺伝子変異に対応する野生型を非検出対象塩基として含む非ターゲット核酸の当該非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用非ターゲット核酸検出用プローブと、を備えるマイクロアレイと、上記ＭＹＤ８８遺伝子の非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用ブロッキング核酸を含むバッファーとを備えるマイクロアレイキット。
　（２）上記マイクロアレイは、上記ＭＹＤ８８遺伝子のターゲット核酸と非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用共通プローブをさらに備えることを特徴とする（１）記載のマイクロアレイキット。
　（３）上記マイクロアレイは、ＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を検出対象塩基として含むターゲット核酸の当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用ターゲット核酸検出用プローブと；上記ＣＸＣＲ４遺伝子の遺伝子変異に対応する野生型を非検出対象塩基として含む非ターゲット核酸の当該非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用非ターゲット核酸検出用プローブとをさらに備え、上記バッファーは、上記ＣＸＣＲ４遺伝子の非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用ブロッキング核酸をさらに含むことを特徴とする（１）記載のマイクロアレイキット。
　（４）上記マイクロアレイは、上記ＣＸＣＲ４遺伝子のターゲット核酸と非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用共通プローブをさらに備えることを特徴とする（３）記載のマイクロアレイキット。
　（５）検出対象塩基を含むターゲット核酸と前記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸との増幅反応後の反応液と；前記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーとを準備する工程と、上記ターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用プローブと、上記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用プローブと、上記ターゲット核酸及び上記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを備えるマイクロアレイに対して、上記反応液及び上記ハイブリダイゼーション用バッファーを接触させる工程と、上記マイクロアレイにおける上記共通プローブからのシグナル強度が閾値を超える場合に上記ターゲット核酸と上記非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたと判断する工程とを含む、ターゲット核酸の検出方法。
　（６）上記判断する工程の後、上記ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度、上記非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度に基づいてターゲット核酸の有無を判定することを特徴とする（５）記載のターゲット核酸の検出方法。
　（７）[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]／（[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]＋[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]）の値を算出し、当該値が閾値を超える場合にターゲット核酸が存在すると判定することを特徴とする（６）記載のターゲット核酸の検出方法。
　（８）上記ターゲット核酸と上記非ターゲット核酸の増幅反応は、鋳型核酸量がコピー数として1.79×105～1.43×106copiesであることを特徴とする（５）記載のターゲット核酸の検出方法。
　（９）上記ターゲット核酸に含まれる検出対象塩基は、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異及び/又はＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異であることを特徴とする（５）記載のターゲット核酸の検出方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-111911号の開示内容を包含する。
　本発明に係るマイクロアレイキットは、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を正確に判定できる。
　また、本発明に係るターゲット核酸の検出方法によれば、ブロッキング核酸の存在下で非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルが低かったとしても、共通プローブからのシグナル強度に基づいて、ターゲット核酸と非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたかを正確に判断できる。
野生型プローブの長さを変更したときの分離度を比較した結果を示す特性図である。 共通プローブからの蛍光強度を測定した結果であり、（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果を示す特性図である。 野生型プローブからの蛍光強度を測定した結果であり、（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果を示す特性図である。 ブロッキング核酸の存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を示す特性図である。 ブロッキング核酸の非存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を示す特性図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るターゲット核酸の検出方法は、検出対象塩基を含むターゲット核酸と当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とを増幅反応により増幅し、反応液に含まれるターゲット核酸にハイブリダイズするターゲット核酸検出用プローブと非ターゲット核酸にハイブリダイズする非ターゲット核酸検出用プローブとを備えるマイクロアレイで検出する方法である。また、本発明に係るマイクロアレイは、検出対象塩基を含むターゲット核酸と当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とを増幅反応により増幅して得られる反応液に含まれるターゲット核酸を検出するためのターゲット核酸検出用プローブ、非ターゲット核酸を検出するための非ターゲット核酸検出用プローブを備えるものである。
　特に、本方法では、核酸増幅反応で得られた反応液と、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーとを上記マイクロアレイに接触させる。このとき、反応液とハイブリダイゼーション用バッファーとは予め混合しておき、得られた混合液を上記マイクロアレイに接触させても良いし、反応液とハイブリダイゼーション用バッファーとをそれぞれ上記マイクロアレイに接触させても良い。このハイブリダイゼーション用バッファーを使用することで、非ターゲット核酸の一部をブロッキング核酸とハイブリダイズさせることで、当該非ターゲット核酸がターゲット核酸検出用プローブに対して非特異的にハイブリダイズすることを防ぐことができる。
　特に、本方法に使用するマイクロアレイは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブを備えている。共通領域とは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する塩基配列の領域であって、非ターゲット核酸における上述したブロッキング核酸がハイブリダイズする領域と重複しない領域である。すなわち、共通領域は、ターゲット核酸検出用プローブがハイブリダイズする領域とも、非ターゲット核酸検出用プローブがハイブリダイズする領域とも重複しない領域である。このように規定した共通プローブは、ターゲット核酸における共通領域にハイブリダイズできるとともに、ブロッキング核酸の存在下であっても非ターゲット核酸における共通領域にハイブリダイズすることができる。
　ここで、ターゲット核酸とは、検出対象塩基を含む核酸分子、すなわち核酸断片を意味する。ターゲット核酸は、ＤＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＲＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＤＮＡとＲＮＡとを含む核酸分子（ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体）でもよい。また、核酸としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、並びに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）等の人工核酸を含む意味である。
　検出対象塩基とは、例えば染色体の所定の位置における１又は複数の核酸残基を意味しており、特に限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）等の塩基配列における特定の塩基の種類を意味している。例えば、所定の一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうるとして、いずれか一方の塩基、すなわち当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすることができる。ここで、検出対象塩基としては、遺伝子多型におけるメジャーアレル及びマイナーアレルのいずれでも良いし、リスクアレルであってもなくても良い。
　検出対象塩基を含むターゲット核酸は、検出対象塩基を含む所定の領域を核酸増幅法により増幅することで調整することができる。また、ターゲット核酸としては、生物個体、組織及び細胞採取から採取した転写産物から逆転写反応により得られるｃＤＮＡとしても良い。ターゲット核酸の塩基長としては、特に限定されないが、例えば６０～１０００塩基とすることができ、６０～５００塩基とすることが好ましく、６０～２００塩基とすることがより好ましい。
　なお、検出対象塩基を含むターゲット核酸に対して、当該検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む核酸分子（核酸断片）を非ターゲット核酸と称する。例えば、染色体における所定の位置で取りうる複数の塩基のうち、１つの塩基を検出対象塩基とした場合、検出対象塩基以外の塩基を非検出対象塩基とする。より具体的に、所定の位置における一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうる場合、当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすると、当該一塩基多型におけるＣ（シトシン）が非検出対象塩基ということになる。
　非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸は、染色体上に非検出対象塩基が存在する場合、上述のように検出対象塩基を含むターゲット核酸を取得する際に同時に取得される。例えば、ターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、一方のアレルが非検出対象塩基であれば、ターゲット核酸とともに非ターゲット核酸が増幅されることとなる。
　ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を核酸増幅により取得するには、先ず、被検者由来の試料からゲノムＤＮＡを抽出する工程と、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、検出対象塩基又は非検出対象塩基を含む領域を増幅する工程とを含む一連の核酸増幅方法が適用できる。
　被検者は通常ヒトであり、詳細を実施例に示すようなリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症が疑われる患者、その他、癌など遺伝子多型を検査することで診断可能な疾患に罹患した患者を挙げることができる。なお、健常者を被検者としてもよい。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織又は臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
　被検者から採取した試料からゲノムＤＮＡを抽出する抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、ＣＴＡＢなどを用いたＤＮＡ抽出法を用いることができる。
　次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて増幅反応を行い、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅されたターゲット核酸及び非ターゲット核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
　またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸の塩基配列に基づいて設計された一対のプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
　一方、ハイブリダイゼーション用バッファーに含まれるブロッキング核酸は、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するように設計される。よって、ブロッキング核酸は、ターゲット核酸とターゲット核酸検出用プローブとがハイブリダイズできる条件下において、非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域にハイブリダイズすることができる。ブロッキング核酸としては、特に限定されないが、ターゲット核酸検出用プローブの塩基長に対して６０％以上の長さであることが好ましい。また、ブロッキング核酸は、ターゲット核酸検出用プローブの塩基長よりも短い長さであることが好ましい。例えばターゲット核酸検出用プローブの長さが２５塩基長とすると、ブロッキング核酸の塩基長は１５～２４塩基長であることが好ましい。
　また、ブロッキング核酸において、非検出対象塩基に相補的な塩基は、ブロッキング核酸を構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなるブロッキング核酸については５’末端又は３’末端方向に１塩基ずれている場合を含む意味である。
　さらに、ブロッキング核酸は、非ターゲット核酸に含まれる非検出対象塩基以外の塩基に対応する位置にミスマッチな塩基（相補的でない塩基）を含んでいても良い。ブロッキング核酸が１５塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。また、ブロッキング核酸が２４塩基長である場合、ミスマッチな塩基は１～３個とすることができ、１～２個であることが好ましい。
　さらにまた、ハイブリダイゼーション用バッファーにおいて、ブロッキング核酸の濃度は、特に限定されないが、例えば、非ターゲット核酸の濃度及び/又はターゲット核酸の濃度に応じて適宜設定することができる。具体的にブロッキング核酸の組成物中の濃度は、０．０１～１μＭとすることができ、０．０５～０．７５μＭとすることが好ましく、０．１２５～０．５μＭとすることがより好ましい。
　なお、所定のターゲット核酸に対して複数の非ターゲット核酸が存在する場合、全ての非ターゲット核酸についてそれぞれブロッキング核酸を準備しても良いし、一部の非ターゲット核酸についてブロッキング核酸を準備しても良い。
　また、ブロッキング核酸は、より好ましくは一本鎖ＤＮＡであり、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
　以上のように構成されたハイブリダイゼーション用バッファーは、ブロッキング核酸を含むため、非ターゲット核酸とターゲット核酸検出用プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、ターゲット核酸とターゲット核酸検出用プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、ハイブリダイゼーション用バッファーを使用することによって、例えばターゲット核酸が低濃度であるような場合であっても、ターゲット核酸検出用プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。また、ブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーを使用することによって、例えば、ターゲット核酸に対して一塩基のみが相違する非ターゲット核酸が存在する場合であっても、ターゲット核酸検出用プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。
　以下、ターゲット核酸を検出する際に使用されるマイクロアレイについて説明する。マイクロアレイは、担体（基板、中空繊維、微粒子を含む）にターゲット核酸検出用プローブ、非ターゲット核酸検出用プローブ及び共通プローブを固定し、固定化したターゲット核酸検出用プローブを用いてターゲット核酸を検出（定性、定量を含む）するものである。
　マイクロアレイにおける担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
　なお担体として、好ましくは表面にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ　Ｌｉｋｅ　Ｃａｒｂｏｎ）等のカーボン層と、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基等の化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
　上述したターゲット核酸検出用プローブ、非ターゲット核酸検出用プローブ及び共通プローブは、その５’末端を直接担体に固定しても良いし、リンカーを介して担体に固定してもよい。
　ターゲット核酸検出用プローブは、検出対象塩基を含むターゲット核酸における当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するものとして設計される。ターゲット核酸検出用プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。また、検出対象塩基に相補的な塩基は、ターゲット核酸検出用プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなるターゲット核酸検出用プローブについては５’末端又は３’末端方向に１塩基ずれている場合を含む意味である。
　同様に、非ターゲット核酸検出用プローブは、非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸を検出するものであって、非ターゲット核酸における少なくとも非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するものとして設計される。非ターゲット核酸検出用プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。また、非検出対象塩基に相補的な塩基は、非ターゲット核酸検出用プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなる非ターゲット核酸検出用プローブについては５’末端又は３’末端方向に１塩基ずれている場合を含む意味である。
　特に、本方法に使用するマイクロアレイは、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸に共通する共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブを備えている。共通プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。
　本発明に係るターゲット核酸の検出方法では、上述したブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーを上記マイクロアレイに接触させる。ここで、先ず、共通プローブからのシグナルに基づいて、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたかを判断する。具体的には、共通プローブからのシグナルが所定の値（閾値）を超える場合には、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたと判断する。上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたと判断した後は、ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルに基づいてターゲット核酸が存在するか否かを判断することができる。
　仮に、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたかを共通プローブではなく、非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルで判断する場合、十分なシグナルが得られずに、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたか正確に判断できない場合がある。例えば、鋳型となるゲノムＤＮＡ量が少ない場合や、ブロッキング核酸が存在する場合には、非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルが十分に得られない。
　本発明に係る方法では、ターゲット核酸と、ブロッキング核酸がハイブリダイズした非ターゲット核酸とがともにハイブリダイズできる共通プローブからのシグナルを利用するため、鋳型となるゲノムＤＮＡ量が少ない場合やブロッキング核酸が存在する場合であっても、上述した一連の核酸増幅方法が正常に行われたか正確に判断することができる。
　このように、上述した一連の核酸増幅反応が正常に行われたと判断した後、ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルに基づいて、増幅反応後の反応液にターゲット核酸が存在するかを判断することができる。このとき、上述した本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファーを使用することで、ブロッキング核酸によって非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができる。
　ここで、ハイブリダイゼーション用バッファーを用いたハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。すなわち、ハイブリダイゼーション用バッファーには、ハイブリダイゼーション反応に必要な塩、例えばSSCや、公知のブロッキング剤、例えばSDSが含まれていても良い。なお、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。
　また、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液とその他の組成物（ブロッキング核酸等）を予め混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズを行った後、反応液をマイクロアレイに接触させて、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸と共通プローブとのハイブリダイズ、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイズ、非ターゲット核酸と非ターゲット核酸検出用プローブとのハイブリダイズを進行させても良い。或いは、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液とその他の組成物（ブロッキング核酸等）とをマイクロアレイ上にて混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズ、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸と共通プローブとのハイブリダイズ、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイズ、非ターゲット核酸と非ターゲット核酸検出用プローブとのハイブリダイズを同時に進行させても良い。
　例えば、標識として蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて各プローブからの蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。
　ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナルに基づいてターゲット核酸が存在するか否かを判断する場合、具体的には、ターゲット核酸検出用プローブ及び非ターゲット核酸検出用プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例としては、例えば、式：[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]/([ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度])を使用する方法が挙げられる。
　判定値を算出する式としては、この他に、[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]/[共通プローブからのシグナル強度]も知られているが、ターゲット核酸が所定の遺伝子変異であり、非ターゲット核酸がその遺伝子変異に対応する野生型である場合には、上述した式：[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]/([ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]+[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度])を使用する方が、変異の検出感度が高く、好ましい。
　そして、上記式にて算出される判定値と予め定めた閾値（カットオフ値）とを比較し、判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸にターゲット核酸が含まれると判断し、判定値が閾値を下回る場合には増幅核酸にターゲット核酸が含まれないと判断する。このように判定値を利用することで、被検者における上述したＳＮＰ等の検出対象塩基の有無（遺伝子変異の有無、疾患に関連するマイナーアレルの有無等）を判定することができる。
　ここで、閾値としては、特に限定されないが、例えば、上述した各遺伝子変異等の検出対象塩基を有しないことが確定している検体、すなわちターゲット核酸が増幅されない検体を用いて上記式により算出された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、各遺伝子変異等の検出対象塩基を有しないことが確定している複数の検体を用いて複数の判定値を算出し、その平均値＋３σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる。なお、平均値＋２σや平均値＋σの値を閾値とすることもできる。
　上述したように、ブロッキング核酸、共通プローブを用いたターゲット核酸の検出方法では、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸を増幅する際に使用する鋳型のゲノムＤＮＡ量が少ない場合であっても、増幅反応が正常に行われたかを正確に判断でき、且つ、ターゲット核酸の存在を正確に検出できる。ここで、鋳型なるゲノムＤＮＡ量は、特に限定さないが、例えば、１００～８００ｆｇといった量であっても核酸増幅反応の成否を正確に判断することができる。
　特に、本発明に係る方法は、リンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関する確定診断に用いるデータを取得する態様に適用できる。例えば、ＩｇＭ型Ｍ蛋白血症を有するＢ細胞リンパ腫患者が状態悪化（Ｍ蛋白増加傾向等）した際に、ＭＹＤ８８遺伝子における所定の一塩基多型を検出する際、また治療薬としてイブルチニブの効果予測するためにＣＸＣＲ４遺伝子における所定の一塩基多型を検出する際に適用することができる。なお、リンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関しては、参考文献（ＮＣＣＮ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＮＣＣＮ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ　Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．２０２１－Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１，２０２０）に詳述されている。
　より具体的には、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異として、Ｌ２６５Ｐ等のアミノ酸置換変異をコードする遺伝子変異を挙げることができる。また、ＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異として、Ｓ３３８Ｘ、Ｒ３３４Ｘ等のアミノ酸置換変異をコードする遺伝子変異を挙げることができる。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、IgM型M蛋白血症を有するB細胞リンパ腫患者が状態悪化（M蛋白増加傾向等）した際に、WM/LPL患者の確定診断、診療補助として有効なMYD88とCXCR4遺伝子の解析を行った。表１にMYD88/CXCR4の対象検査変異を示した。また解析対象箇所を増幅するためのプライマーセットを表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、表２に示したプライマーMYD_F、IC5-MYD_R、CXCR_F及びIC5-CXCR_Rの塩基配列をそれぞれ配列番号１～４とした。
　以下のように調整したDNAサンプルを用いて、MYD88及びCXCR4の2つの対象領域をそれぞれPCRにて増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　PCRの温度条件は表４に示すように設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　そして、予め準備したMYD88/CXCR4解析チップ（WMチップ）を用いてハイブリダイズ反応を行った。調整したハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC、0.23％SDS）、PCR産物を冷凍庫から取り出し、常温に戻した。ハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC、0.23％SDS）は表５に示したブロッキング核酸を添加した。ブロッキング核酸は、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるように、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ここでICHIhybは、後述する表８に示した位置プローブ（ICHI）とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。ICHIhybと位置プローブ（ICHI）とのハイブリダイズに基づいて、マイクロアレイの劣化の有無や、マイクロアレイ上のプローブの位置を示すことができる。ICHIhybは、検出対象変異とは無関係の配列からなり、ブロッキング核酸とともにハイブリダイズ緩衝液に添加される。なお、表５に示したブロッキング核酸MYD_B、CXCR_1012B、CXCR_1000B、CXCR_952B及びICHIhybの塩基配列を配列番号５～９とした。PCR産物30μlとハイブリダイズ緩衝液15μlを混合し、自動化検出装置(HySHOT HT-32又はBIOSHOT HT-32、東洋鋼鈑株式会社製)にセットした。洗浄液（0.1×SSC/0.1%SDS溶液）、リンス液及び検出液（1×SSC）を調製し、装置の取り扱い説明書に従い、混合液、洗浄液、リンス液をBIOHSHOTにセットした。その後、蛍光強度推定法により測定した。装置の試験条件を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
[実験１]
　本実験１では、野生型のプローブ長に対する判定値及び分離度について評価を行った。
・試験条件
　MYD88の変異に対応する変異プローブとこれに対する野生型プローブを表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　なお、表７に示したプローブMYD_W1、MYD_W2及びMYD_M01の塩基配列をそれぞれ配列番号１０～１２とした。
　各プローブの蛍光強度から強度比である判定値を下記式から算出した。
　判定値＝変異型プローブの強度/（野生型プローブの強度＋変異型プローブの強度）
・結果
　図１に示すようにW1/M1と比較して、MYD88の塩基長を短くTmが低くなったW2/M1のプローブ組み合わせの方が分離度(変異5%判定値-野生型判定値)は大きくなった。これは野生型プローブを短くすることで、PCR産物がプローブに結合する特異性が高まったものだと考えられる。よって、判定性能を高めるためには、プローブ長を短くすることは有効であることが示唆された。
[実験２]
　本実験２では、共通プローブを用いたときの最少DNA量を検討した。遺伝子検査キット(WMチップ)の対象検体は、骨髄及びホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded; FFPE）標本が想定されている。一般的にFFPE標本は、固定化処理時の薬品の影響でDNAの断片化が起こりやすく、増幅可能なDNA量が低下することが知られている。そのためWMチップを使用する場合、判定可能なDNA量を改善する、すなわちより少量のDNAで判定できることが非常に重要である。
　一方で、WMチップを使用する場合、野生型ターゲットに相補的な配列を持つブロッキング核酸を用いている。ブロッキング核酸は、変異型プローブに非特異的にハイブリダイズする野生型ターゲットにハイブリダイズすることで、野生型ターゲットが変異型プローブにハイブリダイズすることを防いでいる。これにより、より少量の変異型ターゲットの検出感度を高めることができる。
　しかし、ブロッキング核酸を使用した場合には、野生型プローブと特異的に反応する野生型ターゲットの量を低下させるという問題があった。野生型ターゲット及び変異型ターゲットを増幅する増幅反応が正常に行われたかを野生型プローブの蛍光強度に基づいて判断する場合、ブロッキング核酸により野生型プローブにハイブリダイズ可能な野生型ターゲットが少なくなるため、充分な蛍光量が得られず、判定不能（増幅不能）となる問題を抱えていた。
　本実施例では、ブロッキング核酸の存在下であっても野生型ターゲットと変異型ターゲットにハイブリダイズできる共通プローブを設計した。この共通プローブからは、対象の変異有無に関係なく産物量（野生型ターゲットと変異型ターゲットの合計量）に依存して蛍光強度が検出される。そのため共通プローブからのシグナルを増幅の指標として用いることで、野生型プローブでは蛍光強度の基準に満たさなかった検体でも、判定が可能となり最少DNA検出量が改善できると考えられた。
・試験条件
　変異型ターゲットに対応する変異型プローブ、野生型ターゲットに対応する野生型プローブ、共通プローブの各配列を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　なお、表８に示したプローブMYD88_W、MYD88_M、CXCR4_952_W、CXCR4_952_M、CXCR4_1000_W、CXCR4_1000_M、CXCR4_1012_W、CXCR4_1012_M1、CXCR4_1012_M2、CXCR4_1012_M3、MYD_C、CXCR4_C及びICHIの塩基配列をそれぞれ配列番号１３～２５とした。
　検査対象の変異部位が含まれる野生型、変異型の人工遺伝子3200fgを鋳型とし、PCRにて増幅した。その後、PCR増幅産物をTEで希釈し、鋳型量が10～3200fgとなるサンプルを調製した。試験は蛍光強度と分離度を比較した。判断基準として、当該検査システムでの安定的な解析のために必要な蛍光強度は1000に設定した。また野生型ターゲットと変異ターゲット（５％）が十分に判定可能かどうかの指標を分離度が0.25以上になることと設定した。試験条件を表９に示した。なお、表９に示すように、試験条件1は、ブロッキング核酸が存在する条件であって野生型、変異型及び共通プローブの評価である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
・試験結果
　ブロッキング核酸の存在下で各プローブからの蛍光強度を評価した結果を表１０に示し、ブロッキング核酸の非存在下で各プローブからの蛍光強度を評価した結果を表１１に示した。蛍光強度が1000以上になった条件を〇、それ以外を×とした。なお、共通プローブからの蛍光強度を測定した結果を図２に示した。図２（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、図２（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果である。また、野生型プローブからの蛍光強度を測定した結果を図３に示した。図３（ａ）はブロッキング核酸の存在下で測定した結果を示し、図３（ｂ）はブロッキング核酸の非存在下で測定した結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１０に示したように、ブロッキング核酸の存在下では、共通プローブは鋳型DNA100fg以上で蛍光強度が検出、野生型プローブは鋳型DNA800fg以上の条件で全てのプローブで蛍光強度を検出した。一方、表１１に示したように、ブロッキング核酸の非存在下の場合、鋳型DNA200fg以上で共通プローブ、野生型プローブ共に蛍光強度が検出できた。
　また、ブロッキング核酸の存在下で分離度を評価した結果を表１２に示し、ブロッキング核酸の非存在下で分離度を評価した結果を表１３に示した。分離度が0.25以上になった条件を〇、それ以外を×とした。なお、ブロッキング核酸の存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を図４に示し、ブロッキング核酸の非存在下で各遺伝子変異について分離度を計算した結果を図５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１２に示したように、ブロッキング核酸の存在下では、鋳型100fg以上で分離度が0.25以上になった。一方、表１３に示したように、ブロッキング核酸の非存在下では、全ての条件で分離度が0.25未満になった。この結果から、高感度に変異を検出するには、ブロッキング核酸が必須であることが示された。
　以上の結果を表９の試験条件１～４について整理し、各蛍光強度と分離度を評価した試験結果を表１４に示した。なお、表１４には、蛍光強度が1000以上かつ分離度が0.25以上になった条件:〇、それ以外は×を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本実施例の結果から、ブロッキング核酸の存在下では、DNA鋳型量100fg以上であれば判定十分な分離度を確認できた。しかし、試験条件２の野生型プローブでの蛍光強度検出限界はDNA鋳型量800fgであった。このことから、野生型プローブからのシグナルに基づいて、増幅反応の成否を決定する従来の方法では100～800fgの検体では蛍光強度が不足するため判定不能となっていた。これに対して、試験条件１のように、共通プローブからのシグナルに基づいて、増幅反応の成否を決定することで、DNAが低濃度でも増幅を確認でき変異を検出できることが確認できた。
　ここで、試験に使用した人工遺伝子の分子量をもとにDNA鋳型量の単位を重量からコピー数に換算すると、100fg＝1.79×105copies、800fg＝1.43×106copies、である。したがって試験条件１においては少なくとも検体が1.79×105copiesあれば検出が可能であるといえる。また1.43×106copiesを下回ると野生型プローブは蛍光強度が不足することから、共通プローブの有用性が示されたといえる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を検出対象塩基として含むターゲット核酸の当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用ターゲット核酸検出用プローブと；上記ＭＹＤ８８遺伝子の遺伝子変異に対応する野生型を非検出対象塩基として含む非ターゲット核酸の当該非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用非ターゲット核酸検出用プローブと、を備えるマイクロアレイと、
    　上記ＭＹＤ８８遺伝子の非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用ブロッキング核酸を含むバッファーと
    　を備えるマイクロアレイキット。
  2. 　上記マイクロアレイは、上記ＭＹＤ８８遺伝子のターゲット核酸と非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有するＭＹＤ８８遺伝子用共通プローブをさらに備えることを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイキット。
  3. 　上記マイクロアレイは、ＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異を検出対象塩基として含むターゲット核酸の当該検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用ターゲット核酸検出用プローブと；上記ＣＸＣＲ４遺伝子の遺伝子変異に対応する野生型を非検出対象塩基として含む非ターゲット核酸の当該非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用非ターゲット核酸検出用プローブとをさらに備え、
    　上記バッファーは、上記ＣＸＣＲ４遺伝子の非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用ブロッキング核酸をさらに含むことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイキット。
  4. 　上記マイクロアレイは、上記ＣＸＣＲ４遺伝子のターゲット核酸と非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有するＣＸＣＲ４遺伝子用共通プローブをさらに備えることを特徴とする請求項３記載のマイクロアレイキット。
  5. 　検出対象塩基を含むターゲット核酸と前記検出対象塩基に対応する非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸との増幅反応後の反応液と；前記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング核酸を含むハイブリダイゼーション用バッファーとを準備する工程と、
    　上記ターゲット核酸における検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有するターゲット核酸検出用プローブと、上記非ターゲット核酸における非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な配列を有する非ターゲット核酸検出用プローブと、上記ターゲット核酸及び上記非ターゲット核酸に共通する共通領域であって上記非検出対象塩基を含む上記領域と重複しない共通領域に対して相補的な配列を有する共通プローブとを備えるマイクロアレイに対して、上記反応液及び上記ハイブリダイゼーション用バッファーを接触させる工程と、
    　上記マイクロアレイにおける上記共通プローブからのシグナル強度が閾値を超える場合に上記ターゲット核酸と上記非ターゲット核酸の増幅反応が正常に行われたと判断する工程と
    　を含む、ターゲット核酸の検出方法。
  6. 　上記判断する工程の後、上記ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度、上記非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度に基づいてターゲット核酸の有無を判定することを特徴とする請求項５記載のターゲット核酸の検出方法。
  7. 　[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]／（[ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]＋[非ターゲット核酸検出用プローブからのシグナル強度]）の値を算出し、当該値が閾値を超える場合にターゲット核酸が存在すると判定することを特徴とする請求項６記載のターゲット核酸の検出方法。
  8. 　上記ターゲット核酸と上記非ターゲット核酸の増幅反応は、鋳型核酸量がコピー数として1.79×105～1.43×106copiesであることを特徴とする請求項５記載のターゲット核酸の検出方法。
  9. 　上記ターゲット核酸に含まれる検出対象塩基は、ＭＹＤ８８遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異及び/又はＣＸＣＲ４遺伝子におけるリンパ形質細胞性リンパ腫/ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に関連する遺伝子変異であることを特徴とする請求項５記載のターゲット核酸の検出方法。
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