DE69323872T3

DE69323872T3 - Schnellnachweis der antibiotikaresistenz in mycobacterium tuberculosis

Info

Publication number: DE69323872T3
Application number: DE69323872T
Authority: DE
Inventors: Beate Heym; Stewart Cole; Douglas Young; Ying Zhang; Nadine Honore; Amalio Telenti; Thomas Bodmer
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2013-05-01
Also published as: EP0639229B2; WO1993022454A1; JP2004000136A; DK0639229T4; EP0639229B1; JP3818652B2; GR3030479T3; JP3579049B2; ES2131578T3; DE69323872D1; CA2134103C; DK0639229T3; DE69323872T2; EP0639229A1; CA2134103A1; ES2131578T5; ATE177476T1; JPH07506003A; JP2004154125A; JP3905064B2

Description

Diese Erfindung betrifft den schnellen Nachweis von Stämmen von Mycobacterium tuberculosis, die gegenüber Antibiotika, insbesondere Isoniazid, Rifampicin und Streptomycin, resistent sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen einer Antibiotikaresistenz in Mycobacterium tuberculosis, z. B. entweder als Ergebnis von Mutationen in den relevanten Genen oder durch Nukleinsäurehybridisierung. Diese Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäuresonde und einen Kit zum Ausführen der Nukleinsäurehybridisierung. Die Erfindung betrifft ferner die chromosomale Lage des katG-Gens und seine Nukleotidsequenz.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Trotz mehr als einem Jahrhundert Forschung seit der Entdeckung von Mycobacterium tuberculosis, dem ätiologischen Mittel der Tuberkulose, durch Robert Koch bleibt diese Krankheit eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität beim Menschen. Es gibt schätzungsweise 3 Millionen Tote, die jährlich der Tuberkulose zugeschrieben werden können (Snider, 1989), und obwohl sich die Hauptzahl von diesen in Entwicklungsländern befindet, gewinnt die Krankheit erneute Bedeutung in den westlichen Ländern aufgrund der steigenden Anzahl von Obdachlosen und den Auswirkungen der AIDS-Epidemie (Chaisson et al., 1987; Snider und Roper, 1992).
Isonikotinsäurehydrazid oder Isoniazid (INH) ist in den letzten vierzig Jahren bei der Behandlung von Tuberkulose aufgrund seiner hervorragenden Wirksamkeit gegen die Mitglieder der ”Tuberkulose”-Gruppe – Mycobacterium tuberculosis, M. bovis und M. africanum – verwendet worden (Middlebrook, 1952; Youatt, 1969). Weder der genaue Zielort des Arzneimittels noch dessen Wirkungsweise sind bekannt und eine INH-Behandlung führt zu der Störung mehrerer Stoffwechselwege. Es gibt beträchtliche Beweise, die darauf hinweisen, daß INH als ein Antimetabolit von NAD und Pyridoxalphosphat wirken könnte (Bekierkunst und Bricker, 1967; Sriprakash und Ramakrishnan, 1970; Winder und Collins, 1968, 1969, 1970) und andere Daten weisen darauf hin, daß das Arzneimittel die Synthese der Mycolsäuren blockiert, die für den säurefesten Charakter der mycobakteriellen Zellwände verantwortlich sind (Winder und Collins, 1970; Quemard et al., 1991). Kurz nach seiner Einführung traten INH-resistente Isolate von Mycobacterium tuberculosis auf und bei ihrer Charakterisierung wurde oftmals festgestellt, daß diese Katalase-Peroxidase-Aktivität verloren hatten und verringerte Virulenz in Meerschweinchen zeigten (Middlebrook et al., 1954; Kubica et al., 1968; Sriprakash und Ramakrishan, 1970).
Unlängst hat INH-Resistenz eine neue Bedeutung erworben aufgrund einer Tuberkulose-Epidemie in den USA aufgrund von Varianten von M. tuberculosis, die gegenüber mehreren Arzneimitteln resistent waren, (”multidrug”-resistente (MDR) Varianten) (CDC, 1990; 1991a, b) und der Demonstration, daß solche Stämme für umfassende nosokomiale Infektionen von HIV-infizierten Patienten und Beschäftigten im Bereich der medizinischen Versorgung verantwortlich waren (Snider und Roper, 1992). Angesichts der Schwere dieses Problems besteht ein Bedarf im Stand der Technik, die Beziehung zwischen INH-Resistenz und Katalase-Peroxidase-Produktion zu bestimmen.
Insbesondere besteht ein Bedarf im Stand der Technik, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die an Arzneimittelempfindlichkeit beteiligt sind. Zusätzlich besteht ein Bedarf im Stand der Technik, einen einfachen Test zu entwickeln, der die schnelle Identifizierung von INH-resistenten Stämmen ermöglicht. Ferner besteht ein Bedarf im Stand der Technik an Reagenzien, um einen solchen Test auszuführen.
Gayathri Devi, et al. (Biochem J. 1975) beschreibt die Aufreinigung eines neuen Proteins, Y-Enzyms, in M. tuberculosis H37Rv, mit einer Katalase- und Peroxidase-Aktivität, und offenbart, dass der Verlust von INH-Aufnahme, Verlust von Katalase-, Peroxidase-, Y-Enzym-Aktivitäten und INH-Resistenz zusammenhängen. In diesem Dokument ist kein Verfahren für den Nachweis einer solchen Resistenz offenbart.
Rifampicin ist ebenfalls ein bedeutendes Antibiotikum, das für die Behandlung von Infektionen durch Mycobakterium, insbesondere Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae, verwendet wird. Da einige Mycobakterien sehr langsam wachsen, müssen mögliche schnelle und effiziente Tests für die Untersuchung von Resistenz gegen Rifampicin und Analoga davon verfügbar gemacht werden. In ähnlicher Weise zielt die Erfindung auf einen schnellen Nachweis von Stämmen von Mycobacterium tuberculosis, die gegen Streptomycin resistent sind, ab. Aufgrund der Entwicklung von Resistenz gegen Streptomycin ist das letztgenannte Antibiotikum zusammen mit anderen Antibiotika, z. B. Isoniazid, verwendet worden. Folglich sollte einer adäquaten Behandlung von Tuberkulose ein schneller und effizienter Nachweis von Resistenzen gegen die drei Hauptantibiotika, Isoniazid, Rifampicin und Streptomycin, vorangehen.
Die Offenbarung von Winder, et al. (in „The biology of Mycobacteria, 1982, Eds Ratledge & Stanford, Academic Press, London, vol. 1, Chapter 8) betrifft die Wirkungsweise von Rifampicin und Streptomycin in Mycobakterien, offenbart jedoch weder den Wirkmechanismus dieser Antibiotika, noch ein Verfahren zum Nachweis von Resistenz gegen diese.
Dokument Zhang, et al. (Nature, 1992) offenbart die Anwendung von mycobacterieller Genetik zur Untersuchung der Grundlagen von INH-Resistenz, jedoch nicht gegen Rifampicin und Streptomycin.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend trägt diese Erfindung dazu bei, diese Bedürfnisse im Stand der Technik zu erfüllen, indem ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Zellen eines Mycobacterium tuberculosis, das gegen Isoniazid und andere Arzneimittel, wie Rifampicin oder Analoga davon und Streptomycin, resistent ist, bereitgestellt wird.
Unter Analoga von Rifampicin werden insbesondere Derivate von 3-Formylrifampicin, insbesondere als Ergebnis einer Substitution des Griffs/Zügels gegen den Substituenten, der entweder in der Naphtofuranonylgruppe vorliegt oder der Seitenkette an Position 7 der Naphtofuranonylgruppe oder durch Einfügung oder Entfernung einer Doppelbindung in der Seitenkette, gemeint.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für den Nachweis von Resistenz gegen ein Antibiotikum in einem Mycobakterium, welches umfaßt, eine Mutation in einem Gen nachzuweisen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend das rpoB-Gen oder ein Fragment davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Sequenz zu hybridisieren, und das rpsL-Gen oder ein Fragment davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz z. B. hybridisieren.
Gemäß der Erfindung ist ein Verfahren umfasst zum Nachweisen der Anwesenheit von Nukleinsäuren eines gegen Isoniazid resistenten Mycobacterium tuberculosis in vitro, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

– Inkontaktbringen der Nukleinsäuren, die vorab, sofern erforderlich, zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen;
– Nachweisen von jeglicher Sonde, die mit den Nukleinsäuren hybridisiert hat;

Beispielsweise umfasst dieses Verfahren die folgenden Schritte:

(A) Abscheiden und Fixieren von Nukleinsäuren der Zellen auf einem festen Träger, um die Nukleinsäuren für eine Sonde zugänglich zu machen,
(B) Inkontaktbringen der fixierten Nukleinsäuren aus Schritt (A) mit einer Sonde unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben,
(C) Waschen des aus Schritt (B) resultierenden Filters, um jegliche nicht hybridisierte Sonde zu entfernen, und dann
(D) Nachweisen jeglicher hybridisierter Sonde auf dem aus Schritt (C) resultierenden Filter.

Die Sonde umfaßt eine Nukleinsäuresequenz, die in einem 2,5 kb EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56 vorliegt, wobei das Fragment eine BamHI-Spaltstelle enthält. Es hat sich herausgestellt, daß dieses Fragment mit intrazellulärer DNA von Isoniazid-empfindlichem Mycobacterium tuberculosis assoziiert ist und in der Lage ist, solche Antibiotika-empfindlichen Mikroorganismen von Isoniazid-resistentem Mycobacterium tuberculosis, das keine DNA enthält, die mit diesem Fragment unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen hybridisiert, zu unterscheiden.
Diese Erfindung stellt ferner Nukleotidsequenzen, wie RNA und DNA, von Isoniazid-resistentem Mycobacterium tuberculosis bereit, die den Bereich des katG-Gens von Mycobacterium tuberculosis kodieren, der Empfindlichkeit gegenüber Isoniazid verleiht, und die Isoniazid-resistenten Zellen fehlen.
Diese Erfindung stellt auch eine Sonde bereit, bestehend aus einer Markierung, wie einem Radionuklid, die an eine Nukleotidsequenz der Erfindung gebunden ist.
Zusätzlich stellt diese Erfindung ein hybrides Doppelstrangmolekül bereit, bestehend im Wesentlichen aus einer Sonde der Erfindung, die über Wasserstoffbrücken an eine Nukleotidsequenz von komplementärer Basensequenz, wie DNA oder RNA, gebunden ist.
Auch stellt diese Erfindung ein Verfahren zum Selektieren einer Nukleotidsequenz, die ein Katalase-Peroxidase-Gen von Mycobacterium tuberculosis oder einen Abschnitt einer solchen Nukleotidsequenz ko diert, aus einer Gruppe von Nukleotidsequenzen bereit, welches den Schritt umfaßt, zu bestimmen, welche der Nukleotidsequenzen mit einer Sonde der Erfindung hybridisiert. Die Nukleotidsequenz kann eine DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sein. Das Verfahren kann den Schritt umfassen, eine Markierung an der Nukleotidsequenz nachzuweisen.
Die Erfindung offenbart auch Verbindungen, die als Produkte der Wirkung des Enzyms Katalase oder eines ähnlichen Enzyms auf Isoniazid erhalten werden. Das katG-Gen oder ein Derivat dieses Gens, das eine ähnliche Aktivität bewahrt, kann als Quelle für Katalaseprotein verwendet werden. Die neuen Verbindungen werden durch Reaktivität gegenüber INH-resistenten mycobakteriellen Stämmen durch die ”Antibiogram”-Methode, wie in H. David et al., ”Methodes de laboratoire pour Mycobacteriologie clinique”, herausgegeben vom Institut Pasteur, ISBN Nr. 0995-2454, beschrieben, selektioniert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese Erfindung wird detaillierter unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 zeigt den INH-resistenten M. smegmatis-Stamm, BH1 (Gayathri et al., 1975) (ein Derivat von Stamm MC²-155) wurde transformiert mit einem Pool von M. tuberculosis-H37Rv-Shuttle-Cosmiden (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. W. R. Jacobs, New York) und individuelle Klone hinsichtlich INH-Empfindlichkeit bewertet. Das Cosmid pBH4 verlieh konsistent Arzneimittelempfindlichkeit und die Transformante zeigte eine Überproduktion von Katalase (bestimmt wie in Heym, 1992). Die Restriktionskarte des DNA-Inserts aus pBH4 ist zusammen mit jener des Inserts aus pYZ55 gezeigt – einem Plasmid, das katG von M. tuberculosis H37Rv enthält, isoliert auf Grundlage einer Hybridisierung mit einer Oligonukleotidsonde (5'-TTCATCCGCATGGCCTGGCACGGCGCGGGCACCTACCGC-3'), die so gestaltet war, daß sie mit der Aminosäuresequenz aus einem konservierten Bereich von Hy droperoxidase I (HPI) aus E. coli übereinstimmte. Es sind Restriktionsstellen für die folgenden Enzyme angegeben: B, BamHI; C, ClaI; E, EcoRV; H, HindIII; K, KpnI; M, SmaI, N, NotI; R, EcoRI, S, SacI. Eine Transformation von BH1 mit einem mycobakteriellen Shuttle-Plasmid, pBAK14, Zhang et al., 1991, das das 4,5 kb-Insert aus pYZ55 enthielt, verlieh in ähnlicher Weise INH-Empfindlichkeit. MICs sind ebenfalls für BH1, transformiert mit Subfragmenten, die von pYZ55 abgeleitet waren und in pBAK14 in der einen (+) oder der anderen (–) Orientierung insertiert worden sind, gezeigt. Das katG-Gen und die Fähigkeit, INH-Empfindlichkeit zu verleihen, kartierten beide auf ein 2,9 kb EcoRV-KpnI-Fragment (pBAK-KE+).
2 zeigt Extrakte von M. tuberculosis H37Rv und von E. coli-Stämmen, die mit einer Vielzahl von Plasmidkonstrukten transformiert worden sind, die für eine Aktivitäts-Gelanalyse, wie bereits früher beschrieben (Zhang et al., 1991), hergestellt worden waren. Nicht-denaturierende Gele, die 8% Polyacrylamid enthielten, wurden auf Katalaseaktivität (Panel A) und Peroxidaseaktivität (Panel B) angefärbt, wie von Wayne und Diaz beschrieben (Wayne et al., 1986). Bahn 1, M. tuberculosis H37Rv; 2, E. coli UM2 (katE, katG); 3, E. coli UM2/pYZ55; 4, E. coli UM2/pYZ56 (das 2,9 kb EcoRV-KpnI-Fragment in pUC19, entsprechend pBAK-KE+ in 1); 5, E. coli UM2/pYZ57 (pYZ55 mit einer BamHI-KpnI-Deletion, entsprechend pBAK-KB+ in 1). M. tuberculosis-Katalase- und -Peroxidaseaktivitäten wanderten unter diesen Bedingungen als zwei Banden (Bahn 1); das gleiche Muster wurde hinsichtlich des rekombinierten Enzyms, das von pYZ55 exprimiert wurde, festgestellt (Bahn 3). pYZ56 (Bahn 4) exprimiert ein Protein von erhöhtem Molekulargewicht aufgrund einer Fusion zwischen katG und lacZ' aus dem Vektor, wie in Panel C gezeigt. Panel C zeigt auch ein partielles Sequenzalignment mit E. coli HPI.
3 zeigt einen E. coli-Stamm mit Mutationen sowohl in katG als auch in katE (UM2, Mulvey et al., 1988), der mit dem Vektor pUC19 allein, pYZ55, der M. tuberculosis-katG exprimierte, und pYZ56 mit einem hohen Niveau an Expression von M. tuberculosis-katG transformiert worden war. Übernacht-Kulturen in Luria-Bertani-Brühe, ergänzt mit geeigneten Antibiotika, wurden in Anwesenheit variierender Konzentrationen von INH ausplattiert und koloniebildende Einheiten bestimmt. Ergebnisse eines repräsentativen Experiments sind mit Fehlerbalken, die die bei Dreifachproben beobachtete Standardabweichung angeben, gezeigt. Eine Überexpression von M. tuberculosis-katG verlieh in ähnli cher Weise Empfindlichkeit gegenüber hohen Konzentration an INH in E. coli UM255 (katG, katE, Mulvey et al., 1988), hatte aber keinen Effekt auf Katalase-positive Stämme, wie E. coli TG1. In einigen Experimenten hatten hohe Konzentrationen von INH einen nachweisbaren inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von UM2 und UM255 allein, aber in allen Experimenten war die Inhibition von pYZ56-Transformanten mindestens 10–100-fach größer als jene, die in den entsprechenden Vektorkontrollen beobachtet wurde.
4 zeigt Southern-Blots, hergestellt unter Verwendung von genomischer DNA von verschiedenen M. tuberculosis-Stämmen, verdaut mit KpnI, die mit (A) katG (dem 4,5 kb KpnI-Fragment) und (B) dem SOD-Gen (1,1 kb EcoRI-KpnI-Fragment, Zhang et al., 1991) hybridisiert wurde. Die Markierung von Sonden und die Verarbeitung von Blots wurde ausgeführt, wie bereits früher beschrieben (Eiglmeier et al., 1991; Maniatis et al., 1989). Bahn 1, H37Rv; 2, Stamm 12 – MIC 1,6 μg/ml INH; 3, B1453 – MIC > 50 μg/ml INH (Jackett et al., 1978); 4, Stamm 24 – MIC > 50 μg/ml INH; 5, 79112 – INH-empfindlich (Mitchison et al., 1963); 6, 12646 – INH-empfindlich (Mitchison et al., 1963); 7, 79665 – INH-empfindlich (Mitchison et al., 1963). INH-Empfindlichkeiten wurden durch Inokulation von Lowenstein-Jensen-Schrägagarkulturen, die unterschiedliche Konzentrationen an INH enthielten, bestätigt.
5. Organisation des katG-Genorts. Der obere Balken entspricht einem Abschnitt des M. tuberculosis-Chromosoms, der den katG Bereich überspannt, und die Positionen individueller Cosmide, die zur Konstruktion der Karte verwendet wurden, sind unten zusammen mit dem ursprünglichen Shuttle-Cosmid pBH4 und pYZ55 gezeigt. Die Lagen einiger Schlüssel-Restriktionsenzymstellen (B, BamHI; K, KpnI) sind zusammen mit der ungefähren Lage der bekannten genetischen Marker gezeigt: fbpB, das das alpha- oder 85-B-Antigen kodiert (Matsuo et al., 1988); katG, Katalase-Peroxidase; LL105, ein anonymer λgt11-Klon, der freundlicherweise von A. Andersen zur Verfügung gestellt worden ist; MPTR, eine bedeutende polymorphe Tandemwiederholung (Hermans et al., 1992).
6. A. Nukleotidsequenz des katG tragenden KpnI-Fragments. Diese Sequenz ist bei der EMBL Daten-Bibliothek unter der Aufnahme-Nummer (”accession number”) X68081 hinterlegt worden. Die abgeleitete Proteinsequenz ist in dem Ein-Buchstaben-Code gezeigt. B. Gegenseitig ausgerichtete Darstellung (”alignment”) der zwei Kopien der direkten 700 bp-Wiederholung, wobei Identitäten als * gezeigt sind und – Einfü gungsbereiche, die zur Optimierung des ”alignment” eingeführt wurden, bezeichnen. Die Numerierung bezieht sich auf die Positionen in 2A.
7. Verteilung von katG in Mycobakterien. A. Proben verschiedener bakterieller DNAs (1,5 μg) wurden mit RsrII verdaut, durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt; Bahnen 1 und 7, Größenmarker; M. leprae; Bahn 3, M. tuberculosis H37Rv; Bahn 4, M. gordonae; Bahn 5, M. szulgai; Bahn 6, M. avium. B. Hybridisierung des Gels in A nach Southern-Blotting mit einer katG-spezifischen Sonde.
8. Gegenseitig ausgerichtete Darstellung (”alignment”) der Primärstruktur von Katalase-Peroxidasen. Die Sequenzen stammen von M. tuberculosis H37RV, mtkatg; E. coli, eckatg (Triggs-Raine et al., 1988); S. typhimurium, stkatg; B. stearothermophilus, bspera (Loprasert et al., 1988) und Cytochrom c-Peroxidase aus Hefe (ccp; Finzel et al., 1984). Die gegenseitig ausgerichtete Darstellung (”alignment”) wurde unter Verwendung von PILEUP und PRETTY (Devereux et al., 1984) erzeugt und . bezeichnet Lücken, die zur Maximierung der Homologie eingeführt wurden. Schlüsselreste aus dem aktiven Zentrum und die Peroxidasemotive (Welinder, 1991), die im Text diskutiert werden, sind unter der Consensus-Sequenz angegeben.
9. Western-Blut-Analyse von in verschiedenen Bakterien produzierter M. tuberculosis-KatG. Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt, dann einem Immunblotting und einer Detektion mit gegen BCG erzeugtem Antiserum, wie in Zhang et al., 1991, beschrieben, unterworfen.
Bahn 1, löslicher Extrakt von M. tuberculosis H37Rv; Bahn 2, M. smegmatis MC²155, das den Vektor pBAK14 beherbergt; Bahn 3, MC²155, das pBAK-KK (katG+) beherbergt; Bahn 4, E. coli UM2 (katE, katG); Bahn 5, UM2, das pYZ55 (katG⁺) beherbergt; Bahn 6, UM2, das pYZ56 (lacZ'::katG) beherbergt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Das unlängst erfolgte Auftreten einer Vielzahl von Stämmen von M. tuberculosis, die eine Resistenz gegen eine Vielzahl von Arzneimitteln (”multidrug”-Resistenz) zeigen, in den USA ist eine höchst alarmierende Entwicklung angesichts der extremen Übertragbarkeit dieses Organismus. Diese Gefahr wurde überaus deutlich veranschaulicht durch mehrere kleinere Tuberkuloseepidemien, bei denen ein einzelner Patient, der mit MDR (”multidrug”-resistenten) M. tuberculosis infiziert war, sowohl HIV-positive Personen als auch Gefängniswärter und gesundes Pflegepersonal infizierte (CDC 1990, 1991; Daley et al., 1992; Snider und Roper, 1992). Angesichts der Schwere der gegenwärtigen weltweiten HIV-Epidemie ist es vorstellbar, daß, wenn AIDS-Patienten in den westlichen Ländern wie jene in Afrika mit MDR M. tuberculosis-Stämmen infiziert würden (eher als von Mitgliedern des M. avium/M. intracellulare-Komplexes), eine weitverbreitete Dissemination der Krankheit resultieren würde.
Isoniazid ist ein bakterizides Arzneimittel, das gegen die Tuberkulose-Gruppe von Mycobakterien – Mycobacterium tuberculosis, M. bovis und M. africanum – besonders wirkungsvoll ist, und folglich ist es besonders wirksam bei der Behandlung von Tuberkulose gewesen. Standard-anti-Tuberkulose-Therapien schließen im allgemeinen INH und Rifampicin ein, oftmals in Kombination mit den schwächeren Arzneimitteln, Pyrizinamid, Ethambutol oder Streptomycin. Neben seiner Verwendung in der Therapie wird INH auch an enge Kontaktpersonen von Patienten als prophylaktische Maßnahme verabreicht.
INH-resistente Mutanten von M. tuberculosis, das Mittel der Erkrankung beim Menschen, zeigen zwei Ebenen von Resistenz: niedrige (1 bis 10 μg/ml) und hohe (10 bis 100 μg/ml). INH-Resistenz ist oftmals mit einem Verlust an Katalaseaktivität und Virulenz verbunden. Unlängst ist aufgrund der AIDS-Epidemie, Zunahme an Obdachlosigkeit und sich verschlechternden sozialen Bedingungen Tuberkulose erneut als ein bedeutendes öffentliches Gesundheitsproblem in den entwickelten Ländern, insbesondere in den USA aufgetreten. Ein alarmierendes Merkmal der Krankheit heute ist das Auftreten von gegenüber mehreren Arzneimitteln resistenten Organismen und schnelle nosokomiale Übertragung auf Beschäftigte im Bereich der medizinischen Versorgung und HIV-infizierte Patienten. Dies hat CDC dazu veranlaßt, neue Empfehlungen für die Behandlung von mehrfach resistenten Stämmen (zumindest gegenüber INH und Rifampicin) und die Verhinderung der Übertragung vorzuschlagen. Um neue Einsichten in das Problem der INH-Resistenz zu erhalten und einen schnellen diagnostischen Test zu entwickeln, wurde die folgende Studie ausgeführt.
Eindeutig ist es essenziell, die Mechanismen von Resistenz gegen INH und Rifampicin, die hauptsächlichen Anti-Tuberkulosemittel, zu verstehen, und dies wird ermöglichen, neue chemotherapeutische Strate gien zu entwickeln und die Gestaltung neuer Verbindungen, die gegen MDR-Stämme aktiv sind, zu vereinfachen.
Diese Erfindung zeigt, daß es das Katalase-Peroxidase-Enzym, HPI, ist, das das Ziel von INS ist, und es wird vermutet, daß dieses Enzym allein Toxizität vermittelt. Ein zwingender Beweis für diese Schlußfolgerung wurde durch Expression des katG-Gens von M. tuberculosis in einer Katalase-negativen Mutante von E. coli erhalten, da dies dazu führte, daß dieses Bakterium empfindlich gegenüber INH wurde. Darüber hinaus ist die Isolierung des M. tuberculosis-INH-Empfindlichkeitsgens, katG, wichtig, da sie den schnellen Nachweis INH-resistenter Stämme mittels Hybridisierung und auf PCR-basierenden Strategien vereinfacht. Die hohe Häufigkeit von katG-Deletionen in klinischen Stämmen, wie hier gezeigt, sollte diese Vorgehensweise vereinfachen.
Identifizierung eines M. tuberculosis-Gens, das an INH-Empfindlichkeit beteiligt ist
Es wurde eine heterologe Strategie eingesetzt, um ein oder mehrere Gen(e) von M. tuberculosis, die an INH-Empfindlichkeit beteiligt sind, zu isolieren. BH1 ist eine Spontanmutante des leicht transformierbaren M. smegmatis-Stamms MC²155 (Snapper et al., 1990), die gegen 512 μg/ml INH resistent ist und der Katalase-Peroxidase-Aktivität fehlt (Heym et al., 1992). Da es eine strenge Korrelation zwischen INH-Empfindlichkeit und diesen Enzymaktivitäten gibt, sollte eine Transformation von BH1 mit einem Plasmid, das das geeignete Gen aus M. tuberculosis trägt, zu dessen Wiederherstellung und zu einer begleitenden INH-Empfindlichkeit führen.
Folglich wurde DNA aus einem Pool von M. tuberculosis-Shuttle-Cosmiden in Escherichia coli hergestellt und in BH1 durch Elektro-Transformation eingeschleust. Über 1000 Kanamycin-resistente Transformanten wurden dann hinsichtlich INH-Empfindlichkeit bewertet und es wurden vier Klone erhalten, die kein Wachstum auf Medium zeigten, das 32 g/ml INH, die MIC des Wildtyp-Stamms MC²155, enthielt.
Nach Retransformation von BH1 verlieh nur einer von diesen, pBH4, konsistent den INH-empfindlichen Phänotyp. Restriktionsverdaue mit BamHI, KpnI, NotI, ClaI und HindIII zeigten, daß die in pBH4 enthaltene chromosomale M. tuberculosis-DNA ungefähr 30 kb groß war. eine Karte, die mit den letzten drei Enzymen erstellt worden ist, wird in 1 gezeigt.
Als pBH4 als Hybridisierungssonde zur Detektion homologer Klone in der Bibliothek verwendet wurde, wurden weitere acht Shuttle-Cosmide isoliert. Bei Transformation von BH1 damit stellten fünf von diesen (T35, T646, T673, T79, T556) INH-Empfindlichkeit wieder her und zeigten ähnliche Restriktionsprofile wie pBH4. Insbesondere war in allen Fällen ein KpnI-Fragment von 4,5 kb anwesend.
Versuche, individuelle BamHI-Fragmente subzuklonieren, lieferten keine Transformanten, die in der Lage waren, die Läsion in BH1 zu komplementieren, was nahelegt, daß eine BamHI-Stelle in dem interessierenden Gen lokalisiert sein könnte. Im Gegensatz dazu wurde pBH5, ein Derivat von pBH4, durch Deletion von EcoRI-Fragmenten konstruiert und dies zeigte, daß ein 7 kb-Segment für die Wiederherstellung von INH-Empfindlichkeit nicht erforderlich war.
Transformanten, die Shuttle-Cosmide beherbergten, die die INH-Resistenz-Mutation von BH1 komplementierten, wurden sorgfältig untersucht und die MICs für mehrere Antibiotika ermittelt. In allen Fällen war die MIC für INH von 512 auf 8 μg/ml reduziert worden, ein Wert, der geringer ist als jener des empfindlichen Stamms MC²155 (32 μg/ml). Dieser hyperempfindliche Phänotyp legte nahe, daß die rekombinanten Klone ein Enzym überproduzieren könnten, das in der Lage ist, INH-Toxizität zu verstärken. Enzymologische Studien zeigten, daß diese Transformanten alle ungefähr zweimal mehr Peroxidase und Katalase produzierten als der Wildtypstamm-MC²155, der INH-empfindlich ist.
Zusätzlich zu INH sind viele MDR-Stämme von M. tuberculosis nicht länger gegenüber Rifampicin, Streptomycin, Ethambutol und Pyrazinamid empfindlich. Um die Möglichkeit zu untersuchen, daß es eine Beziehung zwischen Resistenz gegenüber INH und diesen Verbindungen geben könnte, wurden die MICs mehrerer Arzneimittel für verschiedene M. smegmatis-Stämme und deren pBH4-Transformanten untersucht, aber keine Unterschiede gefunden.
Klonierung des Katalasegens von M. tuberculosis
Eine 45-mere Oligonukleotidsonde wurde basierend auf den Primär-sequenzen von hochgradig konservierten Regionen in den Katalase-Peroxidase-Enzymen, HPI, von E. coli (Triggs-Raine et al., 1989) und Bacillus stearothermophilus (Loprasert et al., 1988) gestaltet. Wenn genomische Blots von M. tuberculosis-DNA mit diesem Oligonukleotid hybridisisert wurden, wurden in den meisten Fällen spezifische Banden detektiert. Da KpnI ein einzigartiges Fragment von 4,5 kb erzeugte, das stark hybridisierte, wurde dieses Enzym verwendet, um eine hinsichtlich der Größe selektierte (”size selected”) Bibliothek in pUC19 herzustellen.
Beim Screening mit der Oligonukleotidsonde wurde ein geeigneter Klon, pYZ55, erhalten. Eine Restriktionskarte der Insert-DNA ist in 1 gezeigt, wo festgestellt werden kann, daß diese exakt einem Teil von pBH4 entspricht. Eine unabhängige Bestätigung wurde auch durch Kreuzhybridisierung erhalten.
Mittels verschiedener Subklonierungsexperimente wurde festgestellt, daß das kleinste Fragment, das in E. coli M. tuberculosis-Katalase-Peroxidase-Aktivität exprimiert, ein 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment ist, das, wie erwartet, eine BamHI-Spaltstelle enthielt. Eine partielle DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß das katG-Gen, das in pYZ56 enthalten ist, ein Katalase-Peroxidase-Enzym kodiert, das hochgradig homolog ist zu den HPI-Enzymen von E. coli und B. stearothermophilus:
(2; Triggs-Raine et al., 1988); (Loprasert et al., 1988). Identische Reste werden durch * angegeben. HPI-Aktivität wurde sowohl in E. coli als auch M. smegmatis durch Anfärbung nachgewiesen (siehe unten).
Katalase-Peroxidase-Beteiligung an INH-Empfindlichkeit
Nach der Klonierung des M. tuberculosis-katG-Gens war es von unmittelbarem Interesse, die genetische Basis der Verbindung zwischen Katalase-Negativität und Isoniazid-Resistenz zu untersuchen. Eine Reihe von Konstrukten wurde in dem Shuttle-Vektor pBAK14 erstellt und verwendet, um die INH-resistente M. smegmatis-Mutante BH1 zu transformieren. Nur jene Plasmide, die ein vollständiges katG-Gen trugen, produzierten HPI und stellten INH-Empfindlichkeit wieder her. Das kleinste von diesen, pBAK14, enthielt ein 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment, was zeigt, daß der Bereich von 2 kb stromaufwärts von katG nicht beteiligt war und daß Katalase-Peroxidase-Aktivität allein ausreichend war, um Mycobacterien gegenüber INH empfindlich zu machen.
Zellfreie Extrakte wurden durch nicht-denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und hinsichtlich Peroxidase- und Katalaseaktivität angefärbt. Unter diesen Bedingungen lieferte das M. tuberculosis-Enzym zwei Banden mit Peroxidase-Aktivität (Bahn 1), die mit Katalaseaktivität comigrierte (Heym et al., 1992).
Bei Einschleusung in E. coli bewirkte das katG-Gen die Synthese eben dieser Proteine, wohingegen pYZ56 Proteine produzierte, die geringfügig größer waren. Dies beruht auf der Konstruktion einer innerhalb des Leserasters erfolgenden lacZ::katG-Genfusion. Aktivitätsanfärbungen wurden auch mit Zellextrakten von M. smegmatis ausgeführt. Die Anwesenheit des katG-Gens aus M. tuberculosis in BH1 führte zu der Produktion von Katalase-Peroxidase-Enzym, das die gleiche elektrophoretische Mobilität aufwies wie das Enzym, das in M. tuberculosis oder in E. coli hergestellt worden war, oder das native HPI von M. smegmatis.
Grundlage der INH-Resistenz in M. tuberculosis
Seit vielen Jahren ist bekannt gewesen, daß eine Untergruppe von INH-resistenten Stämmen, insbesondere jene, die gegenüber den höchsten Arzneimittelkonzentrationen resistent sind, im Meerschweinchen von geringerer Virulenz sind und daß ihnen Katalaseaktivität fehlt. Genomische DNA wurde aus mehreren klinischen Isolaten von M. tuberculosis präpariert und durch Southern-Blotting unter Verwendung des 4,5 kb-KpnI-Fragments als Sonde analysiert. In zwei hochgradig resistenten Stämmen, B1453 und 24, ist das Katalasegen aus dem Chromosom deletiert, wohingegen in anderen (3), wie Stamm 12, die ein geringes Resistenzniveau zeigen, es nach wie vor anwesend ist, aber nicht exprimiert wird. Zusätzliche Studien zeigten, daß der Bereich unmittelbar vor katG hochgradig anfällig für Umlagerungen war.
M. tuberculosis-HPI macht E. coli empfindlich gegenüber INH
Um zu bestimmen, ob das HPI-Enzym von M. tuberculosis E. coli INH-Empfindlichkeit verleihen konnte, wurde eine Reihe von Katalase-Mutanten mit pYZ56 transformiert und die MICs bestimmt. Wildtypstämme waren gegenüber INH nicht empfindlich, aber Mutanten, denen beide endogene Katalaseaktivitäten fehlten, jedoch pYZ56 enthielten, zeigten Wachstumsinhibition bei Anwesenheit von hohen INH-Konzentratio-nen (500 μg/ml), wohingegen untransformierte Stämme unempfindlich waren.
Zu Zwecken dieser Erfindung wurde ein Plasmid, das die in 1 gezeigte Restriktionsendonukleasekarte enthielt, im Stamm 10.463 bei der National Collection of Cultures of Microorganisms (C. N. C. M.) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich, am 18. Mai 1992 unter der Kul tursammlungs-Aufnahmenummer I-1209 hinterlegt. Dieses Plasmid enthält die Nukleinsäuresequenz der Erfindung, nämlich das 4,5 kb-KpnI-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56 mit der BamHI-Spaltstelle in dem Fragment.
Allgemein betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Isoniazid-resistentem Mycobacterium tuberculosis in einer Probe, welches umfaßt, mindestens eine DNA- oder RNA-Sonde bereitzustellen, die in der Lage ist, selektiv mit der DNA von Isoniazid-empfindlichem Mycobacterium tuberculosis unter Bildung nachweisbarer Komlexe zu hybridisieren, wobei die Sonde eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56 ist, und wobei das genannte Fragment eine BamHI-Spaltstelle enthält. Der Nachweis wird mit einer Probe unter Bedingungen ausgeführt, die es erlauben, daß die Sonde mit der DNA von Isoniazid-empfindlichem Mycobacterium tuberculosis, die in der Probe anwesend ist, unter Bildung von hybriden Komplexen hybridisiert, und Nachweisen der hybriden Komplexe als einen Hinweis der Anwesenheit von Isoniazid-empfindlichem Mycobacterium tuberculosis in der Probe. (Der Begriff ”selektiv hybridisierend”, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine DNA- oder RNA-Sonde, die nur mit Isoniazid-empfindlichem Mycobacterium tuberculosis und nicht mit Isoniazid-unempfindlichem Mycobacterium tuberculosis hybridisiert). Die Probe kann aus den Mycobacterium tuberculosis-Zellen oder einem Teil der Zellen oder Zellinhalten, die an Mycobacterium tuberculosis-Nukleinsäuren, speziell DNA, angereichert sind, bestehen. Eine Hybridisierung kann unter Verwendung herkömmlicher Hybridisierungsreagentien ausgeführt werden. Die jeweiligen Hybridisierungsbedingungen haben sich als für die Erfindung nicht kritisch erwiesen.
Eine bevorzugte Sonde gemäß der Erfindung umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid der Formel Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser Trp Ala Asp Leu Ile Val kodiert.
Insbesondere können DNA-Sequenzen aus Mycobacterium tuberculosis durch Southern-Blotting und Hybridisierung analysiert werden. Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Techniken sind in Maniatis et al. (1989) beschrieben. DNA-Fragmente können auf Agarose-Gelen getrennt und in situ denaturiert werden. Die Fragmente können dann von dem Gel auf einen wasserunlöslichen, festen, porösen Träger, wie einen Nitrocellulosefilter, eine Nylonmembran oder ein aktiviertes Cellulosepapier, transferiert werden, wo sie immobilisiert werden; beispielsweise kann die Hybond^®-Membran, die von Amersham vertrieben wird, verwendet werden. Nach einer Vorhybridisierung, um nicht-spezifische Hybridisierung mit der Sonde zu verringern, wird der feste Träger mit der Nukleinsäuresonde der Erfindung hybridisiert. Der feste Träger wird gewaschen, um ungebundene und schwach bindende Sonde zu entfernen, und das resultierende hybride Doppelstrangmolekül wird unter sucht. Eine geeignete alternative Strategie besteht darin, Oligonukleotide an die in dem Gel denaturierte DNA zu hybridisieren.
Die Menge an markierter Sonde, die in der Hybridisierungslösung vorliegt, wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der Markierung, der Menge der markierten Sonde, die realistischerweise an den Filter binden kann und der Stringenz der Hybridisierung. Im allgemeinen werden substantielle Überschüsse der Sonde gegenüber der stöchiometrischen Menge eingesetzt werden, um die Bindungsrate der Probe an die fixierte DNA zu erhöhen.
Verschiedene Ausmaße an Stringenz der Hybridisierung können eingesetzt werden. Je strenger die Bedingungen, umso ist größer die Komplementarität, die für eine Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Polynukleotid für eine Doppelstrangbildung erforderlich ist. Strenge kann durch Temperatur, Sondenkonzentration, Sondenlänge, Ionenstärke, Zeit und ähnliches kontrolliert werden. Bequemerweise wird die Stringenz der Hybridisierung variiert, indem die Polarität der Reaktantenlösung verändert wird. Einzusetzende Temperaturen können empirisch bestimmt oder aus wohlbekannten Formeln, die für diesen Zweck entwickelt worden sind, bestimmt werden.
Anders als bei einer Southern-Hybridisierung, wo DNA-Fragmente aus einem Agarosegel auf einen festen Träger transferiert werden, kann das Verfahren der Erfindung auch durch die Oligonukleotidhybridisierung in getrockneten Agarosegelen ausgeführt werden. In diesem Verfahren wird das Agarosegel getrocknet und eine Hybridisierung in situ unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde der Erfindung ausgeführt. Diese Vorgehensweise wird bevorzugt, wo ein schneller Nachweis und Empfindlichkeit wünschenswert sein könnten. Die Vorgehensweise kann an Agarosegelen, die genomische oder klonierte DNA von Mycobacterium tuberculosis enthalten, ausgeführt werden.
Zusätzlich kann das Verfahren dieser Erfindung ausgeführt werden durch Transfer von Mycobacterium tuberculosis-DNA von Polyacrylamidgelen auf Nylonfilter durch Elektroblotting. Elektroblotting kann wünschenswert sein, wo Zeit essentiell ist, da Elektroblotting typischerweise schneller ist als Kapillarblotting, das entwickelt worden ist, um DNA aus Agarosegelen zu transferieren. Dieses Verfahren kann in Verbindung mit UV-Vernetzung ausgeführt werden. Das die zu untersuchenden Proben enthaltende Polyacrylamidgel wird in Kontakt mit einem geeignet präparierten Nylonfilter angeordnet. Diese werden dann in eine Elektroblotting-Vorrichtung eingelegt und die DNA wird aus dem Gel auf den Filter unter Verwendung von elektrischem Strom transferiert. Nach einem Spülen mit Puffer ist der Filter fertig, um vorhybridisiert und hybridisiert oder UV-vernetzt zu werden.
Das Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresonde der Erfindung ausgeführt werden, um gegenüber Isoniazid resistentes Mycobacterium tuberculosis nachzuweisen. Die Sonde kann unter Verwendung herkömmlicher Techniken nachgewiesen werden.
Die Nukleotide der Erfindung können als Sonden für den Nachweis einer Nukleotidsequenz in einer biologischen Probe von M. tuberculosis verwendet werden. Die Polynukleotidsonde kann mit einem Atom oder anorganischen Rest markiert werden, wobei ganz üblicherweise ein Radionuklid verwendet wird, vielleicht aber auch mit einem Schwermetall. Radioaktive Markierungen umfassen ³²P, ³H, ¹⁴C oder ähnliches. Eine jegliche radioaktive Markierung kann eingesetzt werden, die ein adäquates Signal liefert und eine ausreichende Halbwertszeit aufweist. Andere Markierungen umfassen Liganden, die als ein spezifischer Bindungspartner für einen markierten Antikörper dienen können, fluoreszierende Stoffe, chemolumineszierende Stoffe, Enzyme, Antikörper, die als spezifischer Bindungspaarpartner für einen markierten Liganden dienen können, und ähnliches. Die Wahl der Markierung wird durch den Effekt der Markierung auf die Hybridisierungsrate und die Bindung der Sonde an die DNA oder RNA entscheidend bestimmt. Es wird notwendig sein, daß die Markierung eine ausreichende Empfindlichkeit bereitstellt, um die für eine Hybridisierung zur Verfügung stehende Menge an DNA oder RNA zu detektieren.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die Sonde mit einem radioaktiven Isotop markiert, z. B. ³²P oder ¹²⁵I, das in die Sonde z. B. durch Nick-Translation eingebaut werden kann.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die Sonde mit Biotin markiert, das mit Avidin reagiert, an das eine chemische Gruppierung gebunden ist, die, wenn das Avidin an das Biotin gebunden ist, den hybriden DNA-Komplex in die Lage versetzt, nachgewiesen zu werden, z. B. ein Fluorophor, das den hybriden DNA-Komplex fluorometrisch nachweisbar macht; eine elektronendichte Verbindung, die die hybriden DNA-Komplexe durch ein Elektronenmikroskop nachweisbar macht; ein Antikörper, der in der Lage ist, die hybriden DNA-Komplexe immunologisch nachweisbar zu machen; oder ein Bestandteil eines Katalysa tor/Substrat-Paars, der in der Lage ist, die hybriden DNA-Komplexe enzymatisch nachweisbar zu machen. Vor dem Inkontaktbringen der Bakterien mit der Sonde können die M. tuberculosis-Bakterien lysiert werden, um deren DNA freizusetzen, die dann denaturiert und auf einem geeigneten festen, DNA-bindenden Träger, wie einer Nitrocellulosemembran, immobilisiert wird.
Ein anderes Nachweisverfahren, das keine Markierung der Sonde erfordert, ist die sogenannte Sandwich-Hybridisierungstechnik. In diesem Assay hybridisiert eine unmarkierte Sonde, die in einem einzelsträngigen Vektor enthalten ist, mit DNA von Isoniazid-empfindlichem Mycobacterium tuberculosis, und ein markierter, einzelsträngiger Vektor, der die Sonde nicht enthält, hybridisiert mit dem die Sonde enthaltenden Vektor, wodurch der gesamte hybride Komplex markiert wird.
Die Sequenzen der Erfindung wurden durch Didesoxynukleotidsequenzierung abgeleitet. Die Basensequenzen der Nukleotide sind in der 5' → 3'-Richtung geschrieben. Jeder der gezeigten Buchstaben ist eine herkömmliche Bezeichnung für die folgenden Nukleotide:
A Adenin
G Guanin
T Thymin
C Cytosin.
Die Nukleotide der Erfindung können durch die Bildung von 3' → 5'-Phosphat-Verknüpfungen zwischen Nukleosid-Einheiten unter Verwendung herkömmlicher chemischer Synthesetechniken hergestellt werden. Beispielsweise können die wohlbekannten Phosphodiester-, Phosphotriester- und Phosphittriester-Techniken, wie auch bekannte Modifizierungen dieser Strategien, eingesetzt werden. Desoxyribonukleotide können mit automatischen Synthesemaschinen, wie jenen, die auf der Phosphoramidit-Strategie basieren, hergestellt werden. Oligo- und Polyribonukleotide können auch mit der Hilfe von RNA-Ligase und Verwendung von herkömmlichen Techniken erhalten werden.
Die Nukleotide der Erfindung liegen in einer gereinigten Form vor. Beispielsweise sind die Nukleotide frei von von menschlichem Blut abgeleiteten Proteinen, menschlichen Serumproteinen, viralen Proteinen, Nukleotidsequenzen, die diese Proteine kodieren, menschlichem Gewebe und menschlichen Gewebekomponenten. Zusätzlich ist es bevorzugt, daß die Nukleotide frei von anderen Nukleinsäuren, Fremdproteinen und -lipiden und adventiven Mikroorganismen, wie Bakterien und Viren, sind.
Da es möglich sein könnte, die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, indem RNA anstelle von chromosomaler DNA als ursprüngliche Matrize verwendet wird, zieht diese Erfindung in Betracht, RNA-Sequenzen zu verwenden, die zu den hier beschriebenen DNA-Sequenzen komplementär sind. Die RNA kann in komplementäre DNA mittels reverser Transkriptase umgewandelt und dann einer DNA-Amplifikation unterworfen werden.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Bakterienstämme und Plasmide

Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Eigenschaften der Bakterienstämme und Plasmide, die in dieser Erfindung verwendet werden. Tabelle 1. Bakterienstämme und Plasmide

Stämme/Plasmide			Eigenschaften
E. coli NM554
E. coli TG1			supE hsd5 thi delta (lac-proAB) [traD36 proAB+ lacI^g lacZ delta M15]
E. coli UM2			KatE
E. coli UM255			KatE
M. tuberculosis H37Rv			Virulenter Stamm, ursprünglich aus einem Tuberkulosepatienten isoliert
M. tuberculosis 12			Klinisches Isolat, resistent gegen niedrige Konzentrationen von INH (1–2 μg/ml)
M. tuberculosis B1453			Klinisches Isolat, resistent gegen hohe Konzentrationen von INH (> 50 μg/ml)
M. tuberculosis 24			Klinisches Isolat, resistent gegen hohe Konzentrationen von INH (> 50 μg/ml)
M. tuberculosis 79112			Gegen INH empfindliches klinisches Isolat
M. tuberculosis 12646			Gegen INH empfindliches klinisches Isolat
M. tuberculosis 79665			Gegen INH empfindliches klinisches Isolat
M. smegmatis MC²155			MC²6 het
M. smegmatis BH1			MC²155 het katG
Plasmide
pBH4			Shuttle-Cosmid, katG+, das auf pYZB18 basiert
pBH5			Deletierte Version von pBH4, katG+ (7 kb-EcoRI)
pYZ55			pUC19-Derivat mit 4,5 kb-KpnI-Fragment, kat+
pYZ56			pUC19-Derivat mit 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment (kat+)
pYZ57			pUC19-Derivat mit 3,1 kb-KpnI-BamHI-Fragment, kat–
pBAK14			Mycobakterieller Shuttle-Vektor (Zhang et al., 1991)
pBAK15			Mycobakterieller Shuttle-Vektor, der das 4,5 kb-KpnI-Fragment trägt (kat+)
pBAK16			Mycobakterieller Shuttle-Vektor, der das 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment trägt (kat+)
pBAK17			Mycobakterieller Shuttle-Vektor, der das 3,1 kb-KpnI-BamHI-Fragment trägt (kat–)

Die genomische M. tuberculosis H37 RV-Bibliothek wurde in dem Shuttle-Cosmid pYUB18 (Snapper et al., 1988) konstruiert und freundlicherweise von Dr. W. R. Jacobs zur Verfügung gestellt. Andere eingesetzte Shuttle-Vektoren waren PYUB12 (Snapper et al., 1988) und pBAK14 (Zhang et. al., 1991).
Mikrobiologische Techniken und Enzymologie
Details zu den verwendeten Antibiotika, Züchtungsbedingungen, En zymologie und MIC-Bestimmungen können in Heym et al., (1992) gefunden werden.
Nukleinsäuretechniken
Für Subklonierung, Southern-Blotting, DNA-Sequenzierung, Oligonukleotidbiosynthese u. s. w. wurden Standardprotokolle verwendet (Maniatis et al., 1989; Eiglmeier et al., 1991).
Aktivitätsanfärbung
Die Herstellung zellfreier Extrakte von E. coli und Mycobakterien ist beschrieben worden (Heym et al., 1992; Zhang et al., 1991). Native Proteinproben wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt, wie von Laemmli (1970) beschrieben mit der Ausnahme, daß SDS aus allen Puffern weggelassen wurde, die Proben nicht gekocht wurden und kein β-Mercaptoethanol dem Probenpuffer zugesetzt wurde. Nach einer Elektrophorese von Proben mit 50–100 μg Protein auf 7,5%-Polyacrylamidgelen wurde Katalaseaktivität nachgewiesen, indem man das Gel 20 min in 3 mM H₂O₂ unter sanftem Schütteln einweichte. Ein gleiches Volumen von 2% Eisen(III)-chlorid und 2% Kaliumeisen(III)-cyanid wurde zugesetzt und klare Banden von Katalaseaktivität durch Bestrahlung mit Licht aufgezeigt. Peroxidaseaktivität wurde als braune Banden nach Einweichen von Gelen in einer Lösung, enthaltend 0,2–0,5 mg/ml Diaminobenzidin und 1,5 mM H₂O₂, für 30–120 min nachgewiesen.
Um eine hochgradig toxische Verbindung zu erzeugen, erscheint es am wahrscheinlichsten, daß das HPI-Enzym von M. tuberculosis INH peroxidativ aktiviert (Youatt, 1969; Gayathri-Devi et al., 1975). Jetzt, da das katG-Gen isoliert und charakterisiert worden ist, sollte es möglich sein, neue Derivate von INH herzustellen, die auf ähnliche Weise aktiviert werden können.
Vergleichsbeispiel 1
Punktmutationen in dem katG-Gen, die mit der Isoniazid-Resistenz von M. tuberculosis assoziiert sind
Es ist in einer jüngeren Studie gezeigt worden, daß die Katalase-Peroxidase von Mycobacterium tuberculosis, die von dem katG-Gen kodiert wird, daran beteiligt ist, die Toxizität des wirkungsvollen Antituberkulose-Arzneimittels Isoniazid oder INH zu vermitteln. Mutanten, die gegen klinische Konzentrationen von INH resistent sind, zeigen verringerte Katalase-Peroxidase-Aktivität und in einigen Fällen resultiert dies aus der Deletion des katG-Gens aus dem Chromosom. Eine Transformation von INH-resistenten Stämmen von Mycobacterium smegmatis und M. tuberculosis mit dem klonierten katG-Gen führt zur Wiederherstellung von Arzneimittelempfindlichkeit. Eine Expression von katG in einigen Stämmen von Escherichia coli macht diesen natürlicherweise resistenten Organismus empfindlich gegenüber hohen Konzentrationen an INH.
Da einige INH-resistente klinische Isolate von M. tuberculosis ein intaktes katG-Gen beibehalten haben, wurde die molekulare Basis ihrer Resistenz untersucht. Diese Studie wurde durch die Verfügbarkeit der Nukleotidsequenz eines 4,7 kb-KpnI-Fragments aus dem katG-Bereich des Chromosoms erleichtert, da dies ermöglichte, für eine PCR-Analyse geeignete Primer zu gestalten. Elf Paare von Oligonukleotidprimern wurden synthetisiert (siehe Tabelle 2) und zur Erzeugung von PCR-Produkten von ungefähr 280 bp, die das vollständige katG-Gen und einen Teil der flankierenden Sequenzen umfaßten, verwendet. In Kontrollexperimenten allen Experimenten erzeugten alle elf Primerpaare PCR-Produkte der erwarteten Größe, die für eine SSCP-Analyse hochgradig geeignet waren, so daß ein Panel von 36 INH-resistenten Stämmen von M. tuberculosis von niederländischem oder französischem Ursprung untersucht wurden. Viele dieser Stämme sind gegenüber mehreren Arzneimitteln (multidrug) resistent und wurden aus Patienten, die HIV-seropositiv waren, isoliert.
Zwei von diesen lieferten kein PCR-Fragment mit keinem der verwendeten Primer, was anzeigt, daß katG deletiert worden war. Die verbleibenden 34 Stämme lieferten alle die erwarteten PCR-Produkte und diese wurden auf SSCP-Gelen analysiert, so daß mögliche Punktmutationen nachgewiesen werden konnten. In 20 Fällen wurde eine abnormale Strangmobilität im Vergleich zu jener von katG aus Arzneimittel-empfindlichem M. tuberculosis beobachtet, was nahelegt, daß tatsächlich Mutationsereignisse stattgefunden hatten. Die ungefähre Lage der Mutationen, wie durch die PCR-Primer abgegrenzt, ist in Tabelle 3 gezeigt.
Bei Untersuchung eines 200 bp-Segments das katG-Gens von fünf unabhängigen Stämmen (9188, 9106, 9441, 9444, 9363) wurde ein einzelner Rasenunterschied festgestellt. Dieser war in allen Fällen der gleiche, eine G-zu-T-Transversion an Position 3360, was zu der Substitution von Arg-461 durch Leu führte. Folglich kann zusätzlich zu einer Inaktivierung von katG INH-Resistenz aus Fehlsinn (”missense”)-Mutationen herrühren, die in einer veränderten Katalase-Peroxidase resultieren. Diese Mutation könnte eine Wechselwirkungsstelle zwischen dem Arzneimittel und dem Enzym definieren. Die Ergebnisse von DNA-Sequenzstudien mit den restlichen Mutanten werden gespannt erwartet.
Ein weiterer Schluß, der aus dieser Studie gezogen werden kann, betrifft die molekulare Basis der mit verschiedenen M. tuberculosis-Stämmen assoziierten ”Multidrug”-Resistenz. Es werden die gleichen Mutationen gefunden unabhängig davon, ob ein gegebener Patienten HIV-seropositiv oder -seronegativ ist. Beispielsweise beherbergt der Stamm 9291, der aus einem HIV-seropositiven Tuberkulose-Patienten isoliert worden ist, Mutationen, die eine Resistenz gegen INH, Rifampin und Streptomycin verleihen, in dem katG-(R461L), rpoB-(S425L) bzw. rpsL (K42R)-Gen. Die gleichen Mutationen sind separat oder in Kombination in Stämmen aus HIV-seronegativen Personen gefunden worden. Dies bedeutet, daß es für den untersuchten Satz von Stämmen keinen neuen einzelnen Mechanismus gibt, der Resistenz gegen mehrere Arzneimittel verleiht, sondern ”Multidrug”-Resistenz resultiert vielmehr aus der Akkumulation oder Anhäufung von Mutationen in den Genen für verschiedene Arzneimittelziele.
Beispiel 2
Nukleotidsequenz und chromosomale Lage des katG-Genorts von M. tuberculosis
Bakterienstämme, Plasmide und Züchtungsbedingungen. Die folgenden Bakterienstämme aus unseren Laborsammlungen wurden in dieser Studie verwendet: M. tuberculosis H37Rv; M. smegmatis MC²155 (Snapper et al., 1990); E. coli K-12 UM2 (katE katG; Mulvey et al., 1988). Die rekombinanten Plasmide pYZ55 (pUC19, katG⁺), pYZ56 (pUC19, lacZ'::katG) und die Shuttle-Klone pBH4 (pYUB18, katG⁺) und pBAK-KK-(pBAK14, katG⁺) sind unlängst beschrieben worden (Zhang et al., 1992, Nature) und der katG-Genort von M. tuberculosis ist schematisch in 5 gezeigt. Mycobakterien wurden bei 37°C in Middlebrook 7H9-Medium gezüchtet, wo hingegen E. coli-Stämme in L-Brühe mit passenden Anreicherungen und Antibiotika gezüchtet wurden.
Nukleinsäuretechniken. Für die Herstellung, Markierung und Hybridisierung von DNA wurden Standardtechniken (Eiglmeier et al., 1991; Zhang et al., 1992, Infect. Immun.; Zhang et al., 1992, Nature) eingesetzt. Eine Shot-gun-Bibliothek von zufälligen Fragmenten von pYZ55 wurde in M13mp18 hergestellt, wie bereits früher beschrieben (Garnier et al., 1986) und unter Einsatz der modifizierten Didesoxytechnik (Biggin et al., 1983) sequenziert. Sequenzen wurden kompiliert und zu Contigs unter Verwendung von SAP zusammengestellt und mit NIP, SIP und PIP (Staden 1987), die auf einer Vax 3100-Workstation liefen, analysiert. Das Schließen von Lücken wurde durch Verwendung synthetischer Oligonukleotidprimer, die auf einem ABI 381-Apparat synthetisiert worden waren, und T7-DNA-Polymerase (Pharmacia), um Sequenzen direkt aus pYZ55 zu erhalten, erreicht. Um nach verwandten Sequenzen in der Gen-Bank-Datenbank (Version 73.1) zu suchen, wurden die Programme FASTA (Pearson et al., 1988) und BLAST (Altschul et al., 1990) verwendet. Der Katalog PROSIT (Bairoch, 1992) wurde durchmustert, um mögliche Motive, die in Proteinsequenzen vorlagen, nachzuweisen und gegenseitige Zuordnungen unter Berücksichtigung von Homologie (”Alignments”) mit den PILEUP- und PRETTY-Modulen des ”GCG sequence analysis package” (Devereux et al., 1984) vorgenommen.
Western-Blotting und Katalase-Peroxidase-Aktivitätsanfärbung.
Immunblotting von Polypeptiden, die durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt worden waren, und Nachweis mit polyklonalen Antikörpern (erworben von DAKO), die gegen M. bovis-BCG erzeugt worden waren, erfolgten, wie beschrieben (Zhang et al., 1992, Infect. Immun., Nature, Mol. Microbiol.). Verfahren zum Nachweisen von Katalase- und Peroxidase-Aktivitäten sind unlängst erläutert worden (Heym et al., 1992; Zhang et al., 1992, Nature).
ERGEBNISSE
Nukleotidsequenz des katG-Genorts von M. tuberculosis. In früheren Studien war das vollständige katG-Gen unabhängig in E. coli auf einem Shuttle-Cosmid, pBH4, und auf einem 4,5 kb-KpnI-Restriktionsfragment, das so pYZ55 erzeugte (5; Zhang et al., 1992, Nature), kloniert worden. Das Strukturgen für Katalase-Peroxidase wurde nachfolgend auf einem 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment durch Subklonierung lokalisiert. Um die Primärstruktur dieses wichtigen Enzyms abzuleiten und dadurch gewisse Einsichten in dessen mutmaßliche Rolle bei der Umwandlung von INH zu einer wirkungsvollen Antituberkuloseverbindung zu gewinnen, wurde die Nukleotidsequenz des vollständigen Inserts aus pYZ55 bestimmt. Dies wurde durch das modifizierte Didesoxy-Shot-gun-Klonierungsverfahren (Biggin et al., 1993) erzielt und Lücken zwischen den Contigs wurden durch Verwendung spezifischer Primer geschlossen.
Bei einer Inspektion der resultierenden Sequenz, die in 6A gezeigt ist, wurde festgestellt, daß das 4,5 kb-Fragment 4795 Nukleotide mit einem gesamten dG+dC-Gehalt von 64,4% enthielt. Bei einer Analyse auf das Vorliegen von offenen Leserastern mit hohen Kodierungs-Wahrscheinlichkeitswerten wurde ein einzelner Kandidat detektiert und dieser wurde anhand von seiner Größe, Zusammensetzung und Lage als katG identifiziert. Das Fehlen von jeglichen zusätzlichen offenen Leserastern auf beiden Strängen des KpnI-Fragments schloß die Möglichkeit aus, daß andere Gene als katG daran beteiligt waren, INH-Empfindlichkeit zu vermitteln.
Eine weitere Analyse der Sequenz zeigte, daß katG zwei Kopien einer direkten 700 bp-Wiederholung, die zu 68% identisch waren, vorangingen, wobei der längste Abschnitt mit Identität 58 bp umfaßte (6B). Wenn die Datenbanken mit dieser Sequenz durchmustert wurden, wurde keine signifikanten Homologien detektiert. Um die Möglichkeit zu untersuchen, daß sie einem neuen repetitiven Element in M. tuberculosis entsprechen könnte, wurde eine 336 bp-Sonde, die die 58 bp-Wiederholung umfaßte, verwendet, um eine teilweise geordnete Cosmid-Bibliothek mittels Hybridisierung zu untersuchen. Positive Hybridisierungssignale wurden nur von Klonen erhalten, die bekanntermaßen katG trugen. In ähnlicher Weise wurde ein einzelnes Restriktionsfragment in Southern-Blots von M. tuberculosis-DNA, die mit den Restriktionsenzymen BamHI, KpnI und RsrII verdaut worden war, detektiert, wodurch angezeigt wird, daß diese repetitive Sequenz nicht verbreitet ist.
Chromosomale Lage von katG. Als Teil des M. tuberculosis-Genomprojekts ist die Lage der meisten der Gene, für die Sonden zur Verfügung stehen, auf der Contig-Karte ermittelt worden. Aus den Serien von überlappenden Cosmiden, die in 5 gezeigt sind, kann ersehen werden, daß die mit katG verbundenen Marker LL105 und fbpB sind, die ein anonymes Antigen und das mutmaßliche Fibronectin-bindende Protein bzw. alpha-Antigen (Matsuo et al., 1988) kodieren. Keine der bekannten Insertionssequenzen IS6110 und IS1081 (Collins et al., 1991; McAdam et al., 1990; Thierry et al., 1990, J. Clin. Microbiol.; Thier ry et al., 1990, Nucleic Acids Res.) kartieren auf diesen Bereich des Chromosoms, obwohl der Bereich stromaufwärts von katG dicht mit Kopien der hauptsächlichen polymorphen Tandemwiederholung, MPTR, (Hermans et al., 1992; Zhang und Young, 1993) bevölkert ist.
Vorliegen von katG-Homologen in anderen Mycobakterien. INH ist hervorragend wirksam gegen Mitglieder des Tuberkulosekomplexes, zeigt jedoch wenig, wenn überhaupt, Aktivität gegen andere Mycobacterien. Um zu bestimmen, ob zu katG homologe Gene in anderen Mycobakterien vorliegen, wurden Southern-Blots von mit RsrII verdauter DNA mit einer Sonde, hergestellt aus einem 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Restriktionsfragment, das katG aus M. tuberculosis trug, hybridisiert. Unter Bedingungen hoher Stringenz wurden gute Signale von M. leprae und M. avium erhalten (7), wohingegen kaum feststellbare Hybridisierung mit M. gordonae und M. szulgai beobachtet wurde. Es ist unlängst gezeigt worden, daß katG-Homologe auch in M. smegmatis und M. aurum vorliegen (Heym et al., 1992).
Vorhergesagte Eigenschaften von Katalase-Peroxidase aus M. tuberculosis. Die Primärstruktur von Katalase-Peroxdiase, abgeleitet aus der Nukleotidsequenz von katG, ist in 6 gezeigt. Es wird vorhergesagt, daß das Enzym 735 Aminosäuren enthält und ein Molekulargewicht von 80029 Dalton aufweist. Ein Protein dieser Größe ist in M. tuberculosis und beiden rekombinanten M. smegmatis und E. coli beobachtet worden (siehe unten).
Primärstrukturen sind für mehrere andere bakterielle Katalase-Peroxidasen, einschließlich jenen aus E. coli, Salmonella typhimurium und Bacillus stearothermophilus verfügbar (Loewen et al., 1990; Loprasert et al., 1988; Triggs-Raine et al., 1988) und es ist gezeigt worden, daß diese entfernt mit Cytochrom c-Peroxidase aus Hefe verwandt sind (Welinder, 1991). Da die Kristallstruktur der letztgenannten bestimmt worden ist (Finzel et al., 1984), kann diese verwendet werden, um die Sequenzen der bakteriellen Enyzme zu interpretieren. Das M. tuberculosis-Enzym zeigt 53,3% Konservierung mit den enterobakteriellen HPI-Enzymen und teilt 45,7% Identität mit dem Protein aus B. stearothermophilus. Ein ”alignment” der Sequenzen dieser vier Enzyme ist in 8 gezeigt zusammen mit jener von Cytochrom c-Peroxidase aus Hefe (Welinder, 1991). Es ist ersichtlich, daß der NH₂-Terminus, der in dem Hefe-Enzym kein Gegenstück hat, der am stärksten divergente Teil ist, was nahelegt, daß diese Domäne des Proteins umfassende Abweichungen tolerieren kann und für die Katalyse nicht erforderlich ist. Experi mentelle Unterstützung für diese Interpreation wird bereitgestellt in Form eines LacZ-KatG-Fusionsproteins, das zusätzliche 40 Aminosäurereste enthält (9, Bahn 6; Zhang et al., 1992, Nature). Eine Hinzufügung dieses NH₂-terminalen Abschnitts interferiert in merkbarer Weise weder mit den Katalase- noch den Peroxidase-Reaktionen, die durch katG bewirkt werden, wie anhand von Aktivitätsanfärbung beurteilt wird (Zhang et al., 1992, Nature).
Es wird angenommen, daß sich bakterielle Katalase-Peroxidasen mittels eines Genverdopplungsereignisses entwickelt haben und aus zwei Modulen bestehen, die beide Homologie zu dem Hefeenzym zeigen, fusioniert an eine einzigartige NH₂-terminale Sequenz von ungefähr 50 Aminosäureresten (Welinder, 1991). Das M. tuberculosis-Enzym entspricht diesem Muster und, wenn nach einer internen Homologie unter Verwendung von SIP (Staden, 1987) gesucht wurde, war klar, daß der Bereich zwischen den Resten 55-422 mit der carboxyterminalen Domäne, bestehend aus den Aminosäuren 423-735 verwandt war. Es wurde nur eines der zwei Motive des aktiven Zentrums, die für Peroxidasen typisch sind und in dem PROSITE-Katalog (Bairoch, 1992) enthalten sind, gefunden, wenn die M. tuberculosis-Katalase-Peroxidase-Primärstruktur gescreent wurde, da es zwei Abweichungen von der Consensussequenz um His²⁶⁹ herum gibt, wo das zweite Motiv sein sollte. (Consensus-Muster für Peroxidase 1: [DET]-[LIVMT]-x(2)-[LIVM]-[LIVMSTAG]-[SAG]-[LIVMSTAG]-H-[STA]-[LIVMFY]; Consensus-Muster für Peroxidase 2: [SGAT]-x(3)-[LIVMA]-R-[LIVMA]-x-[FW]-H-x-[SAC]; (Bairoch, 1992). Zusätzlich wurde ein mögliches ATP-bindendes Motiv (G-x-x-x-x-G-K-T) detektiert (Bairoch, 1992), aber da dieses teilweise mit dem aktiven Zentrum überlappt, könnte dessen Anwesenheit rein zufällig sein (8).
Durch Analogie mit Cytochrom c-Peroxidase aus Hefe (Welinder, 1991) war es möglich, eine Anzahl von strukturell und katalytisch wichtigen Resten vorauszusagen, die sämtlich in der NH₂-terminalen Wiederholung lokalisiert sind. His²⁶⁹ sollte als der fünfte Ligand des Häm-Eisens dienen, wohingegen Asp³⁸⁰ dessen über Wasserstoffbrücken gebundener Partner sein sollte. Andere Reste, für die vorausgesagt wird, daß sie an der Modulierung des aktive Zentrums und der H₂O₂-Bindung beteiligt sind, sind Arg¹⁰⁴, Trp¹⁰⁷, His¹⁰⁸, Asn¹³⁸, Thr²⁷⁴ und His²⁷⁵ (4). Gemäß den Voraussagen von Welinder (Welinder, 1991) sollte Trp³²⁰ ein Schlüsselrest sein und für die Bildung der Protein-Radikal-Stelle erforderlich sein (Sivaraja et all, 1989).
Antikörperantwort auf M. tuberculosis-KatG. Um den möglichen Wert von KatG als Immunogen auszuwerten, wurden Western-Blots mit Antiserum, das gegen M. bovis-BCG in Kaninchen erzeugt worden war, auf Bindung untersucht. Wie in 9 gezeigt, ist die 80 kD-Katalase-Peroxidase eines der prominentesten Antigene, die in zellfreien Extrakten von M. tuberculosis und M. smegmatis, das das klonierte katG-Gen exprimiert, erkannt werden (Bahnen 1, 3). In ähnlicher Weise wurden bei Einschleusung des Gens in E. coli signifikante Mengen an Katalase-Peroxidase produziert wurde eine auffallende Erhöhung an Expression von der lacZ'-katG-Genfusion, die die Synthese eines 85 kD-Fusionsprotein bewirkte, erhalten (9, Bahn 6).
Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, die Nukleotidsequenz des katG-Gens zu bestimmen und die erhaltene Information zu verwenden, um zu versuchen, zu verstehen, wie dessen Produkt die INH-Empfindlichkeit von M. tuberculosis vermittelt und möglicherweise die apparente Instabilität des katG-Bereichs des Genoms zu erklären. Repetitive DNA ist oftmals eine Quelle von chromosomalen Umlagerungen und eine Analyse der DNA-Sequenz stromaufwärts von katG enthüllte zwei Kopien einer direkten 700 bp-Wiederholung. Da dieses Element auf diesen Genort beschränkt zu sein scheint, ist es unwahrscheinlich, daß es als Ziel für ein Ereignis, wie homologe Rekombination, dient, was zu der Deletion des Gens führen könnte, die so häufig beobachtet wird (Zhang et al., 1992, Nature; Zhang und Young, 1993). In ähnlicher Weise, da ein 70 kb-Abschnitt des Chromosoms von M. tuberculosis H37Rv, der katG umfaßt, keine Kopien von IS6110 und IS1081 aufweist, scheinen diese Insertionssequenzen keine wahrscheinlichen Ursachen von Instabilität zu sein. Vielmehr legt die Anwesenheit einer Anhäufung (”cluster”) von bedeutenderen polymorphen Tandemwiederholungen, MPTR (5; Hermans et al., 1992), die stromaufwärts von katG liegen, nahe, daß diese als rekombinatorischer Hot-Spot wirken könnten. Dieser könnte sowohl die MPTR-Anhäufung als auch katG entfernen (Zhang und Young, 1993). Die Verfügbarkeit der Sequenz des katG-Bereichs wird es ermöglichen, für die Polymerasekettenreaktion geeignete Primer zu gestalten, und folglich Studien vereinfachen, die sowohl auf den schnellen Nachweis von INH-Resistenz als auch das Verständnis der molekularen Basis der chromosomalen Instabilität abzielen.
Vielleicht das interessanteste Merkmal der M. tuberculosis-Katalase-Peroxidase ist ihre Fähigkeit, INH-Empfindlichkeit zu vermitteln. In unserer gegenwärtigen Arbeitshypothese wechselwirkt das Arzneimit tel mit dem Enzym und wird durch die Peroxdiaseaktivität in ein toxisches Derivat umgewandelt, das an einer zweiten, bislang unbekannten Stelle wirksam wird (Zhang et al., 1992, Nature). Obwohl Meerrettich-Peroxidase diese Reaktion bewirken (Pearson et al., 1988; Shoeb et al., 1985) und Hydroxylradikale und freie organische Radikale produzieren kann, sind sehr wenig Bakterien einschließlich anderen Mycobakterien empfindlich gegen INH. Dies ist interessant, da sie zu katG homologe Gene enthalten (7).
Eine Erklärung dafür könnte die Tatsache liefern, daß die meisten Bakterien zwei Katalasen enthalten, von denen eine ein Breitspektrumenzym ist, das mit Peroxidaseaktivität ausgestattet ist, und daß die zweite Katalase die Fähigkeit der Katalase-Peroxidase zur Oxidation von INH begrenzt, indem sie präferentiell H₂O₂ beseitigt. Da M. tuberculosis die letztgenannte Aktivität fehlt, kann dessen KatG-Enzym INH in die letale Form ohne Kompetition um den Elektronenakzeptor umwandeln.
Alternativ könnte es einige einzigartige Eigenschaften des M. tuberculosis-Enzyms geben, die Toxizität fördern oder die Wechselwirkung. mit dem Arzneimittel begünstigen. Eine Untersuchung der Primärstrukturen der bakteriellen Katalase-Peroxidasen war in dieser Hinsicht nicht aussagekräftig, da sie alle gemeinsam umfassende Sequenzidentitäten aufweisen und zwei Motive enthalten, die für die aktiven Zentren von Peroxidasen charakteristisch sind. Darüber hinaus ist unlängst gezeigt worden, daß eine Expression des katG-Gens von E. coli teilweise INH-Empfindlichkeit in Arzneimittel-resistenten Mutanten von M. tuberculosis wiederherstellen kann, was nahelegt, daß das endogene Enzym möglicherweise keinerlei arzneimittelspezifische Eigenschaften aufweist (Zhang et al., 1993). Ein Sequenzvergleich mit der Cytochrom c-Peroxidase aus Hefe lieferte wichtige Informationen über die strukturelle und funktionelle Organisation des KatG-Proteins und führte zu der Identifizierung der mutmaßlich wichtigen katalytischen Reste (8).
Nun, da die vollständige Sequenz von katG verfügbar ist, wird es möglich sein, einige dieser Hypothesen durch ortsgerichtete Mutagenesse zu untersuchen und das Enzym überzuproduzieren, so daß eine detaillierte Analyse der enzymatischen Reaktion und von deren Produkten in vitro ausgeführt werden kann. In ähnlicher Weise sollte es eine relativ einfache Sache sein, Mutanten zu isolieren, die enzymatische Aktivität bewahrt haben, aber nicht in der Lage sind, INH zu binden oder zu oxidieren. Von besonderem Interesse ist die repetitive Struktur des Enzyms und die Voraussage, daß die NH₂-terminale Wiederholung das aktive Zentrum für Peroxidasen enthält. Dies eröffnet die Möglichkeit, daß katG-Gene, die an dem 3'-Ende mutiert oder verkürzt sind, auftreten könnten. Es ist vorstellbar, daß deren Produkte, denen der normale COOH-Terminus, der für Untereinheit-Untereinheit-Wechselwirkungen erforderlich sein könnte (Welinder, 1991), fehlt, instabil wären, aber nach wie vor geringe Enzymaktivität aufweisen könnten. Sie würden folglich ein intermediäres Ausmaß an INH-Empfindlichkeit zwischen jenem von katG⁺-Stämmen und Mutanten, denen das Gen vollständig fehlt, vermitteln, wie es oftmals in klinischen Gesamtbildern beobachtet wird.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit zum Nachweisen von ”multidrug”-resistenten Varianten von M. tuberculosis, wobei der Kit umfaßt:

(a) eine Behältervorrichtung, die eine Sonde für das Arzneimittelresistenz kodierende Gen enthält; und
(b) eine Behältervorrichtung, die eine Kontrollpräparation von Nukleinsäure enthält.

Eine bevorzugte Verfahrensalternative (Oligotypisierung; ”oligotyping”) zum Nachweis einer Resistenz gegen das ausgewählte Antibiotikum umfaßt:

– Fragmentieren des relevanten Gens oder eines Teils davon, der wahrscheinlich die Mutation trägt, in einer Mehrzahl von Fragmenten, wie z. B. durch Verdau des relevanten Gens durch ausgewählte Restriktionsenzyme,
– Hybridisierung dieser Fragmente mit komplementären Oligonukleotidsonden, vorzugsweise einer Reihe von markierten Sonden, die unter stringenten Bedingungen sämtliche der Teile des relevanten Gens einer entsprechenden Kontroll-DNA von einem gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum nicht-resistenten Stamm erkennen,
– und In-Beziehung-Bringen des Fehlens von Hybridisierung von mindestens einer der Oligonukleotidsonden mit einem der DNA-Fragmente des relevanten Gens des untersuchten Mycobacteriums als Nachweis für die Anwesenheit einer Mutation und möglicherweise für eine Resistenz gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum, insbesondere im Vergleich mit Ergebnissen, die erhalten werden bei Ausführen des Tests unter den gleichen Bedingungen mit den gleichen Oligonukleotiden an dem oder den relevanten Gen(en), erhalten von einem Stamm (Stämmen), der (die) gegenüber dem Antibiotikum nicht resistent ist (sind),

13

14

Eine weitere Verfahrensalternative (SSCP-Analyse, d. h. Analyse von Einzelstrang-Konformationspolymorphismus) umfaßt:

– Verdauen der zu analysierenden DNA, insbesondere des relevanten Gens,
– Amplifizieren der erhaltenen Fragmente, z. B. durch PCR,
– Gewinnen der amplifizierten Fragmente und
– Auftrennen derselben gemäß den Größen, z. B. indem man sie beispielsweise auf einem Elektrophoresegel wandern läßt,
– Vergleichen der Größen der verschiedenen Fragmente mit jenen, die von der oder den DNA(s) von einem oder mehreren Kontrollstämmen, die gegenüber dem Antibiotikum nicht resistent sind, erhalten wurden und die einem ähnlichen Assay unterworfen worden waren, und
– In-Beziehung-Bringen des möglicherweise nachgewiesenen Polymorphismus mit der Existenz einer Mutation in dem relevanten Gen, dementsprechend mit einer möglichen Resistenz des Stammes, von dem die un tersuchte DNA erhalten worden ist, gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum, wobei das relevante Gen entweder das rpoB-Gen oder ein Fragment davon ist, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Sequenz zu hybridisieren, oder das rpsL-Gen oder ein Fragment davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz zu hybridisieren, ist.

Es muß nicht gesagt werden, daß auf ein jegliches anderes Verfahren einschließlich klassischer Sequenzierungstechniken für die Erzielung des gleichen Zwecks zurückgegriffen werden kann.
Dieses Verfahren umfaßt jenes, das unter dem Begriff ”Oligotyping” für den Nachweis von Polymorphismus bekannt ist; vorteilhafterweise wird auf das von Orita et al. (worauf bereits vorstehend verwiesen wurde) offenbarte Verfahren für den Nachweis von Polymorphismus auf der Grundlage der Konformation von Einzelsträngen verwiesen.
Im Falle einer Resistenz gegen Rifampicin erweist sich das relevante Gen als das rpoB-Gen, das die β-Untereinheit der RNA-Polymerasen der Mycobakterien kodiert, oder, wenn nur ein Teil jenes Gens verwendet wird, vorzugsweise jener Teil, der die Codons 400 bis 450 jenes rpoB-Gens umfaßt.
Schließlich ist im Falle einer Resistenz gegen Streptomycin das in Betracht gezogene relevante Gen jenes des rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Ribosomen-Untereinheit kodiert, oder, wenn nur ein Teil des Fragments verwendet wird, vorzugsweise jener Teil, der das codon an Position 43 umfaßt.
Ein bevorzugtes Verfahren, insbesondere in Bezug auf die Verfahrensalternative, die PCR-Amplifikation einsetzt, wird im Folgenden offenbart.
DNA wird von einer biologischen Probe (z. B. Blut oder Sputum) nach Entfernung der zellulären Rückstände und Lyse der Bakterienzellen mit einem geeigneten Lysispuffer erhalten. Eine PCR-Amplifikation kann durch klassische Methoden unter Verwendung eines Primerpaars, deren Sequenzen jeweils komplementär zu Fragmenten von jedem der Stränge der zu amplifizierenden DNA sind, ausgeführt werden.
Die Nukleotidsequenzen der Erfindung können in einem DNA-Amplifizierungsverfahren, das als die Polymerasekettenreaktion (PCR) bekannt ist, eingesetzt werden. Siehe z. B. Kwok et al. (1987). PCR ist vorteilhaft, da diese Technik schnell ist.
DNA-Primerpaare von bekannter Sequenz, die 10–300 Basenpaare voneinander entfernt liegen und die zu den zu amplifizierenden Plus- und Minus-Strängen der zu amplifizierenden DNA komplementär sind, können durch wohlbekannte Techniken für die Synthese von Oligonukleotiden hergestellt werden. Ein Ende jedes Primers kann verlängert und modifiziert werden, um Restriktionsendonukleasestellen zu erzeugen, wenn der Primer mit der PBMC-DNA hybridisiert wird. Die PCR-Reaktionsmischung kann die PBMC-DNA, die DNA-Primerpaare, vier Desoxyribonukleosidtriphosphate, MgCl₂, DNA-Polymerase und herkömmliche Puffer enthalten. Die DNA kann für eine Zahl von Zyklen amplifiziert werden. Es ist allgemein möglich, die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, indem eine Mehrzahl von Zyklen verwendet wird, wobei jeder Zyklus aus einer kurzen Zeitspanne der Denaturierung der PBMC-DNA bei einer erhöhten Temperatur, einem Abkühlen der Reaktionsmischung und einer Polymerisation mit der DNA-Polymerase besteht.
Amplifizierte Sequenzen können durch die Verwendung einer Technik, die als Oligomerrestriktion (OR) bezeichnet wird, nachgewiesen werden. Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP)-Analyse kann verwendet werden, um DNA-Polymorphismen und Punktmutationen in einer Vielzahl von Positionen in DNA-Fragmenten nachzuweisen. Siehe Saiki et al. (1985); Orita et al. (1989). Beispielsweise kann nach einer Amplifikation ein Teil der PCR-Reaktionsmischung abgetrennt und einer Hybridisierung mit einer endmarkierten Nukleotidsonde, wie einer mit einem ³²P-markierten Adenosintriphosphat endmarkierten Sonde, unterworfen werden. Bei der OR hybridisiert eine endmarkierte Oligonukleotidsonde in Lösung mit einem Bereich der amplifizierten Sequenz und rekonstituiert in diesem Verfahren eine spezifische Endonukleasestelle.
Das Verfahren kann weiter, wie folgt, ausgeführt werden:

– die Amplifikationsprodukte (z. B. umfassend 100 bis 300 Nukleotide) werden mittels einer geeigneten Restriktionsendonuklease verdaut;
– die aus dem Amplifikationsmedium erhaltenen DNA-Stränge werden einer Denaturierung unterworfen,
– die einzelsträngigen DNA-Stränge werden auf einem neutralen 5%-Polyacrylamidgel abgeschieden,
– man läßt die einzelsträngigen DNA-Stränge auf dem Gel mittels Elektrophorese wandern,
– die DNA-Fragmente, die auf dem Polyacrylamidgel wanderten, werden auf eine Nylonmembran gemäß einer üblichen elektrophoretischen Blotting-Technik transferiert und mit markierten Sonden, beispielsweise ³²P-markierten Sonden, hybridisiert, und
– die Wanderungsdistanzen der der Analyse unterworfenen DNA-Fragmente werden verglichen mit jenen, die von unter den gleichen Bedingungen für Amplifikation, Verdau, Denaturierung, Elektrophorese und Transfer auf eine Nylonmembran erhaltenen Kontrollen erhalten werden, wobei die DNA von einem identischen, allerdings gegenüber dem untersuchten Antibiotikum empfindlichen Bakterienstamm erhalten worden war.

Für die Herstellung der PCR-Primer wie auch der in den vorstehend offenbarten ”Oligotyping”-Verfahren verwendeten Polygonukleotidsonden werden vorteilhafterweise jene verwendet, die zu dem rpoB-Gen von wildem M. tuberculosis, das in ein unter der Nummer I-12167 bei der CNCM am 15. September 1992 hinterlegtes Plasmid insertiert ist, komplementär sind.
Die Erfindung betrifft auch insbesondere die Nukleotidsequenz ei nes Fragments des rpsL-Gens von Mycobacterium tuberculosis, das das S12-Protein der kleinen Ribosomen-Untereinheit kodiert, wie auch die Nukleotidsequenz eines mutierten rpsL-Genfragments, das als für die Resistenz gegen Streptomycin verantwortlich angesehen wird.
Durch Amplifikation jener Nukleotidsequenz kann die Nukleotidsequenz des vollständigen rpsL-Gens erhalten werden.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht in der folgenden Beschreibung zusätzlicher Beispiele, die Bezug nehmen auf die Zeichnungen, in denen:
10 schematisch die für die Untersuchung verschiedener M. leprae-Isolate verwendete PCR-Strategie zeigt, wobei die kodierende Sequenz der rpoB-Sequenz gezeigt ist, wobei die sequenzierten Bereiche durch schraffierte Teile gezeigt sind, und die Position und Bezeich nung der verwendeten Amplifikationsprimer an der oberen Zeile angegeben ist, wohingegen die Sequenzierungsprimer darunter angegeben sind;
11(A) die Nukleotidsequenz eines kurzen Abschnitts von rpoB, der Mutationen trägt, die Resistenz gegen Rifampicin verleihen, mit einer Angabe der Basenänderungen in den entsprechenden Allelen und (B) einen Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen der Domäne I von Bereich II der β-Untereinheit der RNA-Polymerase von E. coli und M. leprae zeigt, wobei die Nummern der Reste und die Unterschiede in den mutierten Aminosäuren angegeben worden sind; die mutierten Aminosäurereste, die mit Rifampicinresistenz assoziiert sind, wie auch die Häufigkeit von deren Auftreten sind ebenfalls angegeben;
12 eine vollständige Sequenz des rpoB-Gens von M. leprae zeigt;
13 die Sequenz eines Teils des rpoB-Gens von M. tuberculosis zeigt;
14 die Sequenz eines Teils des rpsL-Gens von M. tuberculosis zeigt; sowohl die Sequenz des vollständigen rpsL-Gens von M. leprae als auch jene von dessen Expressionsprodukt, welches das S12-Protein ist (dessen Anfangsaminosäure mit 1 bezeichnet ist), sind angegeben. Die Positionen der ML51- und ML52-Primer wie auch die Sequenzen eines Teils des rpsL-Gens von M. tuberculosis sind unter jenen von M. leprae angegeben. Nur jene Positionen, die unterschiedlich sind, und die entsprechender Aminosäureänderungen sind angegeben;
15 die wilde DNA-Sequenz des rpsL-Genfragments, das das S12-Protein der kleinen Ribosomenuntereinheit kodiert, das für die Resistenz gegenüber Streptomycin verantwortlich ist, wie auch die entsprechende Aminosäuresequenz des S12-Proteins zeigt.
Beispiel relativer Resistenz von Mycobakterien gegen Rifampicin
Die Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin ist in Mäusen bestimmt worden, wie offenbart von Grosset et al. (und Int. J. Lepr. 57: 607-614). Die Zellen von M. leprae wurden aus Mäusepfoten gemäß klassischen Verfahren erhalten. Alle resistenten Stämme waren in der Lage, in Mäusen, die tägliche Dosen von 20 mg/kg Rifampicin erhielten, zu wachsen, wohingegen empfindliche Stämme bei niedrigen Rifampicin-Konzentrationen, weniger als 2 mg/kg, getötet wurden.
Relevante Bereiche des rpoB-Gens der extrahierten DNA wurden bei Verwendung zweier Paare biotinylierter Primer, deren Sequenzen in der folgenden Tabelle erscheinen, initiiert. TABELLE
Bei Verwendung herkömmlicher Techniken wurden Amplifikationsprodukte, umfassend 310 bzw. 710 bp, erhalten, wie in 1 gezeigt. Die Lage der Sequenzen der unterschiedlichen, in der Tabelle verwendeten Primer ist ebenfalls in 10 angegeben.
Die erhaltenen DNAs sind auf der Grundlage der rpoB-Sequenz von gegenüber Rifampicin empfindlichen Isolaten sequenziert worden. Ein Plasmid, das die Sequenz jenes Gens enthält, ist bei der CNCM am 15. September 1992 unter der Nummer I-1266 hinterlegt worden. Biotinylierte PCR-Produkte wurden aus den PCR-Reaktionsmischungen aufkonzentriert, indem sie mit mit Streptavidin beschichteten Körnchen unter Bewegung in Kontakt gebracht wurden. Die biotinylierten Stränge, die an die Körnchen anhafteten, wurde dann wiedergewonnen und sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der Sequenz des rpoB-Gens eines Wildtypstamms verglichen. Als Ergebnis einer Sequenzierung des wilden Gens (eines gegenüber Rifampicin empfindlichen Mycobakteriums) und von entsprechenden Sequenzen der β-Untereinheit von vier mutierten Stämmen, die gegenüber Rifampicin resistent waren, wurden signifikante Ergebnisse erhalten (11).
Ergebnisse wurden erhalten ausgehend von 102 Strängen, erhalten von mit M. tuberculosis infizierten Patienten. Unter diesen 102 Strängen waren 53 gegenüber Rifampicin empfindlich und 49 gegenüber Rifampicin resistent. In 43 der Mutanten war die Mutation in dem Bereich 400–450 lokalisiert und unter den letztgenannten trat die Mutation in dem Bereich von ⁴²⁵Ser zu Leu auf.
Beispiel eines Nachweises der Resistenz von Mycobakterien gegenüber Streptomycin
Die Kultur von M. tuberculosis-Stämmen und der Test ihrer Empfindlichkeit gegenüber Streptomycin sind ausgeführt worden durch das Proportionenverfahren (”method of proportions”) auf einem Löwenstein-Ierva-Medium (Laboratory Method for Clinical Mycobacteriology – Hugo David – Véronique Lévy Frébault, M. F. Thorel, veröffentlicht vom Institut Pasteur).
Die Nukleotidsequenz des rpsL-Gens von M. leprae führte durch Sequenzanalogie zu der Konstruktion von zwei Primern, ML51 (CCCACCATTCAGCAGCTGGT) und ML52 (GTCGAGCGAACCGCGAATGA), die Bereiche einschließlich mutmaßlicher Mutationsstellen, die möglicherweise für die Streptomycinresistenz verantwortlich sind, umgaben und für die PCR-Reaktion geeignet waren. Die DNA des verwendeten M. tuberculosis, der als Matrize verwendet wurde, ermöglichte es, ein rpsL-Fragment von 306 bp zu erhalten. Die Nukleotidsequenz der sequenzierten Fragmente wies 28 Unterschiede zu jener von M. leprae auf.
Die rpsL-Gene von 43 Stämmen von M. tuberculosis, von denen 28 resistent waren, sind sowohl durch PCR als auch die SSCP-Technik amplifiziert worden.
DNA wurde aus 200 μl-Aliquots von M. tuberculosis-Proben (durchschnittlich 10⁴ bis 10⁵ Bakterien), bedeckt mit 100 μl Mineralöl, durch eine Einfrier-Auftau-Technik (Woods und Cole, 1989 FEBS. Microbiol. Lett., 65: 305-308) extrahiert.
Nach Elektrophorese der untersuchten DNA-Stränge wurde eine Mutation in 16 der Mutanten nachgewiesen. Um die Natur der Mutation in den betreffenden 16 Strängen zu ermitteln, wurden die entsprechenden rpsL-Genfragmente durch PCR unter Verwendung der ML51- und ML52-Primer amplifiziert und ihre jeweiligen Nukleotidsequenzen bestimmt.
Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der Sequenz des Wildtyp-rpsL-Gens verglichen. Der einzige Unterschied wurde bei der wilden Sequenz festgestellt; Codon 43, AAG, war zu AGG mutiert und folglich wurde die Aminosäure Lys-42 durch Arg ersetzt.
Die Erfindung betrifft ferner Kits für die Resistenz von Mycobakterien gegen Isoniazid, Rifampicin oder Analoga davon, und Streptomycin.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit für die in vitro-Diagnose der Resistenz eines Bakteriums einer Mycobacterium-Gattung gegenüber Isoniazid, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

– Mittel zum Ausführen einer Genamplifikation der DNA des katG-Gens oder eines Fragments davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit einem 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56 zu hybridisieren,
– Mittel zum Nachweisen einer oder mehrerer Mutationen bei den so erhaltenen Amplifikationsprodukten und
– eine Präparation von Kontroll-DNA eines katG-Gens eines Stammes des Bakteriums, der gegenüber Isoniazid empfindlich ist, oder eines Fragments davon,
– gegebenenfalls eine Kontrollpräparation einer DNA des katG-Gens eines Isoniazid-resistenten Mycobacterium-Stammes.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit für die in vitro-Diagnose der Resistenz eines Bakteriums einer Mycobacterium-Gattung gegenüber Rifampicin oder dessen Analoga, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

– Mittel zum Ausführen einer Genamplifikation der DNA des rpoB-Gens oder der β-Untereinheit der RNA-Polymerase des Mycobateriums oder eines Fragments davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Sequenz zu hybridisieren,
– Mittel zum Nachweisen einer oder mehrerer Mutationen bei den so erhaltenen Amplifikationsprodukten und
– eine Präparation von Kontroll-DNA eines rpoB-Gens, das die β-Untereinheit der RNA-Polymerase von einem Stamm des Bakteriums, der gegenüber Rifampicin empfindlich ist, kodiert, oder von einem Fragment davon,
– gegebenenfalls eine Kontrollpräparation einer DNA des rpoB-Gens eines Isoniazid-resistenten Mycobacterium-Stammes.

In ähnlicher Weise bezieht sich die Erfindung auf einen Kit für die in vitro-Diagnose der Resistenz von M. tuberculosis gegenüber Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

– Mittel zum Ausführen einer Genamplifikation der DNA des rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Ribosomenuntereinheit kodiert, oder eines Fragments davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz zu hybridisieren,
– Mittel, die den Nachweis einer oder mehrerer Mutationen bei den erhaltenen Amplifikationsprodukten ermöglichen, und
– eine Kontroll-Präparation einer DNA-Sequenz des rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Untereinheit des Ribosoms eines gegenüber Streptomycin empfindlichen M. tuberculosis-Stamms kodiert, und
– gegebenenfalls eine Kontrollpräparation einer DNA eines rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Untereinheit des Ribosoms eines gegenüber Streptomycin resistenten M. tuberculosis-Stamms kodiert.

Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäuresequenz, umfassend ein 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56.
Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäuresequenz, umfassend ein 4,5 kb-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ55, wobei das Fragment eine BamHi-Spaltstelle umfasst.
Die Erfindung ist auch auf eine Nukleotidsequenz gerichtet, welche die 3447 Basen-Sequenz, wie in 12 beschrieben, ist, oder ein Abschnitt davon, wobei der genannte Abschnitt ist:

– die in 11A abgebildete Sequenz;
– das 710 Basenpaar-Fragment, erhältlich durch Amplifizierung der in 12 abgebildeten Sequenz, mit den Primern CAGGACGTCGAGGCGATCAC und AACGACGACGTGGCCAGCGT;
– die Nukleotidsequenz, die sich von den Nukleotiden 1195 bis 1293 in 12 erstreckt, die die in 11B abgebildete Aminosäuresequenz kodiert.

Die Erfindung ist auch auf eine Nukleotidsequenz gerichtet, die die 432 Basen-Sequenz, wie in 13 beschrieben, ist, oder ein Abschnitt davon, wobei der genannte Abschnitt ist:

– eine Sequenz, die die Kodons 400-450 des rpoB-Gens einschließt;
– die Nukleotidsequenz, die sich von den Nukleotiden 169 bis 267 in 13 erstreckt, die die in 11B abgebildete Aminosäuresequenz kodiert.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, umfassend die Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 28 zum Nachweis von Antibiotikaresistenz in Mycobakterien.
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Claims

Verfahren zum Nachweis einer Resistenz gegen ein Antibiotikum in einem Mycobacterium, welches umfasst, eine Mutation in einem Gen nachzuweisen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend das rpoB-Gen oder ein Fragment davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Sequenz zu hybridisieren, und das rpSL-Gen oder ein Fragment davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz zu hybridisieren.
Verfahren zum in vitro-Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuren eines Mycobacterium tuberculosis, das gegenüber Isoniazid resistent ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritten umfasst: – Inkontaktbringen der Nukleinsäuren, die vorab, sofern erforderlich, für eine Sonde zugänglich gemacht wurden, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, – Nachweisen von jeglicher Sonde, die mit den Nukleinsäuren hybridisiert hat; wobei die Sonde eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56 ist, und wobei das Fragment BamHI-Spaltstelle enthält, wobei ein Isoniazid-resistentes Mycobacterium tuberculosis keine DNA enthält, die mit diesem Fragment hybridisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, das die folgenden Schritte umfasst: (A) Abscheiden und Fixieren von Nukleinsäuren von Mycobacterium tuberculosis auf einem festen Träger, um die Nukleinsäuren für eine Sonde zugänglich zu machen, (B) Inkontaktbringen der fixierten Nukleinsäuren aus Schritt (A) mit der Sonde, wie in Anspruch 2 definiert, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, (C) Waschen des aus Schritt (B) resultierenden Filters, um jegliche nicht hybridisierte Sonde zu entfernen, und dann (D) Nachwesen jeglicher hybridisierter Sonde auf dem aus Schritt (C) resultierenden gewaschenen Filter.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Sonde eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Polypeptid der Formel Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser Tro Ala Asp Leu Ile Val kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Sonde eine Markierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus radioaktiven, enzymatischen, fluoreszierenden und luminiszierenden Markierungen, aufweist.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 5 für den Nachweis der Anwesenheit von gegenüber Isoniazid resistentem Mycobacterium tuberculosis in einer Bakterien enthaltenden Probe, von der vermutet wird, dass sie gegenüber Isoniazid resistentes Mycobacterium tuberculosis enthält.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei vor dem Inkontaktbringen der DNA mit der Sonde die Bakterien von der Probe abgetrennt und auf einem DNA-bindenden Träger, der eine Nitrocellulosemembran ist, immobilisiert worden sind.
Nukleinsäuresonde zum Nachweisen von gegenüber Isoniazid resistentem Mycobacterium tuberculosis, wobei die Sonde aus einem 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56, wobei das Fragment eine BamHI-Spaltstelle enthält, oder aus einem Teil des genannten Fragments, der ein Polypeptid der Formel APLNSWPDNASLDKARRLLWPSKKKYGKKLSWADLIV, besteht.
Hybrides Doppelstrangmolekül, bestehend im Wesentlichen aus der Sonde von Anspruch 8, die über Wasserstoffbrücken an eine Nukleotidsequenz von komplementärer Basensequenz gebunden ist.
Verfahren zum Selektieren einer Nukleotidsequenz eines gegenüber Isoniazid resistenten Mycobacterium tuberkulosis aus einer Gruppe von Nukleotidsequenzen, umfassend den Schritt, zu Bestimmen, welche der Nukleotidsequenzen mit einer Sonde, wie in Anspruch 8 oder 9 beansprucht, hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 1 für den Nachweis einer Resistenz gegenüber dem ausgewählten Antibiotikum, welches umfasst: – Fragment des relevanten Gens oder eines Teils davon, der wahrscheinlich die Mutation trägt, zu einer Mehrzahl von Fragmenten, – Hybridisieren dieser Fragmente mit einer Reihe von markierten Oligonukleotidsonden die unter stringenten Bedingungen sämtliche der Teile des relevanten Gens eines entsprechenden Kontroll-DNA von einem gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum nicht resistenten Stamm erkennen; – und In-Beziehung-Bringen des Fehlens von Hybridisierung von mindestens einer der Oligonukleotidsäuren mit einem der DNA-Fragmente des relevanten Gens des untersuchten Mycobacteriums als Nachweis für die Anwesenheit einer Mutation und möglicherweise für eine Resistenz gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum insbesondere im Vergleich mit Ergebnissen, die erhalten werden, wenn man den Test unter den gleichen Bedingungen mit den gleichen Oligonukleotiden an dem oder den relevanten Gen(en), erhalten von einem Stamm (Stämme), der gegenüber dem Antibiotikum nicht resistent ist, durchgeführt hat, wobei das relevante Gen entweder das rpoB-Gen oder ein Fragment davon ist, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Frequenz zu hybridisieren, oder das rpsL-Gen oder ein Fragment davon ist, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz zu hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 11, welches ein Fragmentieren durch einen Verdau des relevanten Gens durch ausgewählte Restriktionsenzyme umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, welches umfasst: – Verdauen der zu analysierenden DNA, – Amplifizieren der erhaltenen Fragmente, – Gewinnen der amplifizierten Fragmente und – Auftrennen derselben gemäß den Größen, indem man sie wandern lässt, – Vergleichen der Größen der verschiedenen Fragmente mit jenen, die von der oder den DNA(s) von einem oder mehreren Kontrollstämmen, die ge genüber dem Antibiotikum nicht resistent sind, erhalten wurden und die einem ähnlichen Assay unterworfen worden waren, und – In-Beziehung-Bringen des möglicherweise nachgewiesenen Polymorphismus mit der Existenz einer Mutation in dem relevanten Gen, dementsprechend mit einer möglichen Resistenz des Stamms, von dem die untersuchte DNA erhalten worden ist, gegenüber dem entsprechenden Antibiotikum, wobei das relevante Gen entweder das rpoB-Gen oder ein Fragment davon ist, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Frequenz zu hybridisieren, oder das rpsL-Gen oder ein Fragment davon ist, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz zu hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 13, welches umfasst: – Amplifizieren der Fragmente durch PCR und – Auftrennen der amplifizierten Fragmente, indem man sie auf einen Elektrophoresesegel wandern lässt.
Kit für die in vitro-Diagnose der Resistenz eines Bakteriums einer Mycobacterium-Gattung gegenüber Isoniazid, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – Mittel zum Ausführen einer Genamplifikation der DNA des katG-Gens oder eines Fragments davon, wobei das Gen oder Fragment davon in der Lage ist, mit einem 2,5 kb-EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56 zu hybridisieren, – Mittel zum Nachweisen einer oder mehrerer Mutationen bei den so erhaltenen Amplifikationsprodukten und – eine Präparation von Kontroll-DNA eine katG-Gens eines Stammes des Bakteriums, der gegenüber Isoniazid empfindlich ist, oder eines Fragments davon.
Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner eine Kontrollpräparation einer DNA des katG-Gens eines Isoniazid-resistenten Mycobacterium-Stammes enthält.
Kit für die in vitro-Diagnose der Resistenz eines Bakteriums einer Mycobacterium-Gattung gegenüber Rifampicin oder dessen Analoga, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – Mittel zum Ausführen einer Genamplifikation der DNA des rpoB-Gens oder der β-Untereinheit der RNA-Polymerase des Mycobacteriums oder eines Fragments davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 13 gezeigten Sequenz zu hybridisieren, – Mittel zum Nachweisen einer oder mehrerer Mutationen bei den so erhaltenen Amplifikationsprodukten und – Eine Präparation von Kontroll-DNA eines rpoB-Gens, das die β-Untereinheit der RNA-Polymerase von einem Stamm des Bakteriums, der gegenüber Rifampicin empfindlich ist, kodiert, oder von einem Fragment davon.
Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner eine Kontrollpräparation von einer DNA des rpoB-Gens eines Isoniazid-resistenten Mycobacterium-Stammes umfasst.
Kit für die in vitro-Diagnose der Resistenz von M. tuberculosis gegenüber Streptomycin, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – Mittel zum Ausführen einer Genamplifikation des rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Ribosomenuntereinheit kodiert, oder eines Fragments davon, wobei das Gen oder das Fragment davon in der Lage ist, mit der in 14 gezeigten Mycobacterium tuberculosis-Sequenz zu hybridisieren, – Mittel, die den Nachweis einer oder mehrerer Mutationen bei den erhaltenen Amplifikationsprodukten ermöglichen, und – Eine Kontroll-Präparation einer DNA-Sequenz des rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Untereinheit des Ribosoms eines gegenüber Streptomycin empfindlichen M. tuberculosis-Stamms kodiert.
Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kontrollpräparation einer DNA-Sequenz eines rpsL-Gens, das das S12-Protein der kleinen Untereinheit des Ribosoms eines gegenüber Streptomycin resistenten M. tuberculosis-Stamms kodiert, umfasst.
Nukleotidsequenz, die die 263 Basen-Sequenz, wie in 15 beschrieben, ist.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 21, umfassend eine Mutation des Kodons 43, wobei AAG zu AGG mutiert ist.
Nukleotidsequenz, die die 3447 Basen-Sequenz, wie in 12 beschrieben, ist, oder ein Abschnitt davon, der genannte Abschnitt ist: – die in 11A abgebildete Sequenz; – das 710 Basenpaar-Fragment, erhältlich durch Amplifizierung der in 12 abgebildeten Sequenz, mit den Primern CAGGACGTCGAGGCGATCAC und AACGACGACGTGGCCAGCGT; – die Nukleotidsequenz, die sich von den Nukleotiden 1195 bis 1293 in 12 erstreckt, die die in 11B abgebildete Aminosäuresequenz kodiert.
Nukleotidsequenz, die die 432 Basen-Sequenz, wie in 13 beschrieben, ist, oder ein Abschnitt davon, der genannte Abschnitt ist: – eine Sequenz, die die Kodons 400-450 des rpoB-Gens einschließt; – die Nukleotidsequenz, die sich von den Nukleotiden 169 bis 267 in 13 erstreckt, die die in 11B abgebildete Aminosäuresequenz kodiert.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 23 oder 24, umfassend eine in dem Bereich 400-450 lokalisierte Mutation.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 25, umfassend eine Mutation des Kodons 425.
Nukleinsäuresequenz, umfassend ein 2,5 kb EcoRV-KpnI-Fragment von Plasmid pYZ56.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 27, umfassend ein 4,5 kb KpnI-Fragment von Plasmid pYZ55, wobei das Fragment eine BamHI-Schnittstelle enthält.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, umfassend die Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 28, für den Nachweis einer Antibiotikaresistenz in Mycobakterien.