KR100419897B1

KR100419897B1 - 아이나 내성 결핵균 검사용 프로브

Info

Publication number: KR100419897B1
Application number: KR10-2000-0053990A
Authority: KR
Inventors: 박영길; 배길한; 김상재; 이혜영; 조상래
Original assignee: 김상재; 박영길; 배길한
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2004-03-03
Also published as: KR20020021250A

Abstract

본 발명은 1차적인 항결핵약제로 사용되는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균의 내성 또는 감수성 여부를 신속하면서도 정확하게 검사할 수 있는 프로브 (probe)에 관한 것으로, 서열 번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드, 및/또는 서열 번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브(probe)를 사용할 경우, INH에 대한 결핵균의 감수성 또는 내성 여부를 신속하면서도 정확하게 검사할 수 있으며, 균주의 오염이라든지 균주의 사멸로 인해 배양불능인 경우에도 결핵균의 DNA를 대상으로 내성 여부를 검사할 수 있고, 리팜핀(RMP) 내성 관련 유전자(rpoB gene)와 함께 사용할 경우, RMP과 INH의 감수성 여부를 2 일 이내에 알 수 있으므로, 신속한 처방전 결정 및 치료가 이루어질 수 있다.

Description

아이나 내성 결핵균 검사용 프로브{PROBES FOR DETECTION OF ISONIAZID RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS}

본 발명은 1차적인 항결핵약제로 사용되는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균의 내성 또는 감수성 여부를 신속하면서도 정확하게 검사할 수 있는 프로브 (probe)에 관한 것이다.

현재 항결핵약제로 사용되는 것에는 아이나(INH, Isoniazid), 리팜핀(RMP, Rifampin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 가나마이신(Kanamycin), p-아미노살리실산(PAS), 에탐부톨(Ethambutol), 그리고 피라진아미드(Pyrazinamide) 등이 있다.

INH는 결핵균에 내성이 나타나지 않는 한 가장 이상적인 약물이다. 리팜핀은 대사가 활발한 결핵균 뿐 아니라 대사가 활발하지 못한 결핵균을 죽이는 데에도 매우 강력한 약물이고, 스트렙마이신 역시 유효한 성질을 갖는다. PAS는 이들 두 약물보다 효과는 약하지만, 균에 내성을 지연시키는데 매우 유용하다.

1998년 발표에 따르면(The New England Journal of Medicine338: 1641-1649, 1998), 우리나라 결핵 환자 중 항결핵약제에 대한 내성은 12.9 %에서 나타나는데, 각 약제별로는 전체 환자 중 INH에 10.0 %, RMP에 4.0 %, 에탐부톨에 4.2 %, 그리고 스트렙토마이신에 3.5 %가 내성을 갖는다. INH 내성균이 가장 많은데, 특히 INH, RMP의 내성은 결핵약 처방에 있어 매우 중요한 변수가 된다.

이러한 점을 고려할 때, INH, RMP의 내성 여부를 조기에 알 수 있다면 적절한 처방으로 결핵 환자를 효과적으로 치료하여 환자의 건강을 조기에 회복시킬 수 있을 뿐 아니라, 주위 사람에 대한 전염도 조기에 차단시킬 수 있으므로 국민 건강에 크게 이바지 할 수 있을 것이다.

현재 항결핵약제에 대한 내성 여부는 결핵균을 항결핵약제에 접종 배양하는 방법으로 검사하고 있는데, 결핵균의 증식 속도가 타균에 비해 매우 느리기 때문에 그 결과를 알게 되기까지 보통 2 개월이 걸린다는 문제가 있다.

이와 같이 배양 기간이 길다는 문제를 해결하기 위하여 세계적인 기업 벡톤 딕킨슨(Becton Dickenson)사에서는, 결핵균 대사물질을 탐지하여 항결핵약제 내성 여부를 결정하는 MGIT 방법을 시도하였다. 그러나, 이 방법을 실시하기 위해서는 매우 고가의 배양 기계가 필요할 뿐 아니라, 역시 고가의 결핵균 배양액을 전량 수입해야 하며, 배양 기간도 약 1 주일 정도로 길다는 단점이 있다.

1995년 벨기에에서는 항결핵약제 내성에 관련된 유전자의 돌연변이를 이용하는 방법으로 "LiPA를 이용한 리팜핀 내성 검사법"이 개발되었다. 그러나 이 방법은 오직 RMP 검출에만 사용될 수 있을 뿐이며, 우리 나라에서는 전량 수입하여 사용하고 있는데 1 건당 들어가는 비용이 매우 높아서 환자 부담이 크다는 문제가 있다.

최근에는 DNA 칩(chip)을 이용한 항결핵약제 감수성법이 시도되고 있지만, DNA 칩 장비가 고가일 뿐 아니라, 결과에 대한 신뢰성이 부족하다는 단점이 있다. 더우기, 아직 모든 항결핵약제 내성 관련 유전자가 밝혀져 있지 않은 상태에서 DNA 칩과 같은 고가의 장비를 필요로 하는 방법은 유리한 점이 없다.

우리 나라에서는 항결핵약제 내성 중에 INH에 대한 것이 가장 높음에도 불구하고 이를 신속하게 진단하는 방법이 아직 개발되지 않았다.

현재까지 밝혀진 항결핵약제 내성 관련 유전자에 대해서는, RMP 내성이 rpoB 유전자 돌연변이와 95 % 이상 관련이 있으며, INH 내성이 katG 유전자 및 mabA 유전자와 75 % 정도 관련된다는 것이 밝혀져 있다. 그밖에 에탐부톨이나 스트렙토마이신 내성에 관련된 유전자도 있지만 관련성이 그리 높지가 않아 더욱 연구가 필요한 상태이다.

이상과 같은 종래의 항결핵약제에 대한 결핵균 내성 검사법의 문제점을 고려하여 본 발명에서는, 항결핵약제 중에서도 가장 내성이 높게 나타나는 아이나 (INH, Isoniazid)에 대한 결핵균의 내성 또는 감수성 여부를 신속하면서도 정확하게 검사할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 프로브를 가지고 환자에서 분리된 결핵균의 INH 내성 여부를 시험한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열 번호 1의 올리고뉴클레오티드, 및 이의 돌연변이형 올리고뉴클레오티드로서 특히 서열 번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브 (probe)를 제공한다.

또한 본 발명에서는 서열 번호 3의 올리고뉴클레오티드, 및 이의 돌연변이형 올리고뉴클레오티드로서 특히 서열 번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브(probe)를 제공한다.

본 발명에서는, 결핵균의 katG 유전자 및 mabA 유전자가 INH에 대한 내성 또는 감수성에 관련되며, 이들 katG 유전자 및 mabA 유전자 내에 돌연변이가 존재할 때 INH에 대한 내성이 나타난다는 연구 결과에 착안하여, 이들 유전자 내에서 일부 영역을 선택, 정상형(wild type) 및 돌연변이형의 올리고뉴클레오티드를 제작하여 INH 내성 검사용 프로브로 디자인하였다.

이들 프로브를 멤브레인(nylon membrane)에 부착하고, 결핵균 DNA에서 이들 프로브 영역을 포함하는 부분을 PCR로 증폭시킨 다음, 이 PCR 산물과 상기 프로브를 혼성화 반응(hybridization)시키게 되면, 그 결과에 따라 결핵균이 INH에 내성인지 감수성인지를 효과적으로 판단할 수 있다. 즉, katG 관련 정상형 프로브 및 mabA 관련 정상형 프로브와 혼성화 반응이 나타나면 INH 감수성이고, katG 관련 돌연변이형 프로브와 mabA 관련 돌연변이형 프로브 둘 중의 어느 하나라도 혼성화 반응이 나타나면 INH 내성으로 된다.

이하, 실시예에 따라 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: INH 내성 검사용 프로브 제작

결핵균의 게놈 염기서열(GenBank)을 근거로, 아이나 내성과 관련된 katG 유전자 및 mabA 유전자의 특정 부위를 선택하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 제작하고, 이에 대한 돌연변이형의 올리고뉴클레오티드 프로브를 제작하였다:

① katG 관련 프로브

KW(정상형): 5'- atc-acc-agc-ggc-atc-gag-gtc-3' (서열번호 1)

KM(돌연변이형): 5'- atc-acc-acc-ggc-atc-gag-gtc-3' (서열번호 2)

② mabA 관련 프로브

MW(정상형): 5'- cgg-cga-gac-gat-agg-ttg-tcg-ggg-3' (서열번호 3)

MM(돌연변이형): 5'- cgg-cga-gat-gat-agg-ttg-tcg-ggg-3' (서열번호 4)

이들 프로브 각각 10 ㎕ 씩을 10X SSC(1.5 M NaCl, 0.15 M 구연산나트륨, pH 7.0) 300 ㎕에 첨가한 후 나일론 멤브레인(nylon membrane)에 12 시간 동안 반응시켜 부착하였다.

실시예 2: INH 내성 여부 확인 시험

(1) 결핵균 유전자의 PCR

다음과 같은 방법으로 결핵균 DNA를 추출하였다: 1.5 ㎖ 스크류캡 튜브에 증류수 300 ㎕와 구경 0.1 ㎜ 글라스비드 50 ㎕를 넣고, 결핵균 1 루프(loop)를 이 튜브에 넣은 다음 80 ℃에서 30 분 동안 유지하여 결핵균을 사멸시켰다. 이어서 비드 비팅을 1 분 동안 실시하여 결핵균을 터트려 DNA가 증류수에 노출되도록 한 후 이중 5 ㎕를 PCR의 주형으로 사용하였다.

PCR용 프라이머는, 결핵균의 게놈 염기서열(GenBank)을 참고하여 위 프로브를 포함하는 DNA 절편을 얻을 수 있도록 다음과 같이 제작하였다:

① katG를 위한 PCR 프라이머쌍:

katF: 5'-cag-atg-ggc-ttg-ggc-tgg-aag-agc-3'

katR: 5'-gac-gac-gcc-gcc-gcc-ca-3' (5' 말단 비오틴 표지)

② mabA를 위한 PCR 프라이머쌍:

mabF: 5'-cgc-tgc-cca-gaa-agg-ga-3'

mabR: 5'-ccg-ggt-ttc-ctc-cgg-t-3' (5' 말단 비오틴 표지)

이들 프라이머쌍을 가지고 위에서 얻은 결핵균 DNA를 주형으로 하여 다음 방법에 따라 PCR을 실시하였다: 결핵균 DNA 5 ㎕를 PCR 반응 혼합액(Taq DNA 폴리머라제 2 U, KCl 10 mM, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 각 200 μM, MgCl₂2.5 mM, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 프라이머 각 1 μM)에 첨가하여 최종 50 ㎕가 되도록 혼합한 후, 95 ℃에서 7 분 동안 예비변성을 1 회 실시하고; 95 ℃에서 1 분, 60 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 2 분을 35 회 반복한 후; 95 ℃에서 1 분, 60 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 10 분 동안 1 회 실시하여 중합을 진행하였다.

(2) 프로브와의 혼성화 반응(hybridization)

위에서 얻은 PCR 산물을 혼성화 용액(5X SSC, 1 % blocking reagent, 0.1 % N-라우릴사르코신, 0.02 % SDS) 300 ㎕와 혼합하여 프로브와 2 시간 동안 반응시켜 혼성화시켰다.

반응액을 TBS(0.05 M 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5)로 10 분씩 3 회 세척한 후 스트렙타비딘-AP(streptavidin-AP conjugate, BM 제품, 5 ㎕/10 ㎖ TBS)로 1 시간 동안 반응시켰다.

다음에, 다시 TBS로 10 분씩 3 회 세척한 후 NBT/BCIP 기질 반응액(BM 제품, 20 ㎕/0.1 M 트리스, 0.05 M MgCl₂, 0.1 M NaCl, 10 ㎖)으로 반응시켜 발색시켰다. 다음과 같이 유전자의 내성 여부를 판단하였다:

KW와 MW 프로브 위에서 색이 나타나면 INH 감수성; 그리고

KM과 MM 프로브 위에서 색이 나타나면 INH 내성.

(3) 결과

도 1은 본 발명에 따른 프로브를 가지고 환자에서 분리된 결핵균의 INH 내성 여부를 시험한 결과이다. 여기에서, 번호 1∼14는 각각 다른 환자에서 분리된 결핵균이고, A, B, C 및 D는 각각 KW, KM, MW 및 MM 프로브로서,

A: KW 프로브에서 반응이 있는 것은 INH 감수성을 의미;

B: KM 프로브에서 반응이 있는 것은 INH 내성을 의미;

C: MW 프로브에서 반응이 있는 것은 INH 감수성을 의미; 그리고

D: MM 프로브에서 반응이 있는 것은 INH 내성을 의미한다.

따라서, A와 C 모두에서 혼성화가 일어난 경우는 INH 감수성균임을 의미하며, 번호 1, 5, 7, 8, 9 및 12의 경우가 이에 속한다. 그리고, B와 C 둘 중 하나에서라도 혼성화가 일어난 경우는 INH 내성균임을 의미하며, 번호 2, 3, 4, 6, 10, 11, 13 및 14의 경우가 이에 속한다.

다음 표 1은 결핵 환자 245 인에 대하여 결핵균의 INH 내성 여부를 시험한 결과이다.

	katG	mabA	katG + mabA
	내성	감수성	내성	감수성	내성	감수성
절대농도법	내성(220건)	134(60.9%)	86	38(17.2%)	182	162(73.6%)	58
절대농도법	감수성(25건)		25(100%)		25(100%)		25(100%)

(1) 이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브에 의하면, 1차적인 항결핵약제로 사용되는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균의 감수성 또는 내성 여부를 신속하면서도 정확하게 검사할 수 있다.

(2) 또한, 기존의 감수성 검사법에서는 검사가 어려웠던 경우, 즉 균주의 오염이라든지 균주의 사멸로 인해 배양불능인 경우에도 결핵균의 DNA를 대상으로 내성 여부를 검사할 수 있다.

(3) 도말검사에서 양성인 경우는 배양검사 과정 없이 바로 내성 여부를 알 수 있다.

(4) 수입품인 고가의 리팜핀 내성 검사 키트(Inno LiPA Rif TB kit)를 대체할 수 있으며, 보다 값싸게 우수한 결과를 얻을 수 있다.

(5) 리팜핀 내성 관련 유전자(rpoB gene)와 함께 사용할 경우, RMP과 INH의 감수성 여부를 2 일 이내에 알 수 있으므로, 신속한 처방전 결정 및 치료가 이루어질 수 있다.

(6) 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브는 DNA 칩의 프로브로도 사용할 수 있다.

Claims

서열 번호 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브.
서열 번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브.
서열 번호 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나(INH, Isoniazid)에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브.
서열 번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 아이나에 대한 결핵균 내성 검사용 프로브.