JP2002532103A - マイコバクテリウムツバキュロシスにおける抗生物質耐性変異の特徴付けのための方法及びキット - Google Patents

マイコバクテリウムツバキュロシスにおける抗生物質耐性変異の特徴付けのための方法及びキット

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JP2002532103A JP2000588389A JP2000588389A JP2002532103A JP 2002532103 A JP2002532103 A JP 2002532103A JP 2000588389 A JP2000588389 A JP 2000588389A JP 2000588389 A JP2000588389 A JP 2000588389A JP 2002532103 A JP2002532103 A JP 2002532103A
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Abstract

(57)【要約】 増幅及びサイクル配列決定プライマーの組み合わせが、マイコバクテリウムツバキュロシスのrpoB（リファンピン）、katG（イソニアジド）、oxyR-ahpC PR（イソニアジド）、mabA（イソニアジド）、rpsL/s12（ストレプトマイシン）、16S/rrs（ストレプトマイシン）、embB（エタンブトール）、pncA（ピラジナミド）、gyrA（シプロフロキサシン）及び23S（アジスロマイシン）遺伝子の定義された領域における抗生物質耐性関連変異の検出及び分析のために開発された。これらのプライマーは、試料中に存在するマイコバクテリウムツバキュロシスの検出及び特徴付け方法において使用されうる。この方法は、マイコバクテリウムツバキュロシスを含むと思われる喀痰試料を得、マイコバクテリウムツバキュロシスの存在を検出するために、試料について予めの増幅を行うか、又は行わずに第一の配列決定手続を実施し、存在する場合に、抗生物質耐性を誘導する変異の存在について、rpoB、katG、rpsL/s12及び23S遺伝子の評価を行い；及び（ｃ）工程（ｂ）においてマイコバクテリウムツバキュロシスが検出された場合に、試料について予めの増幅を行うか、又は行わずに第二の配列決定手続を実施して抗生物質耐性を誘導する変異の存在について更なる遺伝子の評価を実施する工程を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） この発明は、マイコバクテリウムツバキュロシス（Mycobacterium tuberculos
is）における抗生物質耐性変異の特徴付けのための方法及びキット、特には臨床
試料中のこのような変異の評価に関するものである。
【０００２】 （発明の背景） マイコバクテリウムツバキュロシスは、結核患者の処置に現在使用されている
全ての抗生物質に対して耐性であり得る。抗生物質耐性は、マイコバクテリウム
ツバキュロシスのゲノムの標的遺伝子において後天的に得た点変異によるもので
ある。これらの点変異は、抗生物質の取込又は活性化の阻害により、あるいは抗
生物質の標的の改変により、抗生物質の作用に対して生物を非感受性にする。マ
イコバクテリウムツバキュロシスにおける観察された抗生物質耐性は、一つの株
から他の株に転送されるエピソームにコードされた耐性遺伝子によるものではな
く、他のバクテリアと同様に単一工程の（１点の変異）の、高水準耐性である。
【０００３】 喀痰試料中のマイコバクテリウムツバキュロシスにおける抗生物質耐性の迅速
かつ正確な検出は、患者の処置及びその経過の両者について大きく改善する。現
在、マイコバクテリウムツバキュロシスの分析は、標準感染疾患／公衆衛生研究
所（Standard Infectious Disease / Public Health Laboratory）実務に従って
取り扱われる喀痰試料から回収されるＤＮＡに対して実施される。喀痰試料は、
汚染除去され、細胞沈殿物が単離される。この細胞沈殿物は、マイコバクテリウ
ムツバキュロシスの検出及び単離において使用される全ての提携手法のための試
料供給源である。この試料の小分け分は、マイコバクテリウムツバキュロシスの
選択的育成のためのBac Tec培養、マイコバクテリウムツバキュロシスの寒天平
板／寒天スラント培養、マイコバクテリア検出のための抗酸性バクテリア（ＡＦ
Ｂ）スメア、ならびにマイコバクテリウムツバキュロシス及び非定型マイコバク
テリア検出のための分子生物学的方法において使用される（Ｆｉｇ．１参照）。
【０００４】 マイコバクテリアＤＮＡは、標準的手法に従って、汚染除去された喀痰細胞沈
殿物から直接に調製され、このマイコバクテリアＤＮＡは、種々の分子生物学的
検出方法において使用される。現在マイコバクテリウムツバキュロシスの検出に
使用されている方法は、ＰＣＲに基づくか又はプローブに基づく方法の何れかで
ある。これらの試験は、主としてＡＦＢスメア(smear)−陽性試料に対して使用
される。マイコバクテリウムツバキュロシスの存在が、ＡＦＢスメアで既に確立
されてからは、診断的役割とは異なって、これらの試験は主として確認的役割に
おいて使用される。更に、これらの試験は、これらのマイコバクテリウムツバキ
ュロシス試料の可能性を持った抗生物質耐性に関する情報を提供することがない
。
【０００５】 以下に示すものはマイコバクテリウムツバキュロシス感染を処置するために使
用される抗生物質のリストである。知られている場合には、特定の抗生物質の標
的遺伝子及び抗生物質耐性に関連する領域が揚げられている。コドンの割り当て
の元とした文献を、本願の最後に掲載した。
【０００６】 １．リファンピン rpoB遺伝子 コドン507-533a ２．イソニアジド katG遺伝子 コドン275/315/328b ３．イソニアジド mabA遺伝子 未知c ４．イソニアジド oxyR-ahpC遺伝子間領域（ＰＲ） ヌクレオチド-48 〜 +33 ５．アジスロマイシン 23S rRNA配列 ヌクレオチド2568Ae ６．ピラジナミド pncA遺伝子 コドン47/85f ７．エタンブトール embB遺伝子 コドン306g ８．ストレプトマイシン rpsL/s12遺伝子 コドン43/88h ９．ストレプトマイシン 16S/rrs配列 ヌクレオチド491,512,516,513, 903,904 10．シプロフロキサシン gyrA遺伝子 コドン88-95j
【０００７】 プローブに基づく試験は、マイコバクテリウムツバキュロシスにおけるリファ
ンピン（rifampin）耐性の決定のために当に存在するが（ライン プローブ アッ
セイ−Inno Tek）、これらのプローブは、rpoB遺伝子における抗生物質耐性関連
の変異の予めの知識に依存する。該プローブによりまかなわれる領域外の変異又
はプローブ混合物に含まれない新たな変異は、なおも耐性を与えうるものである
が、この製品を現在の形態で使用しても検出されないであろう。
【０００８】 従って、抗生物質耐性を与える遺伝指標的の全てにおける変異を検出しうる、
臨床的マイコバクテリウムツバキュロシス喀痰試料における抗生物質耐性変異の
検出のための方法の必要性がある。このような方法を提供することが本発明の目
的である。マイコバクテリウムツバキュロシスにおける抗生物質耐性変異の特徴
付けにおいて使用するための、増幅及びサイクル配列決定プライマーの組み合わ
せ、及びこのようなプライマーの組み合わせを含むキットを提供することは、本
発明の更なる目的である。
【０００９】 （発明の要約） 増幅及びサイクル配列決定プライマーの組み合わせが、rpoB（リファンピン[r
ifampin]）、katG（イソニアジド[isoniazid]）、oxyR-ahpC PR（イソニアジド
）、mabA（イソニアジド）、rpsL/s12（ストレプトマイシン）、16S/rrs（スト
レプトマイシン）、embB（エタンブトール[ethambutol]）、pncA（ピラジナミド
[pyrazinamide]）、gyrA（シプロフロキサシン[ciprofloxacin]）及び23S（アジ
スロマイシン[azithromycin]）遺伝子の定義（限定）された領域における抗生物
質耐性関連変異の検出及び分析のために開発された。これらのプライマーの組み
合わせ及びOPENGENETM自動化ＤＮＡ配列決定システムを使用して、マイコバクテ
リウムツバキュロシスの迅速検出、及び一連の遺伝子標的における抗生物質耐性
関連変異の同定の両者を可能とするプロトコールが開発された。本発明は、現在
結核の処置のために使用されている全ての抗生物質についての、全ての遺伝子標
的における抗生物質耐性関連変異を検出すべく設計された一連の試験を使用する
ものである。該試験は、所定の試料においてマイコバクテリウムツバキュロシス
の存在及び抗生物質耐性の両者を決定するために、ＡＦＢスメア陽性又はスメア
陰性の試料の両方について、階層的様式にて使用される。この方法は、試料中の
マイコバクテリウムツバキュロシスの存在、及び抗生物質の全体のパネルについ
ての抗生物質耐性プロフィールの同時決定を可能とする。標準法は、マイコバク
テリウムツバキュロシスの培養のために２−６週間、及び抗生物質耐性の確立の
ための付加的な時間を必要とする。ＤＮＡ配列に基づく（遺伝子型）試験は、伝
統的な培養に基づく（表現型）方法を置き換えることを意図するものではないが
、これらの試験は迅速、高感度かつ正確なプロトコールを表し、これは臨床医に
抗生物質処置の選択肢に関して数週とは対照的に数日以内での有用な情報を提供
する。
【００１０】 （図面の簡単な記述） 図１は、マイコバクテリウムツバキュロシスに対する既知の試験プロトコール
を示し；及び 図２は、本発明に従ってマイコバクテリウムツバキュロシスタイプを評価する
ための階層的アッセイスキームを示す。
【００１１】 （発明の詳細な記述） 本発明によれば、抗生物質耐性に関連するマイコバクテリウムツバキュロシス
のゲノムの領域が、特異的に設計された増幅及び配列決定プライマーを用いて増
幅され、配列決定される。増幅のための種々の技術が、ここに参考として取り入
れる米国特許第4,683,202号に記述される基本ＰＣＲ増幅技術を含んで知られて
いる。同様に、配列決定のための種々の技術が知られており、そのあるものは予
めの増幅を必要とし、あるものは必要としない。既知の配列決定技術に含まれる
ものは、ここに参考として取り入れる米国特許第5,834,189号及び5,789,168号に
記述されるものである。発明は以下に別途に増幅及びサイクル配列決定工程を使
用して例示されるが、発明のプライマーは、これらの配列決定様式の何れにおい
ても使用されうる。
【００１２】 理論的には、興味ある既知領域を増幅し配列決定するためのプライマーの選択
は容易である。しかし、実際にはプライマーの他の領域に結合する可能性、二次
構造に起因する複雑さ及び完全には理解されていない他の因子のために、ある種
のプライマーは同じ興味ある領域の増幅及び配列決定において他のものより優れ
た性能を示す。本発明は、抗生物質耐性の１０種の既知のタイプのそれぞれに関
連する領域の増幅及び配列決定のために、至適化されているプライマーを提供す
る。これらのプライマーの組み合わせは、分析に使用される遺伝子配列と共に以
下に示される。遺伝子配列において、プライマーの位置が下線により示される。
【００１３】 プライマー
【００１４】 rpoB（リファンピン耐性） rpoB-F 増幅プライマー、２０量体、bp2201-2220
【００１５】
【化１】 配列番号１
【００１６】 rpoB-R 増幅プライマー、２０量体、bp2611-2592
【００１７】
【化２】 配列番号２
【００１８】 rpoB-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp2201-2220
【００１９】
【化３】 配列番号３
【００２０】 rpoB-3s 配列決定プライマー、２０量体、bp2611-2592
【００２１】
【化４】 配列番号４
【００２２】
【化５】 配列番号５
【００２３】 katG（イソニアジド耐性） katG-F 増幅プライマー、２０量体、bp722-741
【００２４】
【化６】 配列番号６
【００２５】 katG-R 増幅プライマー、２０量体、bp1250-1231
【００２６】
【化７】 配列番号７
【００２７】 katG-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp722-741
【００２８】
【化８】 配列番号８
【００２９】 katG-3s 配列決定プライマー、２０量体、bp1250-1231
【００３０】
【化９】 配列番号９
【００３１】
【化１０】 配列番号１０
【００３２】 oxyR-aphC遺伝子間領域（PR） PR-F 増幅プライマー、２０量体、bp451-470
【００３３】
【化１１】 配列番号１１
【００３４】 PR-R 増幅プライマー、２０量体、bp687-668
【００３５】
【化１２】 配列番号１２
【００３６】 PR-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp451-470
【００３７】
【化１３】 配列番号１３
【００３８】 PR-3s 配列決定プライマー、２０量体、bp687-668
【００３９】
【化１４】 配列番号１４
【００４０】
【化１５】 配列番号１５
【００４１】 mabA（イソニアジド耐性） mabA-F 増幅プライマー、２０量体、bp56-75
【００４２】
【化１６】 配列番号１６
【００４３】 mabA-R 増幅プライマー、２０量体、bp303-284
【００４４】
【化１７】 配列番号１７
【００４５】 mabA-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp56-75
【００４６】
【化１８】 配列番号１８
【００４７】 mabA-3s 配列決定プライマー、２０量体、bp303-284
【００４８】
【化１９】 配列番号１９
【００４９】
【化２０】 配列番号２０
【００５０】 rpsL/s12（ストレプトマイシン耐性） s12-F 増幅プライマー、２０量体、bp1-20
【００５１】
【化２１】 配列番号２１
【００５２】 s12-R 増幅プライマー、２０量体、bp384-365
【００５３】
【化２２】 配列番号２２
【００５４】 s12-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp1-20
【００５５】
【化２３】 配列番号２３
【００５６】 s12-3s 配列決定プライマー、２０量体、bp384-365
【００５７】
【化２４】 配列番号２４
【００５８】
【化２５】 配列番号２５
【００５９】 16S/rrs（ストレプトマイシン耐性） 16S-F 増幅プライマー、２１量体、bp5-25
【００６０】
【化２６】 配列番号２６
【００６１】 16S-R 増幅プライマー、２１量体、bp147-127
【００６２】
【化２７】 配列番号２７
【００６３】 16S-5s 配列決定プライマー、２１量体、bp5-25
【００６４】
【化２８】 配列番号２８
【００６５】 16S-3s 配列決定プライマー、２１量体、bp147-127
【００６６】
【化２９】 配列番号２９
【００６７】
【化３０】 配列番号３０
【００６８】 embB（エタンブトール耐性） embB-F 増幅プライマー、２１量体、bp7761-7781
【００６９】
【化３１】 配列番号３１
【００７０】 embB-R 増幅プライマー、２１量体、bp8040-8020
【００７１】
【化３２】 配列番号３２
【００７２】 embB-5s 配列決定プライマー、２１量体、bp7761-7781
【００７３】
【化３３】 配列番号３３
【００７４】 embB-3s 配列決定プライマー、２１量体、bp8040-8020
【００７５】
【化３４】 配列番号３４
【００７６】
【化３５】 配列番号３５
【００７７】 pncA（ピラジナミド耐性） pncA-F 増幅プライマー、２0量体、bp1-20
【００７８】
【化３６】 配列番号３６
【００７９】 pncA-R 増幅プライマー、２0量体、bp561-542
【００８０】
【化３７】 配列番号３７
【００８１】 pncA-5s 配列決定プライマー、２0量体、bp1-20
【００８２】
【化３８】 配列番号３８
【００８３】 pncA-3s 配列決定プライマー、２0量体、bp561-542
【００８４】
【化３９】 配列番号３９
【００８５】
【化４０】 配列番号４０
【００８６】 gyrA（フルオロキニロン／シプロフロキサシン耐性） gyrA-F 増幅プライマー、２０量体、bp2383-2402
【００８７】
【化４１】 配列番号４１
【００８８】 gyrA-R 増幅プライマー、２０量体、bp2702-2683
【００８９】
【化４２】 配列番号４２
【００９０】 gyrA-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp2383-2402
【００９１】
【化４３】 配列番号４３
【００９２】 gyrA-3s 配列決定プライマー、２０量体、bp2702-2683
【００９３】
【化４４】 配列番号４４
【００９４】
【化４５】 配列番号４５
【００９５】 23S（マクロライド／アジスロマイシン耐性） 23S-F 増幅プライマー、２０量体、bp2444-2463
【００９６】
【化４６】 配列番号４６
【００９７】 23S-R 増幅プライマー、２０量体、bp2683-2664
【００９８】
【化４７】 配列番号４７
【００９９】 23S-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp2444-2463
【０１００】
【化４８】 配列番号４８
【０１０１】 23S-5s 配列決定プライマー、２０量体、bp2683-2664
【０１０２】
【化４９】 配列番号４９
【０１０３】
【化５０】 配列番号５０
【０１０４】 実時間蛍光−ベース電気泳動装置（例えば、Visible Genetics OPENGENETM配
列決定装置）を使用する配列決定生成物の検出を容易にするために、少なくとも
１個の配列決定プライマーは蛍光標識されることが望ましい。標識は、使用され
る配列決定装置との適合性について選択され、例えばフルオレッセインあるいは
ＣＹ５．０又はＣＹ５．５等のシアニンであってよい。
【０１０５】 本発明のプライマーは、好適にはキット中に包装される。このキットは、評価
されるべき個々の耐性遺伝子について、それぞれに包装された増幅及び配列決定
プライマーの組み合わせを含む。従って、本発明のキットは、少なくとも４種の
プライマー（２種の増幅及び２種の配列決定プライマー）を含み、好ましくは複
数の耐性遺伝子のためのプライマーの組み合わせ、最も好ましくは１０種の耐性
遺伝子全てのためのプライマーの組み合わせを含む。
【０１０６】 臨床試料中のマイコバクテリウムツバキュロシスの評価におけるこれらのプラ
イマーの利用のための好適なプロトコールは、ＰＣＲ増幅及び引き続くサイクル
配列決定を使用する。試験において使用するためのＤＮＡは、喀痰（１００μｌ
〜１０ｍｌ）試料から得られる。喀痰試料は、標準感染疾患／公衆衛生研究所（
Standard Infectious Disease / Public Health Laboratory）実務（マイコバク
テリア学、卓上マニュアル、試験所サービス部門、１９９７年１２月、オンタリ
オ衛生局）に従って処理される。喀痰試料は均質化され、汚染除去され、濃縮さ
れる。マイコバクテリアＤＮＡは、標準的ＤＮＡ抽出方法又は商業的に入手可能
なキットを使用して、濃縮された細胞沈殿物（１００〜２００μｌ）の部分から
直接に調製される。
【０１０７】 ＤＮＡの増幅は、上述した増幅プライマーの組み合わせを使用して実施される
。ＰＣＲ試薬は、個々の反応について調製することができ、あるいは、複数の試
験、例えば、１０回のＰＣＲ反応に使用されうるマスター混合液として調製され
てもよい。試薬の例示的組み合わせは、下記表に要約される。
【０１０８】 ＰＣＲ混合物 １ＰＣＲ １０ＰＣＲ 最終濃度／ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡ (20ng/ul) 1.0ul 20ng (〜0.5fM) 10 X PCR緩衝液I 2.5ul 25.0ul 1X 2.5mM dNTP混合物(1:1:1:1) 2.5ul 25.0ul 250uM ＤＭＳＯ 1.3ul 13.0ul 5% Taq DNA ホ゜リメラーセ゛(1U) 0.2ul 2.0ul 1単位 分子級水 16.5ul 165.0 ul MTB 遺伝子フ゜ライマー(10uM) 1.0ul 10.0ul 10pmol/フ゜ライマー ＰＣＲ当たり全体積 25.0ul
【０１０９】 １０ＰＣＲと記された列に示されるようにマスター混合液が使用される場合に
は、該マスター混合液は、ゲノムＤＮＡ以外の全ての必要なＰＣＲ試薬を含む。
この例において、鉱油の覆いの添加及びサーモサイクラへの設置に先行して、１
．０μｌのゲノムＤＮＡを既に含む２４．０μｌのマスター混合液がＰＣＲチュ
ーブに加えられる。
【０１１０】 使用されるゲノムＤＮＡ調製物は、強くかつ再現性あるＰＣＲの為に十分な質
及び完全状態でなければならない。好適なＤＮＡ調製物は、Gentra PuregeneTM
ＤＮＡ単離キットを使用して得られ得る。キット成分は、血液、新鮮又は凍結組
織、古記録的材料及びパラフィン埋設組織からのゲノムＤＮＡの単離に適当であ
る。
【０１１１】 各フ゜ライマー対は、下記の条件下で単一遺伝子領域を増幅するために使用された。
【０１１２】 １．変性 ９４℃ ５分間 １サイクル ２．変性 ９４℃ ３０秒間 アニーリング ６０℃ ３０秒間 ３５サイクル 伸長 ７２℃ ６０秒間 ３．伸長 ７２℃ ５分間 １サイクル ４．維持 ６℃
【０１１３】 工程２のサイクルの間の温度変化は、好ましくは１℃／秒の速度の傾斜を持っ
て設定される。
【０１１４】 増幅後、２５．０μｌのＰＣＲからの２．０μｌが０．８％アガロースゲルに
より純度分析される。単一ＰＣＲ生成物バンドを示す試料は、直接に配列分析に
使用されうる。ＰＣＲ生成物の収率及び純度は、引き続くサイクル配列決定反応
において使用される量を決定する。配列純度の比較検証は、他の増幅生成物のそ
れぞれについて行われる。
【０１１５】 配列分析は、増幅生成物について行われる。基本的手順及び条件は、各領域に
ついて同一である。従って、発明はrpoB遺伝子を使用して例示される。
【０１１６】 rpoBの最初の配列分析のために、rpoB-5sプライマーが使用されなければなら
ない。確認的配列分析のために、rpoB-3sプライマーが使用されなければならな
い。配列決定される各テンプレートについて、ヌクレオチド停止混合物のそれぞ
れの３．０μｌを＜Ａ＞、＜Ｃ＞、＜Ｇ＞及び＜Ｔ＞の印を付けた４本の別個の
チューブに分別し、配列決定マスター混合液が調製されるまで氷上に保存する。
【０１１７】サイクル配列決定マスター混合液 rpoBテンプレート ２．０μｌ １０ｘＶＧＩSequenaceTM緩衝溶液 ２．５μｌ ＤＭＳＯ ３．５μｌ ２．５μＭ色素−配列決定プライマー ２．０μｌ ＰＣＲ級水 ９．０μｌ１：１０希釈サーモシーケナーゼ ０．５μｌ 全体積 ２２．０μｌ
【０１１８】 マイクロピペットを用いた反復するピペット操作（５回）により、ＤＭＳＯ及
び他の成分をマスター混合液中に十分に混合する。該マスター混合液を、ヌクレ
オチド停止混合物の添加が準備されるまで氷上に保存する。
【０１１９】 ５．０μｌのマスター混合液を、ヌクレオチド停止混合物を含む４種の印を付
けたチューブのそれぞれに添加する。
【０１２０】 ８．０μｌの軽量鉱油を、マスター混合液及びヌクレオチド停止混合物を含む
４種の印を付けたチューブのそれぞれに添加する。 サーモサイクラに乗せるまで、氷上に保存する。
【０１２１】 １．変性 ９４℃ ５分間 １ｘ ２．変性 ９４℃ ３０秒間 アニーリング ６０℃ ３０秒間 ３５ｘ 伸長 ７２℃ ６０秒間 ３．伸長 ７２℃ ５分間 １ｘ ４．維持 ６℃
【０１２２】 工程２のサイクルの間の温度変化は、好ましくは１℃／秒の速度の傾斜を持っ
て設定される。
【０１２３】 サイクル配列決定反応の最後に、配列決定反応を停止させるために６．０μｌ
のStop Loading Dyeを４本のチューブのそれぞれに添加する。配列決定試料は、
９５℃にて２分間加熱され、次いでCLIPPERTM配列決定装置上で２．０μｌ（全
体積１４μｌから）を負荷する前に氷上に置いた。配列決定反応物の残りは、引
き続く使用のために−２０℃にて保存されうる。
【０１２４】 CLIPPERTM配列決定装置は、OPENGENE自動ＤＮＡ配列決定システム・ユーザー
マニュアルに記述されるように設定される。CLIPPERTM配列決定装置の操作パラ
メータは、５４℃／１３００ボルト／０．５秒サンプリング／３５分間操作／５
０％レーザー出力である。負荷される試料は、例えばＣＹ５．０及びＣＹ５．５
シアニン色素標識により異なって標識された、標的遺伝子に対するフォワード及
びリバース配列決定反応生成物の各２μｌを含む。操作が一旦完了すれば、塩基
にて評価されたデータは、GENELIBRARIANTMのrpoB配列データベースに対する試
験配列の対比により分析される。この配列アラインメントは、標準対照配列に対
して試験配列を対比し、配列の不明確さの評価を可能とする。一旦編集されると
、試験配列がGENELIBRARIANTMを使用して抗生物質耐性関連変異に対してスクリ
ーニングされうる。
【０１２５】 複数型の抗生物質耐性変異についての試験が、図２に要約されるように階層的
アッセイを使用して行われうる。現在は、マイコバクテリウムツバキュロシス検
出のための分子生物学的方法は、ＡＦＢスメア−陽性喀痰試料に対してのみ行わ
れる。これらの方法は、マイコバクテリウムツバキュロシスの存在について確認
的試験としての役割を果たす。これらの分子生物学的方法に加え、マイコバクテ
リウムツバキュロシス検出の培養に基づく方法（Bac Tec液体培養、寒天プレー
ト及び傾斜培養）が、平衡して行われる。ＡＦＢスメア−陰性喀痰試料は、培養
に基づく検出方法によってのみ処理される（図２）。
【０１２６】 本発明においては、ＡＦＢスメア−陽性及びスメア−陰性喀痰試料の両者が、
培養に基づく、及び分子生物学的方法の両者を使用して処理されうる。ＡＦＢ染
色方法の限界が、その検出限界である。喀痰試料が、５０００個の細菌／μｌ未
満の濃度を有する場合には、ＡＦＢ染色は陰性であろう。これに加えて、喀痰試
料を調製するために使用する汚染除去方法は、通常、存在する１０〜２０％のマ
イコバクテリアを殺してしまう。このことは、ＡＦＢスメア−陰性試料の３分の
２が、マイコバクテリアを含む可能性があることを示唆している。実際上、ＡＦ
Ｂスメア−陽性試料の１０〜２０％が、マイコバクテリウムツバキュロシスにつ
いて培養−陽性である（オンタリオ公衆衛生研究所）。この水準のマイコバクテ
リアは、分子生物学的方法によって容易に検出され、従って本発明に取り込まれ
る。
【０１２７】 提案される階層は、マイコバクテリウムツバキュロシス（rpoB）を特異的に検
出する試験を取り込み、マイコバクテリウムツバキュロシス感染の処置のために
使用される“第一列目”の抗生物質に対する耐性に関連する遺伝子（rpoB、katG
、rpsL/s12、PR、embB、pncA）における変異を検出し、かつマイコバクテリウム
ツバキュロシスが存在しない場合にマイコバクテリアの別の種を検出する（図２
）。グループＩの分析は、グループII及びグループIIIの両者より前に行われる
。グループＩ分析は、リファンピン（rpoB）、イソニアジド（katG）、ストレプ
トマイシン（rpsL/s12）及びアジスロマイシン（23S）に対する抗生物質耐性状
況の情報を提供する。加えて、rpoB増幅は、マイコバクテリウムツバキュロシス
の存在を示し、rpoB増幅がない場合に23S配列は、臨床的に関連するマイコバク
テリアの種のほとんどの同定を許容する。グループII分析は、マイコバクテリウ
ムツバキュロシス感染の処置に使用される“第二列目”の抗生物質、即ちイソニ
アジド（PR）、エタンブトール（embB）、ピラジナミド（pncA）及びシプロフロ
キサシン（gyrA）における抗生物質耐性変異の情報を提供する。グループIIIは
、変異が、たまに見出される抗生物質耐性に関連する遺伝指標的を含む。このプ
ロトコールは、マイコバクテリウムツバキュロシス感染の処置に使用される抗生
物質、及び、従って関連する抗生物質変異のパターンの両者が、地理的に変化す
ることから、地域的な処置方法に従って試験される特定の遺伝指標的を許容する
。図２に示されるように、培養に基づく方法は、並行して実施される。分子生物
学的方法は、ＡＦＢスメア−陽性及びスメア−陰性喀痰試料の両者からのマイコ
バクテリウムツバキュロシスの同定を可能とし、更に現在の培養に基づく方法に
充分先行して、これらの試料の抗生物質耐性のプロフィールを提供する。この情
報は、マイコバクテリウムツバキュロシス感染に対する適切かつ有効な抗生物質
処置両方の開始に対して決定的である。
【０１２８】 実施例 抗生物質感受性マイコバクテリウムツバキュロシス単離物からのＤＮＡ試料の
貯留物は、オンタリオ、オタワのカナダ厚生局、ＬＣＤＣから得た。抗生物質耐
性マイコバクテリウムツバキュロシスにおいて変異を持つものとして知られる全
ての遺伝子標的について、野生型配列の証跡を作製した。
【０１２９】 ５種類の表現型ストレプトマイシン耐性マイコバクテリウムツバキュロシス単
離物からのＤＮＡ試料のパネルは、オンタリオ、トロントのオンタリオ衛生局、
公衆衛生研究所から入手した。これらのＤＮＡ試料は、上に列記した１０種の抗
生物質遺伝子標的の全てについて抗生物質耐性関連変異を試験した。ストレプト
マイシン耐性関連変異は、４種の単離物においてrpsL/s12遺伝子に検出された。
rpoB（リファンピン）、katG（イソニアジド）、PR（イソニアジド）embB（エタ
ンブトール）、pncA（ピラジナミド）及びgyrA（シプロフロキサシン）遺伝子に
おける並行する抗生物質耐性関連変異も同定され、これはマイコバクテリウムツ
バキュロシスの処置において使用される第一列の抗生物質についての全ての遺伝
子標的を試験することの重要性を強調した。結果の要約は、表１に示される。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】 以下の文献がここにおいて引用され、また許容される全てに国において、参考
として取り入れる。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マイコバクテリウムツバキュロシスに対する既知の試験
プロトコールを示す。
【図２】 図２は、本発明に従ってマイコバクテリウムツバキュロシスタイ
プを評価するための階層的アッセイスキームを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月１０日（２００１．１．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】 プローブに基づく試験は、マイコバクテリウムツバキュロシスにおけるリファ
ンピン（rifampin）耐性の決定のために当に存在するが（ライン プローブ アッ
セイ−Inno Tek）、これらのプローブは、rpoB遺伝子における抗生物質耐性関連
の変異の予めの知識に依存する。該プローブによりまかなわれる領域外の変異又
はプローブ混合物に含まれない新たな変異は、なおも耐性を与えうるものである
が、この製品を現在の形態で使用しても検出されないであろう。 抗微生物薬剤及び化学療法に関する境界科学会議の要約（Interscience Confe
rence on Antimicrobial Agents and Chemotherapy）Vol.34, p163 (1994)は、
マイコバクテリウムツバキュロシスであるとして以前に同定された単離物の種形
成について、hsp65の自動化ＤＮＡ配列分析の応用を記述している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】 の増幅を行うか、又は行わずに第二の配列決定手続を実 施して抗生物質耐性を誘導する変異の存在について更な る遺伝子の評価を実施する工程を含んでなる。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中に存在するマイコバクテリウムツバキュロシスの検出
    及び特徴付けの方法であって、 （ａ）マイコバクテリウムツバキュロシスを含むと思われる喀痰試料を得、 （ｂ）マイコバクテリウムツバキュロシスの存在を検出するために、試料につい
    て予めの増幅を行うか、又は行わずに第一の配列決定手続を実施し、存在する場
    合に、抗生物質耐性を誘導する変異の存在について、rpoB、katG、rpsL/s12及び
    23S遺伝子の評価を行い；及び （ｃ）工程（ｂ）においてマイコバクテリウムツバキュロシスが検出された場合
    に、試料について予めの増幅を行うか、又は行わずに第二の配列決定手続を実施
    して抗生物質耐性を誘導する変異の存在について更なる遺伝子の評価を実施する
    工程を含んでなる、試料中に存在するマイコバクテリウムツバキュロシスの検出
    及び特徴付けの方法。
  2. 【請求項２】 第二の配列決定手続が、抗生物質耐性変異について、PR、em
    bB、pncA及びgyrA遺伝子を評価する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程（ｂ）においてマイコバクテリウムツバキュロシスが検
    出された場合に、第三の配列決定手順を実施して抗生物質耐性変異の存在につい
    て16S/rrs及びmabA遺伝子の評価を実施する工程を更に含む、請求項３に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 rpoBについての第一の配列決定手順が、配列番号１及び２に
    示される増幅プライマーならびに配列番号３及び４に示される配列決定プライマ
    ーを使用して実施される請求項１〜３の何れかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 katGについての第一の配列決定手順が、配列番号６及び７に
    示される増幅プライマーならびに配列番号８及び９に示される配列決定プライマ
    ーを使用して実施される請求項１〜４の何れかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 rpsL/s12についての第一の配列決定手順が、配列番号２１及
    び２２に示される増幅プライマーならびに配列番号２３及び２４に示される配列
    決定プライマーを使用して実施される請求項１〜５の何れかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 23Sについての第二の配列決定手順が、配列番号４６及び４
    ７に示される増幅プライマーならびに配列番号４８及び４９に示される配列決定
    プライマーを使用して実施される請求項１〜６の何れかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 PRについての第二の配列決定手順が、配列番号１１及び１２
    に示される増幅プライマーならびに配列番号１３及び１４に示される配列決定プ
    ライマーを使用して実施される請求項１〜７の何れかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 pncAについての第二の配列決定手順が、配列番号３６及び３
    ７に示される増幅プライマーならびに配列番号３８及び３９に示される配列決定
    プライマーを使用して実施される請求項１〜８の何れかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 embBについての第二の配列決定手順が、配列番号３１及び
    ３２に示される増幅プライマーならびに配列番号３３及び３４に示される配列決
    定プライマーを使用して実施される請求項１〜９の何れかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 gyrAについての第二の配列決定手順が、配列番号４１及び
    ４２に示される増幅プライマーならびに配列番号４３及び４４に示される配列決
    定プライマーを使用して実施される請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 16S/rrsについての第三の配列決定手順が、配列番号２６
    及び２７に示される増幅プライマーならびに配列番号２８及び２９に示される配
    列決定プライマーを使用して実施される請求項２〜１１の何れかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 mabAについての第三の配列決定手順が、配列番号１６及び
    １７に示される増幅プライマーならびに配列番号１８及び１９に示される配列決
    定プライマーを使用して実施される請求項２〜１２の何れかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 マイコバクテリウムツバキュロシスのゲノム内の増幅及び
    配列決定領域用の、一対以上の増幅プライマー及び合致する一対以上の配列決定
    プライマーを含む、マイコバクテリウムツバキュロシス試料中の抗生物質耐性変
    異の評価用キットであって、該増幅及び配列決定プライマー対が、 （ａ）配列番号１及び２の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号３及
    び４の配列決定プライマー； （ｂ）配列番号６及び７の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号８及
    び９の配列決定プライマー； （ｃ）配列番号１１及び１２の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    １３及び１４の配列決定プライマー； （ｄ）配列番号１６及び１７の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    １８及び１９の配列決定プライマー； （ｅ）配列番号２１及び２２の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    ２３及び２４の配列決定プライマー； （ｆ）配列番号２６及び２７の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    ２８及び２９の配列決定プライマー； （ｇ）配列番号３１及び３２の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    ３３及び３４の配列決定プライマー； （ｈ）配列番号３６及び３７の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    ３８及び３９の配列決定プライマー； （ｉ）配列番号４１及び４２の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    ４３及び４４の配列決定プライマー；及び （ｊ）配列番号４６及び４７の増幅プライマーの組み合わせ、ならびに配列番号
    ４８及び４９の配列決定プライマー； から選択されることを特徴とする抗生物質耐性変異の評価用キット。
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