JP3905064B2 - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける抗生物質耐性の迅速検出法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、抗生物質、特にイソニアジド、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対して耐性であるMycobacterium tuberculosis株の迅速な検出に関する。より特定的には、本発明は、例えば、適切な遺伝子の突然変異の結果として、または核酸ハイブリダイゼーションにより、Mycobacterium tuberculosisにおける抗生物質耐性を検出する方法に関する。本発明は、核酸ハイブリダイゼーションを実施するための核酸プローブおよびキットにも関する。本発明は、さらに、ｋａｔＧ遺伝子の染色体の位置およびそのヌクレオチド配列にも関する。
【０００２】
発明の背景
ロバート・コッホ（Robert Koch)による結核の原因学的因子であるMycobacterium tuberculosisの発見以来、一世紀を越える研究にもかかわらず、この疾患は依然として人間の罹患および死亡の主要原因の一つのままである。結核に起因する死亡は年間３００万件と概算されており（Snider, 1989) 、これらの大部分は開発途上国におけるものではあるが、西側諸国においても、ホームレスの人々の数の増加およびＡＩＤＳの流行の衝撃のため、この疾患は復活した重要性を握っている(Chaisson et al., 1987; Snider and Roper, 1992) 。
【０００３】
イソニコチン酸ヒドラジド、すなわちイソニアジド（ＩＮＨ）は、「結核（菌）」群のメンバー、すなわち、Mycobacterium tuberculosis、M. bovisおよびM. africanumに対するその絶妙な強さのため、過去４０年間の間結核の治療に使用されてきた(Middlebrook, 1952; Youatt, 1969) 。この薬物の正確な標的（ターゲット）も、その作用モードも、どちらも知られておらず、ＩＮＨ治療はいくつかの代謝経路の動揺をもたらす。ＩＮＨはＮＡＤおよびピリドキサールホスフェートの代謝拮抗物質として作用し得ることを示すかなりの証拠があり(Bekierkunst and Bricker, 1967; Sriprakash and Ramakrishnan, 1970; Winder and Collins, 1968, 1969, 1970)、また、この薬物が、マイコバクテリウムの細胞壁の抗酸性(acid-fast) 特性に関連するミコール酸の合成を遮断することを示す他のデータも存在する(Winder and Collins 1970; Quemard et al., 1991) 。その導入の少し後に、Mycobacterium tuberculosisのＩＮＨ耐性単離株が出現し、これらは、特性付けによると、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を損失しており、モルモット（guinea pigs)において減少した毒力(virulence) を示すことがしばしば見出された(Middlebrook et al., 1954; Kubica et al., 1968; Sriprakash and Ramakrishnan, 1970) 。
【０００４】
ごく最近、ＩＮＨ耐性は、Mycobacterium tuberculosisの多剤耐性（ＭＤＲ）変異株による米国における結核の流行(CDC, 1990; 1991a, b) と、このような株がＨＩＶ感染者および医療従事者の広範な院内感染に関連することの証明(Snider and Roper, 1992)とによって、新たな重要性を獲得してきた。この問題の重要性の点から見て、当業界には、ＩＮＨ耐性とカタラーゼ−ペルオキシダーゼ産生との間の関係を決定する必要性が存在する。
【０００５】
より特定的には、当業界には、薬剤感受性に関与する分子メカニズムを理解する必要性がある。その上、当業界には、ＩＮＨ耐性株を迅速に同定することを可能にする簡便な試験を開発する必要性がある。さらに、当業界には、このような試験を実施するための試薬に対する必要性がある。
【０００６】
リファンピシンもまた、マイコバクテリウム、特にMycobacterium tuberculosisおよびMycobacterium lepraeによる感染の治療のために使用される主要な抗生物質である。マイコバクテリウムのあるものは、ゆっくり生育するので、リファンピシンまたはその類縁体に対する耐性を試験するための迅速で効率的な試験が利用可能にされなければならない。同様に、本発明は、ストレプトマイシンに対して耐性であるMycobacterium tuberculosisのストレインの迅速な検出を目的とする。ストレプトマイシンに対する耐性の発達のため、後者の抗生物質は他の抗生物質、例えば、イソニアジドと共に使用されてきた。したがって、結核の適切な治療の前には、この３種の主要な抗生物質、すなわち、イソニアジド、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対する耐性の迅速で効率的な検出が先行すべきである。
【０００７】
発明の概要
以上のように、本発明は、イソニアジドおよび他の薬剤、例えばリファンピシンまたはその類縁体、およびストレプトマイシンに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの細胞の存在をインビトロで検出するための方法を提供することにより、当業界におけるこれらの必要性を充足することを助けるものである。
【０００８】
リファンピシンの類縁体、特に３−ホルミル−リファマイシンの誘導体、特に置換の結果として、……ナフトフラノニル基中またはナフトフラノニル基の７位の側鎖に存在する置換物……、または側鎖中に二重結合の導入もしくは除去により……。
【０００９】
本発明によれば、イソニアジドに対する耐性の検出は、特にイソニアジドに対して耐性ではないMycobacterium tuberculosisにおける同じｋａｔＧ遺伝子のヌクレオチド配列に関して、Mycobacterium tuberculosisのｋａｔＧ遺伝子内の１つまたはいくつかのミューテーションの検出を包含する。
【００１０】
イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisの核酸の存在をインビトロで検出するための別の代替法においては、その方法が、以下の工程：
−必要であれば予めプローブに接触可能にした上記核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブに接触させる工程、
−上記核酸にハイブリダイズしたプローブを検出する工程
を含み、
上記プローブが、プラスミドｐＹＺ５６の２．５kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントまたはその一部分である核酸配列を含み、上記フラグメントがＢａｍＨＩ切断部位を含み、上記一部分はイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロでの検出の選択性を提供するのに充分長いものである。
【００１１】
例えば、この代替的方法は、以下の工程を含む：
（Ａ）細胞の核酸を、核酸がプローブに接触可能になるように、固体支持体上におき、固定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）からの固定された核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）から得られるフィルターを、ハイブリダイズしていないプローブを除去するように洗浄する工程、および次に
（Ｄ）工程（Ｃ）から得られる洗浄したフィルター上のハイブリダイズしたプローブを検出する工程。
【００１２】
プローブは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントに存在する核酸配列を含み、上記フラグメントはＢａｍＨＩ切断部位を含む。このフラグメントは、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisの細胞内ＤＮＡと関連していることが見出されており、このような抗生物質感受性微生物を、以下に記載する条件下でこのフラグメントとハイブリダイズするＤＮＡを含有しないイソニアジド耐性Mycobacterium tuberculosisから区別することができる。
【００１３】
本発明は、さらに、イソニアジド耐性細胞から欠如しているイソニアジド感受性を与えるMycobacterium tuberculosisのｋａｔＧ遺伝子の領域をコードしているイソニアジド耐性Mycobacterium tuberculosisのＲＮＡおよびＤＮＡのようなヌクレオチド配列を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のヌクレオチドに結合している放射性核種のような標識されたプローブをも提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、相補的な塩基配列のヌクレオチド配列に水素結合した、実質的に本発明のヌクレオチド配列からなるハイブリッド二本鎖分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを提供する。
【００１６】
また、本発明は、Mycobacterium tuberculosisのカタラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子またはこのようなヌクレオチド配列の一部分をコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列のグループから選択する方法をも提供する。この方法は、どのヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズするかを決定する工程を含む。このヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であることができる。この方法は、ヌクレオチド配列上の標識を検出する工程を含んでいてもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisを検出するためのキットを提供する。キットは、プラスミドｐＹＺ５６の２．５kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントであり、ＢａｍＨＩ切断部位を含むフラグメントである核酸配列を含むプローブを含有している容器を含む。キットは、また核酸の対照調製物を含有している容器をも含む。
【００１８】
本発明は、酵素カタラーゼまたは同様の酵素のイソニアジドに対する作用の産物として得られる化合物をもカバーする。ｋａｔＧ遺伝子、または同様の活性を有するこの遺伝子の誘導体を、カタラーゼタンパクの供給源として使用することができる。この新規の化合物は、H. David et al. の「臨床マイコバクテリウム学のための実験室方法（Methodes de laboratoire pour Mycobacteriologie clinique) 」、パスツール研究所（Pasteur Institute)編集、ＩＳＢＮ番号０９９５−２４５４に記載されているようなアンチバイオグラム（antibiogram)方法により、ＩＮＨ耐性マイコバクテリウム株に対する反応性によって選択される。
【００１９】
好ましい態様の詳細な説明
最近の米国における多剤耐性を示すM. tuberculosis の多数の株の出現は、この生物の非常な伝染性（うつり易さ）の点から、大変警告的な状況である。この危険は、いくつかの小規模の結核の流行によって際立って示されており、これらにおいてはＭＤＲのM.tuberculosisに感染した一人の患者が、ＨＩＶ陽性者、監獄警備員および健康な看護員を感染させた(CDC 1990, 1991; Daley et al., 1992; Snider and Roper, 1992) 。現在の世界的なＨＩＶの流行の重大さの点から、西側諸国のＡＩＤＳ患者がアフリカの患者のように（M. avium/M. intracellulareコンプレックスのメンバーよりむしろ）ＭＤＲのM. tuberculosis 株に感染するようなら、この疾患の広範な蔓延が起こるであろうということが考えられる。
【００２０】
イソニアジド（ＩＮＨ）は、マイコバクテリウムの結核菌のグループ( Mycobacterium tuberculosis、 M. bovisおよび M. africanum ）に対して特に強力な殺菌性薬剤であり、結果としてそれは結核の治療において特に効果的であった。標準的な対結核療法は、一般にＩＮＨおよびリファンピシンを、しばしばピラジナミド、エタンブトールまたはストレプトマイシンのようなより弱い薬剤との組合せで含む。療法におけるその用途に加えて、ＩＮＨは予防的手段として患者の近接者にも与えられる。
【００２１】
ヒトの疾患の因子であるM. tuberculosis のＩＮＨ耐性突然変異体は、２レベルの耐性を示し、低レベルは１〜１０μg /ml 、高レベルは１０〜１００μg /ml である。ＩＮＨ耐性は、しばしばカタラーゼ活性の損失および毒力と関連している。近年、ＡＩＤＳの流行、ホームレスの増加および社会状態の低下により、先進国、特に米国において、結核は主要な公衆衛生問題として再出現してきた。今日のこの疾患の警告的な特徴は、多剤耐性生物の出現と、医療従事者およびＨＩＶ感染患者への迅速な院内伝播である。このことは、ＣＤＣによる、多剤耐性株（少なくともＩＮＨおよびリファンピシン）の治療および伝播の防止のための新規な推薦の提案を促した。ＩＮＨ耐性の問題の新鮮な洞察を入手し、迅速な診断試験を開発するために、以下の研究を実施した。
【００２２】
明らかに、主な抗結核剤であるＩＮＨおよびリファンピシンに対する耐性のメカニズムを理解することは必須である。これは、そのことが、新規な化学療法的戦略の開発を可能にし、ＭＤＲ株に対して活性な新規化合物の設計を容易にするからである。
【００２３】
本発明は、ＩＮＨターゲットがカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素ＨＰＩであること、およびこの酵素が単独で毒性を媒介することを明らかにする。この結論を強要する証拠は、E. coli のカタラーゼ陰性突然変異体におけるM. tuberculosis ｋａｔＧ遺伝子の発現が、この細菌をＩＮＨに対して感受性にするという結果をもたらしたことによって得られた。さらに、M. tuberculosis のＩＮＨ感受性遺伝子ｋａｔＧの単離は、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲベースのアプローチによるＩＮＨ耐性株の迅速な検出を容易にするので、重要である。ここで示されるように、臨床株における高頻度のｋａｔＧ欠失は、この手順を簡便化するはずである。
【００２４】
ＩＮＨ感受性に関与する M. tuberculosis 遺伝子の同定
ＩＮＨ感受性に関与するM. tuberculosis 遺伝子を単離するため、非相同のアプローチを用いた。ＢＨ１は、容易に形質転換可能なM. smegmatis株ＭＣ² １５５の偶発突然変異体(Snapper et al., 1990) であり、これは５１２μg /ml のＩＮＨに対して耐性で、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を欠いている(Heym et al., 1992) 。ＩＮＨ感受性とこれらの酵素活性との間には厳密な相関があるので、M. tuberculosis からの適切な遺伝子を担持するプラスミドを用いたＢＨ１の形質転換は、それらの回復および付随するＩＮＨ感受性を導くはずである。
【００２５】
結果として、ＤＮＡを、Escherichia coli中のM. tuberculosis シャトルコスミドのプールから調製し、電気的形質転換（エレクトロトランスフォーメーション）によりＢＨ１中に導入した。次いで１０００を越えるカナマイシン耐性形質転換体をＩＮＨ感受性に関して採点し、ＭＣ² １５５野生型株からのＭＩＣである３２g /mlのＩＮＨを含有する培地上で生育しない４個のクローンを得た。
【００２６】
ＢＨ１の再形質転換の後、これらのうちの１つであるｐＢＨ４のみが一貫してＩＮＨ感受性表現型を与えた。ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄIIIを用いた制限酵素消化物は、ｐＢＨ４に担持されているM. tuberculosis 染色体ＤＮＡが約３０kbの大きさであることを示した。最後の３種の酵素を用いて作製した地図を図１に示す。
【００２７】
ｐＢＨ４をライブラリー中の相同クローンを検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いた場合、さらに８個のシャトルコスミドが単離された。ＢＨ１の形質転換の際に、これらの５種（Ｔ３５、Ｔ６４６、Ｔ６７３、Ｔ７９、Ｔ５５６）はＩＮＨ感受性を回復し、ｐＢＨ４と同様の制限プロフィールを示した。特に、４．５kbのＫｐｎＩフラグメントは、全ての場合に存在した。
【００２８】
個々のＢａｍＨＩフラグメントをサブクローニングする試みは、ＢＨ１の傷を相補することができる形質転換体を与えず、ＢａｍＨＩ部位が目的の遺伝子中に位置している可能性があることが示唆された。これに対して、ｐＢＨ４の誘導体であるｐＢＨ５を、ＥｃｏＲＩフラグメントの欠失によって構築したところ、これはＩＮＨ感受性の回復には７kbセグメントが必要ではないことを示した。
【００２９】
ＢＨ１のＩＮＨ耐性突然変異を相補したシャトルコスミドを担持する形質転換体を注意深く検査し、いくつかの抗生物質に関するＭＩＣを確立した。全ての場合において、ＩＮＨに関するＭＩＣは５１２μg /ml から８μg /ml に減少し、この値は感受性株ＭＣ² １５５の値（３２μg /ml ）よりも低い値であった。この高度感受性の表現型は、組換えクローンがＩＮＨ毒性を強化し得る酵素を過剰産生している可能性があることを示唆した。酵素学的研究は、これらの形質転換体は全て、ＩＮＨ感受性である野生型株ＭＣ²１５５よりも約２倍多いペルオキシダーゼおよびカタラーゼを産生することを示した。
【００３０】
ＩＮＨに加えて、M. tuberculosis の多くのＭＤＲ株は、リファンピシン、ストレプトマイシン、エタンブトールおよびピラジナミドに対しても、もはや感受性ではない。ＩＮＨに対する耐性とこれらの化合物との間に関係がある可能性を検査するために、種々のM. smegmatis株およびそれらのｐＢＨ４形質転換体についていくつかの薬剤のＭＩＣを決定したが、差異は見られなかった。
【００３１】
M. tuberculosis カタラーゼ遺伝子のクローニング
４５mer のオリゴヌクレオチドプローブを、E. coli (Triggs-Raine et al., 1989) およびBacillus stearothermophilus (Loprasert et al., 1988)のカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素ＨＰＩの高度に保存された領域の一次構造に基づいて設計した。M. tuberculosis ＤＮＡのゲノムブロットを、このオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて調べると、ほとんどの場合に特異的バンドが検出された。ＫｐｎＩは強くハイブリダイズする４．５kbの独自の（ユニーク）フラグメントを生成したので、この酵素を、ｐＵＣ１９にサイズ選択ライブラリーを作るために用いた。
【００３２】
このオリゴヌクレオチドを用いたスクリーニングを行うと、適切なクローンｐＹＺ５５が得られた。そのインサートＤＮＡの制限地図を図１に示す。図１では、これがｐＢＨ４の部分に正確に対応することがわかる。独立した確認もまたクロスハイブリダイゼーションにより得られた。
【００３３】
種々のサブクローニング実験によって、M. tuberculosis カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性をE. coli 中で発現する最小のフラグメントは２．５kbのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントであることが見出され、これは予想されたようにＢａｍＨＩの切断部位を含んでいた。部分的ＤＮＡ配列解析は、ｐＹＺ５６に担持されているｋａｔＧ遺伝子が、E. coli およびB. stearothermophilus のＨＰＩ酵素に高度に相同なカタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素をコードすることを示した：
【００３４】
【表１】

【００３５】
( 図２：Triggs-Raine et al., 1988); (Loprasert et al., 1988) 。同一の残基は「＊」で示す。ＨＰＩ活性は、染色によりE. coli およびM. smegmatisの両方において検出された（以下を参照されたい）。
【００３６】
ＩＮＨ感受性におけるカタラーゼ−ペルオキシダーゼの関与
M. tuberculosis のｋａｔＧ遺伝子をクローニングしたので、カタラーゼ陰性とイソニアジド耐性との間の関連の遺伝的基礎を調べることが、直ちに興味のあることであった。シャトルベクターｐＢＡＫ１４中に構築物のシリーズを確立し、ＩＮＨ耐性M. smegmatis 突然変異体ＢＨ１を形質転換するために用いた。完全なｋａｔＧ遺伝子を担持するプラスミドのみが、ＨＰＩを産生し、ＩＮＨ感受性を回復した。これらの中で最小のものであるｐＢＡＫ１４は、２．５kbのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントを担持しており、したがって、ｋａｔＧ遺伝子の上流の２kb領域は関与していないこと、およびカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性が単独でマイコバクテリウムをＩＮＨに感受性にするのに充分であることが明らかになった。
【００３７】
無細胞抽出物を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼ活性について染色した。これらの条件下で、このM. tuberculosis 酵素は、カタラーゼ活性(Heym et al., 1992) と共に移動するペルオキシダーゼ活性（レーン１）の２本のバンドを示した。
【００３８】
E. coli 中に導入すると、ｋａｔＧ遺伝子は同タンパク質の合成を指示したが、一方、ｐＹＺ５６は大きさがやや大きいタンパク質を産生した。これは、フレームの合ったｌａｃＺ′ :: ｋａｔＧ遺伝子融合の構築によるものである。活性染色は、M. smegmatisの細胞抽出物を用いても実施した。ＢＨ１におけるM. tuberculosis からのｋａｔＧ遺伝子の存在は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ酵素の産生に導き、これはM. tuberculosis 中またはE. coli 中で作られた酵素、およびM. smegmatisのネイティブＨＰＩと同じ電気泳動移動度を示した。
【００３９】
M. tuberculosis におけるＩＮＨ耐性の基盤
多年の間、ＩＮＨ耐性株のサブセット、特に最も高い薬剤濃度に対して耐性のものが、モルモットにおいて毒力が低く、カタラーゼ活性を持たないものであることが知られていた。ゲノムＤＮＡをM. tuberculosis のいくつかの臨床単離株から調製し、プローブとして４．５kb ＫｐｎＩフラグメントを用いてサザンブロッッティングにより解析した。２つの高度に耐性の株、Ｂ１４５３および２４においては、カタラーゼ遺伝子は染色体から欠失していたが、一方、例えば株１２のように低レベルの耐性を示す他のものにおいては（図３）、それはなお存在するが発現されていない。さらに研究すると、ｋａｔＧのすぐ前の領域は高度に再配列を受け易いことが示された。
【００４０】
M. tuberculosis ＨＰＩは E. coli をＩＮＨ感受性にする
M. tuberculosis のＨＰＩ酵素がE. coli にＩＮＨ感受性を付与することが可能かどうかを決定するために、カタラーゼ突然変異体のシリーズをｐＹＺ５６を用いて形質転換し、ＭＩＣを決定した。野生型株はＩＮＨに対して感受性ではなかったが、両方の内在性カタラーゼ活性を欠くがｐＹＺ５６を有している突然変異体は、高レベルのＩＮＨ（５００μg /ml ）が存在する場合、生育阻害を示した。一方、形質転換されていない株は非感受性であった。
【００４１】
本発明の目的のために、図１に示す制限エンドヌクレアーゼ地図を有するプラスミドは、株中において、National Collection of Cultures of Microorganisms（ＣＮＣＭ）、Institut Pasteur、Paris, France に、受託番号（culture collection accession No.)Ｉ−１２０９として１９９２年５月１８日付けで寄託された。このプラスミドは、本発明の核酸配列、すなわち、プラスミドｐＹＺ５６の４．５kb ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントを含んでおり、そのフラグメントは中にＢａｍＨＩ切断部位を有している。
【００４２】
一般に、本発明は、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisＤＮＡに選択的にハイブリダイズして検出可能な複合体を形成することができる少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡプローブを提供することを含む、試料中のイソニアジド耐性Mycobacterium tuberculosisの存在を検出する方法を備えている。検出は、試料を用いて、試料中に存在するイソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisＤＮＡにプローブがハイブリダイズしてハイブリッド複合体を形成することを可能にする条件下で、およびハイブリッド複合体を試料中のイソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisの存在の指標として検出することを可能にする条件下で実施する。（「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ここで使用される場合は、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブが、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisのみにハイブリダイズし、イソニアジド非感受性Mycobacterium tuberculosisにはハイブリダイズしないことを表わす。）試料は、Mycobacterium tuberculosis細胞、またはその細胞の一部分、またはMycobacterium tuberculosis核酸、特にＤＮＡを豊富にした細胞内容物からなっていることが可能である。ハイブリダイゼーションは、従来のハイブリダイゼーション試薬を用いて実施することができる。特定のハイブリダイゼーション条件は本発明に重要ではないことが見出されている。
【００４３】
より詳細には、Mycobacterium tuberculosisからのＤＮＡ配列は、サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションにより解析することができる。本発明に用いられた技法はManiatis et al. (1989)に記載されている。ＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル上で分離し、その場所で（in situ ）変性させる。フラグメントは、次いでゲルから水不溶性固体多孔性支持体、例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンメンブレン、または活性化セルロースペーパーのようなものにトランスファーし、そこでそれらを固定する。例えば、Amershamにより市販されている Hybond （商標）メンブレンを用いることができる。プローブとの非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるためのプレハイブリダイゼーションの後、固体支持体を、本発明の核酸プローブとハイブリダイズさせる。固体支持体を洗浄して、非結合および弱く結合しているプローブを除去し、結果として得られるハイブリッド二本鎖分子を検査する。好都合な代替的アプローチは、ゲル中で変性させたＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることである。
【００４４】
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、フィルターに妥当に結合し得る標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションの強度（ストリンジェンシー）に依存して大きく変化する。一般に、固定されたＤＮＡに対するプローブの結合率を増強するために、化学量論に対してかなり過剰を用いる。
【００４５】
種々の程度のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを用いることができる。条件が厳密になればなる程、二本鎖形成のためにプローブとポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションのために必要とされる相補性が大きくなる。厳密さは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間などによって制御することができる。好都合には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、反応溶液の極性を変えることにより変化させる。用いるべき温度は、経験的に決定するか、またはこの目的のために開発された周知の公式から決定することができる。
【００４６】
ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから固体支持体にトランスファーするサザンブロッティングとは異なって、本発明の方法は、乾燥アガロースゲル中でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても実施することができる。この手順においては、アガロースゲルを乾燥し、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いてin situ でハイブリダイゼーションを実施する。この手順は、検出の速度および感度が望ましい可能性がある場合に好ましい。この手順はMycobacterium tuberculosisのゲノムＤＮＡまたはクローニングされたＤＮＡを含有するアガロースゲルについて実施することができる。
【００４７】
さらに、本発明の方法は、エレクトロブロッティングによるポリアクリルアミドゲルからナイロンフィルターへのMycobacterium tuberculosisＤＮＡのトランスファーによっても実施することができる。エレクトロブロッティングは、典型的にはアガロースゲルからＤＮＡをトランスファーするために開発されたキャピラリブロッティングよりも速いので、時間が重要である場合に望ましい可能性がある。この方法は、ＵＶ架橋と組合せて実施することができる。試験すべき試料を含有するポリアクリルアミドゲルを、適切に準備したナイロンフィルターと接触する状態に置く。これらを次いでエレクトロブロッティング装置中にサンドイッチにし、電流を用いてＤＮＡをゲルからフィルター上へトランスファーする。緩衝液ですすいだ後、フィルターは、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションまたはＵＶ架橋に供する準備ができている。
【００４８】
本発明の方法は、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisを検出するための本発明の核酸プローブを用いて実施することができる。プローブは従来の技法を用いて検出することができる。
【００４９】
本発明の方法は、ｋａｔＧ遺伝子の点突然変異もまた、この遺伝子の部分的欠失同様に検出することが可能である。
【００５０】
本発明のヌクレオチドは、生物学的試料中のM. tuberculosis のヌクレオチド配列を検出するためのプローブとして用いることができる。ポリヌクレオチドプローブは、原子または無機ラジカル、最も普通には放射性核種を用いて標識することができるが、おそらくは重金属を用いて標識することもできる。放射活性標識としては、³²Ｐ、 ³Ｈ、¹⁴Ｃまたは同様のものが挙げられる。適切なシグナルを提供し、充分な半減期を有する、いかなる放射活性標識を用いることも可能である。他の標識としては、標識抗体に対する特異的結合メンバーとして役立ち得るリガンド、蛍光物質(fluorescers) 、化学発光物質(chemiluminescers)、酵素、標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして役立ち得る抗体、などが挙げられる。標識の選択は、ハイブリダイゼーション率およびＤＮＡもしくはＲＮＡに対するプローブの結合に対する標識の効果により支配される。標識が、ハイブリダイゼーションに利用可能なＤＮＡまたはＲＮＡの量を検出するのに充分な感度を提供することが必要となる。
【００５１】
本発明の好ましい態様においては、プローブは、例えばニックトランスレーションによりプローブ中に取り込まれ得る放射活性同位元素、例えば、³²Ｐまたは¹²⁵ Ｉで標識する。
【００５２】
別の好ましい態様においては、プローブは、化学的実体に結合したアビジンと反応するビオチンで標識する。この化学的実体は、アビジンがビオチンと結合すると、ハイブリッドＤＮＡ複合体を検出され得るようにするものであり、例えば、ハイブリッドＤＮＡ複合体を蛍光計測的に検出可能にする蛍光団(fluorophore) ；ハイブリッドＤＮＡ複合体を電子顕微鏡により検出可能にし得る電子密度の高い化合物；ハイブリッドＤＮＡ複合体を免疫学的に検出可能にし得る抗体；または、ハイブリッドＤＮＡ複合体を酵素的に検出可能にする触媒／基質対などがある。細菌をプローブと接触させる前に、M. tuberculosis 細菌を溶菌してそのＤＮＡを放出させ、次いでそれを変性させ、ニトロセルロースメンブレンのような適切な固体のＤＮＡ結合支持体上に固定化することができる。
【００５３】
別の検出方法は、プローブの標識を必要としない、いわゆるサンドイッチハイブリダイゼーション技法である。このアッセイにおいては、一本鎖ベクターに含有されている標識されていないプローブが、イソニアジド感受性Mycobacterium tuberculosisＤＮＡにハイブリダイズし、プローブを含有していない標識された一本鎖ベクターがプローブを含有するベクターにハイブリダイズして、ハイブリッド複合体全体が標識される。
【００５４】
本発明の配列はジデオキシヌクレオチド配列決定法（シークエンシング法）により誘導された。ヌクレオチドの塩基配列は、５′→３′方向に書かれている。示されている各文字は、以下のヌクレオチドについての従来の命名である：
Ａ：アデニン
Ｇ：グアニン
Ｔ：チミン
Ｃ：シトシン
【００５５】
本発明のヌクレオチドは、従来の化学合成技法を用いて、ヌクレオシド単位間の３′→５′ホスフェート連結の形成により調製することができる。例えば、周知のホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、およびホスファイトトリエステル技法を、これらのアプローチの変法と同様に、用いることができる。デオキシリボヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法に基づくもののような自動合成機械を用いて調製することができる。オリゴリボヌクレオチドおよびポリリボヌクレオチドも、従来の技法を用いるＲＮＡ連結を使って得ることができる。
【００５６】
本発明のヌクレオチドは精製された形態である。例えば、本発明のヌクレオチドは、ヒト血液由来のタンパク質、ヒト血清タンパク質、ウイルスタンパク質、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヒト組織、およびヒト組織成分を含まない。さらに、本発明のヌクレオチドは、他の核酸、外来性タンパク質および脂質、ならびに細菌およびウイルスのような外来の微生物を含まないことが好ましい。
【００５７】
本発明は、当然のことながら、本発明のヌクレオチド配列の変異種、またはここにおける同一のプローブと同じ選択的ハイブリダイゼーション特性を現す本発明のプローブの血清型的変異種を包含する。
【００５８】
本発明のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られるＤＮＡ増幅法において使用することができる。例えば、Kwok et al. (1987)を参照されたい。ＰＣＲは、迅速な方法であるので、有利である。
【００５９】
増幅すべきＤＮＡのプラス鎖およびマイナス鎖に相補的な、１０〜３００塩基対離れて位置する既知の配列のＤＮＡプライマー対は、オリゴヌクレオチドの合成のための既知の技法により調製することができる。プライマーがＰＢＭＣ ＤＮＡにアニーリングする場合、各プライマーの一端を、延長し、改変して、制限エンドヌクレアーゼ部位を創り出すことができる。このＰＣＲ反応混合物は、ＰＢＭＣ ＤＮＡ、ＤＮＡプライマー対、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＭｇＣｌ₂ 、ＤＮＡポリメラーゼおよび従来の緩衝剤を含有することができる。ＤＮＡは、ある数のサイクルで増幅させ得る。一般に、各サイクルが上昇させた温度での短時間のＰＢＭＣ ＤＮＡの変性、反応混合物の冷却、およびＤＮＡポリメラーゼによる重合からなる複数のサイクルを用いて、検出感度を増加させることが可能である。
【００６０】
増幅された配列は、オリゴマー制限（ＯＲ）と呼ばれる技法を用いることによって検出することができる。一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）解析を、ＤＮＡフラグメント中の種々の位置における点突然変異およびＤＮＡ多型を検出するために用いることができる。Saiki et al. (1985) 、Orita et al. (1989) を参照されたい。例えば、増幅の後、ＰＣＲ反応混合物の一部を分離し、末端標識されたヌクレオチドプローブ、例えば³²Ｐ−アデノシン三リン酸で末端標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションに供することができる。ＯＲにおいては、末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブは増幅された配列のある領域に溶液中でハイブリダイズし、このプロセスにおいて特異的エンドヌクレアーゼ部位を再構成する。したがって、増幅されたｋａｔＧ配列との標識プローブのハイブリダイゼーションは、選択的制限酵素消化に対して感受性の二本鎖ＤＮＡ形態を生じる。エンドヌクレアーゼによる制限処理の後、結果として生じる試料をポリアクリルアミドゲル上で解析することができ、診断的標識フラグメントを用いてゲルの一部分のオートラジオグラムを得ることができる。オートラジオグラムにおける診断的フラグメント（例えば、長さ１０〜１５塩基の）の出現は、ＰＢＭＣ中のｋａｔＧ配列の存在を示す。
【００６１】
もとのテンプレート（鋳型）として染色体ＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることにより検出感度を増加させ得る可能性があるので、本発明は、ここに記載されているＤＮＡ配列に対して相補的なＲＮＡ配列を使用することを企図する。このＲＮＡは、逆転写酵素によって相補的ＤＮＡに変換することができ、次いでＤＮＡ増幅に供することができる。
【００６２】
実験手順
細菌株およびプラスミド
表１は、本発明において使用した細菌株およびプラスミドの特性を概略的に示す。
【００６３】
【表２】

【００６４】
M. tuberculosis Ｈ３７ＲＶゲノムライブラリーは、シャトルコスミドｐＹＵＢ１８(Snapper et al., 1988)中に構築され、W.R. Jacobs 博士の厚意により供給された。用いた他のシャトルベクターは、ｐＹＵＢ１２(Snapper et al., 1988)およびｐＢＡＫ１４ (Zhang et al., 1991) であった。
【００６５】
微生物学的技法および酵素学
用いた抗生物質、生育条件、酵素学およびＭＩＣ決定の詳細は、Heym et al. (1992)中に見出すことができる。
【００６６】
核酸技法
サブクローニング、サザンブロッティング、ＤＮＡシークエンシング、オリゴヌクレオチド生合成などには、標準的プロトコールを用いた(Maniatis et al., 1989; Eiglmeier et al., 1991) 。
【００６７】
活性染色
E. coli およびマイコバクテリウムの無細胞抽出物の調製は記載されてきた(Heym et al., 1992; Zhang et al., 1991) 。ネイティブタンパク質試料は、全ての緩衝液からＳＤＳを除外し、試料を煮沸せず、β−メルカプトエタノールを試料緩衝液中に包含させなかったことを除き、Laemmli(1970) により記載されたようにポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。７．５％ポリアクリルアミドゲル上での５０〜１００μg タンパク質試料の電気泳動の後、ゲルを３mMＨ₂ Ｏ₂ 中に２０分間、緩やかに振とうしつつ浸漬することにより、カタラーゼ活性を検出した。等容量の２％塩化鉄および２％フェリシアン化カリウムを添加し、光で照らすことによりカタラーゼ活性の明らかなバンドを解明した。ペルオキシダーゼ活性は、０．２〜０．５mg/ml ジアミノベンジジンおよび１．５mMＨ₂ Ｏ₂ を含有する溶液中にゲルを３０〜１２０分間浸漬した後、褐色のバンドとして検出した。
【００６８】
高度に毒性の化合物を生成するためには、M. tuberculosis ＨＰＩ酵素がペルオキシダーゼによりＩＮＨを活性化する可能性が最も高いように考えられる(Youatt, 1969; Gayathri-Devi et al., 1975) 。ｋａｔＧ遺伝子が単離され、特徴付けられたので、同様にして活性化され得るＩＮＨの新規な誘導体を作ることが可能なはずである。
【００６９】
例１
M. tuberculosis のイソニアジド耐性に関連するｋａｔＧ遺伝子中の点突然変異最近の研究において、ｋａｔＧ遺伝子によりコードされるMycobacterium tuberculosisのカタラーゼ−ペルオキシダーゼが強力な抗結核剤のイソニアジドまたはＩＮＨの毒性を媒介することに関与していることが示された。臨床レベルのＩＮＨに対して耐性の突然変異体は、減少したカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性を示し、ある場合においては、このことは染色体からのｋａｔＧ遺伝子の欠失によってもたらされている。クローニングされたｋａｔＧ遺伝子を用いたMycobacterium smegmatis およびM. tuberculosis のＩＮＨ耐性株の形質転換は、薬剤感受性の回復をもたらす。E. coli のいくつかの株におけるｋａｔＧの発現は、この天然には耐性の生物を、高濃度のＩＮＨに対して感受性にする。
【００７０】
M. tuberculosis のいくつかのＩＮＨ耐性臨床単離株はインタクトなｋａｔＧ遺伝子を保持していたので、その耐性の分子的基盤を調べた。この研究は、染色体のｋａｔＧ領域からの４．７kb ＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列の利用可能性により容易になった。これは、このことがＰＣＲ解析に好適なプライマー対の設計を可能にしたためである。１１対のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し（表２参照）、完全ｋａｔＧ遺伝子およびフランキング配列のいくらかをカバーする２８０bp程度のＰＣＲ産物を生成するために用いた。対照実験においては、全ての実験で１１対のプライマー全てが予想されたサイズのＰＣＲ産物を生成し、ＳＳＣＰ解析に非常に好適であったので、オランダまたはフランス起源のM. tuberculosis の３６のＩＮＨ耐性株のパネルを試験した。これらの株の多くが多剤耐性であり、ＨＩＶ血清陽性患者から単離されたものである。
【００７１】
【表３】

【００７２】
【表４】

【００７３】
それらのうちの２つは、どのプライマーを用いてもＰＣＲフラグメントを生じず、ｋａｔＧ遺伝子が欠失してしまっていることが示された。残りの３４株は、全て予想されたＰＣＲ産物を生じ、存在する可能性がある点突然変異を検出し得るようにこれらをＳＳＣＰゲルで解析した。２０のケースにおいて、薬剤感受性M. tuberculosis のｋａｔＧと比較して異常なストランド移動度が観察され、突然変異的事象が実際に起こっていたことが示唆された。ＰＣＲプライマーにより決定したこれらの突然変異のおよその位置を表３に示す。
【００７４】
【表５】

【００７５】
【表６】

【００７６】
５つの独立した株（９１８８、９１０６、９４４１、９４４４、９３６３）からのｋａｔＧ遺伝子の２００bpセグメントを検査すると、単一の塩基の差異が見出された。これは全てのケースで同じであり、位置３３６０でのＧからＴへのトランスバージョンであって、結果としてArg −４６１のLeu による置換をもたらしていた。したがって、ｋａｔＧの不活性化に加えて、ＩＮＨ耐性は変化したカタラーゼ−ペルオキシダーゼを結果として生じるミスセンス突然変異からも派生し得る。この突然変異は、薬剤と酵素との間の相互作用の部位を規定する可能性がある。残りの突然変異体を用いたＤＮＡ配列研究の結果が待ち望まれる。
この研究から導き出される別の結論は、種々のM. tuberculosis 株に関連する多剤耐性の分子的基盤に関する。ある与えられた患者がＨＩＶに関して血清陽性であるかまたは血清陰性であるかに関係なく、同じ突然変異が見出される。例えば、株９２９１は、あるＨＩＶ血清陽性結核患者から単離されたものであり、ｋａｔＧ（Ｒ４６１Ｌ）、ｒｐｏＢ（Ｓ４２５Ｌ）およびｒｐｓＬ（Ｋ４２Ｒ）遺伝子に各々ＩＮＨ、リファンピシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する突然変異を有している。同じ突然変異が、ＨＩＶ血清陰性個人からの株に、別々に、または組合せで、見出されている。このことは、研究した株のセットに関して、いくつかの薬剤に対する耐性を付与する新規な単一のメカニズムは存在せず、むしろ多剤耐性は異なる薬剤ターゲットに関する遺伝子中の突然変異の蓄積の結果として生じることを意味する。
【００７７】
例２
M. tuberculosis のｋａｔＧ遺伝子座の染色体中の位置およびヌクレオチド配列細菌株、プラスミドおよび生育条件。我々の研究室のコレクションから以下の細菌株をこの研究に使用した：M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ；M. smegmatisＭＣ² １５５(Snapper et al., 1990); E. coli Ｋ−１２ ＵＭ２ (ｋａｔＥ ｋａｔＧ；Mulvey et al., 1988)。組換えプラスミド、ｐＹＺ５５（ｐＵＣ１９，ｋａｔＧ ⁺ ）、ｐＹＺ５６（ｐＵＣ１９， ｌａｃＺ′ :: ｋａｔＧ）およびシャトルクローン、ｐＢＨ４（ｐＹＵＢ１８，ｋａｔＧ ⁺ ）およびｐＢＡＫ−ＫＫ−（ｐＢＡＫ１４，ｋａｔＧ ⁺ ）は最近記載されており(Zhang et al., 1992, Nature) 、M. tuberculosis のｋａｔＧ遺伝子座は図５に模式化して示す。マイコバクテリウムは、Middlebrook 7H9 培地で３７℃で生育させ、一方、E. coli 株は、適切な添加栄養と抗生物質を含むＬブロス中で培養した。
【００７８】
核酸技法。ＤＮＡの調製、標識およびハイブリダイゼーションには、標準技法を用いた(Eiglmeier et al., 1991; Zhang et al., 1992, Infect. Immun.; Zhang et al., 1992, Nature) 。ｐＹＺ５５のランダムフラグメントのショットガンライブラリーは、以前記載されたようにＭ１３ｍｐ１８中に調製し(Garnier et al., 1986)、ジデオキシ変法を用いてシークエンシングした(Biggin et al., 1983) 。配列は、蓄積し、ＳＡＰを用いてコンティグ（contigs ）に集合させ、Ｖａｘ３１００ワークステーションで作動させてＮＩＰ、ＳＩＰおよびＰＩＰを用いて解析した(Staden, 1987)。ギャップ閉鎖（gap closure)は、ＡＢＩ ３８１装置上で合成した合成オリゴヌクレオチドプライマーと、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(Pharmacia) を用いて得、ｐＹＺ５５から直接配列を得た。ＧｅｎＢａｎｋデータベース（リリース７３．１）中の関連配列を検索するためには、ＦＡＳＴＡ(Pearson et al., 1988)およびＢＬＡＳＴ(Altschul et al., 1990) プログラムを用いた。タンパク質配列中に存在する可能性のあるモチーフを検出するために、ＰＲＯＳＩＴＥ(Bairoch, 1992) カタログをスクリーニングし、ＧＣＧ配列解析パッケージのＰＩＬＥＵＰおよびＰＲＥＴＴＹモジュールを用いて整列（アラインメント）を行った(Devereux et al., 1984) 。
【００７９】
ウエスタンブロッティングおよびカタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性染色。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解像されたポリペプチドのイムノブロッティングおよびM. bovisＢＣＧに対して生成されたポリクローナル抗体（DAKOより購入）を用いた検出は、記載されたとおり行った(Zhang et al., 1992, Infect. Immun., Nature, Mol. Microbiol.)。カタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性を検出するための手順は、最近概略的に示されている(Heym et al., 1992; Zhang et al., 1992, Nature) 。
【００８０】
結果
M. tuberculosis のｋａｔＧ遺伝子座のヌクレオチド配列。以前の研究においては、完全ｋａｔＧ遺伝子は、シャトルコスミドｐＢＨ４上に、およびｐＹＺ５５を与えるために４．５kb ＫｐｎＩ制限フラグメント上に、E. coli において別々にクローニングされた( 図５；Zhang et al., 1992, Nature) 。カタラーゼ−ペルオキシダーゼの構造遺伝子は、続いてサブクローニングにより２．５kbのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントに位置決定された。この重要な酵素の一次構造を推定し、それにより強力な抗結核誘導体へのＩＮＨの変換におけるその推定上の役割についての洞察を得るために、ｐＹＺ５５からの完全インサートのヌクレオチド配列を決定した。これは、ジデオキシ−ショットガンクローニング手順の変法(Biggin et al., 1993) により達成し、コンティグ間のギャップは特異的プライマーを用いて閉鎖した。
【００８１】
結果として得られた図６Ａに示す配列を調べると、この４．５kbフラグメントは、４，７９５ヌクレオチドを含み、総体的ｄＧ＋ｄＣ含量が６４．４％であることが見出された。高コーディング確率値を用いてオープンリーディングフレームの存在に関してこれを解析すると、単一の候補が検出され、その大きさ、組成および位置から、これをｋａｔＧとして同定した。ＫｐｎＩフラグメントのどちらのストランドにもそれ以外のオープンリーディングフレームが存在しないことは、ｋａｔＧ以外の遺伝子がＩＮＨ感受性の付与に関与している可能性を除外した。
【００８２】
この配列をさらに解析すると、ｋａｔＧが、それに先行する２コピーの７００bpのダイレクトリピートを有することが示された。これらは６８％同一であり、同一である最長のストレッチは５８bpであった（図６Ｂ）。この配列を用いてデータベースをスクリーニングしたところ、有意な相同性は全く検出されなかった。それがM. tuberculosis の新規な反復要素に相当する可能性を試験するために、５８bpのリピートを含む３３６bpのプローブを用いて部分的に整理したコスミドライブラリーを調べた。陽性のハイブリダイゼーションシグナルは、ｋａｔＧを担持することが既知であるクローンからのみ得られた。同様に、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＲｓｒIIを用いて消化したM. tuberculosis ＤＮＡのサザンブロット中には単一の制限フラグメントが検出され、それによりこの反復配列が分散していないことが示された。
【００８３】
ｋａｔＧの染色体での位置。M. tuberculosis ゲノム計画の一部として、プローブが利用可能であるほとんどの遺伝子をコンティグ地図上で位置決定した。図５に示す重複するコスミドのシリーズから、ｋａｔＧにリンクしたマーカーは、それぞれ無名の抗原および推定上のフィブロネクチン結合タンパク、またはα抗原(Matsuo et al., 1988)をコードする、ＬＬ１０５およびｆｂｐＢであることがわかる。既知の挿入配列ＩＳ６１１０およびＩＳ１０８１(Collins et al., 1991; McAdam et al., 1990; Thierry et al., 1990, J. Clin. Microbiol.; Thierry et al., 1990, Nucleic Acids Res.) のどれ一つとして染色体のこの領域にマップされないが、ｋａｔＧの上流領域には主要多型タンデムリピートであるＭＰＴＲ(Hermans et al., 1992; Zhang and Young, 1993) が密に存在する。
【００８４】
他のマイコバクテリウムにおけるｋａｔＧ相同体（ホモログ）の存在。ＩＮＨは結核コンプレックスのメンバーに対して絶妙に強力であるが、他のマイコバクテリウムに対しては、あるとしてもわずかの活性しか示さない。ｋａｔＧに相同な遺伝子が他のマイコバクテリウムに存在するかどうかを決定するために、ＲｓｒIIで消化したＤＮＡのサザンブロットを、M. tuberculosis のｋａｔＧを担持する２．５kbのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ制限フラグメントから調製したプローブにハイブリダイズさせた。高ストリンジェンシー条件下で、M. leprae およびM. aviumから良好なシグナルが得られた（図７）が、一方、M. gordonae およびM. szulgaiについては、かろうじて識別できるハイブリダイゼーションが観察された。最近、ｋａｔＧホモログはM. smegmatisおよびM. aurumにも存在することが示された (Heym et al., 1992)。
【００８５】
M. tuberculosis のカタラーゼ−ペルオキシダーゼの予測される特性。ｋａｔＧのヌクレオチド配列から推定されるカタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造を図６に示す。この酵素は、７３５アミノ酸を含み、８０，０２９ダルトンの分子量を有すると予測される。このサイズのタンパク質は、M. tuberculosis 、およびM. smegmatisとE. coli の両方の組換え体において観察された（以下を参照されたい）。
【００８６】
一次構造は、E. coli 、Salmonella typhimuriumおよびBacillus stearothermophilus を含むいくつかの他の細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼについても入手可能であり(Loewen et al., 1990; Loprasert et al., 1988; Triggs-Raine et al., 1988) 、これらは酵母シトクロムｃペルオキシダーゼと遠く関連していることが示されている(Welinder, 1991)。後者の結晶構造は決定されており(Finzel et al., 1984) 、これを細菌の酵素の配列を解釈するために使用することができる。M. tuberculosis の酵素はエンテロバクテリアのＨＰＩ酵素と５３．３％の保存を示し、 B. stearothermophilusからのタンパク質と４５．７％の同一性を共有する。これらの４つの酵素の配列の整列図を、酵母シトクロムｃペルオキシダーゼのそれ(Welinder, 1991)と共に図８に示す。ＮＨ₂ 末端は、酵母の酵素には対応物がなく、最も変化の多い部分であることは明らかであり、タンパク質のこのドメインが広範な変動を許容することができ、触媒に必要とされないことが示唆される。この解釈の実験的支持は、さらに４０アミノ酸残基を含有するＬａｃＺ−ＫａｔＧ融合タンパクの形態において提供される（図９、レーン６；Zhang et al., 1992, Nature) 。このＮＨ₂ 末端セグメントの付加は、活性染色による判定から、ＫａｔＧにより行われるカタラーゼまたはペルオキシダーゼ反応のどちらかに、認め得る程度に干渉しない(Zhang et al., 1992, Nature)。
【００８７】
細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼは、遺伝子重複事象により進化したものであり、両方とも酵母の酵素との相同性を示し、約５０アミノ酸残基のユニークなＮＨ₂ 末端配列と融合した２つのモジュールからなると考えられている(Welinder, 1991)。M. tuberculosis の酵素はこのパターンに従っており、ＳＩＰを用いて内部的相同性について検索したところ(Staden, 1987)、残基５５〜４２２の間の領域がアミノ酸４２３〜７３５からなるカルボキシ末端ドメインと関連していることが明らかであった。ＰＲＯＳＩＴＥカタログに存在する、ペルオキシダーゼに典型的な２つの活性部位モチーフ(Bairoch, 1992) の一方のみが、M. tuberculosis カタラーゼ−ペルオキシダーゼ一次構造をスクリーニングした場合に見出された。これは、第二のモチーフがあるはずのところであるHis²⁶⁹周辺のコンセンサスから２つの逸脱が存在するためである。（ペルオキシダーゼ１についてのコンセンサスパターン：〔ＤＥＴ〕−〔ＬＩＶＭＴ〕−ｘ（２）−〔ＬＩＶＭ〕−〔ＬＩＶＭＳＴＡＧ〕−〔ＳＡＧ〕−〔ＬＩＶＭＳＴＡＧ〕−Ｈ−〔ＳＴＡ〕−〔ＬＩＶＭＦＹ〕；ペルオキシダーゼ２についてのコンセンサスパターン：〔ＳＧＡＴ〕−ｘ（３）−〔ＬＩＶＭＡ〕−Ｒ−〔ＬＩＶＭＡ〕−ｘ−〔ＦＷ〕−Ｈ−ｘ−〔ＳＡＣ〕；(Bairoch, 1992) 。さらに、可能性があるＡＴＰ結合モチーフ（Ｇ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｇ−Ｋ−Ｔ）が検出された(Balroch, 1992) が、これは活性部位と部分的に重複するため、その存在は純粋に偶然である可能性がある（図８）。
【００８８】
酵母シトクロムｃペルオキシダーゼとの類似性により(Welinder, 1991)、全てがＮＨ₂ 末端リピート中に位置する、構造的におよび触媒的に重要な残基の数を予測することが可能であった。His²⁶⁹はヘム鉄の５番目のリガンドとして役立つはずであり、一方、Asp³⁸⁰はその水素結合した相手であるはずである。活性部位のモジュレーションおよびＨ₂ Ｏ₂ 結合に関与すると予測される他の残基は、Arg¹⁰⁴、Trp¹⁰⁷、His¹⁰⁸、Asn¹³⁸、Thr²⁷⁴およびHis²⁷⁵である（図４）。Welinderの予測によれば、Trp³²⁰は重要な残基であり、タンパク質−ラジカル部位の形成に必要なはずである (Sivaraja et al., 1989) 。
【００８９】
M. tuberculosis ＫａｔＧに対する抗体応答。ＫａｔＧの免疫原としての可能性がある値を評価するために、ウエスタンブロットを、ウサギにおいてM. bovisＢＣＧに対して生成させた抗血清を用いてプローブした。図９に示すように、８０kDカタラーゼ−ペルオキシダーゼは、M. tuberculosis 、およびクローニングされたｋａｔＧ遺伝子を発現しているM. smegmatisの無細胞抽出物において認識される顕著な抗原の一つである（レーン１、３）。同様に、E. coli 中にこの遺伝子を導入すると、有意なレベルのカタラーゼ−ペルオキシダーゼが産生され、８５kD融合タンパクの合成を指示するｌａｃＺ′−ｋａｔＧ遺伝子融合から顕著な発現の増加が得られた（図９、レーン６）。
【００９０】
本研究の目的は、ｋａｔＧ遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、得られた情報を用いてその産物がいかにしてM.tuberculosisのＩＮＨ感受性を媒介するかを理解しようとすること、およびおそらくはゲノムのｋａｔＧ領域の見かけ上の不安定性を説明することであった。反復ＤＮＡはしばしば染色体再配列の源であり、ｋａｔＧの上流のＤＮＡ配列の解析から、２コピーの７００bpダイレクトリピートが明らかになった。この要素は、この遺伝子座に限られているように見えるので、このように頻繁に観察されるこの遺伝子の欠失を導き得る、相同組換えのような事象のターゲットとして役立つ可能性は低い(Zhang et al., 1992, Nature; Zhang and Young, 1993)。同様に、ｋａｔＧを包含するM. tuberculosisＨ３７Ｒｖの染色体の７０kbストレッチにはＩＳ６１１０およびＩＳ１０８１のコピーが存在しないので、これらの挿入配列が不安定性の源である可能性は高いようには見えない。むしろ、ｋａｔＧの上流に位置する主要多型タンデムリピート、ＭＰＴＲ( 図５；Hermans et al., 1992) のクラスターの存在は、これが組換えのホットスポットとして作用する可能性があることを示唆する。これは、ＭＰＴＲクラスターとｋａｔＧの両方を除去する可能性がある(Zhang and Young, 1993) 。ｋａｔＧ領域の配列の利用可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応に好適なプライマーの設計を可能にし、したがってＩＮＨ耐性の迅速な検出および染色体不安定性の分子的基礎の理解の両方に向けられた研究を容易にする。
【００９１】
M. tuberculosis カタラーゼ−ペルオキシダーゼのおそらく最も興味深い特徴は、ＩＮＨ感受性を媒介するその能力である。我々の現在の作動仮説においては、この薬剤はその酵素と相互作用し、ペルオキシダーゼ活性によって毒性誘導体に変換され、それが未知の第二の部位に作用する(Zhang et al., 1992, Nature)。西洋ワサビペルオキシダーゼはこの反応を実行することができ(Pearson et al., 1988; Shoeb et al., 1985)、ヒロドキシルおよび有機を含まないラジカルを生成し得るが、他のマイコバクテリウムを含め、ごくわずかの細菌しかＩＮＨに対して感受性を有さない。それらはｋａｔＧに相同な遺伝子を有するので、このことは興味深い（図７）。これについての１つの説明は、ほとんどの細菌は２つのカタラーゼを含み、それらの一方はペルオキシダーゼ活性を有する広いスペクトルの酵素であり、また、第二のカタラーゼはＨ₂ Ｏ₂ を優先的に除去することによりこのカタラーゼ−ペルオキシダーゼの能力をＩＮＨを酸化することに制限するという事実によって提供され得る。M. tuberculosis は後者の活性を欠いているので、そのＫａｔＧ酵素は、電子受容体についての競合なしにＩＮＨをその致死形態に変換することができる。
【００９２】
あるいはそうでなければ、毒性を助長するか、またはその薬剤との相互作用を好む、M. tuberculosis 酵素の何らかの独自の特徴が存在する可能性がある。細菌のカタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造を調べることは、この点に関して指示を与えるものではない。これは、それらが皆広範な配列の同一性を共有し、ペルオキシダーゼの活性部位に特徴的な２つのモチーフを含むためである。さらに、E. coli ｋａｔＧ遺伝子の発現はM. tuberculosis の薬剤耐性突然変異体にＩＮＨ感受性を部分的に回復させ得ることが最近示され、この内在性酵素はいかなる薬剤特異的特性も有さない可能性があることが示唆された(Zhang et al., 1993)。酵母からのシトクロムｃペルオキシダーゼとの配列の比較は、ＫａｔＧタンパク質の構造的および機能的編成についての重要な情報を提供し、推定的に重要な触媒残基の同定に導いた（図８）。
【００９３】
ｋａｔＧの完全配列が利用可能になったので、位置指定突然変異誘発によりこれらの仮説のいくつかを試験すること、および酵素的反応およびその生成物の詳細な解析をインビトロで実施し得るように酵素を過剰産生させることが可能である。同様に、酵素的活性を保持しているが、ＩＮＨへの結合またはその酸化ができない突然変異体を単離することも比較的簡便なことのはずである。特に興味深いのは、この酵素の反復構造、およびＮＨ₂ 末端リピートがペルオキシダーゼの活性部位を含むという予測である。これは、突然変異を起こした、または３′端で短縮されたｋａｔＧ遺伝子が生じ得る可能性を提起する。その生成物は、サブユニット−サブユニット相互作用に必要であり得る正常なＣＯＯＨ末端(Welinder, 1991)を欠いており、不安定ではあるが、低い酵素活性をなお保持しているであろうということは考えられる。それらは、したがって、臨床的な場においてしばしば観察されるように、この遺伝子を完全に欠いている突然変異体とｋａｔＧ ⁺ 株との間の、中間的レベルのＩＮＨ感受性を付与するであろう。
【００９４】
本発明は、当然のことながら、上述した２．５kbのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメントの一部分を使用してもよく、上記一部分はそれでもなおイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロ検出の選択性を提供するのに充分に長いものである。
【００９５】
本発明は、M. tuberculosis の多剤耐性変異体の検出のためのキットにも関し、上記キットは、
（ａ）薬剤耐性をコードしている遺伝子についてのプローブを含有している容器；および
（ｂ）核酸の対照調製物を含有している容器
を含む。
【００９６】
いうまでもなく、その使用は、イソニアジドに対して耐性のMycobacterium の核酸に特異的なヌクレオチド配列を利用するあらゆる代替的検出方法であってよく、例えば、増幅技法およびプライマーを用いる方法であって、そのプライマーは、上述のプローブのヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含有するフラグメントの増幅を提供するために上記特異的なヌクレオチド配列内に包含されていてもよく、それにもかかわらずイソニアジドに対して耐性のMycobacterium tuberculosisのインビトロ検出の選択性を提供するのに充分に長いものであり、最終的に増幅された配列のいずれかの中の可能性がある突然変異を検出する。
【００９７】
選択した抗生物質に対する耐性の検出のための好ましい代替的方法（オリゴタイピング）は、以下の工程を含む：
−突然変異を有している可能性が高い適切な遺伝子またはその一部を、選択した制限酵素により上記適切な遺伝子を消化するなどによって、複数のフラグメントにフラグメント化する工程、
−これらのフラグメントを、好ましくは、ストリンジェンシーの高い条件下で、対応する抗生物質に対して耐性ではない株の対応する対照ＤＮＡの上記適切な遺伝子の全部または一部を認識する標識プローブのシリーズである、相補的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる工程、
−そして、調べているマイコバクテリウムの上記適切な遺伝子のいずれかのＤＮＡフラグメントへの、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの欠如を、特に上記抗生物質に対して耐性ではない株から得られた上記適切な遺伝子上での同じオリゴヌクレオチドを用いた同じ条件下での試験の結果と比較して、突然変異の存在、そしておそらく対応する抗生物質に対する耐性の証拠として関連させる工程。
【００９８】
別の代替的方法（ＳＳＣＰ解析、すなわち、一本鎖コンフォメーション多型の解析）は、以下の工程を含む：
−解析すべきＤＮＡ、特に適切な遺伝子のＤＮＡを消化する工程、
−得られたフラグメントを、例えばＰＣＲにより増幅する工程、
−増幅されたフラグメントを回収する工程、および
−例えば、電気泳動ゲルなどでそれらを移動させることによって、サイズにしたがってそれらを互いに分離する工程、
−異なるフラグメントのサイズを、同様のアッセイに供した、抗生物質に対して耐性ではない１つまたはいくつかの対照株のＤＮＡから得られたものと比較する工程、および
−おそらく検出される多型を、上記適切な遺伝子中の突然変異の存在と関連させ、したがって調べているＤＮＡを得たもとの株の対応する抗生物質に対する可能性のある耐性と関連させる工程。
【００９９】
いうまでもなく、古典的なシークエンシング技法を含め、他のあらゆる方法を、同じ目的の達成のために行使することができる。
【０１００】
この方法は、多型の検出のための「オリゴタイピング」という表現で知られるものを含み、Orita et al.( 本明細書中以前に既にこれを参照している）により開示された一本鎖のコンフォメーションに基づいた多型の検出のための方法を参照するのが有利である。
【０１０１】
イソニアジドに対する耐性の場合の適切な遺伝子は、当然のことながらｋａｔＧ遺伝子またはそのフラグメントである。
【０１０２】
リファンピシンに対する耐性の場合には、適切な遺伝子は、上記マイコバクテリウムのＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子であり、あるいはその遺伝子の一部のみを使用する場合には、好ましくはｒｐｏＢ遺伝子のコドン４００〜４５０を含む部分である。
【０１０３】
最後に、ストレプトマイシンに対する耐性の場合には、企図される適切な遺伝子は、小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子のそれであり、あるいは上記遺伝子の一部のみを使用する場合には、好ましくは位置４３のコドンを含む部分である。
【０１０４】
好ましい手順を、特にＰＣＲ増幅法を利用する代替的方法に関して、以下に開示する。
【０１０５】
生物学的試料（例えば、血液または唾液）から、細胞破砕物を除去し、適切な溶解緩衝液を用いて細菌細胞を溶解した後、ＤＮＡを得る。ＰＣＲ増幅法を、それぞれ増幅すべきＤＮＡの各ストランドのフラグメントに相補的な１対のプライマーを用いて、古典的な方法により実施する。
【０１０６】
この手順は、さらに以下のように実施してもよい：
−増幅産物（例えば、１００〜３００ヌクレオチドを含む）を、好適なエンドヌクレアーゼにより消化し、
−増幅媒体から得られたＤＮＡストランドを変性処理に付し、
−一本鎖にしたＤＮＡストランドを中性５％ポリアクリルアミドゲル上に置き、−上記一本鎖にしたＤＮＡストランドを、電気泳動により上記ゲル上を移動させ、
−ポリアクリルアミドゲル上を移動したＤＮＡフラグメントを通常のエレクトロブロッティング技法に従ってナイロンメンブレンにトランスファーし、例えば、³²Ｐ標識したプローブのような標識プローブとハイブリダイズさせ、そして
−解析に供したＤＮＡフラグメントの移動距離を、同じ条件下の増幅、消化、変性電気泳動およびナイロンメンブレンへのトランスファーで得た対照から得られたものと比較する。上記ＤＮＡは同一ではあるが調べている抗生物質に対して感受性の細菌株から得られていたものである。
【０１０７】
上記で開示した「オリゴタイピング」手順に用いるオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにＰＣＲプライマーの作製のためには、１９９２年９月１５日にＣＮＣＭに番号Ｉ−１２６７として寄託されているプラスミドに挿入された野生型Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｒｐｏＢ遺伝子に相補的なものを、有利に利用する。
【０１０８】
本発明は、より詳細には、小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするMycobacterium tuberculosisのｒｐｓＬ遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列、並びにストレプトマイシンに対する耐性に関連があると認められている突然変異を起こしたｒｐｓＬ遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列にも関する。
【０１０９】
そのヌクレオチド配列の増幅により、ｒｐｓＬ遺伝子全体のヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１１０】
本発明のさらなる説明は、以下の別の例の記載において提供され、そこで関連する図面においては：
−図１０は、異なるM. leprae 単離株の研究のために用いたＰＣＲ戦略をダイアグラムにより表すものであり、ｒｐｏＢのコーディング配列を示す。シークエンシングされた領域は、陰影をつけた部分で示し、用いた増幅プライマーの位置および参考は上部の線により示し、シークエンシングプライマーはその下に示してある。
−図１１は、（Ａ）リファンピシンに対する耐性を付与する突然変異を有するｒｐｏＢの短い領域のヌクレオチド配列を、対応する対立遺伝子中の塩基の変化と共に示すもの、および（Ｂ）E. coliおよびM. leprae のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの領域IIのドメインＩのアミノ酸配列間の比較であり、ここで、突然変異を起こしたアミノ酸の差異および残基の番号を示してある。リファンピシン耐性と関連する突然変異を起こしたアミノ酸残基並びにその出現頻度も示してある。
−図１２は、M. leprae のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を示す。
−図１３は、M. tuberculosis のｒｐｏＢ遺伝子の一部の配列を表す。
−図１４は、M. tuberculosis のｒｐｓＬ遺伝子の一部の配列を表す；M. leprae の完全ｒｐｓＬ遺伝子の配列と、その発現産物であるＳ１２タンパク質（その出発アミノ酸は１で記してある）のそれとを両方示してある。ＭＬ５１およびＭＬ５２プライマーの位置、並びにM. tuberculosis のｒｐｓＬ遺伝子の一部の配列は、M. leprae のそれらの下に提供してある。それらの位置のうち異なるものおよび相当するアミノ酸変化のみを示す。
−図１５は、ストレプトマイシンに対する耐性に関連する、小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子フラグメントの野生型ＤＮＡ配列、並びにＳ１２タンパク質の対応するアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
例
リファンピシンに対する感受性を、Grosset et al. (およびInt. J. Lepr. 57: 607-614)により開示されているように、マウスにおいて決定した。M. leprae の細胞は、古典的手順によってマウスの足から得た。耐性株は全て、２０mg/kg の日用量のリファンピシンを受けたマウスにおいて生育することができたが、一方、感受性株は２mg/kg 未満の低いリファンピシン濃度で殺菌された。
【０１１２】
抽出したＤＮＡのｒｐｏＢ遺伝子の適切な領域を２対のビオチン化したプライマーを用いて開始した。その配列を以下の表に示す。
【０１１３】
【表７】

【０１１４】
従来の技法を用いて、３１０bpおよび７１０bpを含む増幅産物を、図１０に示すようにそれぞれ得た。表に用いた異なるプライマーの配列の局在も、図１０に示す。
【０１１５】
得られたＤＮＡを、リファンピシンに対して感受性の単離株のｒｐｏＢ配列に基づいてシークエンシングした。その遺伝子の配列を含むプラスミドは、番号Ｉ−１２６６として１９９２年９月１５日にＣＮＣＭに寄託されている。ビオチニル化したＰＣＲ産物を、攪拌しながらストレプトアビジンでコーティングしたビーズに接触させることにより、ＰＣＲ反応混合物から濃縮した。ビーズに付着したビオチニル化されたストランドを、次いで回収し、シークエンシングした。得られた配列を、野生型株のｒｐｏＢ遺伝子の配列と比較した。野生型遺伝子（リファンピシンに対して感受性のマイコバクテリウムの）、およびリファンピシンに対して耐性の４つの突然変異体のβサブユニットの対応する配列のシークエンシングの結果として、有為な結果が得られた（図１１）。
【０１１６】
M. tuberculosis に感染した患者から得た１０２ストランドから始めて、結果が得られた。この１０２ストランドのうち、５３はリファンピシンに対して感受性であり、４９はリファンピシンに対して耐性であった。後者のうちでは、突然変異は、突然変異体のうち４３において４００〜４５０の領域中に位置決定され、突然変異は⁴²⁵ Ser の領域でLeu へ起こっていた。
【０１１７】
ストレプトマイシンに対するマイコバクテリウムの耐性の検出の例
M. tuberculosis 株の培養およびストレプトマイシンに対するその感受性の試験は、Lowenstein-Ierva培地上での比例法により実施した〔「臨床マイコバクテリウム学の実験室方法(Laboratory Method for Clinical Mycobacteriology)」- Hugo David-Veronique Levy Frebault, M.F. Thorel、Institut Pasteur刊〕。
【０１１８】
M. leprae のｒｐｓＬ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列類似性により、ストレプトマイシン耐性に関連のあることに責任がある、推定突然変異部位を含む領域を取り囲む、ＰＣＲ反応に好適なＭＬ５１(CCCACCATTCAGCAGCTGGT)およびＭＬ５２(GTCGAGCGAACCGCGAATGA)の２つのプライマーの構築に導いた。マトリックスとして使用した、用いたM. tuberculosis のＤＮＡは、３０６bpのｒｐｓＬフラグメントを得ることを可能にした。配列決定したフラグメントのヌクレオチド配列は、M. leprae のそれと２８か所の差異を呈していた。
【０１１９】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの４３ストレインのｒｐｓＬ遺伝子（そのうち２８は耐性であった）を、ＰＣＲおよびＳＳＣＰ技法の両方で増幅した。
【０１２０】
凍結−解凍(congelation-decongelation) 技法により、１００μl の鉱物油でカバーされたM. tuberculosis 試料の２００μlアリコートからＤＮＡを抽出した(Woods and Cole, 1989, FEBS Microbiol. Lett., 65:305-308) 。
【０１２１】
試験したＤＮＡストランドの電気泳動後、突然変異体のうち１６に突然変異が示された。考慮中の１６ストランドにおける突然変異の性質を確立するために、ＭＬ５１およびＭＬ５２プライマーを用いてＰＣＲにより相当するｒｐｓＬ遺伝子フラグメントを増幅し、それらの各々のヌクレオチド配列を決定した。
【０１２２】
得られた配列を野生型ｒｐｓＬ遺伝子の配列と比較した。野生型に関して単一の差異が見出された。コドン４３のＡＡＧが突然変異によりＡＧＧとなり、結果として、Lys-42アミノ酸がArg に置き換わっていた。
【０１２３】
本発明は、「突然変異を起こした」ＤＮＡフラグメントにも関する。それらは、次に、好適なハイブリダイゼーション手順における検出のための、および上記で説明したいずれかの抗生物質に対して耐性を有する疑いのあるM. tuberculosis 株から抽出したＤＮＡにおける同様の突然変異の検出のための、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【０１２４】
本発明は、さらに、イソニアジド、リファンピシンまたはその類似体、およびストレプトマイシンに対するマイコバクテリウム科の耐性についてのキットにも関する。
【０１２５】
本発明は、さらに、イソニアジドに対するマイコバクテリウム属細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−ｋａｔＧ遺伝子またはそのフラグメントのＤＮＡの遺伝子を増幅する手段、
−そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
−イソニアジドに対して感受性の上記細菌の株のｋａｔＧ遺伝子またはそのフラグメントの対照ＤＮＡの調製物、
−場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテリウム株のｋａｔＧ遺伝子のＤＮＡの対照調製物
を含むことを特徴とするキットにも関する。
【０１２６】
本発明は、さらに、リファンピシンまたはその類似体に対するマイコバクテリウム属細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−上記マイコバクテリウムのｒｐｏＢ遺伝子もしくはＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットのＤＮＡまたはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段、
−そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
−リファンピシンに対して感受性の上記細菌の株のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメントの対照ＤＮＡの調製物、
−場合によっては、イソニアジド耐性マイコバクテリウム株のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡの対照調製物
を含むことを特徴とするキットにも関する。
【０１２７】
同様に、本発明はストレプトマイシンに対するM. tuberculosis の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
−小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントの遺伝子を増幅する手段、
−得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
−ストレプトマイシンに対して感受性のM. tuberculosis 株のリボソームの小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子のＤＮＡ配列の対照調製物、および
−場合によっては、ストレプトマイシンに対して耐性のM.tuberculosis株のリボソームの小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子のＤＮＡ配列の対照調製物
を含むことを特徴とするキットにも関する。
【０１２８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明は、以下のような図面を参照してその詳細の大部分が記載される。
図１は、ＩＮＨ耐性M. smegmatis株ＢＨ１(Gayathri et al., 1975) （ＭＣ² −１５５株の誘導体）を、M. tuberculosis − Ｈ３７Ｒｖシャトルコスミド（ New York のW.R. Jacobs 博士の厚意により提供されたもの）のプールにより形質転換し、個々のクローンをＩＮＨ感受性について採点したことを示す。コスミドｐＢＨ４は定常的に薬剤感受性を付与し、形質転換体はカタラーゼを過剰産生する（Heym, 1992のようにアッセイした場合）。ｐＢＨ４からのＤＮＡインサートの制限地図を、ｐＹＺ５５からのインサートのそれと共に示す。ｐＹＺ５５は、E. coli ヒドロペルオキシダーゼＩ（ＨＰＩ）の保存された領域からのアミノ酸配列と一致するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ(5′-TTCATCCGCATGGCCTGGCACGGCGCGGGCACCTACCGC-3′) を用いたハイブリダイゼーションをもとに単離された、M. tuberculosis Ｈ３７ＲｖのｋａｔＧを含有するプラスミドである。以下の酵素に関する制限部位が示されている：Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｃ，ＣｌａＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，ＨｉｎｄIII；Ｋ，ＫｐｎＩ；Ｍ，ＳｍａＩ；Ｎ，ＮｏｔＩ；Ｒ，ＥｃｏＲＩ；Ｓ，ＳａｃＩ。ｐＹＺ５５からの４．５kbインサートを含有するマイコバクテリウムのシャトルプラスミドｐＢＡＫ１４(Zhang et al., 1991)を用いたＢＨ１の形質転換も、同様にＩＮＨ感受性を付与した。ｐＹＺ５５に由来し、ｐＢＡＫ１４中にある方向（＋）または逆の方向（−）に挿入されているサブフラグメントを用いて形質転換されたＢＨ１について、ＭＩＣも同様に示す。
【図２Ａ】図２は、以前記載されたように活性ゲル解析のために調製された種々のプラスミド構築物(Zhang et al., 1991)を用いて形質転換されたE. coli およびM. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株からの抽出物を示す。８％ポリアクリルアミドを含有する非変性ゲルは、Wayne および Diaz により記載されているように(Wayne et al., 1986)カタラーゼ活性（パネルＡ）およびペルオキシダーゼ活性（パネルＢ）について染色した。レーン１、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ；２、E. coli ＵＭ２（ｋａｔＥ，ｋａｔＧ）；３、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５５；４、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５６（ｐＵＣ１９中の２．９kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント、図１のｐＢＡＫ−ＫＥ＋に相当する）；５、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５７（ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ欠失を有するｐＹＺ５５、図１のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に相当する）。M. tuberculosis カタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性は、これらの条件下で２つのバンドとして移動した（レーン１）。同じパターンは、ｐＹＺ５５により発現された組換え酵素についても見られた（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに示すベクターからのｌａｃＺ′およびｋａｔＧの間の融合により分子量が増加したタンパク質を発現する。パネルＣは、E. coli のＨＰＩとの部分的な配列の整列図（アラインメント）をも示す。
【図２Ｂ】図２は、以前記載されたように活性ゲル解析のために調製された種々のプラスミド構築物(Zhang et al., 1991)を用いて形質転換されたE. coli およびM. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株からの抽出物を示す。８％ポリアクリルアミドを含有する非変性ゲルは、Wayne および Diaz により記載されているように(Wayne et al., 1986)カタラーゼ活性（パネルＡ）およびペルオキシダーゼ活性（パネルＢ）について染色した。レーン１、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ；２、E. coli ＵＭ２（ｋａｔＥ，ｋａｔＧ）；３、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５５；４、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５６（ｐＵＣ１９中の２．９kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント、図１のｐＢＡＫ−ＫＥ＋に相当する）；５、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５７（ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ欠失を有するｐＹＺ５５、図１のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に相当する）。M. tuberculosis カタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性は、これらの条件下で２つのバンドとして移動した（レーン１）。同じパターンは、ｐＹＺ５５により発現された組換え酵素についても見られた（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに示すベクターからのｌａｃＺ′およびｋａｔＧの間の融合により分子量が増加したタンパク質を発現する。パネルＣは、E. coli のＨＰＩとの部分的な配列の整列図（アラインメント）をも示す。
【図２Ｃ−１】図２は、以前記載されたように活性ゲル解析のために調製された種々のプラスミド構築物(Zhang et al., 1991)を用いて形質転換されたE. coli およびM. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株からの抽出物を示す。８％ポリアクリルアミドを含有する非変性ゲルは、Wayne および Diaz により記載されているように(Wayne et al., 1986)カタラーゼ活性（パネルＡ）およびペルオキシダーゼ活性（パネルＢ）について染色した。レーン１、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ；２、E. coli ＵＭ２（ｋａｔＥ，ｋａｔＧ）；３、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５５；４、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５６（ｐＵＣ１９中の２．９kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント、図１のｐＢＡＫ−ＫＥ＋に相当する）；５、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５７（ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ欠失を有するｐＹＺ５５、図１のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に相当する）。M. tuberculosis カタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性は、これらの条件下で２つのバンドとして移動した（レーン１）。同じパターンは、ｐＹＺ５５により発現された組換え酵素についても見られた（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに示すベクターからのｌａｃＺ′およびｋａｔＧの間の融合により分子量が増加したタンパク質を発現する。パネルＣは、E. coli のＨＰＩとの部分的な配列の整列図（アラインメント）をも示す。
【図２Ｃ−２】図２は、以前記載されたように活性ゲル解析のために調製された種々のプラスミド構築物(Zhang et al., 1991)を用いて形質転換されたE. coli およびM. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株からの抽出物を示す。８％ポリアクリルアミドを含有する非変性ゲルは、Wayne および Diaz により記載されているように(Wayne et al., 1986)カタラーゼ活性（パネルＡ）およびペルオキシダーゼ活性（パネルＢ）について染色した。レーン１、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ；２、E. coli ＵＭ２（ｋａｔＥ，ｋａｔＧ）；３、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５５；４、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５６（ｐＵＣ１９中の２．９kb ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩフラグメント、図１のｐＢＡＫ−ＫＥ＋に相当する）；５、E. coli ＵＭ２／ｐＹＺ５７（ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ欠失を有するｐＹＺ５５、図１のｐＢＡＫ−ＫＢ＋に相当する）。M. tuberculosis カタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性は、これらの条件下で２つのバンドとして移動した（レーン１）。同じパターンは、ｐＹＺ５５により発現された組換え酵素についても見られた（レーン３）。ｐＹＺ５６（レーン４）は、パネルＣに示すベクターからのｌａｃＺ′およびｋａｔＧの間の融合により分子量が増加したタンパク質を発現する。パネルＣは、E. coli のＨＰＩとの部分的な配列の整列図（アラインメント）をも示す。
【図３】図３は、ｐＵＣ１９ベクター単独、M. tuberculosis ｋａｔＧを発現するｐＹＺ５５、およびM. tuberculosis ｋａｔＧの高レベル発現を伴うｐＹＺ５６を用いて形質転換された、ｋａｔＧおよびｋａｔＥの両方に突然変異を有するE. coli 株（ＵＭ２、Mulvey et al., 1988)を示す。適切な抗生物質を添加したLuria-Bertani 培地中の一晩培養を、種々の濃度のＩＮＨの存在下でプレーティングし、コロニー形成単位を評価した。代表的な実験の結果を、３組の試料について観察された標準偏差を示すエラーバーと共に示す。M. tuberculosis のｋａｔＧの過剰発現は、同様にE. coli ＵＭ２５５（ｋａｔＧ、ｋａｔＥ、Mulvey et al., 1988 )において高濃度のＩＮＨに対する感受性を付与したが、E. coli ＴＧ１のようなカタラーゼ陽性株に対しては何の効果も示さなかった。いくつかの実験においては、高濃度のＩＮＨは、単独で、ＵＭ２およびＵＭ２５５の生育に対して検出可能な阻害効果を有していたが、全ての実験において、ｐＹＺ５６形質転換体の阻害は、相当するベクター対照において観察されたものよりも少なくとも１０〜１００倍大きいものであった。
【図４Ａ】図４は、ＫｐｎＩで消化し、（Ａ）ｋａｔＧ（４．５kb ＫｐｎＩフラグメント）および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子 （１．１kb ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント、 Zhang et al., 1991 ）をプローブとして調べた、異なるM. tuberculosis 株からのゲノムＤＮＡを用いて調製したサザンブロットを示す。プローブの標識およびブロットの処理は、以前記載されたように実施した(Eiglmeier et al., 1991; Maniatis et al., 1989)。レーン１、Ｈ３７Ｒｖ；２、株１２−ＭＩＣ １．６μg /ml ＩＮＨ；３、Ｂ１４５３−ＭＩＣ ＞５０μg /ml ＩＮＨ(Jackett et al., 1978)；４、株２４−ＭＩＣ ＞５０μg /ml ＩＮＨ；５、７９１１２−ＩＮＨ感受性(Mitchison et al., 1963)；６、１２６４６−ＩＮＨ感受性(Mitchison et al., 1963)；７、７９６６５−ＩＮＨ感受性(Mitchison et al., 1963)。ＩＮＨ感受性は、異なる濃度のＩＮＨを含有するLowenstein-Jensen スロープ（斜面）の接種により確認した。
【図４Ｂ】図４は、ＫｐｎＩで消化し、（Ａ）ｋａｔＧ（４．５kb ＫｐｎＩフラグメント）および（Ｂ）ＳＯＤ遺伝子 （１．１kb ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント、 Zhang et al., 1991 ）をプローブとして調べた、異なるM. tuberculosis 株からのゲノムＤＮＡを用いて調製したサザンブロットを示す。プローブの標識およびブロットの処理は、以前記載されたように実施した(Eiglmeier et al., 1991; Maniatis et al., 1989)。レーン１、Ｈ３７Ｒｖ；２、株１２−ＭＩＣ １．６μg /ml ＩＮＨ；３、Ｂ１４５３−ＭＩＣ ＞５０μg /ml ＩＮＨ(Jackett et al., 1978)；４、株２４−ＭＩＣ ＞５０μg /ml ＩＮＨ；５、７９１１２−ＩＮＨ感受性(Mitchison et al., 1963)；６、１２６４６−ＩＮＨ感受性(Mitchison et al., 1963)；７、７９６６５−ＩＮＨ感受性(Mitchison et al., 1963)。ＩＮＨ感受性は、異なる濃度のＩＮＨを含有するLowenstein-Jensen スロープ（斜面）の接種により確認した。
【図５】図５は、ｋａｔＧ遺伝子座の編成である。上部のバーは、ｋａｔＧ領域にわたるM. tuberculosis 染色体のストレッチに相当し、地図の作製に用いた個々のコスミドの位置は、もとのシャトルコスミドｐＢＨ４およびｐＹＺ５５と共に下部に示されている。いくつかの重要な制限部位の位置（Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｋ，ＫｐｎＩ）は、公知の遺伝子マーカーのおよその位置と共に示されている：ｆｂｐＢ、αまたは８５Ｂ抗原(Matsuo et al., 1988) をコードする；ｋａｔＧ、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ；ＬＬ１０５、Å Andersenの厚意により供給された無名のλｇｔ１１クローン；ＭＰＴＲ、主要多型タンデムリピート(Hermans et al., 1992)。
【図６Ａ−１】図６のＡは、ｋａｔＧを担持するＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、７００bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図２Ａでの位置を引用する。
【図６Ａ−２】図６のＡは、ｋａｔＧを担持するＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、７００bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図２Ａでの位置を引用する。
【図６Ａ−３】図６のＡは、ｋａｔＧを担持するＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、７００bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図２Ａでの位置を引用する。
【図６Ａ−４】図６のＡは、ｋａｔＧを担持するＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、７００bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図２Ａでの位置を引用する。
【図６Ｂ−１】図６のＡは、ｋａｔＧを担持するＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、７００bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図２Ａでの位置を引用する。
【図６Ｂ−２】図６のＡは、ｋａｔＧを担持するＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列である。この配列は、ＥＭＢＬデータライブラリーに受託番号Ｘ６８０８１として寄託されている。推定タンパク質配列は一文字コードで示されている。Ｂは、同一性を「＊」で示し、整列を最適にするために導入したパッドを表わす「−」を含む、７００bpのダイレクトリピートの２コピーの整列図である。番号付けは図２Ａでの位置を引用する。
【図７】図７は、マイコバクテリウムにおけるｋａｔＧの分布である。Ａ．は、異なる細菌ＤＮＡ（１．５μg ）の試料をＲｓｒIIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロミドで染色したもの。レーン１および７、サイズマーカー；M. leprae;レーン３、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ；レーン４、M. gordonae;レーン５、M. szulgai；レーン６、M. avium。Ｂ．は、Ａのゲルを、サザンブロッティングした後、ｋａｔＧ特異的プローブでハイブリダイゼーションしたもの。
【図８−１】図８は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造の整列図である。配列は、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ、ｍｔｋａｔｇ；E. coli 、ｅｃｋａｔｇ(Triggs-Raine et al., 1988); S. typhimurium 、ｓｔｋａｔｇ; B. stearothermophilus 、ｂｓｐｅｒａ (Loprasert et al., 1988) および酵母シトクロムｃペルオキシダーゼ(ccp; Finzel et al., 1984)からのものである。整列図は、ＰＩＬＥＵＰおよびＰＲＥＴＴＹを用いて作製した(Devereux et al., 1984) 。「・」は、相同性を最大にするように導入したギャップを表わす。本文中で考察している活性部位およびペルオキシダーゼモチーフからの重要な残基(Welinder, 1991)は、コンセンサスの下に示されている。
【図８−２】図８は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼの一次構造の整列図である。配列は、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ、ｍｔｋａｔｇ；E. coli 、ｅｃｋａｔｇ(Triggs-Raine et al., 1988); S. typhimurium 、ｓｔｋａｔｇ; B. stearothermophilus 、ｂｓｐｅｒａ (Loprasert et al., 1988) および酵母シトクロムｃペルオキシダーゼ(ccp; Finzel et al., 1984)からのものである。整列図は、ＰＩＬＥＵＰおよびＰＲＥＴＴＹを用いて作製した(Devereux et al., 1984) 。「・」は、相同性を最大にするように導入したギャップを表わす。本文中で考察している活性部位およびペルオキシダーゼモチーフからの重要な残基(Welinder, 1991)は、コンセンサスの下に示されている。
【図９】図９は、異なる細菌において産生されたM. tuberculosis ＫａｔＧのウエスタンブロット解析である。タンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、次いでイムノブロッティングと、Zhang et al., 1991に記載されているようにＢＣＧに対して生成された抗血清を用いた検出を行った。レーン１、M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖの可溶性抽出物；レーン２、ベクターｐＢＡＫ１４を担持するM. smegmatis ＭＣ²１５５；レーン３、ｐＢＡＫ−ＫＫを担持するＭＣ² １５５（ｋａｔＧ＋）；レーン４、E. coli ＵＭ２（ｋａｔＥ、ｋａｔＧ）；レーン５、ｐＹＺ５５を担持するＵＭ２（ｋａｔＧ ⁺ ）；レーン６、ｐＹＺ５６を担持するＵＭ２（ｌａｃＺ′ :: ｋａｔＧ）。
【図１０】図１０は、異なるM. leprae 単離株の研究のために用いたＰＣＲ戦略をダイアグラムにより表すものであり、ｒｐｏＢのコーディング配列を示す。シークエンシングされた領域は、陰影をつけた部分で示し、用いた増幅プライマーの位置および参考は上部の線により示し、シークエンシングプライマーはその下に示してある。
【図１１】図１１は、（Ａ）リファンピシンに対する耐性を付与する突然変異を有するｒｐｏＢの短い領域のヌクレオチド配列を、対応する対立遺伝子中の塩基の変化と共に示すもの、および（Ｂ）E. coliおよびM. leprae のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの領域IIのドメインＩのアミノ酸配列間の比較であり、ここで、突然変異を起こしたアミノ酸の差異および残基の番号を示してある。リファンピシン耐性と関連する突然変異を起こしたアミノ酸残基並びにその出現頻度も示してある。
【図１２−１】図１２は、M. leprae のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を示す。
【図１２−２】図１２は、M. leprae のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を示す。
【図１２−３】図１２は、M. leprae のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を示す。
【図１２−４】図１２は、M. leprae のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を示す。
【図１２−５】図１２は、M. leprae のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を示す。
【図１３】図１３は、M. tuberculosis のｒｐｏＢ遺伝子の一部の配列を表す。
【図１４−１】図１４は、M. tuberculosis のｒｐｓＬ遺伝子の一部の配列を表す；M. leprae の完全ｒｐｓＬ遺伝子の配列と、その発現産物であるＳ１２タンパク質（その出発アミノ酸は１で記してある）のそれとを両方示してある。ＭＬ５１およびＭＬ５２プライマーの位置、並びにM. tuberculosis のｒｐｓＬ遺伝子の一部の配列は、M. leprae のそれらの下に提供してある。それらの位置のうち異なるものおよび相当するアミノ酸変化のみを示す。
【図１４−２】図１４は、M. tuberculosis のｒｐｓＬ遺伝子の一部の配列を表す；M. leprae の完全ｒｐｓＬ遺伝子の配列と、その発現産物であるＳ１２タンパク質（その出発アミノ酸は１で記してある）のそれとを両方示してある。ＭＬ５１およびＭＬ５２プライマーの位置、並びにM. tuberculosis のｒｐｓＬ遺伝子の一部の配列は、M. leprae のそれらの下に提供してある。それらの位置のうち異なるものおよび相当するアミノ酸変化のみを示す。
【図１５】図１５は、ストレプトマイシンに対する耐性に関連する、小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子フラグメントの野生型ＤＮＡ配列、並びにＳ１２タンパク質の対応するアミノ酸配列を示す。

Claims (16)

1. マイコバクテリウムにおける抗生物質に対する耐性の検出方法であって、
   図１３に示される配列とハイブリダイズできるｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメント、および
   図１４に示される配列とハイブリダイズできるｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントを含む群から選択される遺伝子中の突然変異を検出することを含む方法。
2. 選択した抗生物質に対する耐性の検出のための請求項１記載の方法において、以下の工程：
   −突然変異を有する可能性が高い関連する遺伝子又はその一部を、たとえば選択された制限酵素による上記関連する遺伝子の消化によって複数のフラグメントにフラグメント化すること、
   −これらのフラグメントを、相補的なオリゴヌクレオチドプローブに、好ましくは、対応する抗生物質に対して非耐性の株の対応する対照ＤＮＡの上記関連する遺伝子の全ての部分をストリンジェントな条件下で認識する標識したプローブのシリーズにハイブリダイズさせること、
   −調べているマイコバクテリウムの上記関連する遺伝子のＤＮＡフラグメントのいずれかに対する上記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのハイブリダイゼーションの不在を、特に、上記抗生物質に対して耐性ではない株から得られた上記関連する遺伝子について同じオリゴヌクレオチドを用いて同じ条件下で試験を実施して得られた結果と比較して、突然変異の存在、および場合により対応する抗生物質に対する耐性の存在の証拠として関連させること、
   を含み、
   上記関連する遺伝子は、ｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメント、ｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントのいずれかである、方法。
3. 請求項１記載の方法において、
   −解析すべきＤＮＡ、特に関連する遺伝子のＤＮＡを消化すること、
   −得られたフラグメントを、例えばＰＣＲにより増幅すること、
   −増幅されたフラグメントを回収すること、
   −例えば電気泳動ゲル上で、それらを移動させることなどにより、それらをサイズにしたがって互いに分離すること、
   −異なるフラグメントのサイズを、同様のアッセイに供した抗生物質に対して耐性ではない１つまたはいくつかの対照株のＤＮＡから得られたものと比較すること、及び
   −場合により検出された多型を、上記関連する遺伝子中の突然変異の存在と関連させ、調べているＤＮＡを得たもとの株の対応する抗生物質に対する可能性のある耐性と関連させること、
   を含み、
   上記関連する遺伝子は、ｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメント、ｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントのいずれかである、方法。
4. リファンピシンまたはその類縁体に対するマイコバクテリウム属の細菌の耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
   −上記マイコバクテリウムのＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードする、図１３に示される配列とハイブリダイズできるｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメントの遺伝子増幅を実施する手段、
   −そのようにして得られた増幅産物の１つまたはいくつかの突然変異を証明する手段、
   −リファンピシンに対して感受性の上記細菌の株のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子またはそのフラグメントの対照ＤＮＡ調製物、
   −場合により、リファンピシン耐性マイコバクテリウム株のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡの対照調製物
   を含むことを特徴とするキット。
5. ストレプトマイシンに対するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの耐性のインビトロ診断のためのキットであって、
   −小リボソームサブユニットのＳ１２タンパク質をコードする、図１４に示される配列とハイブリダイズできるｒｐｓＬ遺伝子またはそのフラグメントの遺伝子増幅を実施する手段、
   −得られた増幅産物の１又はいくつかの突然変異の証明を可能にする手段、
   −ストレプトマイシンに対して感受性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のリボソーム小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子のＤＮＡ配列の対照調製物、及び
   −場合により、ストレプトマイシンに対して耐性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株のリボソームの小サブユニットのＳ１２タンパク質をコードするｒｐｓＬ遺伝子のＤＮＡ配列の対照調製物
   を含むことを特徴とするキット。
6. 図１５に記載された２６３塩基配列又はそのストレプトマイシンに対するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの耐性の検出に使用可能な部分を含む、マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出における使用のための、ヌクレオチド分子。
7. マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出における使用のための、コドン４３のＡＡＧがＡＧＧに突然変異している突然変異を含む、請求項６記載のヌクレオチド分子。
8. 図１２に記載された３４４７塩基配列又はそのリファンピシンに対するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの耐性の検出に使用可能な部分を含む、マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出における使用のための、ヌクレオチド分子。
9. 図１３に記載された４３２塩基配列又はそのリファンピシンに対するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの耐性の検出に使用可能な部分を含む、マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出における使用のための、ヌクレオチド分子。
10. 領域４００−４５０に位置する突然変異を含む、マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出における使用のための、請求項８又は９記載のヌクレオチド分子。
11. コドン４２５の突然変異を含む、マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出における使用のための、請求項１０記載のヌクレオチド分子。
12. マイコバクテリウムの抗生物質耐性の検出のための、請求項６〜１１のいずれか１項記載のヌクレオチド分子の使用。
13. ｒｐｏＢ遺伝子の遺伝子増幅を実施するための上記手段が請求項８〜１１のいずれか1項記載のヌクレオチド分子であることを特徴とする、請求項４記載のキット。
14. ｒｐｏＢ遺伝子の遺伝子増幅を実施するための上記手段が下記配列：
    

    

    のプライマー対Ｂｒｐｏ２４及びｒｐｏ２５であることを特徴とする、請求項１３記載のキット。
15. ｒｐｓＬ遺伝子の遺伝子増幅を実施するための上記手段が請求項６又は７記載のヌクレオチド分子であることを特徴とする、請求項５記載のキット。
16. ｒｐｓＬ遺伝子の遺伝子増幅を実施するための上記手段が下記配列：
    

    

    のプライマー対ＭＬ５１及びＭＬ５２であることを特徴とする、請求項１５記載のキット。

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