DE69532675T2

DE69532675T2 - Verfahren zum nachweis des antibiotikaresistenzspektrums von mykobakterium spezies

Info

Publication number: DE69532675T2
Application number: DE69532675T
Authority: DE
Inventors: Hans De Beenhouwer; Françoise PORTAELS; Lieve Machtelinckx; Geert Jannes; Rudi Rossau
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2015-06-10
Also published as: AU703947B2; AU2789695A; RU2204608C2; JP4558105B2; US6632607B1; CZ298020B6; CA2192364A1; BR9507960B8; BR9507960B1; ATE261496T1; EP0771360B1; DE69532675D1; ES2217280T3; US6329138B1; US20090068651A1; WO1995033851A2; CZ361296A3; WO1995033851A3; US20030152982A1; EP0771360A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet arzneistoffresistenter Mycobakterien.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Kits zum Nachweis mycobakterieller Nukleinsäuren in biologischen Proben.
Die Identifizierung der meisten klinisch relevanten Mycobacterium-Spezies, insbesondere von Mycobacterium tuberculosis, ist aufgrund der Kultivierungsverfahren, die bis zu 6 Wochen in Anspruch nehmen können, langwierig und zeitaufwendig. Die schnelle Diagnose einer Mycobacterium-Infektion ist sehr wichtig, da die Erkrankung lebensbedrohend und hochansteckend sein kann. Erst kürzlich wurden einige Verfahren – die alle den einen oder anderen Amplifikationsvorgang nutzen – entwickelt, um Mycobacterium-Spezies nachzuweisen und zu identifizieren, ohne daß dabei eine Kultur benötigt wird (Claridge et al., 1993). Die meisten dieser Verfahren befinden sich noch in der Prüfungsphase und ihr Vorteil bei Routineanwendungen bleibt fraglich. Zudem lösen diese Verfahren nicht das Problem des Nachweises der Mycobacterium-Arzneistoffresistenz, bei dem weiterhin auf eine Kultur zurückgegriffen werden muß.
Da bei der Tuberkulose die Häufigkeit einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe ständig ansteigt (Culliton, 1992), besteht nun Klarheit darüber, daß für die Therapie und eine optimale Kontrolle der wiederauflebenden Epidemie eine frühe Diagnose von M. tuberculosis und die schnelle Erkennung einer Resistenz gegen die Haupttuberculostatica wesentlich sind.
Die zur Behandlung von M. tuberculosis-Infektionen verwendeten Antibiotika sind hauptsächlich Isoniazid und Rifampicin, die entweder getrennt oder als gemeinsames Kombinationspräparat verabreicht werden. Gelegentlich werden Pyrazinamid, Ethambutol und Streptomycin verwendet; andere Antibiotikaklassen, wie die (Fluor)chinolone könnten in der Zukunft zu den bevorzugten Tuberkulostatika werden.
Da die meisten gegen mehrere Arzneistoffe resistenten Mycobakterien ebenso die Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin verloren haben, wird die Rifampicinresistenz als ein potentieller Marker für gegen mehrere Arzneistoffe resistente Tuberkulose angesehen. Aus diesem Grund könnte der Nachweis einer Resistenz gegen Rifampicin besonders bedeutsam sein.
Für die Mehrzahl der bisher untersuchten M. tuberculosis-Stämme wurde der für die Resistenz gegenüber Rifampicin (und Analogen wie Rifabutin) verantwortliche Mechanismus aufgeklärt. Rifampicin (und Analoge) blockieren die RNA-Polymerase, indem sie mit der β-Untereinheit dieses Enzyms wechselwirken. Dabei wurde von Telenti et al. (1993a) festgestellt, daß Mutationen in einem begrenzten Bereich der β-Untereinheit der RNA-Polymerase von M. tuberculosis zu einer Unempfindlichkeit der RNA-Polymerase gegenüber der Rifampicinwirkung führen. Dieser Bereich ist auf einen Abschnitt von 23 Codons im rpoB-Gen beschränkt. Von den Autoren werden 17 Aminosäureaustausche beschrieben, die eine Resistenz gegen Rifampicin hervorrufen. (Telenti et al., 1993b). Diese Aminosäureaustausche werden durch Punktmutationen oder Deletionen an 15 Nukleotiden bzw. 8 Aminosäurecodons, die über einen Abschnitt von 67 Nukleotiden bzw. 23 Aminosäurecodons verteilt sind, verursacht.
Von Telenti et al. (1993a und b) wurde ein PCR-SSCP-Verfahren zum Screening der für die Rifampicinresistenz verantwortlichen relevanten Mutationen beschrieben (SSCP steht für „single-strand conformation polymorphism [Einzelstrangkonformationspolymorphismus]). Die SSCP-Analyse läßt sich entweder mittels Radioaktivität oder mit Fluoreszenzmarkern durchführen. In letzterem Fall werden komplizierte und teure Geräte (ein DNA-Sequenzierautomat) benötigt. Der beschriebene SSCP-Ansatz weist auch im Hinblick auf Spezifität und Sensitivität weitere Einschränkungen auf, die seine routinemäßige Verwendung behindern könnten. Präparate lassen sich nur dann zufriedenstellend direkt analysieren, wenn eine signifikante Bakterienladung (mikroskopische Trefferzahl: > 90 Organismen/Feld) mikroskopisch beobachtet wird, wobei in DNA-Rohproben Strangtrennungsartefakte beobachtet werden können, die die Interpretation der Ergebnisse komplizieren.
Von Kapur et al. (1994) werden 23 unterschiedliche, mit Rifampicinresistenz assoziierte rpoB-Allele beschrieben. Zusätzlich zu den von Telenti et al. (1993a) beschriebenen Mutationen werden einige neue mutante rpoB-Allele beschrieben, doch handelt es sich bei den am häufigsten auftretenden Allelen weiterhin um die gleichen wie die zuvor beschriebenen.
In M. leprae wurde die molekulare Grundlage für die Rifampicinresistenz von Honoré und Cole (1993) beschrieben. Hierbei stammte die Resistenz ebenfalls von Mutationen im rpoB-Gen, das die Beta-Untereinheit der RNA-Polymerase von M. leprae codiert. Es wurde nur eine beschränkte Anzahl resistenter M. leprae-Stämme (9) analysiert, wobei in den meisten von ihnen (8/9) die Resistenz auf eine den Rest Ser-425 betreffende Mutation zurückzuführen war.
Andere, von M. tuberculosis und M. leprae verschiedene klinisch wichtige Mycobakterien zeigen häufig eine natürliche, wenn auch variable, Resistenz gegen Rifampicin. Dies ist der Fall bei M. avium und M. intracellulare, menschlichen Krankheitserregern, für die nur beschränkte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfü gung stehen. Von Guerrero et al. (1994) wurden die rpoB-Gensequenzen unterschiedlicher M. avium- und M. intracellulare-Isolate mit der von M. tuberculosis verglichen. Dabei sind zwar Unterschiede auf der Nukleotidebene vorhanden, doch wurde eine vollständige Aminosäureidentität mit Rifampicin-sensitiven M. tuberculosis festgestellt. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß ein anderer Resistenzmechanismus, möglicherweise eine Permeabilitätsschranke, auf M. avium und M. intracellulare zutrifft.
Eine elegante Möglichkeit zur Erzielung eines spezifischen Nachweises von Punktmutationen oder kleinen Deletionen besteht in der Verwendung von Hybridisierungsverfahren, wie z.B. dem reversen Hybridisierungstest. Doch läßt die im relevanten Teil des rpoB-Gens beobachtete Komplexität keine einfache Sondenentwicklung zu. Wie weiter unten veranschaulicht, bestand eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung im Entwurf eines spezifischen Ansatzes, der den Nachweis der meisten oder aller bislang gefundenen Mutationen auf schnelle und zweckmäßige Weise gestattet, ohne daß komplizierte Geräte benötigt werden.
Der Mechanismus der Resistenz gegen Isoniazid (INH) ist um einiges komplexer als der für Rifampicin. An der INH-Resistenz sind mindestens zwei Genprodukte beteiligt. Erstens handelt es sich dabei um die Katalase-Peroxidase, von der man annimmt, daß sie INH in ein aktiviertes Molekül umwandelt. Daher sind Stämme, die keine Katalase-Peroxidase produzieren, aufgrund eines defekten oder zerstörten katG-Gens nicht mehr gegenüber INH empfinden (Zhang et al., 1992; Stoeckle et al., 1993). In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, daß die Verbindung zwischen INH-Resistenz und dem Verlust der Katalaseaktivität bereits in den fünfziger Jahren bemerkt wurde (Middlebrook, 1954 a und b; Youatt, 1969).
Bei dem zweiten beteiligten Molekül handelt es sich um das inhA-Genprodukt, von dem man annimmt, daß es eine Rolle in der Mycosäurebiosynthese spielt. Dabei wird postuliert, daß das aktivierte INH-Molekül entweder direkt oder indirekt mit diesem Produkt wechselwirkt und möglicherweise die korrekte Mycosäurebiosynthese verhindert. Diese Hypothese beruht auf der kürzlich gemachten Beobachtung, daß die Überexpression des inhA-Wildtypgens oder ein bestimmter Aminosäureaustausch (S94A) im inhA-Genprodukt Resistenz gegen INH verleiht (Banerjee et al., 1994).
So läßt sich kurz gesagt und etwas vereinfacht feststellen, daß in gewissen M. tuberculosis-Stämmen eine Resistenz gegen INH durch:

– den Verlust der Katalase-Peroxidase-Aktivität
– das Vorhandensein gewisser Aminosäureaustausche im inhA-Protein
– das Expressionsniveau des inhA-Wildtypproteins

Ebenso könnten bei der Verleihung einer Resistenz gegen INH und verwandter Arzneistoffe andere Mechanismen beteiligt sein. Die Bedeutung dieser Faktoren im Gesamtspektrum der INH-Resistenzmechanismen muß noch beurteilt werden. Dieses Problem läßt sich mittels DNA-Sondentechniken angehen, falls zuverlässige DNA-Sonden aus den verfügbaren DNA-Sequenzen des katG-Gens (EMBL Nr. X68081) und des inhA-Gens (EMBL Nr. U02492) von M. tuberculosis entwickelt werden können. Diese Sondentests könnten dann auch auf den Nachweis einer Arzneistoffresistenz in biologischen Proben angewendet werden.
Zum Nachweis einer Resistenz gegen Streptomycin und (Fluor)chinolonen kann demselben Ansatz wie für Rifampicin gefolgt werden. Resistenz gegenüber diesen Antibiotika wird ebenfalls durch Punktmutationen in einem begrenzten Bereich eines oder mehrerer Gene induziert. Punktmutationen im Gyrasegen verleihen Resistenz gegen (Fluor)chinolone (EMBL Nr. L27512). Die Streptomycinresistenz korreliert mit Mutationen entweder im 16S-rRNA-Gen oder im Gen eines ribosomalen Proteins, S12 (rpsL) (Finken et al., 1993; Douglas und Steyn, 1993; Nair et al., 1993).
Eine Resistenz aufgrund von Nukleotidaustauschen in den Genen katG, rpoB und rpsL wurde in der internationalen Anmeldung WO 93/22454 beschrieben. Für die unterschiedlichen Gene in M. tuberculosis wurde jeweils nur eine der vielen möglichen Mutationen ausführlich beschrieben, d.h. R461L für katG, S425L (entspricht S531L, beschrieben von Telenti et al. und in der vorliegenden Erfindung) für rpoB und K42R für rpsL.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der Resistenz von in einer biologischen Probe vorhandenen M. tuberculosis gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren, mit denen der Nachweis und die Identifizierung von Mycobacterium-Spezies in einer biologischen Probe in direkter Kopplung mit der Überwachung des Antibiotikaresistenzspektrums ermöglicht wird.
Insbesondere besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Mycobacterium tuberculosis in einer biologischen Probe in direkter Kopplung an den Nachweis der Resistenz gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) bereitzustellen.
Insbesondere besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Mycobacterium leprae in einer biologischen Probe in direkter Kopplung an den Nachweis der Resistenz gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) bereitzustellen.
Insbesondere besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, einen bestimmten Satz von Sonden, die in der Lage sind, Wildtypsequenzen von Resistenz gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) verleihenden mutierten Sequenzen zu unterscheiden, auszuwählen, wobei dieser bestimmte Satz von Sonden unter denselben Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet wird.
Darüber hinaus besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, einen Satz ausgewählter Sonden, die in der Lage sind, Wildtypsequenzen von Resistenz gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) verleihenden mutierten Sequenzen zu unterscheiden, mit einem weiteren Satz ausgewählter Sonden, die in der Lage sind, die in der biologischen Probe vorhandenen Mycobakterienspezies zu identifizieren, zu kombinieren, wodurch sämtliche Sonden unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Kits zum Nachweis einer Antibiotikaresistenz in Mycobakterien, möglicherweise gekoppelt an die Identifizierung der beteiligten Mycobakterienspezies, bereitzustellen.
Alle Aufgaben der vorliegenden Erfindung wurden durch die folgenden spezifischen Ausführungsformen gelöst.
Die Auswahl der bevorzugten Sonden der vorliegenden Erfindung beruht auf dem Prinzip des Line Probe Assay (LiPA), wobei es sich um einen reversen Hybridisierungsassay unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die in Form paralleler Reihen auf einem festen Trägerstreifen immobilisiert sind, handelt (Stuyver et al., 1993; internationale Anmeldung WO 94/12670). Dieser Ansatz ist besonders vorteilhaft, da er schnell und einfach durchzuführen ist. Das Format der reversen Hybridisierung und insbesondere der LiPA-Ansatz besitzt viele praktische Vorteile verglichen mit anderen DNA-Techniken oder Hybridisierungsformaten, vor allem wenn die Verwendung einer Kombination von Sonden bevorzugt oder unvermeidbar ist, um die entsprechenden gesuchten Informationen zu erhalten.
Es versteht sich jedoch, daß alle andere Arten von Hybridisierungsassays oder -formaten, in denen einer der Sätze ausgewählter Sonden, wie sie weiter unten in der Erfindung beschrieben sind, verwendet wird, ebenfalls von der vorliegenden Erfindung abgedeckt werden.
Der reverse Hybridisierungsansatz impliziert, daß die Sonden auf einem festen Träger immobilisiert werden und daß die Ziel-DNA markiert wird, um den Nachweis der gebildeten Hybride zu ermöglichen.
Die folgenden Definitionen dienen der Veranschaulichung der Begriffe und Ausdrücke, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bei dem Zielmaterial in diesen Proben kann es sich entweder um DNA oder RNA, z.B. genomische DNA oder Boten-RNA oder amplifizierten Versionen davon, handeln. Diese Moleküle werden auch Polynukleinsäuren genannt.
Der Begriff „Sonde" bezieht sich auf sequenzspezifische Einzelstrang-Oligonukleotide, die eine zur nachzuweisenden Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweisen.
Unter dem Begriff komplementär, wie er hier verwendet wird, versteht man, daß die Sequenz der Einzelstrangsonde zu der Sequenz des einzelsträngigen Zielmoleküls vollständig komplementär ist, wobei das Zielmolekül als die Sequenz, in der die nachzuweisende Mutation lokalisiert ist, definiert ist. Da die vorliegende Anmeldung den Nachweis von Fehlpaarungen eines einzigen Basenpaars erfordert, werden sehr stringente Bedingungen für die Hybridisierung benötigt, wobei im Prinzip nur eine Hybridisierung vollständig komplementärer Sequenzen gestattet ist. Es sind jedoch bei der Länge der Sonden Variationen möglich (siehe unten), und es sollte angemerkt werden, daß, da der Zentralteil der Sonde für ihre Hybridisierungseigenschaften wesentlich ist, mögliche Abweichungen zwischen der Sondensequenz und der Zielsequenz zum Kopf und Schwanz der Sonde gestattet sein können, wenn längere Sondensequenzen verwendet werden. Diese Variation, auf die man mit allgemeinem Fachwissen kommen kann, sollten jedoch immer experimentell beurteilt werden, um zu überprüfen, ob sie zu den vollständig komplementären Sonden äquivalente Hybridisierungseigenschaften ergeben.
Die Sonden weisen vorzugsweise eine Länge von etwa 5 bis 50 Nukleotiden, besonders bevorzugt von etwa 10 bis 25 Nukleotiden, auf. Bei den Nukleotiden, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann es sich um Ribonukleotide, Desoxyribonukleotide und modifizierte Nukleotide, wie z.B. Inosin, oder um Nukleotide, die modifizierte Gruppen enthalten, die ihre Hybridisierungseigenschaften nicht wesentlich verändern, handeln. In der gesamten Beschreibung sind die Sondensequenzen in Form von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden vom 5'- zum 3'-Ende dargestellt. Es ist dem Fachmann ersichtlich, daß alle unten angegebenen Sonden entweder als solche oder in ihrer komplementären Form oder in ihrer RNA-Form (worin T durch U ersetzt ist) verwendet werden können.
Die erfindungsgemäß verwendeten Sonden lassen sich durch Klonierung rekombinanter Plasmide, die Insertionen, einschließlich der entsprechenden Nukleotidsequenzen, enthalten, herstellen, falls notwendig durch Ausschneiden der letzteren aus den klonierten Plasmiden nach Verwendung der entsprechenden Nucleasen und ihrer Wiedergewinnung, z.B. durch Auftrennung nach Molekulargewicht. Die Sonden lassen sich auch chemisch synthetisieren, beispielsweise mit dem herkömmlichen Phosphotriesterverfahren.
Der Begriff „fester Träger" kann sich auf ein beliebiges Substrat beziehen, an das eine Oligonukleotidsonde gekoppelt werden kann, vorausgesetzt, daß sie ihre Hybridisierungseigenschaften behält, und vorausgesetzt, daß das Hintergrundniveau der Hybridisierung niedrig bleibt. Üblicherweise handelt es sich bei dem festen Substrat um eine Mikrotiterplatte, eine Membran (z.B. Nylon oder Nitrocellulose) oder ein Mikrokügelchen (bead). Vor Auftragen auf die Membran oder dem Fixieren, kann es zweckmäßig sein, die Nukleinsäuresonde zu modifizieren, um die Fixierung zu erleichtern oder die Hybridisierungseffizienz zu verbessern. Solche Modifikationen können ein Homopolymer-Tailing, eine Kopplung mit unterschiedlichen reaktiven Gruppen, wie z.B. aliphatischen Gruppen, NH₂-Gruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen, oder eine Kopplung mit Biotin, Haptenen oder Proteinen umfassen.
Der Begriff „markiert" betrifft die Verwendung markierter Nukleinsäuren. Eine Markierung kann durch Verwendung markierter Nukleotide, die während des Polymeraseschritts der Amplifikation eingebaut werden, wie z.B. von Saiki et al. (1988) oder Bej et al. (1990), oder von markierten Primern oder durch ein anderes dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Die Art der Markierung kann isotopisch (³²P, ³⁵S usw.) oder nichtisotopisch (Biotin, Digoxigenin usw.) sein.
Der Begriff „Primer" bezieht sich auf eine einzelsträngige Oligonukleotidsequenz, die als Startpunkt für die Synthese eines Primer-Verlängerungsprodukts, das zu dem zu kopierenden Nukleinsäurestrang komplementär ist, fungieren kann. Die Länge sowie die Sequenz des Primers müssen so beschaffen sein, daß sie das Priming der Synthese der Verlängerungsprodukte gestatten. Der Primer ist vorzugsweise etwa 5-50 Nukleotide lang. Die spezifische Länge und Sequenz hängt von der Komplexität der benötigten DNA- oder RNA-Zielmoleküle ab, ebenso wie von den Bedingungen der Primerverwendung, wie z.B. Temperatur und Ionenstärke.
Die Tatsache, daß Amplifikationsprimer nicht genau mit der entsprechenden Matrizensequenz übereinstimmen müssen, um eine korrekte Amplifikation zu garantieren, ist in der Literatur ausgiebig dokumentiert (Kwok et al., 1990).
Bei dem verwendeten Amplifikationsverfahren kann es sich entweder um eine Polymerasekettenreaktion (PCR; Saiki et al., 1988), eine Ligasekettenreaktion (LCR; Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), eine Amplifikation auf Grundlage einer Nukleinsäuresequenz (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), ein Amplifikationssystem auf Transkriptionsbasis (transcription-based amplification system, TAS; Kwoh et al., 1989), eine Amplifikation durch Strangverdrängung (strand displacement amplification, SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992) oder eine Amplifikation mittels Qβ-Replicase (Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989) oder um ein beliebiges anderes, im Fachgebiet bekanntes, zur Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen geeignetes Verfahren handeln.
Die als Primer oder Sonden verwendeten Oligonukleotide können auch Nukleotidanaloge, wie z.B. Phosphorothioate (Matsukura et al., 1987), Alkylphosphorothioate (Miller et al., 1979) oder Peptidnukleinsäuren (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993), aufweisen oder interkalierende Agenzien enthalten (Asseline et al., 1984).
Wie die meisten anderen in die ursprünglichen DNA-Sequenzen eingeführten Variationen oder Modifikationen machen diese Variationen Anpassungen hinsichtlich der Bedingungen, unter denen das Oligonukleotid verwendet werden sollte, um die benötigte Spezifität und Sensitivität zu erzielen, notwendig. Jedoch sind letztendlich die Ergebnisse der Hybridisierung im wesentlichen die gleichen wie die, die mit den nichtmodifizierten Oligonukleotiden erhalten werden.
Die Einführung dieser Modifikationen kann vorteilhaft sein, um Eigenschaften, wie z.B. die Hybridisierungskinetik, die Reversibilität der Hybridbildung, die biologische Stabilität der Oligonukleotidmoleküle, usw., positiv zu beeinflussen.
Bei der „Probe" kann es sich um ein beliebiges biologisches Material handeln, das entweder direkt dem infizierten Patienten (oder Tier) entnommen oder nach Kultivierung (Anreicherung) erhalten wurde. Das biologische Material können beispielsweise Expektorate jeglicher Art, Bronchiallavagen, Blut, Hautgewebe, Biopsien, Lymphozytenblutkulturmaterial, Kolonien, Flüssigkulturen, Bodenproben, Stuhlproben, Urin usw. sein.
Die erfindungsgemäß verwendeten Sonden sind für die Erzielung einer optimalen Leistung unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen konstruiert, so daß sie sich in Sätzen zur gleichzeitigen Hybridisierung einsetzen lassen; dadurch wird die Nützlichkeit dieser Sonden stark erhöht sowie deutlich an Zeit und Arbeit eingespart. Wären andere Hybridisierungsbedingungen bevorzugt, so sollten natürlich alle Sonden entsprechend angepaßt werden, indem an ihren Enden eine Reihe von Nukleotiden hinzugefügt oder deletiert werden. Es versteht sich, daß diese begleitenden Anpassungen im wesentlichen das gleiche Ergebnis ergeben sollten, das nämlich die jeweiligen Sonden weiterhin spezifisch mit dem definierten Zielmolekül hybridisieren. Solche Anpassungen könnten auch notwendig sein, falls es sich bei dem amplifizierten Material um RNA und nicht um DNA handeln sollte, wie es für das NASBA-System der Fall ist.
Zur Konstruktion von Sonden mit gewünschten Eigenschaften lassen sich die folgenden sinnvollen Richtlinien, die dem Fachmann bekannt sind, anwenden.
Da das Ausmaß und die Spezifität von Hybridisierungsreaktionen, wie z.B. den hier beschriebenen, durch eine Reihe von Faktoren beeinflußt werden, wird durch die Manipulation eines oder mehrerer dieser Faktoren die genaue Sensitivität und Spezifität einer bestimmten Sonde bestimmt, gleichgültig ob sie vollkommen komplementär zu ihrem Zielmolekül ist oder nicht. Die Wichtigkeit und die Auswirkung verschiedener Assaybedingungen, die hier weiter erklärt werden, sind dem Fachmann bekannt.
Zunächst sollte die Stabilität des [Sonde: Zielmolekül]-Nukleinsäurehybrids so gewählt werden, daß sie mit den Assaybedingungen kompatibel ist. Dies kann dadurch erreicht werden, daß man lange AT-reiche Sequenzen vermeidet, die Hybride mit G:C-Basenpaaren terminiert und die Sonde mit einer geeigneten Tm konstruiert. Die Anfangs- und Endpunkte der Sonde sollten so gewählt werden, daß die Länge sowie der %GC-Wert eine Tm ergeben, die etwa 2–10°–C höher als die Temperatur ist, bei der der endgültige Assay durchgeführt wird. Dabei ist die Basenzusammensetzung der Sonde signifikant, weil G-C-Basenpaare verglichen mit A-T-Basenpaaren aufgrund zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindungen eine größere Temperaturstabilität zeigen. Somit ist eine Hybridisierung, an der komplementäre Nukleinsäuren mit höherem G-C-Gehalt beteiligt sind, bei höheren Temperaturen stabil.
Bedingungen, wie z.B. Ionenstärke und Inkubationstemperatur, unter denen eine Sonde verwendet wird, sollten ebenso bei einer Konstruktion einer Sonde berücksichtigt werden. Es ist bekannt, daß die Hybridisierung mit einem Anstieg der Ionenstärke des Reaktionsgemischs zunimmt, und daß die Temperaturstabilität der Hybride mit zunehmender Ionenstärke zunimmt. Andererseits erhöhen Chemikalien, wie z.B. Formamid, Harnstoff, DMSO und Alkohole, die Wasserstoffbrückenbindungen aufbrechen, die Stringenz der Hybridisierung. Durch die Destabilisierung der Wasserstoffbrückenbindungen durch solche Reagentien kann die Tm stark reduziert werden. Im allgemeinen erfolgt die optimale Hybridisierung für synthetische Oligonukleotidsonden mit einer Länge von etwa 10-50 Basen bei ungefähr 5°–C unterhalb der Schmelztemperatur für einen gegebenen Duplex. Eine Inkubation bei Temperaturen unterhalb des Optimums kann die Hybridisierung fehlgepaarter Basensequenzen gestatten und daher zu einer verringerten Spezifität führen.
Wünschenswerterweise verfügt man über Sonden, die nur unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren. Unter Hochstringenzbedingungen bilden sich nur hochkomplementäre Nukleinsäurehybride; Hybride ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität werden nicht gebildet. Dementsprechend bestimmt die Stringenz der Assaybedingungen das Ausmaß der zwischen zwei ein Hybrid bildenden Nukleinsäuresträngen benötigten Komplementarität. Der Stringenzgrad wird so gewählt, daß der Unterschied in der Stabilität zwischen dem mit dem Zielmolekül und mit der Nichtziel-Nukleinsäure gebildeten Hybrid maximiert wird. Im vorliegenden Fall müssen Austausche einzelner Basenpaare nachgewiesen werden, was Bedingungen sehr hoher Stringenz erfordert.
Zweitens sollten die Sonden so positioniert werden, daß dadurch die Stabilität des [Sonde:Nichtziel]-Nukleinsäurehybrids minimiert wird. Das läßt sich dadurch erreichen, indem die Länge der perfekten Komplementarität zu Nichtziel-Organismen minimiert, GC-reiche Bereiche der Homologie zu Nichtziel-Sequenzen vermieden werden und die Sonde so positioniert wird, daß sie möglichst viel destabilisierende Fehlpaarungen überspannt. Ob eine Sondensequenz zum Nachweis nur einer spezifischen Art von Organismus geeignet ist, hängt größtenteils vom Unterschied in der Temperaturstabilität zwischen [Sonde:Zielmolekül]-Hybriden und [Sonde:Nichtziel]-Hybriden ab. Bei der Konstruktion der Sonden sollten die Unterschiede zwischen diesen Tm-Werten so groß wie möglich sein (z.B. mindestens 2°–C und vorzugsweise 5°–C).
Die Länge der Zielnukleinsäuresequenz und dementsprechend die Länge der Sondensequenz kann ebenso von Bedeutung sein. In manchen Fällen können mehrere, hinsichtlich Ort und Menge variierende Sequenzen aus einem bestimmten Bereich vorliegen, durch die sich Sonden mit den gewünschten Hybridisierungseigenschaften ergeben. In anderen Fällen kann eine Sequenz deutlich besser als eine andere, die sich nur durch eine einzige Base unterscheidet, sein. Während es für Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, möglich ist, zu hybridisieren, bestimmt normalerweise in erster Linie der längste Abschnitt einer perfekt komplementären Basensequenz die Hybridstabilität. Während Oligonukleotidsonden unterschiedlicher Länge und Basenzusammensetzung verwendet werden können, weisen bevorzugte Oligonukleotidsonden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine Länge zwischen etwa 5 bis 50 (insbesondere 10–25) Basen sowie einen ausreichenden Abschnitt in der Sequenz auf, der zur Zielnukleinsäuresequenz vollkommen komplementär ist.
Drittens sind Bereiche in der Ziel-DNA oder –RNA, von denen man weiß, daß sie starke, die Hybridisierung hemmende interne Strukturen bilden, weniger bevorzugt. Sonden mit beträchtlicher Selbstkomplementarität sollten ebenfalls vermieden werden. Wie oben erläutert wurde, handelt es sich bei der Hybridisierung um die Zusammenlagerung zweier Einzelstränge komplementärer Nukleinsäuren unter Bildung eines Doppelstrangs mit Wasserstoffbrückenbindungen. Es ergibt sich, daß, wenn einer der beiden Stränge vollständig oder teilweise an einem Hybrid beteiligt ist, er weniger in der Lage ist, an der Bildung eines neuen Hybrids teilzunehmen. Falls genügend Selbstkomplementarität vorhanden ist, können sich innerhalb der Moleküle einer Sondenart intramolekulare und intermolekulare Hybride ausbilden. Durch sorgfältige Sondenkonstruktion lassen sich solche Strukturen vermeiden. Wird eine Probe so konstruiert, daß ein wesentlicher Anteil der interessierenden Sequenz in Einzelstrangform vorliegt, so kann dadurch die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Hybridisierung stark erhöht werden. Es gibt Computerprogramme, die nach dieser Art von Wechselwirkung suchen können. Unter gewissen Umständen kann es jedoch möglich sein, daß sich diese Art der Wechselwirkung nicht vermeiden läßt.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer Resistenz von in einer biologischen Probe vorhandenem M. tuberculosis gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) bereitgestellt, bei dem man:

(i) nötigenfalls die in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren freisetzt, isoliert oder konzentriert;
(ii) nötigenfalls den in den Polynukleinsäuren vorhandenen betreffenden Teil des rpoB-Gens mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar amplifiziert;
(iii) die Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit einem ausgewählten Satz von rpoB-Wildtypsonden unter geeigneten Hybridisierungs- und Waschbedingungen hybridisiert, wobei der Satz mit dem vollständigen Mutationsbereich des in 1 abgegrenzten rpoB-Gens überlappt und wenigstens einen der folgenden Sonden umfaßt (siehe Tabelle 2): S1 (SEQ ID NO 1) S11 (SEQ ID NO 2) S2 (SEQ ID NO 3) S3 (SEQ ID NO 4) S33 (SEQ ID NO 5) S4 (SEQ ID NO 6) S44 (SEQ ID NO 7) S444 (SEQ ID NO 43) S4444 (SEQ ID NO 8) S5 (SEQ ID NO 9) S55 (SEQ ID NO 10) S555 (SEQ ID NO 39) S5555 (SEQ ID NO 40) S55C (SEQ ID NO 441 S55M (SEQ ID NO 45) S6 (SEQ ID NO 11) S66 (SEQ ID NO 12)
(iv) die in Schritt (iii) gebildeten Hybride nachweist;
(v) auf die Rifampicin-Suszeptibilität (Sensitivität gegen Resistenz) des in der Probe vorhandEnen M. tuberculosis aus dem bzw. den in Schritt (iv) erhaltenen unterschiedlichen Hybridisierungssignal bzw. -signalen schließt.

Der Begriff „Suszeptibilität" bezieht sich auf die phänotypische Eigenschaft des M. tuberculosis-Stamms, entweder resistent oder sensitiv gegenüber dem Arzneistoff, wie durch in-vitro-Kultivierungsverfahren bestimmt, insbesondere gegenüber Rifampicin (und/oder Rifabutin) zu sein. Die Resistenz gegen Rifampicin zeigt sich in der fehlenden Hybridisierung mit wenigstens einer der S-Sonden.
Standard-Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind beispielsweise 3× SSC (Sodium Saline Citrate [=Kochsalz-Citrat-Lösung]), 20% deionisiertes FA (Formamid) bei 50°C. Andere Lösungen (SSPE (Sodium saline phosphate EDTA [=Kochsalz-Phosphat-EDTA]), TMACl (Tetramethylammoniumchlorid), usw.) und Temperaturen lassen sich ebenfalls einsetzen, vorausgesetzt, daß die Spezifität und Sensitivität der Sonden gewahrt wird. Nötigenfalls müssen leichte Modifikationen der Sonden hinsichtlich Länge oder Sequenz durchgeführt werden, um die unter den gegebenen Umständen erforderliche Spezifität und Sensitivität zu bewahren. Unter Verwendung der obenerwähnten Sonden führt eine Änderung der Bedingungen zu 1,4× SSC, 0,07 SDS bei 62°C zu den gleichen Hybridisierungsergebnissen wie diejenigen, die unter Standardbedingungen erzielt wurden, ohne daß dabei die Sequenz oder die Länge der Sonden angepaßt werden muß.
Geeignete Primerpaare können aus einer Liste von Primerpaaren, wie unten beschrieben ist, gewählt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die obenerwähnten Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn oder siebzehn der obenerwähnten S-Sonden, vorzugsweise mit 5 oder 6 S-Sonden, die zusammengenommen den „Mutationsbereich" des rpoB-Gens abdecken, hybridisiert.
Unter dem Begriff „Mutationsbereich" versteht man den Bereich in der rpoB-Gensequenz, wo die meisten oder alle für die Rifampicinresistenz verantwortlichen Mutationen lokalisiert sind. Dieser Mutationsbereich ist in 1 dargestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die obenerwähnten Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit einem ausgewählten Satz von rpoB-Wildtypsonden hybridisiert, wobei der Satz mindestens eine und vorzugsweise alle der folgenden Sonden umfaßt (siehe Tabelle 2):

S11 (SEQ ID NO 2)
S2 (SEQ ID NO 3)
S33 (SEQ ID NO 5)
S4444 (SEQ ID NO 8)
S55 oder S5555 (SEQ ID NO 10 oder 40)

In einer weiteren besonderen Ausführungsform kann der wie oben beschriebene Satz S-Sonden, oder wenigstens eine dieser Sonden, mit einer oder mehreren SIL-Sonden zum Nachweis stiller Mutationen im rpoB-Gen kombiniert werden. Eine bevorzugte SIL-Sonde ist SIL-1 (SEQ ID NO 13, siehe Tabelle 2).
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform läßt sich der Satz aus S-Sonden und möglicherweise SIL-Sonden mit wenigstens einer eine mit der Rifampicinresistenz in Zusammenhang stehende Mutation nachweisenden R-Sonde kombinieren.
R-Sonden werden aus der folgenden Gruppe von Sonden (siehe Tabelle 2) ausgewählt:

R1 (SEQ ID NO 46)
R2 (SEQ ID NO 14)
R2B (SEQ ID NO 47)
R2C (SEQ ID NO 48)
R3 (SEQ ID NO 49)
R4A (SEQ ID NO 15)
R44A (SEQ ID NO 16)
R444A (SEQ ID NO 17)
R4B (SEQ ID NO 18)
R44B (SEQ ID NO 19)
R444B (SEQ ID NO 20)
R4C (SEQ ID NO 50)
R4D (SEQ ID NO 51)
R4E (SEQ ID NO 52)
R5 (SEQ ID NO 21)
R55 (SEQ ID NO 22)
R58 (SEQ ID NO 53)
R5C (SEQ ID NO 54)

Vorzugsweise läßt sich der Satz aus S-Sonden und möglicherweise SIL-Sonden mit wenigstens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr R-Sonden kombinieren.
Ganz besonders bevorzugt läßt sich der Satz aus S-Sonden und möglicherweise SIL-Sonden mit wenigstens einer R-Sonde aus der folgenden eingeschränkten Gruppe von Sonden kombinieren:

R2 (SEQ ID NO 14)
R444A (SEQ ID NO 17)
R444B (SEQ ID NO 20)
R55 (SEQ ID NO 23)

Im Fall einer Kombination von S- und R-Sonden zeigt sich eine Resistenz gegen Rifampicin an dem Fehlen einer Hybridisierung mit einer der S-Sonden und möglicherweise an einem positiven Hybridisierungssignal mit der entsprechenden R-Sonde.
Da einige Mutationen häufiger als andere auftreten können, beispielsweise in gewissen geographischen Zonen (siehe z.B. Tabelle 5) oder unter spezifischen Umständen (z.B. relativ geschlossene Gemeinschaften) kann geeigneterweise ein Screening nur auf spezifische Mutationen unter Verwendung eines ausgewählten Satzes von S- und/oder R-Sonden durchgeführt werden. Dies würde zu einem einfacheren Test führen, der unter gewissen Umständen den Anforderungen genügen würde. Gemäß Telenti et al. (1993a und b) sind die meisten in seiner Veröffentlichung beschriebenen Mutationen relativ selten (3% oder weniger): vorherrschende Mutationen sind S531L (51,6%), H526Y (12,5%), D516V (9,4%) und H526D (7,8%).
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können die obenerwähnten S-, SIL- oder R-Sonden mit wenigstens einer Spezies-spezifischen Sonde für M. tuberculosis kombiniert werden, wodurch eine gleichzeitige Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis und Nachweis der Rifampicinresistenz gestattet sind, wobei die Spezies-spezifische Sonde aus der folgenden Gruppe von Sonden gewählt wird (siehe Tabelle 2):

MT-POL-1 (SEQ ID NO 23)
MT-POL-2 (SEQ ID NO 24)
MT-POL-3 (SEQ ID NO 25)
MT-POL-4 (SEQ ID NO 26)
MT-POL-5 (SEQ ID NO 27)

Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Spezies-spezifischen M. tuberculosis-Sonde um:

MT-POL-1 (SEQ ID NO 23)

In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform lassen sich die obenerwähnten S-, SIL-, R- oder MT-POL-Sonden mit wenigstens einer Spezies-spezifischen Sonde für M. paratuberculosis, M. avium, M. scrophulaceum, M. kansasii, M. intracellulare (sowie MAC-Stämme) oder M. leprae kombinieren, wobei es sich bei den Sonden um MP-POL-1 (SEQ ID NO 28), MA-POL-1 (SEQ ID NO 29), MS-POL-1 (SEQ ID NO 38), MK-POL-1 (SEQ ID NO 55), MI-POL-1 (SEQ ID NO 68) bzw. ML-POL-1 (SEQ ID NO 57) (siehe Tabelle 2B) oder eine beliebige Spezies-spezifische Sonde, die von der Sequenz des betreffenden Teils des rpoB-Gens von M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35), M. avium (SEQ ID NO 36), M. scrophulaceum (SEQ ID NO 37), M. kansasii (SEQ ID NO 56) oder MAC-Stämmen (SEQ ID NO 69) , wie in 5, 6, 7, 8 bzw. 11 dargestellt, abgeleitet ist, handeln. Es ist hier anzumerken, daß es sich bei den in 5–8 und 11 dargestellten Sequenzen um neue Sequenzen handelt. Die Sequenz des rpoB-Genfragments von M. intracellulare und M. leprae wurde bereits von anderen beschrieben (Guerrero et al., 1994: Honore und Cole, 1993).
Unter dem Begriff „MAC-Stämme" versteht man „M. avium complex"-Stämme, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Mycobakterientaxonomie bekannt sind. Diese ziemlich heterogene Gruppe von MAC-Stämmen kann jedoch Stämme umfassen, die genotypisch eher M. intracellulare gleichen. Dies trifft auch auf das Isolat ITG 926 zu, von dem die rpoB-Sequenz in 11 gezeigt ist. Die von SEQ ID NO 69 sowie der veröffentlichten M. intracellulare rpoB-Sequenz abgeleitete MI-POL-1-Sonde ist daher gemeinsam für M. intracellulare und einige MAC-Stämme spezifisch.
Es sollte betont werden, daß alle obenerwähnten Sonden, einschließlich mehr spezifischen Sonden, in der Sequenz des rpoB-Gens enthalten sind, und insbesondere in der Sequenz des amplifizierten rpoB-Genfragments. Wie weiter in den Beispielen veranschaulicht wird, sind die oben als „bevorzugt" beschriebenen Sonden zudem so konstruiert, daß sie alle gleichzeitig unter denselben Hybridisierungs- und Waschbedingungen eingesetzt werden können. Diese beiden Kriterien bedeuten, daß ein einziger Amplifikations- und Hybridisierungsschritt ausreicht, um gleichzeitig die Rifampicinresistenz nachzuweisen und die betreffende Mycobakterienspezies zu identifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sowie als Beispiel wird ein Verfahren zum Nachweis von M. tuberculosis und seiner Resistenz gegenüber Rifampicin offenbart, bei dem man:

(i) nötigenfalls die in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren freisetzt, isoliert oder konzentriert;
(ii) nötigenfalls den betreffenden Teil des rpoB-Gens mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar amplifiziert;
(iii) die Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) unter geeigneten Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit dem folgenden Satz Sonden hybridisiert MT-POL-1 S11 S2 S33 S4444 S55 oder S5555 R2 R444A R444B R55
(iv) die in Schritt (iii) gebildeten Hybride nachweist;
(v) auf das Vorhandensein von M. tuberculosis sowie seine Suszeptibilität gegenüber Rifampicin aus dem bzw. den in Schritt (iv) erhaltenen unterschiedlichen Hybridisierungssignal bzw. -signalen schließt.

Um die mycobakteriellen Organismen und ihr Resistenzmuster mit dem ausgewählten Satz von Oligonukleotidsonden nachzuweisen, können alle im Fachgebiet bekannten Hybridisierungsverfahren verwendet werden (herkömmlicher Dot-Blot, Southern-Blot, Sandwich, usw.).
Um jedoch schnelle und einfache Ergebnisse zu erzielen, wenn eine Vielzahl von Sonden beteiligt ist, ist das Format der reversen Hybridisierung am zweckmäßigsten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der ausgewählte Satz Proben an einem festen Träger immobilisiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der ausgewählte Satz Proben reihenförmig auf einem Membranstreifen immobilisiert. Dabei können die Proben einzeln oder im Gemisch an gekennzeichneten Stellen auf dem festen Träger immobilisiert werden.
Eine spezifische und sehr anwenderfreundliche Ausführungsform des obenerwähnten bevorzugten Verfahrens ist das LiPA-Verfahren, bei dem der obenerwähnte Satz Sonden in parallelen Reihen auf einer Membran immobilisiert wird, wie in den Beispielen weiter beschrieben.
Mit den obenerwähnten R-Sonden werden Mutationen nachgewiesen, die bereits im Stand der Technik beschrieben wurden (Telenti et al., 1993a und 1993b). Es werden jedoch, wie in den Beispielen weiter erläutert wird, durch die vorliegende Erfindung vier neue Mutationen offenbart, die mit der Rifampicinresistenz in M. tuberculosis im Zusammenhang stehen und von anderen noch nicht beschrieben wurden. Mit den S-Sonden der vorliegenden Erfindung lassen sich neue Mutationen ebenso wie bereits im Stand der Technik beschriebene Mutationen nachweisen. Das einzigartige Konzept der Verwendung eines Satzes von S-Sonden, die den Mutationsbereich im rpoB-Gen vollständig abdecken, gestattet den Nachweis der meisten oder sogar aller Mutationen im rpoB-Gen, die für die Rifampicinresistenz verantwortlich sind, und selbst derjenigen Mutationen, die bis jetzt noch nicht beschrieben worden sind.
Die vier neuen rpoB-Mutationen (D516G, H526C, H526T und R529Q) sind in Tabelle 1 mit einem Sternchen markiert. Als Beispiel ist die Sequenz des rpoB-mutanten Allels H526C in 2 dargestellt (SEQ ID NO 34).
Die Erfindung sieht ebenfalls beliebige Sonden oder Primersets vor, die für den spezifischen Nachweis oder die spezifische Amplifikation dieser neuen rpoB-Genmutationen konstruiert sind, sowie alle Verfahren oder Kits, in denen die Primer-Sätze oder Sonden verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ebenso ein Verfahren zum Nachweis der Resistenz von in einer biologischen Probe vorhandenem M. leprae gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) vor, bei dem man:

(i) nötigenfalls die in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren freisetzt, isoliert oder konzentriert;
(ii) nötigenfalls den betreffenden Teil des rpoB-Gens mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar amplifiziert;
(iii) die Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) unter geeigneten Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit einem ausgewählten Satz von rpoB-Wildtyp-Sonden hybridisiert, wobei der Satz mit dem vollständigen Mutationsbereich des rpoB-Gens, der dem in 1 beschriebenen Mutationsbereich entspricht, überlappt und wenigstens einen der folgenden Sonden (siehe Tabelle 2) umfaßt: ML-SI (SEQ ID NO 58) ML-S2 (SEQ ID NO 59) ML-S3 (SEQ) ID NO 60) ML-S4 (SEQ ID NO 61) ML-S5 (SEQ ID NO 62) ML-S6 (SEQ ID NO 63)
(iv) die in Schritt (iii) gebildeten Hybride nachweist;
(v) auf die Rifampicin-Suszeptibilität (Sensitivität gegen Resistenz) der in der Probe vorhandenen M. leprae aus dem bzw. den in Schritt (iv) erhaltenen unterschiedlichen Hybridisierungssignal bzw. –signalen schließt.

Die Resistenz gegen Rifampicin zeigt sich am Fehlen einer Hybridisierung mit wenigstens einer der ML-S-Sonden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können die obenerwähnten ML-S-Sonden mit einer Spezies-spezifischen Sonde für M. leprae, ML-POL-1, kombiniert werden, wodurch gleichzeitig die Identifizierung von M. leprae und der Nachweis der Rifampicinresistenz ermöglicht wird, wobei die Spezies-spezifische Sonde in SEQ ID NO 57 dargestellt ist.
Dabei ist anzumerken, daß alle obenerwähnten ML-S-Sonden und ML-POL-1-Sonden im selben amplifizierten rpoB-Genfragment von M. leprae enthalten und so konstruiert sind, daß sie alle unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen eingesetzt werden können.
Ein Primer-Satz, der die Amplifikation des Mutationsbereichs des rpoB-Gens von M. tuberculosis gestattet, läßt sich aus der folgenden Gruppe von Netzen (siehe Tabelle 2) wählen:

P1 und P5 (SEQ ID NO 30 und 33)
P3 und P4 (SEQ ID NO 31 und 32)
P7 und P8 (SEQ ID NO 41 und 42)

P2 und P6, kombiniert mit (P1 und P5) oder (P3 und P4) oder (P7 und P8) Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Primer-Satz um den folgenden:

P3 und P4 (SEQ ID NO 31 und 32)

Ein Primer-Satz, der die Amplifikation des Mutationsbereichs des rpoB-Gens in Mycobakterien im allgemeinen, d.h. wenigstens in M. tuberculosis, M. avium, M. paratuberculosis, M. intracellulare, M. leprae, M. scrophulaceum, gestattet, kann beispielsweise in Proben verwendet werden, in denen vermutlich von M. tuberculosis verschiedene Mycobakterien vorhanden sind, sowie dort, wo es wünschenswert ist, über ein allgemeineres Nachweisverfahren zu verfügen. Der Primer-Satz setzt sich aus einem 5'-Primer, ausgewählt aus dem folgenden Satz:

MGRPO-1 (SEQ ID NO 64)
MGRPO-2 (SEQ ID NO 65)

MGRPO-3 (SEQ ID NO 66)
MGRPO-4 (SEQ ID NO 67)

Die Primer können mit einer Markierung nach Wahl (z.B. Biotin) markiert werden. Es können unterschiedliche Zielmoleküle-Amplifikationssysteme auf Primerbasis verwendet werden, wobei die PCR-Amplifikation bevorzugt ist, wie in den Beispielen dargelegt. Dabei kann eine Einrunden- oder eine „nested"-PCR verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist ebenso ein Kit zum Schließen auf das Rifampicin-Resistenzspektrum von in einer biologischen Probe vorhandenen Mycobakterien, möglicherweise an die Identifizierung der beteiligten Mycobakterienspezies gekoppelt, mit den folgenden Bestandteilen vorgesehen:

(i) gegebenenfalls einem Mittel zur Freisetzung, Isolierung oder Konzentrierung der in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren;
(ii) gegebenenfalls wenigstens einem Primer aus dem oben definierten Primer-Satz;
(iii) wenigstens einer Sonde aus dem Satz erfindungsgemäßer Sonden, möglicherweise an einem festen Träger angebracht;
(iv) einem Hybridisierungspuffer bzw. notwendigen Komponenten zur Herstellung des Puffers;
(v) einer Waschlösung bzw. zur Herstellung der Lösung notwendigen Komponenten;
(vi) gegebenenfalls einem Mittel zum Nachweis der aus der vorausgegangenen Hybridisierung erhaltenen Hybride.

Unter dem Begriff „Hybridisierungspuffer" versteht man einen Puffer, der eine zwischen den Sonden und den in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren oder den amplifizierten Produkten unter den entsprechenden Stringenzbedingungen auftretende Hybridisierungsreaktion ermöglicht.
Unter dem Begriff „Waschlösung" versteht man eine Lösung, die das Waschen der gebildeten Hybride unter den entsprechenden Stringenzbedingungen ermöglicht.
BESCHREIBUNG DER TABELLE
In Tabelle 1 sind die Nukleotid- und Aminosäureaustausche (beschrieben von Telenti et al. (1993a und b), Kapur et al., 1994 sowie der vorliegenden Erfindung) im rpoB-Genfragment Rifampicinresistenter M. tuberculosis-Isolate zusammengefaßt. Die Codonnummerierung entspricht der in 1. Neue, in der vorliegenden Erfindung beschriebene Mutationen sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.
In Tabelle 2 sind die Sequenzen der aus dem rpoB-Gen gewählten Primer und Sonden aufgeführt.

2A: M. tuberculosis
2B: andere Mycobakterienspezies

In Tabelle 3 sind die Hybridisierungsergebnisse die mit der Sonde MT-POL-1 erhalten wurden, mit DNA aus unterschiedlichen Mycobakterien- und Nicht-Mycobakterienspezies dargestellt.
In Tabelle 4 sind einige mit LiPA erhaltene repräsentative Ergebnisse für einige M. tuberculosis-Isolate, die sequenziert wurden, sowie die Interpretation der unterschiedlichen LiPA-Muster dargestellt.
In Tabelle 5 ist das Auftreten der unterschiedlichen rpoB-Mutationen in M. tuberculosis in unterschiedlichen geographischen Zonen dargestellt. Abkürzungen: Bel = Belgien, Bengla = Bangladesch, Bur-Fa = Burkina Faso, Buru = Burundi, Can = Kanada, Chi = Chile, Col = Kolumbien, Egy = Ägypten, Gui = Guinea, Hon = Honduras, Pak = Pakistan, Rwa = Ruanda, Tun = Tunesien.
In Tabelle 6 ist ein Vergleich der LiPA-Ergebnisse mit der Bestimmung der Rifampicinresistenz in Kultur für M. tuberculosis dargestellt, S = sensitiv, R = resistent.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
In 1 sind die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Mutationsbereichs des rpoB-Gens bzw. der RNA-Polymerase-β-Untereinheit eines wildtypischen (d.h. nichtresistenten) Mycobacterium tuberculosis-Stamms (ITG 9081) dargestellt. Die Numerierung der Codons (Aminosäuren) entspricht der in Telenti et al. (1993a). Die an den resistenzinduzierenden Veränderungen beteiligten Nukleotide bzw. Aminosäuren sind unterstrichen. Die beobachteten Mutationen stehen in Kästchen. Die waagerechten Balken deuten die Positionen einiger der Oligonukleotidsonden an (eine Sonde pro Gruppe ist angedeutet).
In 2 ist die Teilnukleotidsequenz des neu beschriebenen rpoB-Mutantenallels des M. tuberculosis-Stamms ITG 9003 (SEQ ID NO 34) gezeigt.
In 3 sind die auf LiPA-Streifen mit den Sonden S44 und S4444, die in unterschiedlichen Konzentrationen auf den Membranstreifen aufgetragen wurden, dargestellt. Als Zielmaterial dienten Nuklein säurepräparationen der M. tuberculosis-Stämme ITG 8872 und ITG 9081.
In 4 ist ein Vergleich der Leistungsfähigkeit der Sonden S44 und S4444 in einem "Line probe assay"-Aufbau angegeben. Die Sonden auf Streifen A und B sind mit Ausnahme von S44 und 54444 identisch. Die Hybridisierungen wurden unter Verwendung von aus dem M. tuberculosis-Stamm ITG 8872 stammenden Material durchgeführt.
In 5 ist die Teilnukleotidsequenz des mutmaßlichen rpoB-Gens des M. paratuberculosis-Stamms 316F (SEQ ID NO 35) dargestellt.
In 6 ist die Teilnukleotidsequenz des mutmaßlichen rpoB-Gens des M. avium-Stamms ITG 5887 (SEQ ID NO 36) dargestellt.
In 7 ist die Teilnukleotidsequenz des mutmaßlichen rpoB-Gens des M. scrofulaceum-Stamms ITG 4979 (SEQ ID NO 37) dargestellt.
In 8 ist die Teilnukleotidsequenz des mutmaßlichen rpoB-Gens des M. kansasii-Stamms ITG 4987 (SEQ ID NO 56) dargestellt.
In 9 sind einige rpoB-Mutationen in M. tuberculosis sowie ihre entsprechenden LiPA-Muster dargestellt. Die Nomenklatur der Mutationen entspricht der in Tabelle 1 beschriebenen. Die Nomenklatur des LiPA-Musters ist wie folgt:

wt = positive Hybridisierung mit allen S-Sonden und negative Hybridisierung mit allen R-Sonden;
ΔS1-5 = Fehlen einer Hybridisierung mit der entsprechenden S-Sonde;
R2, 4A, 4B, 5 = positive Hybridisierung mit den entsprechenden R-Sonden und Fehlen einer Hybridisierung mit der entsprechenden S-Sonde;
C = Positivkontrollenreihe; sollte positiv sein, wenn der Test korrekt ausgeführt wurde;
Mtb = MT-POL-Sonde.

Zwar ist für jede Gruppe nur eine Sonde aufgeführt, doch steht diese für die gesamte Gruppe; z.B. S5 steht für S5, S55, S555, S5555, S55C, S55M.
In 10 ist die Häufigkeit der in den mittels LiPA analysierten Rifampicin-resistenten M. tuberculosis-Stämmen angetroffenen unterschiedlichen Mutationen dargestellt. Die Nomenklatur entspricht der in 9. „Mix" bedeutet, daß in der Probe ein Gemisch aus Stämmen vorlag. „Doppelt" bedeutet das Vorhandensein von zwei Mutationen in einem Stamm.
In 11 ist die Teilnukleotidsequenz des mutmaßlichen rpoB-Gens des MAC-Stamms ITG 926 (SEQ ID NO 69) dargestellt.
Beispiel 1: Amplifikation des rpoB-Genfragments in M. tuberculosis
Nach der Nukleinsäureextraktion aus Mycobakterienisolaten (entweder kultiviert oder in Körperflüssigkeit oder Gewebe vorhanden) wurden 2 μl Produkt zur Amplifikation des betreffenden Teils des rpoB-Gens unter Verwendung einer oder mehrerer Kombinationen zwischen den 5'-Primern (P1 (SEQ ID NO 30), P2, P3 (SEQ ID NO 31) und P7 (SEQ ID NO 41)) sowie den 3'-Primern (P4 (SEQ ID NO 32), P5 (SEQ ID NO 33), P6 und P8 (SEQ ID NO 42) eingesetzt.
Die Sequenz dieser Primer ist in Tabelle 2 angegeben. Bei P1, P3, P4, P5, P7 und P8 handelt es sich um neue Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind. P2 und P6 wurden zuvor beschrieben (Telenti et al., 1993a).
Diese Primer können mit einer Markierung nach Wahl (z.B. Biotin) markiert werden. Es können unterschiedliche Zielmolekül-Amplifikationssysteme auf Primerbasis verwendet werden. Zur Amplifikation mit der PCR werden die Bedingungen im folgenden beschrieben. In einer Einrunden-Amplifikation mit den Primern P1 und P5 wurde 35 Zyklen von jeweils 45 sec/94°C, 45 sec/58°C, 45 sec/72°C durchgeführt. Bei Bevorzugung einer nested-PCR wurden in der zweiten Runde die Primer P3 und P4 verwendet und 25 Zyklen (45 sec/94°C, 60 sec/68°C) durchgeführt, wobei von 1 μl des Erstrundenprodukts ausgegangen wurde.
Bei Verwendung von P3 und P4 in einer Einrunden-PCR wurde die folgende Zyklusvorschrift verwendet: 30 Zyklen von jeweils 1 min/95°C, 1 min/55°C, 1 min/72°C. Die gleiche Zyklusvorschrift wurde für den Primer-Satz P2/P6 verwendet.
Die PCRs wurden üblicherweise in einem Gesamtvolumen von 50 μl mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,2 mM MgCl₂, jeweils 200 μl dNTP, 0,01% Gelatine und 1 U Taq-Polymerase durchgeführt.
Die Primer-Konzentrationen lagen zwischen 10 und 25 pmol/Reaktion.
Da der Primer-Satz P3/P4 deutlich stärkere Signale nach der Hybridisierung ergab als der Primer-Satz P2/P6, wurde der erste Primer-Satz für alle weiteren Hybridisierungsexperimente verwendet. Der Primer-Satz P2/P6 wurde für die Sequenzanalyse verwendet. Nested-PCR mit P2 und P6 als äußeren Primern und P3 und P4 als inneren (biotinuierten) Primern wurde nur zum direkten Nachweis in klinischen Proben (Expektoraten und Biopsien) eingesetzt.
Die Länge des amplifizierten Produkts, wie sie mittels Agarose-Gelelektrophorese beobachtet wurde, ist wie folgt:
Beispiel 2: Sequenzierung der rpoB-Genfragmente aus M. tuberculosis-Stämmen
Aus Mycobakterienisolaten, von denen man wußte, daß sie gegenüber Rifampicin resistent oder sensitiv waren, extrahierte DNA wurde unter Verwendung des Primer-Satzes P2/P6 (wobei P6 am 5'-Ende biotinuiert war) amplifiziert. Es wurde eine direkte Sequenzierung des einzelsträngigen PCR-Produkts unter Verwendung Streptavidin-beschichteter Kügelchen sowie des „Taq Dye Deoxy Terminator / Cycle Sequencing"-Kits in einem ABI373A-DNA-Sequenzierautomaten (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Die für die Sequenzierung verwendeten Primer waren die gleichen wie die für die Amplifikation verwendeten (P2 bzw. P6).
Wie erwartet, ergaben alle sensitiven (= sensitiv in der Kultur sowie sensitive LiPA-Muster) sequenzierten Stämme (7) eine Wildtypsequenz (keine Mutation). In den meisten Stämmen konnte eine Mutation identifiziert werden. Die meisten dieser Mutationen wurden bereits beschrieben (Telenti et al., 1993a, 1993b, Kapur et al., 1994). Es werden jedoch in der vorliegenden Erfindung 4 neue Mutationen beschrieben: D516G, H526C, H526T und R529Q (siehe auch Tabelle 1 (*)). Die vollständige Sequenz des amplifizierten rpoB-Fragments des Mutantenallels H526C (Isolat ITG 9003) ist als Beispiel in 2 (SEQ ID NO 34) dargestellt.
Einige wenige Stämme (3/180, siehe Tabelle 6) waren in der Kultur gegen Rifampicin resistent, zeigten jedoch ein Wildtyp-LiPA-Muster. Nach der Sequenzierung zeigten alle diese Isolate eine Wildtyp-rpoB-Gensequenz, womit die Hybridisierungsergebnisse bestätigt wurden. Es besteht daher die Möglichkeit, daß auf diese Isolate ein unterschiedlicher molekularer Mechanismus der Rifampicinresistenz zutrifft.
Beispiel 3: Entwicklung des Line Probe Assay (LiPA)-Streifens
Der Line Probe Assay entsprach im Prinzip und hinsichtlich der Vorschrift mit wenigen Ausnahmen der früheren Beschreibung (Stuyver et al., 1993). Anstelle des Einbaus von biotinuiertem dUPT wurden biotinuierte Primer verwendet und die Hybridisierung sowie der stringente Waschschritt bei 50°C in 3 × SSC/20% deionisiertem Formamid durchgeführt.
Die zur Resistenz gegen Rifampicin führenden Mutationen im rpoB-Gen sind hauptsächlich in einer kleinen Zone des Gens, die 67 Nukleotide (23 Aminosäurecodons) umspannt, lokalisiert. Wenigstens 17 Nukleotide, die gleichmäßig über diesen Bereich verteilt sind, sind an Mutationen beteiligt, die zu wenigstens 28 unterschiedlichen Aminosäureaustauschen führen. Eine solche Komplexität der Nukleotidaustausche bereitet Probleme für den Nachweis aller dieser Austausche in einem einzigen Hybridisierungsschritt. Im Prinzip würde pro mutierter Stelle eine Wildtyp-Sonde und pro Nukleotidaustausch eine Mutantensonde benötigt, die die jeweilige Mutation spezifisch nachweist. Somit wären an einem Hybridisierungstest mindestens etwa 35 sequenzspezifische Oligonukleotidsonden beteiligt, die die Herstellung sowie Verwendung dieses Testkomplexes und als Folge davon den Test kommerziell weniger attraktiv machen würden.
Daher wurde ein besonderer Ansatz entworfen, bei dem sorgfältig gewählte (S-)Wildtyp-Sonden eingesetzt werden, die jeweils mehr als eine polymorphe Stelle überspannen und mit der vollständigen relevanten Zone überlappen (siehe 1). Dadurch ließ sich der Satz von mindestens 10 Wildtyp-Sonden auf eine Gesamtzahl von fünf oder sechs Sonden verkleinern. Diese Sonden wurden experimentell sehr genau eingestellt, so daß das Vorhandensein jeder resistenzverursachenden Mutation im rpoB-Mutationsbereich zu einer deutlich nachweisbaren Abnahme der Hybridstabilität zwischen dem Zielmolekül und wenigstens einer dieser Sonden unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen führte.
Da sich mit dieser Sondenkombination alle bislang beschriebenen relevanten Mutationen nachweisen lassen, kann die Rifampicinresistenz in Mycobacterium tuberculosis-Isolaten beobachtet werden. Dieser Sondensatz ist auch in der Lage, das Vorhandensein nicht beschriebener Mutationen, z.B. der TGC-Mutation in Position 526 im Stamm ITG 9003, nachzuweisen.
Obwohl genau genommen die Zugabe von (R-)Mutantensonden zu der ausgewählten Liste von Wildtyp-Sonden überflüssig ist, könnte es für wissenschaftliche Zwecke informativ sein, die exakte vorhandene Punktmutation nachzuweisen. Daher wurden 4 Mutantensonden (R2, R4A, R4B, R5) konstruiert, die den am häufigsten auftretenden Mutationen entsprechen und die zusammengenommen in der Lage sind, mehr als 70% aller Resistenzfälle positiv zu identifizieren (siehe 10). Zusätzliche Mutantensonden (z.B. R1, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R5B, R5C) können diesem 4er-Satz hinzugefügt werden, um die meisten klinisch relevanten Resistenzfälle positiv zu identifizieren. Die Hinzufügung dieser Sonden trägt auch zur Zuverlässigkeit des Assays bei, da das Auftreten einer Mutantensonde unweigerlich das Verschwinden einer Wildtyp-Sonde verursacht, falls man es nicht mit gemischten Infektionen zu tun hat. In manchen Fällen kann es klinisch relevant sein, zwischen den möglicherweise vorhandenen unterschiedlichen Mutationen unterscheiden zu können. Diese Situation kann beispielsweise in der Aminosäureposition 516 auftreten. Wird die in dieser Position vorhandene normale (Wildtyp-)Aminosäure (Asparaginsäure) gegen ein Valin oder Tyrosin ausgetauscht, so wird eine Resistenz auf hohem oder mittlerem Niveau gegen Rifampicin induziert; unveröffentlichte Daten scheinen jedoch darauf hinzudeuten, daß die Sensitivität gegenüber Rifabutin bestehen bleibt. Somit wäre im Gegensatz zu Rifampicin Rifabutin noch bei Infektionen durch Stämme mit dieser Mutation wirksam. Das gleiche könnte für das Codon 511 zutreffen, doch sind dies unseres Wissens nach die einzigen Mutationsstellen, für die die Wirkung von Rifampicin und Rifabutin unterschiedlich sein könnte; üblicherweise sind gegen Rifampicin-resistente Stämme auch gegen Rifabutin resistent.
Um einen LiPA-Streifen zum Nachweis des Vorhandenseins von Resistenz gegen Rifampicin (und/oder Rifabutin) in M. tuberculosis erzeugenden Mutationen zu entwickeln, wurden insgesamt 36 Oligonukleotidsonden synthetisiert und in einem reversen Hybridisierungstest beurteilt. Die Sequenz dieser Sonden ist in Tabelle 2A (Wildtyp- und Mutationssonden) dargestellt. Bei dem ersten Satz getesteter Sonden handelte es sich um: S1, S2, S3, S4, S5, R2, R4A, R4B und R5. Unter den für die reverse Hybridisierung verwendeten Bedingungen zeigten die meisten Sonden nicht die theoretisch erwartete Leistung, und es mußten Modifikationen eingeführt werden, die zur Synthese und Beurteilung der folgenden zusätzlichen Sonden führten: S11, S33, S44, S4444, S5555, R44A, R444A, R44B, R444B, R55. Von der gesamten Liste der Sonden wurden Sonden, die die optimalsten Eigenschaften im Hinblick auf Spezifität und Sensitivi tät unter den gleichen experimentellen Bedingungen zeigten, für die weitere Verwendung ausgewählt.
Die bevorzugten Sonden mit Wildtyp-Sequenzen (5-Sonden), die zusammen mit dem gesamten interessierenden rpoB-Bereich überlappen, sind: S11, S2, S33, S4444 und S55 oder S5555 (siehe Tabelle 2). Die Resistenz wird durch einen Verlust des Hybridisierungssignals mit einer dieser S-Sonden nachgewiesen.
Bei den bevorzugten Mutationssonden (R-Sonden) handelt es sich um R2, R444A, R444B und R55 (siehe Tabelle 2). In manchen Resistenzfällen kann ein Verlust des Hybridisierungssignals mit den S-Sonden mit einem positiven Hybridisierungssignal mit der entsprechenden R-Sonde einhergehen.
Einige der rpoB-Mutationen und ihre entsprechenden LiPA-Muster sind beispielhaft in 9 dargestellt.
Obwohl sich die Sonden aus der gleichen Gruppe (z.B. Sonden S4, S44, S444 und S4444) nur leicht voneinander unterscheiden, können ihre Hybridisierungseigenschaften beträchtlich variieren. Dies wird beispielhaft in einem Experiment veranschaulicht, bei dem die Leistung der Sonden S44 und S4444 unter Verwendung von aus zwei M. tuberculosis-Stämmen (ITG 8872 und ITG 9081), die beide jeweils eine Wildtyp-Sequenz im Zielbereich der Sonden S44 und S4444 zeigen, stammenden PCR-Produkten verglichen wird. Der Unterschied zwischen den beiden Sonden ist nachfolgend dargestellt:
Die Sonde S44 wurde auf einer theoretischen Grundlage aus der bekannten Gensequenz gewählt (Telenti et al., 1993a). Diese Sonde wäre theoretisch die beste Sonde zur Unterscheidung von Fehlpaarungen im CAC-Codon (unterstrichen), da dieses Codon im zentralen Teil der Sonde liegt. Im Gegensatz zu den allgemeinen Regeln erwies sich jedoch die Leistung der Sonde S4444 als deutlich besser (wie im nachfolgenden Experiment beschrieben).
Beide Sonden wurden in unterschiedlichen Mengen auf Nitrocellulosestreifen aufgetragen (2,4, 1,2 und 0,6 pmol/Streifen). Nach dem Fixieren und Blockieren der Streifen wurden die Sonden mit biotinuierten PCR-Fragmenten (aus den Stämmen IGT 8872 und ITG 9081) wie zuvor beschrieben hybridisiert. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Unter den verwendeten Hybridisierungsbedingungen (3 × SSC, 20% deionisiertes Formamid, 50°C) sind die mit der Sonde S44 erhaltenen Signale sehr schwach. Andererseits erzeugt die Sonde S4444 sehr starke und zuverlässige Signale. Folglich ist die Sonde S4444 zur Verwendung auf dem LiPA-Streifen gegenüber S44 bevorzugt. Dieser dramatische Effekt kann nicht allein dem Unterschied in der Länge der beiden Sonden zugeschrieben werden, sondern es scheint auch die Lokalisierung von Bedeutung zu sein. Höchstwahrscheinlich beeinflußt die Sekundärstruktur des Zielbereichs der Sonden in hohem Maße die Hybridisierungseigenschaften.
In 4 sind die Ergebnisse eines weiteren Experiments gezeigt, bei dem die Leistung der beiden Sonden im Zusammenhang mit den anderen Sonden verglichen wird. Beide Streifen A und B werden identisch behandelt, wobei ein aus dem Stamm ITG 8872 stammendes Amplifikationsprodukt verwendet wird. Beide Streifen sind fast identisch, mit der Ausnahme, daß Streifen A die Sonde S44 (0, 6 pmol) und Streifen B die Sonde S4444 (0,1 pmol) enthält und daß die Reihenfolge der auf den Streifen aufgetragenen Sonden unterschiedlich ist. Auf dem Streifen A ist die Sonde S44 negativ, wohingegen auf dem Streifen B die Sonde S4444 eindeutig positiv ist, obwohl in beiden Fällen eine perfekte Übereinstimmung zwischen dem Zielmolekül und der Sonde vorliegt und man in beiden Fällen ein positives Ergebnis erwarten würde.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Sondenkonstruktion, vor allem unter den festgelegten Bedingungen des reversen Hybridisierungsformats (gleichen Bedingungen für jede Sonde), nicht einfach ist und daß die Sonden sehr sorgfältig beurteilt werden müssen, bevor sie in einem reversen Hybridisierungsformat verwendet werden können.
Allgemein läßt sich festhalten, daß sich geeignete Sonden nicht immer einfach auf einer theoretischen Grundlage von einer bekannten Gensequenz ableiten lassen.
Obwohl unter den in der vorliegenden Erfindung getesteten Isolaten keine Störmutation nachgewiesen werden konnte, kann das Vorhandensein einer solchen Störmutation zu einem Resistenzmuster auf den Streifen (Fehlen einer Wildtyp-Sonde) führen, obwohl der Stamm sensitiv ist. Bislang wurde erst eine stille Substitution beschrieben (im Codon 528: CGC → CGT; Telenti et al., 1993a). Diese Mutation würde zu einer Destabilisierung des Hybrids mit der Sonde S4444 führen. Durch Hinzufügen einer für die stille Mutation spezifischen Sonde (Sonde SIL-1; Tabelle 2) zu dem Streifen kann diese stille Mutation von resistenzinduzierenden Mutationen unterschieden werden, wodurch eine Fehlinterpretation des beobachteten Musters vermieden würde. Zudem können die SIL-Sonden an der gleichen Stelle wie die entsprechenden S-Sonden auf dem Streifen aufgetragen werden (gemischte Sonden). Dabei würde als Ergebnis der stillen Mutation kein Verlust des Hybridisierungssignals beobachtet werden.
Um die Rifampicinresistenz verleihenden Insertionsmutationen 514insF und 514insFM (siehe 1) nachzuweisen, wurden zwei neue Wildtyp-Sonden konstruiert, nämlich S6 und S66, deren Sequenz in Tabelle 2 dargestellt ist. Eine Hybridisierung mit aus Stämmen, in denen diese Insertionsmutationen vorliegen, stammenden Nukleinsäuren führt zum Fehlen eines Hybridisierungssignals mit S6 und S66 (siehe auch Tabelle 1).
Zur positiven Identifizierung von mehr Mutationen als denen, die durch den Satz von R2, R4A, R4B und R5 nachgewiesen wurden, wurde eine Reihe zusätzlicher R-Sonden konstruiert, die dem LiPA-Streifen unter Verwendung der gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen hinzugefügt werden können. Zusammen mit den oben beschriebenen R-Sonden gestatten die zusätzlichen R-Sonden (R1, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R58, R5C) eine positive Identifizierung der Mutationen, die am häufigsten in der in der vorliegenden Anmeldung getesteten Stammsammlung angetroffen werden.
Beispiel 4: Für den M. tuberculosis-Komplex spezifische Sonde
Es wurde ein Line Probe Assay entwickelt, um den gleichzeitigen Nachweis der Resistenz gegen Rifampicin verursachenden Mutationen direkt gekoppelt an den Nachweis des Krankheitserregers in casu M. tuberculosis zu ermöglichen.
Da es äußerst vorteilhaft ist, das Vorhandensein von M. tuberculosis und das Vorhandensein oder Fehlen eines Gens oder einer Mutation, durch das bzw. die eine Arzneistoffresistenz hervorgerufen wird, gleichzeitig nachweisen zu können, bestand das Ziel darin, eine M. tuberculosis-Sonde zu entwickeln, die im selben PCR-Fragment enthalten ist wie wenigstens einer der relevanten zu identifizierenden Resistenzmarker. Daher wurden rpoB-Gene von Nicht-M. tuberculosis-Isolaten sequenziert. Bei diesen Organismen handelte es sich um: M. paratuberculosis 316F, M. avium ITG5887, M. scrophulaceum ITG4979 und M. kansasii ITG4987. Die Sequenzen der entsprechenden rpoB-Genfragmente sind in 5 bis 8 gezeigt. Darüber hinaus waren die Sequenz der rpoB-Genfragmente von M. leprae und M. intracellulare aus der Literatur bekannt (Honore und Cole, 1993; Guerrero et al., 1994). Ein Vergleich dieser Sequenzen mit der rpoB-Gensequenz von M. tuberculosis ermöglichte die Bezeichnung eines spezifischen Bereichs (außerhalb des für die Resistenz verantwortlichen Bereichs) im rpoB-Genfragment, von dem die Entwicklung von möglicherweise für M. tuberculosis spezifischen Sonden durchführbar erschien. Eine aus diesem Bereich abgeleitete Oligonukleotidsonde (im folgenden mit MT-POL-1 bezeichnet) mit der folgenden Sequenz:
wurde im Hinblick auf ihre Sensitivität und Spezifität durch Hybridisierung auf LiPA-Streifen weiter beurteilt. Dabei entsprachen die Amplifikations- und Hybridisierungsbedingungen den oben beschriebenen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Zusätzlich zu den in Tabelle 3 aufgeführten vier M. tuberculosis-Stämmen wurden 521 weitere klinische M. tuberculosis-Isolate getestet: Alle Isolate ergaben ein positives Hybridisierungssignal. Offensichtlich hybridisieren auch M. bovis-Stämme mit der Sonde, doch besteht für diesen Zweck keine klinische Relevanz darin, M. tuberculosis von M. bovis zu unterschieden. Tatsächlich kann in der gesamten Anmeldung der Begriff „M. tuberculosis" durch „M. tuberculosis-Komplex", der sich auf M. tuberculosis s.s., M. bovis, M. africanum und M. microti bezieht, ersetzt werden, ohne dabei die Signifikanz der Ergebnisse zu beeinflussen.
Zwar besteht die Möglichkeit, daß man mit der DNA einiger anderer Mycobacterium-Spezies und selbst einiger genetisch nicht verwandter Mikroorganismen, die ebenfalls in den Atemwegen vorhanden sein können, unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Primer-Sätze ein PCR-Produkt erhält, doch zeigten keine dieser Bakterien eine Hybridisierung mit der ausgewählten MT-POL-1-Sonde. Zusammenfassend läßt sich festhalten, daß die ausgewählte Sonde für Stämme des M. tuberculosis-Komplexes hochspezifisch ist und für M. tuberculosis 100% Sensitivität aufweist. Auch könnten weitere Sonden aus diesem Bereich für den spezifischen Nachweis von Stämmen des M. tuberculosis-Komplexes geeignet sein, wie z.B.: MT-POL-2, MT-POL-3, MT-POL-4 und MT-POL-5 (siehe Tabelle 2).
In ähnlicher Weise lassen sich die folgenden Sonden zur Differenzierung von M. avium-, M. paratuberculosis-, M. scrophulaceum-, M. kansasii-, M. intracellulare- und M. leprae-Stämmen voneinander und von anderen Mycobakterien verwenden: MA-POL-1, MP-POL-1, MS-POL-1, MK-POL-1, MI-POL-1 bzw. ML-POL-1 (siehe Tabelle 2B).
Beispiel 5: Beurteilung der LiPA-Streifen für M. tuberculosis
Es wurden LiPA-Streifen präpariert, die die folgenden Sonden (zusätzlich zu einer Reihe mit positiven Kontrollen) trugen: MT-POL-1, S11, S2, S33, S4444, S5555, R2, R444A, R444B, R55.
Diese Streifen wurden mit PCR-Produkten von M. tuberculosis-Stämmen, für die die betreffende rpoB-Gensequenz bestimmt worden war, hybridisiert.
Einige repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Die Hybridisierungsergebnisse korrelieren vollkommen mit den Sequenzergebnissen, was darauf hindeutet, daß mit den verwendeten Sonden auf dem Niveau einer einzigen Fehlpaarung unterschieden werden kann. Alle Mutationen, für die ein Screening durchgeführt wurde, ließen sich jeweils entweder durch Fehlen einer der Wildtyp-Sonden (S-Sonden) oder durch das Fehlen einer Wildtyp-Sonde zusammen mit dem Vorhandensein der entsprechenden Mutantensonde (R-Sonde) nachweisen. Im letzteren Fall läßt sich die exakte vorhandene Mutation aus den Hybridisierungsergebnisse herleiten. Man braucht jedoch die exakte vorhandene Mutation nicht zu kennen, um zu bestimmen, ob man es mit einem gegen Rifampicin resistenten Stamm zu tun hat oder nicht, da alle Mutationen, für die ein Screening durchgeführt wurde, Resistenz leihen. Sensitive Stämme, d.h. Stämme ohne Mutationen im betreffenden Teil des rpoB-Gens, ergeben positive Reaktionen mit allen S-Sonden, während alle R-Sonden ein negatives Ergebnis liefern (= wt-Muster).
Beispiel 6: Direkter Nachweis von M. tuberculosis-Stämmen und Rifampicinresistenz in klinischen Proben
Achtundsechzig klinische Präparate aus unterschiedlichen geographischen Quellen (13 bzw. 35 Speichelpräparate aus Belgien bzw. Ruanda sowie 20 Lymphknotenbiopsien aus Burundi), die alle in Kultur positiv für M. tuberculosis waren und bei –20°C aufbewahrt wurden, wurden analysiert. Die Probenherstellung für die Amplifikation beruhte auf dem Verfahren von Boom et al. (1990), modifiziert nach De Beenhouwer et al. (zur Veröffentlichung eingereicht). Es wurde für den betreffenden Bereich des rpoB-Gens ein Nested-PCR-Ansatz mit biotinuierten inneren Primern (P3 und P4) durchgeführt. Nach den Temperaturzyklen wurde das amplifizierte Produkt mit dem LiPA-Streifen inkubiert. Die Rifampicinresistenz wurde auf Löwenstein-Jensen unter Verwendung des Proportionsverfahrens von Canetti et al. (1963) bestimmt. Bei resistenten Stämmen wurde die MIC (Minimal Inhibitory Concentration [= minimale Hemmkonzentration]) von Rifampicin auf 7H10-Agar bestimmt (Heifets, 1988).
Unter dem Mikroskop waren 20 (29,4%) Proben negativ, 15 (22,1%) schwach positiv (1 + oder weniger nach der Skala der American Thoracic Society) und 33 (48,5%) stark positiv (≥ +2) nach Ziehl-Neelsen-Anfärbung.
Durch den LiPA wurde in 49 Präparaten Rifampicinsensitivität (nur M. tuberculosis- und Wildtyp-Sonden positiv) und in 19 Präparaten Resistenz nachgewiesen (M. tuberculosis-Sonde positiv, Fehlen einer der Wildtyp-Sonden und schließlich einer der Mutationssonden positiv). Ein in-vitro-Test auf Rifampicinsuszeptibilität bestätigte diese Ergebnisse mit drei Ausnahmen. Bei allen sensitiven Stämmen wurde ein sensitives Sondenmuster beobachtet, was darauf hindeutet, daß mögliche stille Mutationen in dieser Serie nicht nachgewiesen wurden. Es stellte sich heraus, daß alle Stämme, die ein Resistenzmuster zeigten, bei Anwendung herkömmlicher Techniken resistent waren. Bei drei Präparaten (von drei gegen mehrere Arzneistoffe resistenten Patienten aus Ruanda) wurde mit PCR-LiPA ein sensitives Muster erhalten, während die Kultur eine Resistenz zeigte (MIC > 2 μg/ml auf 7H10). Die Sequenzierung des rpoB-Bereichs dieser Stämme bestätigte die Wildtyp-Gensequenz, was möglicherweise auf einen unterschiedlichen Mechanismus der Rifampicinresistenz in diesen Fällen oder auf eine Mutation in einem anderen Teil des rpoB-Gens hindeutet. Es ist ebenfalls mit Interesse anzumerken, daß das Nested-PCR-System für alle in der Kultur positiven getesteten Präparate, einschließlich der 20 Ziehl-Neelsen-negativen Präparate, positive Ergebnisse ergab.
In einem weiteren Experiment (Daten nicht gezeigt) mit 17 Abstrich-negativen Speichelpräparaten aus klinisch vermuteten Tuberkulosefällen, die in der Kultur negativ waren, wurde mit dem LiPA-System kein einziges Signal erhalten, was darauf hindeutet, daß die Infektionen höchstwahrscheinlich nicht durch M. tuberculosis verursacht worden waren.
In einem anschließenden Experiment wurde eine große Sammlung klinischer Präparate von unterschiedlichen geographischen Ursprungs in LiPA getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Von den gefundenen 137 resistenten Stämmen konnte eine ziemlich große Anzahl einer der durch die R-Sonden repräsentierten Mutationen (R2, R4A, R4B, R5) zugeschrieben werden. Interessanterweise scheinen einige Mutationen in einigen Ländern häufiger vorzukommen als in anderen Ländern (z.B. in Tunesien und Ägypten; R4B (=H526D), in Ruanda: R5 (S531L)). Dies kann eventuell zu unterschiedlichen Testformaten für unterschiedliche Länder führen.
Von insgesamt 213 mit LiPA in der vorliegenden Anmeldung analysierten Rifampicin-resistenten Stämmen konnten 151 (71%) den Mutationen S531L, H526D, D516V oder H526Y zugeschrieben werden und waren somit durch ein positives Signal mit den Sonden R5, R4B, R2 bzw. R4A nachweisbar (siehe 10).
Bei einer Gesamtzahl von 180 sowohl in Kultur als auch mit LiPA analysierten Stämmen erfolgte eine korrekte Identifikation (sensitiv/resistent) in 164 (=91,1%) der Stämme (siehe Tabelle 6). In drei resistenten Stämmen zeigten die LiPA-Ergebnisse und die Sequenzierung ein Wildtyp-rpoB-Genfragment, was darauf hindeutet, daß der Mechanismus für Rifampicinresistenz nicht auf Mutationen in dem untersuchten Teil des rpoB-Gens zurückgeführt werden konnten.
Dreizehn der 180 analysierten Stämme waren in LiPA resistent, doch schienen in der Kultur sensitiv zu sein. Nach Rekultivierung von 2 dieser 13 Stämme in synthetischem 7H11-Medium anstelle des traditionellen Löwenstein-Jensen-Mediums erwiesen sich diese jedoch trotzdem als Rifampicin-resistent. Dieses bisher unveröffentlichte Ergebnis zeigt, daß sich das herkömmliche Löwenstein-Jensen-Medium nicht zur Bestimmung der antibiotischen Suszeptibilität von Mycobakterien empfiehlt (möglicherweise aufgrund der Tatsache, daß in für die Herstellung des Löwenstein-Jensen-Mediums verwendeten im Handel erhältlichen Eiern Spuren von Antibiotika gefunden wurden). Daher ist bei Durchführung der Kultivierung auf einem synthetischen Medium, wie 7H11, zu erwarten, daß der Prozentanteil von Stämmen mit der Diskrepanz, daß sie zwar im LiPA resistent, aber in Kultur sensitiv sind (in diesem Fall 13/180 = 7,2%), wesentlich niedriger liegt (und möglicherweise 0% beträgt).
Interessanterweise waren die meisten der in der vorliegenden Anmeldung untersuchten Rifampicinresistenten Isolate (> 90%) zusätzlich resistent gegenüber Isoniazid und somit resistent gegenüber mehreren Arzneistoffen (Definition einer Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe = Resistenz mindestens gegenüber Isoniazid und Rifampicin). Die Rifampicinresistenz kann somit als potentialer Marker für eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe betrachtet werden, und bei dem oben beschriebenen LiPA-Test kann es sich daher um ein wichtiges Werkzeug zur Bekämpfung der gegen mehrere Arzneistoffe resistenten Tuberkulose handeln.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß das oben beschriebene Verfahren die korrekte Identifikation von M. tuberculosis und den gleichzeitigen Nachweis einer Rifampicinresistenz direkt in klinischen Präparaten ohne Vorkultur gestattet. Es ermöglicht einen einfachen Nachweis der Rifampicinresistenz direkt in einem klinischen Präparat in weniger als 24 Stunden.
Beispiel 7 Nachweis der Rifampicinresistenz in M. leprae
Der oben beschriebene Nachweisansatz läßt sich auch auf den Nachweis von in biologischen Proben vorhandenen M. leprae anwenden, gekoppelt an den Nachweis ihrer Resistenz gegenüber Rifampicin. Die Sequenz des rpoB-Gens von M. leprae wurde bereits von Honore und Cole (1993) beschrieben. Dabei wurde nur eine beschränkte Anzahl von Mutationen, die für die Rifampicinresistenz in M. leprae verantwortlich sind, identifiziert. Man kann daher aus guten Gründen erwarten, daß, ähnlich wie bei M. tuberculosis, viele andere Mutationen die Rifampicinresistenz in M. leprae verursachen können und daß die meisten dieser Mutationen in einer ziemlich begrenzten Zone des rpoB-Gens, die dem zuvor in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen „Mutationsbereich" entspricht, lokalisiert sind.
Daher wird ein Satz von Wildtyp-Sonden ausgewählt, die mit dem putativen Mutationsbereich im rpoB-Gen von M. leprae überlappen (siehe Tabelle 2B):

ML-S1 (SEQ ID NO 58)
ML-S2 (SEQ ID NO 59)
ML-S3 (SEQ ID NO 60)
ML-S4 (SEQ ID NO 61)
ML-S5 (SEQ ID NO 62)
ML-S6 (SEQ ID NO 63).

Die Rifampicinresistenz zeigt sich am Fehlen einer Hybridisierung mit wenigstens einer dieser ML-S-Sonden. Mit diesem Satz von ML-S-Sonden werden Rifampicinresistenz hervorrufende Mutationen in diesem Bereich nachgewiesen, obwohl die Sequenz dieser Mutationen noch nicht beschrieben wurde.
Die obenerwähnten ML-S-Sonden wurden sorgfältig konstruiert, so daß sie alle unter den gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können. Das gleiche trifft auf die Spezies-spezifische ML-POL-1-Sonde zu, mit der die ML-S-Sonden kombiniert werden können, um einen gleichzeitigen Nachweis von M. leprae und seiner Resistenz gegenüber Rifampicin zu gestatten.
Alle in diesem Beispiel erwähnten Sonden sind im gleichen rpoB-Genfragment von M. leprae enthalten, das sich mittels PCR unter Verwendung eines Primer-Satzes, ausgewählt aus MGRPO-1 oder MGRPO-2 (5'-Primer) und MGRPO-3 oder MGRPO-4 (3'-Primer), erhalten läßt.

Tabelle 6: Vergleich der LiPA-Ergebnisse mit der Bestimmung der Rifampicinresistenz in Kultur für M. tuberculosis
LITERATURHINWEISE

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Claims

Verfahren zum Nachweis einer Rifampicin und/oder Rifabutin-Resitenz einer in einer Probe vorhandenen Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Spezies, bei dem man: (i) nötigenfalls die in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren freisetzt, isoliert oder konzentriert; (ii) nötigenfalls den betreffenden Teil des rpoB-Gens mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar amplifiziert; (iii) die Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit einem Satz von Wildtypsonden, wobei es sich bei wenigstens einer davon um eine S-Sonde aus Tabelle 2 handelt und wobei der Satz mit dem vollständigen Mutationsbereich des in 1 abgegrenzten rpoB-Gens überlappt, unter geeigneten Hybridisierungs- und Waschbedingungen hybridisiert; (iv) die in Schritt (iii) gebildeten Hybride nachweist; (v) auf die Rifampicin-Suszeptibilität (Sensitivität gegen Resistenz) der in Probe vorhandenen Mycobacterium-Spezies aus dem bzw. den in Schritt (iv) erhaltenen unterschiedlichen Hybridisierungssignal bzw. -signalen schließt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Mycobacterium-Spezies um M. tuberculosis handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Satz von Wildtypsonden aus 5 oder 6 Wildtypsonden besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, wobei der Satz von Wildtypsonden in Schritt (iii) weiter mit wenigstens einer Spezies-spezifischen Sonde für M. tuberculosis, M. paratuberculosis, M. avium, M. scrophulaceum, M. kansasii, M. intracellulare (und MAC-Stämme) oder M. leprae zusammengebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonde M. tuberculosis ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: MT-POL-1 (SEQ ID NO 23), MT-POL-2 (SEQ ID NO 24), MT-POL-3 (SEQ ID NO 25), MT-POL-4 (SEQ ID NO 26), und MT-POL-5 (SEQ ID NO 27).
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonde(n) für M. paratuberculosis ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: MP-POL-1 (SEQ ID NO 28), und/oder einer beliebigen, aus der Sequenz des betreffenden Teils des rpoB-Gens von M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35) abgeleiteten, für M. paratuberculosis spezifischen Sonde.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonde(n) für M. avium ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: MA-POL-1 (SEQ ID NO 29), and/or einer beliebigen, aus der Sequenz des betreffenden Teils des rpoB-Gens von M. avium (SEQ ID NO 36) abgeleiteten, für M. avium spezifischen Sonde.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonde(n) für M. scrophulaceum ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: MS-POL-1 (SEQ ID NO 38), and/or einer beliebigen, aus der Sequenz des betreffenden Teils des rpoB-Gens von M. scrophulaceum (SEQ ID NO 37) abgeleiteten, für M. scrophulaceum spezifischen Sonde.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonde(n) für M. kansasii ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: MK-POL-1 (SEQ ID NO 55), und/oder einer beliebigen, aus der Sequenz des betreffenden Teils des rpoB-Gens von M. kansasii (SEQ ID NO 56) abgeleiteten, für M. kansasii spezifischen Sonde.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonde(n) für M. intracellulare (und MAC-Stämme) ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: MI-POL-1 (SEQ ID NO 68), und/oder einer beliebigen, aus der Sequenz des betreffenden Teils des rpoB-Gens von MAC-Stamm (SEQ ID NO 69) abgeleiteten, eines MAC-Stamms spezifischen Sonde.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Spezies-spezifische Sonden(n) für M. leprae ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: ML-POL-1 (SEQ ID NO 57),
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Satz von Wildtypsonden in Schritt (iii) weiterhin mit wenigstens einer Sonde einer stillen rpoB-Mutation zusammengebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Satz aus Wildtypsonden in Schritt (iii) weiterhin mit wenigstens einer der rpoB-Mutationssonden aus Tabelle 2 zusammengebracht wird.
Verfahren nach Ansprüchen 1–13, wobei der Satz von Wildtypsonden wenigstens eine (S-)Sonde umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: S11 (SEQ ID NO 2), S2 (SEQ ID NO 3), S33 (SEQ ID NO 5), S4444 (SEQ ID NO 8), S55 (SEQ ID NO 10) und S5555 (SEQ ID NO 40).
Verfahren nach Ansprüchen 1–13, wobei der Satz von Wildtypsonden wenigstens die folgenden (S-)Sonden umfaßt: S4444 (SEQ ID NO 8), und, S55 or S5555 (SEQ ID NO 10) oder (SEQ ID NO 40)
Verfahren nach Ansprüchen 1–13, wobei der Satz von Wildtypsonden aus allen der folgenden (S-)Sonden besteht: S11 (SEQ ID NO 2), S2 (SEQ ID NO 3), S33 (SEQ ID NO 5), S4444 (SEQ ID NO 8), und S55 or S5555 (SEQ ID NO 10) oder (SEQ ID NO 40)
Verfahren nach Ansprüchen 12 bis 16, wobei die Sonde der stillen rpoB-Mutation aus: SIL-1 (SEQ ID NO 13) besteht.
Verfahren nach Ansprüchen 13–17, wobei die R-Sonde(n) ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus: R2 (SEQ ID NO 14), R444A (SEQ ID NO 17), R444B (SEQ ID NO 20), und R55 (SEQ ID NO 22).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, unter Verwendung einer Sonde oder eines Satzes von Primern, die für den spezifischen Nachweis bzw. die Amplifikation der folgenden neuen rpoB-Genmutationen gestaltet sind: – D516G, eine Mutation in Codon 516 des rpoB-Gens darstellend, die zu einem Austausch der Aminosäure D gegen G führt, – H526C, eine Mutation in Codon 526 des rpoB-Gens darstellend, die zu einem Austausch der Aminosäure H gegen C führt, – H526T, eine Mutation in Codon 526 des rpoB-Gens darstellend, die zu einem Austausch der Aminosäure H gegen T führt; – R529Q, eine Mutation in Codon 529 des rpoB-Gens darstellend, die zu einem Austausch der Aminosäure R gegen Q führt.
Verfahren zum Nachweis einer Rifampicin und/oder Rifabutin-Reistenz einer in einer Probe vorhandenen Mycobacterium leprae-Komplex-Spezies, bei dem man: (i) nötigenfalls die in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren freisetzt, isoliert oder konzentriert; (ii) nötigenfalls den betreffenden Teil des rpoB-Gens mit wenigstens einem geeigneten Primerpaar amplifiziert; (iii) die Polynukleinsäuren aus Schritt (i) oder (ii) mit einem Satz von Wildtypsonden, die wenigstens eine (S-)Sonde ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: ML-S1 (SEQ ID NO 58), ML-S2 (SEQ ID NO 59), ML-S3 (SEQ ID NO 60), ML-S4 (SEQ ID NO 61), ML-S5 (SEQ ID NO 62), und, ML-S6 (SEQ ID NO 63), umfaßt, wobei der Satz mit dem vollständigen Mutationsbereich des rpoB-Gens, der dem in 1 beschriebenen Mutationsbereich entspricht, überlappt, unter geeigneten Hybridisierungs- und Waschbedingungen hybridisiert; (iv) die in Schritt (iii) gebildeten Hybride nachweist; (v) auf die Rifampicin-Suszeptibilität (Sensitivität gegen Resistenz) der in Probe vorhandenen Mycobacterium-Spezies aus dem bzw. den in Schritt (iv) erhaltenen unterschiedlichen Hybridisierungssignal bzw. -signalen schließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Sonden auf einem festen Träger immobilisiert sind.
Satz von Wildtypsonden zum Nachweis der Rifampicin- und/oder Rifabutin-Resistenz einer Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Spezies, dadurch gekennzeichnet, daß der Satz mit dem in 1 abgegrenzten vollständigen rpoB-Mutationsbereich überlappt und wenigstens eine S-Sonde aus Tabelle 2 umfaßt.
Satz von Wildtypsonden gemäß Anspruch 22, wobei der Satz 5 oder 6 Wildtypsonden umfaßt.
Zusammensetzung, enthaltend einen der Sätze von Wildtypsonden mit der in einem der Ansprüche 22 bis 23 angegebenen Bedeutung.
Kit zum Schließen auf das Rifampicin und/oder Rifabutin-Resistenzspektrum einer in einer biologischen Probe vorhandenen Mycobacterium tuberculosis-Komplex-Spezies, möglicherweise gekoppelt an die Identifizierung der beteiligten Mycobakterienspezies, mit den folgenden Bestandteilen: (i) gegebenenfalls einem Mittel zur Freisetzung, Isolierung oder Konzentrierung der in der Probe vorhandenen Polynukleinsäuren; (ii) gegebenenfalls einem Satz von Primern zur Amplifizierung des rpoB-Gens; (iii) wenigstens einer aus dem Satz von Wildtypsonden mit der in einem der Ansprüche 22 und 23 angegebenen Bedeutung und gegebenenfalls an einem festen Träger angebracht; (iv) einem Hybridisierungspuffer bzw. notwendigen Komponenten zur Herstellung des Puffers; (vi) einer Waschlösung bzw. zur Herstellung der Lösung notwendigen Komponenten; (vi) gegebenenfalls einem Mittel zum Nachweis der aus der vorausgegangenen Hybridisierung erhaltenen Hybride.
Kit nach Anspruch 25 zum Nachweis einer Rifampicin- und/oder Rifabutin-Resistenz von M. tuberculosis, wobei der Satz von Wildtypsonden in Schritt (iii) aus dem Satz der in Anspruch 22 bis 23 angegebenen Bedeutung besteht.