JPH05317098A - 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH05317098A JPH05317098A JP4184893A JP18489392A JPH05317098A JP H05317098 A JPH05317098 A JP H05317098A JP 4184893 A JP4184893 A JP 4184893A JP 18489392 A JP18489392 A JP 18489392A JP H05317098 A JPH05317098 A JP H05317098A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】黄色ブドウ球菌の特定遺伝子を検出することを
目的とする。 【構成】黄色ブドウ球菌の産生するent A,B,C,D,E 遺伝
子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（配列番号１〜３２）を作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす黄色ブドウ球菌のみを選択的に検出することを特
徴としている。
目的とする。 【構成】黄色ブドウ球菌の産生するent A,B,C,D,E 遺伝
子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（配列番号１〜３２）を作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす黄色ブドウ球菌のみを選択的に検出することを特
徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査での黄色ブドウ
球菌の検出に関するものである。
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査での黄色ブドウ
球菌の検出に関するものである。
【０００２】
【従来技術】食中毒にかかる検査では、検査材料は患者
の嘔吐物、糞便、患者が食した食品または患者の周辺環
境からの拭き取り材料の場合である。これらの材料から
黄色ブドウ球菌が検出・同定されるまでには、まず、増
菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行う
必要がある。
の嘔吐物、糞便、患者が食した食品または患者の周辺環
境からの拭き取り材料の場合である。これらの材料から
黄色ブドウ球菌が検出・同定されるまでには、まず、増
菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行う
必要がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、各培養
段階で要する時間は、１８〜２４時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると約４日間となり、非常に
長時間である。確認培養における生化学試験では、好気
的発育性、ＶＰ反応性、硝酸塩の還元性、Ｔｗｅｅｎ８
０の水解性、ヒアルロニダーゼ活性、糖分解性等の諸性
状を調べる必要があり、操作的にも煩雑で時間や費用も
かかる。
段階で要する時間は、１８〜２４時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると約４日間となり、非常に
長時間である。確認培養における生化学試験では、好気
的発育性、ＶＰ反応性、硝酸塩の還元性、Ｔｗｅｅｎ８
０の水解性、ヒアルロニダーゼ活性、糖分解性等の諸性
状を調べる必要があり、操作的にも煩雑で時間や費用も
かかる。
【０００４】また、黄色ブドウ球菌の場合、分離菌株の
エントテロトキシン産生性を試験することが食中毒、お
よび下痢症の最も確実な起病菌決定法であると見なされ
ているが、市販の簡便試薬キットを使用しても、結果を
得るまでに１８〜２０時間を要し、迅速性に欠ける。
エントテロトキシン産生性を試験することが食中毒、お
よび下痢症の最も確実な起病菌決定法であると見なされ
ているが、市販の簡便試薬キットを使用しても、結果を
得るまでに１８〜２０時間を要し、迅速性に欠ける。
【０００５】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
【０００６】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、黄色ブドウ球菌由来のent A,B,C,D,E 遺伝
子を検出するもので、簡便、迅速、かつ高感度な検査法
を食中毒検査、または下痢症検査に提供することにあ
る。
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、黄色ブドウ球菌由来のent A,B,C,D,E 遺伝
子を検出するもので、簡便、迅速、かつ高感度な検査法
を食中毒検査、または下痢症検査に提供することにあ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、黄色ブドウ球
菌のent A,B,C,D,E 遺伝子と選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす黄色ブドウ球菌のうちent A,B,C,D,E を産生する
黄色ブドウ球菌のみを選択的に検出することを特徴とし
ている。
菌のent A,B,C,D,E 遺伝子と選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を
起こす黄色ブドウ球菌のうちent A,B,C,D,E を産生する
黄色ブドウ球菌のみを選択的に検出することを特徴とし
ている。
【０００８】プライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ドは、ent A 遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標
的とする場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となる
ように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合
成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＧＴＣＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ａ） （５’）ｄ−ＣＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧ−（３’） ・・・・（ｂ） （５’）ｄ−ＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧ−（３’） ・・・・（ｃ） （５’）ｄ−ＣＴＴＡＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＣ−（３’） ・・・・（ｄ） （５’）ｄ−ＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧ−（３’） ・・・・（ｅ） （５’）ｄ−ＴＣＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧ−（３’） ・・・・（ｆ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
ドは、ent A 遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標
的とする場合は、そのヌクレオチド配列と相補的となる
ように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合
成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＧＴＣＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ａ） （５’）ｄ−ＣＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧ−（３’） ・・・・（ｂ） （５’）ｄ−ＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧ−（３’） ・・・・（ｃ） （５’）ｄ−ＣＴＴＡＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＣ−（３’） ・・・・（ｄ） （５’）ｄ−ＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧ−（３’） ・・・・（ｅ） （５’）ｄ−ＴＣＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧ−（３’） ・・・・（ｆ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００９】また、ent B 遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＡＣ−（３’） ・・・・（ｇ） （５’）ｄ−ＡＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧ−（３’） ・・・・（ｈ） （５’）ｄ−ＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧ−（３’） ・・・・（ｉ） （５’）ｄ−ＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｊ） （５’）ｄ−ＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴＡＧＧ−（３’） ・・・・（ｋ） （５’）ｄ−ＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−（３’） ・・・・（ｌ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＡＣ−（３’） ・・・・（ｇ） （５’）ｄ−ＡＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧ−（３’） ・・・・（ｈ） （５’）ｄ−ＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧ−（３’） ・・・・（ｉ） （５’）ｄ−ＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｊ） （５’）ｄ−ＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴＡＧＧ−（３’） ・・・・（ｋ） （５’）ｄ−ＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−（３’） ・・・・（ｌ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【００１０】更に、ent C 遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡ−（３’） ・・・・（ｍ） （５’）ｄ−ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｎ） （５’）ｄ−ＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＣ−（３’） ・・・・（ｏ） （５’）ｄ−ＧＴＡＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧ−（３’） ・・・・（ｐ） （５’）ｄ−ＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣ−（３’） ・・・・（ｑ） （５’）ｄ−ＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＧＴＴ−（３’） ・・・・（ｒ） または対応する相補的配列からなることを特徴とし、en
t D 遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とする
ときは、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化
学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレ
オチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＡＧＴＡＣＣＧ−（３’） ・・・・（ｓ） （５’）ｄ−ＡＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧ−（３’） ・・・・（ｔ） （５’）ｄ−ＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣ−（３’） ・・・・（ｕ） （５’）ｄ−ＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣ−（３’） ・・・・（ｖ） （５’）ｄ−ＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧＣＣ−（３’） ・・・・（ｗ） （５’）ｄ−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧ−（３’） ・・・・（ｘ） （５’）ｄ−ＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣ−（３’） ・・・・（ｙ） （５’）ｄ−ＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＴ−（３’） ・・・・（ｚ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
チド配列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡ−（３’） ・・・・（ｍ） （５’）ｄ−ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｎ） （５’）ｄ−ＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＣ−（３’） ・・・・（ｏ） （５’）ｄ−ＧＴＡＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧ−（３’） ・・・・（ｐ） （５’）ｄ−ＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣ−（３’） ・・・・（ｑ） （５’）ｄ−ＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＧＴＴ−（３’） ・・・・（ｒ） または対応する相補的配列からなることを特徴とし、en
t D 遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とする
ときは、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化
学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレ
オチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＡＧＴＡＣＣＧ−（３’） ・・・・（ｓ） （５’）ｄ−ＡＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧ−（３’） ・・・・（ｔ） （５’）ｄ−ＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣ−（３’） ・・・・（ｕ） （５’）ｄ−ＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣ−（３’） ・・・・（ｖ） （５’）ｄ−ＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧＣＣ−（３’） ・・・・（ｗ） （５’）ｄ−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧ−（３’） ・・・・（ｘ） （５’）ｄ−ＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣ−（３’） ・・・・（ｙ） （５’）ｄ−ＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＴ−（３’） ・・・・（ｚ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【００１１】ent E 遺伝子をコードするヌクレオチド配
列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と相補的
となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧ−（３’） ・・・・（イ） （５’）ｄ−ＧＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡ−（３’） ・・・・（ロ） （５’）ｄ−ＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴ−（３’） ・・・・（ハ） （５’）ｄ−ＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡ−（３’） ・・・・（ニ） （５’）ｄ−ＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧ−（３’） ・・・・（ホ） （５’）ｄ−ＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＣＧＴＧ−（３’） ・・・・（ヘ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
列を標的とするときは、そのヌクレオチド配列と相補的
となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧ−（３’） ・・・・（イ） （５’）ｄ−ＧＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡ−（３’） ・・・・（ロ） （５’）ｄ−ＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴ−（３’） ・・・・（ハ） （５’）ｄ−ＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡ−（３’） ・・・・（ニ） （５’）ｄ−ＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧ−（３’） ・・・・（ホ） （５’）ｄ−ＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＣＧＴＧ−（３’） ・・・・（ヘ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【００１２】ここで、遺伝子増幅は、Saiki らが開発し
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は黄色ブドウ球菌のent A,B,C,D,E 遺伝子）を検出
する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖
をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするような
オリゴヌクレオチドを用意する。それを熱変性により１
本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチ
ド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本
鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさ
せる。この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマ
ーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大し
てくる。
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は黄色ブドウ球菌のent A,B,C,D,E 遺伝子）を検出
する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖
をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするような
オリゴヌクレオチドを用意する。それを熱変性により１
本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチ
ド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本
鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさ
せる。この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマ
ーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大し
てくる。
【００１３】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
【００１４】本発明でプライマーとして用いられる上記
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ている黄色ブドウ球菌のent A,B,C,D,E 遺伝子のヌクレ
オチド配列における増幅領域は、５０塩基から２, ００
０塩基、望ましくは１００塩基から１, ０００塩基とな
ればよい。
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の
長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天
然のどちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用
として標識されていなくてもよい。プライマーが規定し
ている黄色ブドウ球菌のent A,B,C,D,E 遺伝子のヌクレ
オチド配列における増幅領域は、５０塩基から２, ００
０塩基、望ましくは１００塩基から１, ０００塩基とな
ればよい。
【００１５】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
る黄色ブドウ球菌のent A,B,C,D,E 遺伝子を増幅させ
る。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
る黄色ブドウ球菌のent A,B,C,D,E 遺伝子を増幅させ
る。
【００１６】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。
【００１７】その結果から、検体中にプライマーが認識
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままent A,B,C,D,E
遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌の有無を判定するものとな
る。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他の
電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままent A,B,C,D,E
遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌の有無を判定するものとな
る。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他の
電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。
【００１８】また、上記の（ａ）〜（ヘ）の配列の１つ
を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして機能さ
せ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオチド配
列を選択的に検出してもよい。この場合、オリゴヌクレ
オチドは標識物で修飾するのが好ましい。
を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして機能さ
せ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオチド配
列を選択的に検出してもよい。この場合、オリゴヌクレ
オチドは標識物で修飾するのが好ましい。
【００１９】
【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄
色ブドウ球菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄
色ブドウ球菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
【００２０】
［実施例１：黄色ブドウ球菌のent A 遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 黄色ブドウ球菌は表１〜６の縦の見出しに示した総計１
５７株を用いた。これらの菌株は、食中毒事例株で、食
中毒患者の下痢便、嘔吐物、原因食品等から分離された
ものである。各菌株をブレインハートインフュージョン
培地（ＢＢＬ社製）に接種し、３７℃の好気的条件下で
終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリ
スー塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で希釈
し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、これらを
遠心し、その上清を検体とした。
５７株を用いた。これらの菌株は、食中毒事例株で、食
中毒患者の下痢便、嘔吐物、原因食品等から分離された
ものである。各菌株をブレインハートインフュージョン
培地（ＢＢＬ社製）に接種し、３７℃の好気的条件下で
終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリ
スー塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で希釈
し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、これらを
遠心し、その上清を検体とした。
【００２１】プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のent A 遺伝子の塩基配列（Betley,M.
J.and Mekalanos, J.J.,J.Bacteriol.170,34-41(198
8)）から、請求項第１項に示した配列 (a)から(f)を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮＡ合成装置
（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、βーシア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
J.and Mekalanos, J.J.,J.Bacteriol.170,34-41(198
8)）から、請求項第１項に示した配列 (a)から(f)を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮＡ合成装置
（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、βーシア
ノエチルフォスホアミダイト法により行った。合成した
オリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
【００２２】ＰＣＲ 前記検体液３μl を用い、それに滅菌蒸留水１６．０５
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
【００２３】各使用した溶液の内容、およびプライマー
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
各水溶液（濃度5 OD/ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に
示した組合せで使用した。
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3,
15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
各水溶液（濃度5 OD/ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に
示した組合せで使用した。
【００２４】 プライマー(1) プライマー(1) （ａ） （ｅ） （ａ） （ｆ） （ｂ） （ｄ） （ｂ） （ｅ） （ｂ） （ｆ） （ｃ） （ｄ） （ｃ） （ｅ） （ｃ） （ｆ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
【００２５】反応条件は、次のとおりである。 熱変性: ９４℃、１分 アニーリング: ５５℃、１分 重合反応: ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
【００２６】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２７】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μｌ/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第２版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
し、臭化エチジウム（0.5 μｌ/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Manatis 等著 Molecular C
loning 第２版(1989)に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
【００２８】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination;RPLA 試験） 市販の黄色ブドウ球菌エンテロトキシン検出用ＲＰＬＡ
キット（ＳＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研製）を購
入し、付属の使用説明書に従い検体を調製して、試験を
行った。
sive Latex Agglutination;RPLA 試験） 市販の黄色ブドウ球菌エンテロトキシン検出用ＲＰＬＡ
キット（ＳＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研製）を購
入し、付属の使用説明書に従い検体を調製して、試験を
行った。
【００２９】ただし、試験に供する検体については、エ
ンテロトキシンの産生を十分に行わせるために、一部条
件を変更して調製した。すなわち、使用説明書中では
『ブレインハートインフュージョン培地等で、３７℃、
１８〜２０時間振とう培養』のところを、本実施例で
は、ＢＢＬ社製のブレインハートインフュージョン培地
を使用し、３７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とうさ
せながら培養した。この培養上清をＲＰＬＡ試験に供し
た。
ンテロトキシンの産生を十分に行わせるために、一部条
件を変更して調製した。すなわち、使用説明書中では
『ブレインハートインフュージョン培地等で、３７℃、
１８〜２０時間振とう培養』のところを、本実施例で
は、ＢＢＬ社製のブレインハートインフュージョン培地
を使用し、３７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とうさ
せながら培養した。この培養上清をＲＰＬＡ試験に供し
た。
【００３０】結果 前述したように、黄色ブドウ球菌のent A 遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００３１】それによるとプライマー(a) と(e) の組合
せを用いた場合には、５１３塩基（または５１３塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
せを用いた場合には、５１３塩基（または５１３塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
【００３２】次に、本発明のプライマーの全組合せにつ
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
【００３３】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー（１） （ａ） （ｂ） （ｃ） （ｄ） − ２７４ ２３６ プライマー（２） （ｅ） ５１３ ３９０ ３５２ （ｆ） ５４６ ４２３ ３８５ 各数字の単位は塩基を示す。
【００３４】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーはent A 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
の長さが一致した場合、各プライマーはent A 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
【００３５】表１〜６に黄色ブドウ球菌１５７株で調べ
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＡを産
生していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子
を増幅した。すなわちent A遺伝子を正しく増幅し、ent
A 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出している
ことを示している。
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＡを産
生していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子
を増幅した。すなわちent A遺伝子を正しく増幅し、ent
A 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出している
ことを示している。
【００３６】なお、表に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
についても同様の試験結果が得られた。
【００３７】（実験例２）実験例１で得られた結果がen
t A 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、臨床検査において検査対象
となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒菌または下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
か調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示
したものと同じである。
t A 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、臨床検査において検査対象
となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒菌または下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
か調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示
したものと同じである。
【００３８】検体の調製 表中の各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種し、３７
℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を行った
（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表中のClos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides flagilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。
℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を行った
（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表中のClos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides flagilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。
【００３９】各菌株培養液０. ５ｍｌから遠心操作によ
り、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７. ５に溶解した
Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ
／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間処理し、溶
菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
り、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７. ５に溶解した
Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ
／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間処理し、溶
菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
【００４０】遠心後、上層液を回収し、エタノール処理
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
【００４１】結果 表７に示すように、使用したプライマーは食中毒菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡの全てについて、それら
のＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発
明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーはent A
遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。また、表７に掲載されなかった残り
の各組合せについても同様な試験結果が得られた。
Ａをはじめとする種々のＤＮＡの全てについて、それら
のＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発
明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーはent A
遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。また、表７に掲載されなかった残り
の各組合せについても同様な試験結果が得られた。
【００４２】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
【００４３】さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ent A 遺伝子の選択的検出における信頼
度は、さらに高まるものと考えられる ［実施例２：黄色ブドウ球菌ent B 遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ent A 遺伝子の選択的検出における信頼
度は、さらに高まるものと考えられる ［実施例２：黄色ブドウ球菌ent B 遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００４４】プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のent B 遺伝子の塩基配列（Ranelli,D.
M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,5850-5854 (19
85)）から、請求項第２項に示した配列（ｇ）から
（ｌ）までを選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成および合成したオリゴ
ヌクレオチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,5850-5854 (19
85)）から、請求項第２項に示した配列（ｇ）から
（ｌ）までを選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレ
オチドを化学合成した。化学合成および合成したオリゴ
ヌクレオチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００４５】ＰＣＲ プライマーとして下記の組合わせのものを使用した以外
は、実施例１と同様の手法で行った。
は、実施例１と同様の手法で行った。
【００４６】 プライマー(1) プライマー(2) （ｇ） （ｊ） （ｇ） （ｋ） （ｈ） （ｊ） （ｈ） （ｋ） （ｈ） （ｌ） （ｉ） （ｋ） （ｉ） （ｌ） 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００４７】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
【００４８】結果 前述したように、黄色ブドウ球菌のent B 遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００４９】それによるとプライマー(g) と(j) の組合
せを用いた場合には、３０４塩基（または３０４塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
せを用いた場合には、３０４塩基（または３０４塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
【００５０】次に、本発明のプライマーの全組合せにつ
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
【００５１】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー（１） （ｇ） （ｈ） （ｉ） （ｊ） ３０４ ２４１ − プライマー（２） （ｈ） ３９１ ３２８ １９７ （ｌ） − ４１９ ２８８ 各数字の単位は塩基を示す。
【００５２】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーはent B 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
の長さが一致した場合、各プライマーはent B 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
【００５３】表１〜６に黄色ブドウ球菌１５７株で調べ
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＢ産生
していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子を
増幅した。すなわち ent B遺伝子を正しく増幅し、ent
B 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出している
ことを示している。
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＢ産生
していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子を
増幅した。すなわち ent B遺伝子を正しく増幅し、ent
B 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出している
ことを示している。
【００５４】なお、表に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
についても同様の試験結果が得られた。
【００５５】（実験例２）実験例１で得られた結果がen
t B 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で臨
床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒
菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマ
ーが反応するかどうか調べた。
t B 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で臨
床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒
菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマ
ーが反応するかどうか調べた。
【００５６】表７に示すように、使用したプライマーは
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent B 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択
的に反応するものと断言できる。また、表に掲載されな
かった残りの各組合せについても同様な試験結果が得ら
れた。
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent B 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択
的に反応するものと断言できる。また、表に掲載されな
かった残りの各組合せについても同様な試験結果が得ら
れた。
【００５７】［実施例３：黄色ブドウ球菌ent C 遺伝子
の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００５８】プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のent C 遺伝子の塩基配列（Betley,M.
J.and Mekalanos, J.J.,J.Bacteriol.170,34-41(198
8)）から、請求項第３項に示した配列（ｍ）から（ｒ）
までを選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
J.and Mekalanos, J.J.,J.Bacteriol.170,34-41(198
8)）から、請求項第３項に示した配列（ｍ）から（ｒ）
までを選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００５９】ＰＣＲ プライマーとして下記の組合わせのものを使用した以外
は、実施例１と同様の手法で行った。
は、実施例１と同様の手法で行った。
【００６０】 プライマー(1) プライマー(2) （ｍ） （ｑ） （ｍ） （ｒ） （ｎ） （ｑ） （ｎ） （ｒ） （ｏ） （ｑ） （ｏ） （ｒ） （ｐ） （ｑ） （ｐ） （ｒ） 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００６１】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
【００６２】結果 前述したように、黄色ブドウ球菌のent C 遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００６３】それによるとプライマー(m) と(q) の組合
せを用いた場合には、２８２塩基（または２８２塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
せを用いた場合には、２８２塩基（または２８２塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
【００６４】次に、本発明のプライマーの全組合せにつ
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
【００６５】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー（１） （ｍ） （ｎ） （ｏ） （ｐ） プライマー（２） （ｑ） ２８２ ２７４ ２３６ ９９ （ｒ） ４７８ ４２０ ３４２ ２９５ 各数字の単位は塩基を示す。
【００６６】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーはent C 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
の長さが一致した場合、各プライマーはent C 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
【００６７】表１〜６に黄色ブドウ球菌１５７株で調べ
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＣ産生
していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子を
増幅した。すなわちent C 遺伝子を正しく増幅し、ent
C 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出しているこ
とを示している。
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＣ産生
していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子を
増幅した。すなわちent C 遺伝子を正しく増幅し、ent
C 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出しているこ
とを示している。
【００６８】なお、表に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
についても同様の試験結果が得られた。
【００６９】（実験例２）実験例１で得られた結果がen
t C 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で臨
床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒
菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマ
ーが反応するかどうか調べた。
t C 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で臨
床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒
菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマ
ーが反応するかどうか調べた。
【００７０】表７に示すように、使用したプライマーは
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent C 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択
的に反応するものと断言できる。また、表に掲載されな
かった残りの各組合せについても同様な試験結果が得ら
れた。
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent C 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択
的に反応するものと断言できる。また、表に掲載されな
かった残りの各組合せについても同様な試験結果が得ら
れた。
【００７１】［実施例４：黄色ブドウ球菌ent D 遺伝子
の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
の検出］ （実験例１）検体の調製 実施例１と同様の手法で検体を調整した。
【００７２】プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のent D 遺伝子の塩基配列（Betley,M.
J.and Mekalanos, J.J.,J.Bacteriol.170,34-41(198
8)）から、請求項第４項に示した配列（ｓ）から（ｚ）
までを選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
J.and Mekalanos, J.J.,J.Bacteriol.170,34-41(198
8)）から、請求項第４項に示した配列（ｓ）から（ｚ）
までを選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成および合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００７３】ＰＣＲ プライマーとして下記の組合わせのものを使用した以外
は、実施例１と同様の手法で行った。
は、実施例１と同様の手法で行った。
【００７４】 プライマー(1) プライマー(2) （ｓ） （ｗ） （ｓ） （ｙ） （ｓ） （ｚ） （ｔ） （ｗ） （ｔ） （ｘ） （ｔ） （ｚ） （ｕ） （ｘ） （ｕ） （ｙ） （ｖ） （ｙ） （ｖ） （ｚ） 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００７５】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
【００７６】結果 前述したように、黄色ブドウ球菌のent D 遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させる
ヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００７７】それによるとプライマー(s) と(w) の組合
せを用いた場合には、２１１塩基（または２１１塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
せを用いた場合には、２１１塩基（または２１１塩基
対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
【００７８】次に、本発明のプライマーの全組合せにつ
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
いて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記
載した。
【００７９】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー（１） （ｓ） （ｔ） （ｕ） （ｖ） （ｗ） ２１１ １４２ − − （ｘ） − ２２６ １２５ − プライマー（２） （ｙ） ４７４ ４０５ ３０４ １９９ （ｚ） ５０１ ４３２ − ２２６ 各数字の単位は塩基を示す。
【００８０】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーはent D 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
の長さが一致した場合、各プライマーはent D 遺伝子の
標的としている領域を正しく増幅していると判断し、表
１〜６中に”＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの増
幅がみられなかったものには”−”を記入した。
【００８１】表１〜６に黄色ブドウ球菌１５７株で調べ
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＤ産生
していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子を
増幅した。すなわちent D 遺伝子を正しく増幅し、ent
D 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出しているこ
とを示している。
た結果を示す。表からわかるように、表中のプライマー
全ての組合せは、ＲＰＬＡ法でエンテロトキシンＤ産生
していると確認された菌株に限ってのみ、その遺伝子を
増幅した。すなわちent D 遺伝子を正しく増幅し、ent
D 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出しているこ
とを示している。
【００８２】なお、表に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
についても同様の試験結果が得られた。
【００８３】（実験例２）実験例１で得られた結果がen
t D 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で臨
床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒
菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマ
ーが反応するかどうか調べた。
t D 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手法で臨
床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒
菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマ
ーが反応するかどうか調べた。
【００８４】表７に示すように、使用したプライマーは
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent D 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択
的に反応するものと断言できる。また、表に掲載されな
かった残りの各組合せについても同様な試験結果が得ら
れた。
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent D 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択
的に反応するものと断言できる。また、表に掲載されな
かった残りの各組合せについても同様な試験結果が得ら
れた。
【００８５】［実施例５：黄色ブドウ球菌ent E(see)
遺伝子の検出］検体の調製 黄色ブドウ球菌は表８に示す１７株を用いた。これらの
菌株は、食中毒事例株で、食中毒患者の下痢便、嘔吐
物、原因食品等から分離されたものである。これらの菌
株のエンテロトキシン産生能については、逆受身ラテッ
クス凝集反応で確認した。ただし、ＦＲＩ−３２６株に
ついては、American Type Culture Collectionの資料に
基づいた。なお、検体の調整は実施例１と同様の手法で
行った。
遺伝子の検出］検体の調製 黄色ブドウ球菌は表８に示す１７株を用いた。これらの
菌株は、食中毒事例株で、食中毒患者の下痢便、嘔吐
物、原因食品等から分離されたものである。これらの菌
株のエンテロトキシン産生能については、逆受身ラテッ
クス凝集反応で確認した。ただし、ＦＲＩ−３２６株に
ついては、American Type Culture Collectionの資料に
基づいた。なお、検体の調整は実施例１と同様の手法で
行った。
【００８６】プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のent E(see)遺伝子の塩基配列（Couch,
J.L.et al.,J.Bacteriol.170,2954-2960(1988)）から、
請求項第５項に示した配列（イ）から（ヘ）までを選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成および合成したオリゴヌクレオチドの
精製は実施例１と同様の方法で行った。
J.L.et al.,J.Bacteriol.170,2954-2960(1988)）から、
請求項第５項に示した配列（イ）から（ヘ）までを選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成および合成したオリゴヌクレオチドの
精製は実施例１と同様の方法で行った。
【００８７】ＰＣＲ プライマーとして下記の組合わせのものを使用した以外
は、実施例１と同様の手法で行った。
は、実施例１と同様の手法で行った。
【００８８】 プライマー(1) プライマー(2) （イ） （ニ） （イ） （ヘ） （ロ） （ハ） （ロ） （ホ） 検出 実施例１と同様の手法で行った。
【００８９】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
sive Latex Agglutination;RPLA試験） 実施例１と同様の手法で行った。
【００９０】結果 前述したように、黄色ブドウ球菌のent E(see)遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅
させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅
させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。
【００９１】それによるとプライマー（イ）と（ニ）の
組合せを用いた場合には、４８１塩基（または４８１塩
基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。次に、本発明のプライマーの全組合せについて、増
幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記載した。
組合せを用いた場合には、４８１塩基（または４８１塩
基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。次に、本発明のプライマーの全組合せについて、増
幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまとめて記載した。
【００９２】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー（１） （ａ） （ｂ） （ハ） − ２９２ （ニ） ４８１ − プライマー（２） （ホ） − ３７３ （ヘ） ５５７ − 各数字の単位は塩基を示す。
【００９３】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、各プライマーはent E(see) 遺
伝子の標的としている領域を正しく増幅していると判断
し、表８中に“＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの
増幅がみられなかったものには“−”を記入した。
の長さが一致した場合、各プライマーはent E(see) 遺
伝子の標的としている領域を正しく増幅していると判断
し、表８中に“＋”と記入した。一方、ヌクレオチドの
増幅がみられなかったものには“−”を記入した。
【００９４】表８に黄色ブドウ球菌１７株で調べた結果
を示す。表からわかるように、表中のプライマー全ての
組合せは、ＦＲＩ−３２６株の遺伝子のみを増幅した。
すなわちent E(see) 遺伝子を正しく増幅し、ent E 遺
伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出していることを
示している。
を示す。表からわかるように、表中のプライマー全ての
組合せは、ＦＲＩ−３２６株の遺伝子のみを増幅した。
すなわちent E(see) 遺伝子を正しく増幅し、ent E 遺
伝子をもつ黄色ブドウ球菌を正確に検出していることを
示している。
【００９５】ent E(see) 遺伝子配列と相補的な配列の
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、サザンブロット
ハイブリダイゼーション試験を行ったところ、この増幅
ＤＮＡは、ent E(see) 遺伝子由来であると確認でき
た。なお、図１（ａ）はプライマの組合せ（イ）＋
（ヘ）でＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動像（な
お、検体ＤＮＡとしてＦＲＩ−３２６株のＤＮＡを用い
た）、図１（ｂ）はサザンハイブリダイゼ−ション像を
示す。
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、サザンブロット
ハイブリダイゼーション試験を行ったところ、この増幅
ＤＮＡは、ent E(see) 遺伝子由来であると確認でき
た。なお、図１（ａ）はプライマの組合せ（イ）＋
（ヘ）でＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動像（な
お、検体ＤＮＡとしてＦＲＩ−３２６株のＤＮＡを用い
た）、図１（ｂ）はサザンハイブリダイゼ−ション像を
示す。
【００９６】（実験例２）実験例１で得られた結果がen
t E(see) 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択
的なものかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手
法で臨床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の
食中毒菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプ
ライマーが反応するかどうか調べた。
t E(see) 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択
的なものかどうかを確かめるため、実施例１と同様の手
法で臨床検査において対象となる黄色ブドウ球菌以外の
食中毒菌または下痢症菌等の遺伝子について本発明のプ
ライマーが反応するかどうか調べた。
【００９７】表９に示すように、使用したプライマーは
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent E(see) 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にの
み、選択的に反応するものと断言できる。
食中毒菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡの全てにつ
いて、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。した
がって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライ
マーはent E(see) 遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にの
み、選択的に反応するものと断言できる。
【００９８】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
ースゲル電気泳動を前述の条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、ま
た、１００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであ
れば、１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
【００９９】さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ent E(see) 遺伝子の選択的検出におけ
る信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ent E(see) 遺伝子の選択的検出におけ
る信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
【０１００】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【０１０１】
【効果】本発明ではＰＣＲ法を用いたことで、黄色ブド
ウ球菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
ウ球菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
【０１０２】また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
【０１０３】また、検出にアガロースゲル電気泳動と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
【０１０４】最近の細菌学の知見では、食中毒事件や、
下痢症の原因菌として黄色ブドウ球菌が検出された場
合、その黄色ブドウ球菌株がエンテロトキシン等の該当
する病原因子の産生能の有無、さらに場合によっては、
その菌株が産生する病原因子の型を調べなければ、原因
菌として正確に判定されたものとは認められなくなりつ
つある。したがって、本発明は黄色ブドウ球菌の病原因
子遺伝子の１つであるエンテロトキシン遺伝子を検出す
るものであるので、食中毒事件、および下痢症等の起病
菌としての黄色ブドウ球菌の検出を正確に行うことがで
きる。
下痢症の原因菌として黄色ブドウ球菌が検出された場
合、その黄色ブドウ球菌株がエンテロトキシン等の該当
する病原因子の産生能の有無、さらに場合によっては、
その菌株が産生する病原因子の型を調べなければ、原因
菌として正確に判定されたものとは認められなくなりつ
つある。したがって、本発明は黄色ブドウ球菌の病原因
子遺伝子の１つであるエンテロトキシン遺伝子を検出す
るものであるので、食中毒事件、および下痢症等の起病
菌としての黄色ブドウ球菌の検出を正確に行うことがで
きる。
【０１０５】
【配列表】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＴＣＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧ
【０１０６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧ
【０１０７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２４塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧ
【０１０８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＴＡＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＣ
【０１０９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧ
【０１１０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧ
【０１１１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２４塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＡＣ
【０１１２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧ
【０１１３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；９ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧ
【０１１４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１０ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧＡＡＣＡＧ
【０１１５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴＡＧＧ
【０１１６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１２ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
【０１１７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１３ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡ
【０１１８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１４ 配列の長さ ２４塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧ
【０１１９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１５ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＣ
【０１２０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１６ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＴＡＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧ
【０１２１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１７ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣ
【０１２２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１８ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＧＴＴ
【０１２３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１９ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＡＧＴＡＣＣＧ
【０１２４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２０ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧ
【０１２５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２１ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣ
【０１２６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２２ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣ
【０１２７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２３ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧＣＣ
【０１２８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２４ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧ
【０１２９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２５ 配列の長さ ２５塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣ
【０１３０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２６ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＴ
【０１３１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２７ 配列の長さ ２４塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧ
【０１３２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２８ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡ
【０１３３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２９ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴ
【０１３４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３０ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡ
【０１３５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧ
【０１３６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３２ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＣＧＴＧ
【図１】（ａ）はアガロース電気泳動図、（ｂ）はサザ
ンハイブリダイゼーション像を示す。
ンハイブリダイゼーション像を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 尾崎 博子 京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会 社島津製作所三条工場内 (72)発明者 西村 直行 京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会 社島津製作所三条工場内
Claims (6)
- 【請求項１】 検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）の産生するエンテロトキシンＡの
遺伝子（以下、ent A 遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＧＴＣＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ａ；配列番号１） （５’）ｄ−ＣＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧ−（３’） ・・・・（ｂ；配列番号２） （５’）ｄ−ＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧ−（３’） ・・・・（ｃ；配列番号３） （５’）ｄ−ＣＴＴＡＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＣ−（３’） ・・・・（ｄ；配列番号４） （５’）ｄ−ＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＴＣＴＧ−（３’） ・・・・（ｅ；配列番号５） （５’）ｄ−ＴＣＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧ−（３’） ・・・・（ｆ；配列番号６） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）の産生するエンテロトキシンＢの
遺伝子（以下、ent B 遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＡＣ−（３’） ・・・・（ｇ；配列番号７） （５’）ｄ−ＡＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧ−（３’） ・・・・（ｈ；配列番号８） （５’）ｄ−ＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧ−（３’） ・・・・（ｉ；配列番号９） （５’）ｄ−ＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｊ；配列番号10） （５’）ｄ−ＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＴＡＧＧ−（３’） ・・・・（ｋ；配列番号11） （５’）ｄ−ＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−（３’） ・・・・（ｌ；配列番号12） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）の産生するエンテロトキシンＣの
遺伝子（以下、ent C 遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡ−（３’） ・・・・（ｍ；配列番号13） （５’）ｄ−ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧ−（３’） ・・・・（ｎ；配列番号14） （５’）ｄ−ＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＣ−（３’） ・・・・（ｏ；配列番号15） （５’）ｄ−ＧＴＡＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧ−（３’） ・・・・（ｐ；配列番号16） （５’）ｄ−ＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣ−（３’） ・・・・（ｑ；配列番号17） （５’）ｄ−ＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＣＣＧＴＴ−（３’） ・・・・（ｒ；配列番号18） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）の産生するエンテロトキシンＤの
遺伝子（以下、ent D 遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＡＧＴＡＣＣＧ−（３’） ・・・・（ｓ；配列番号19） （５’）ｄ−ＡＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧ−（３’） ・・・・（ｔ；配列番号20） （５’）ｄ−ＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣ−（３’） ・・・・（ｕ；配列番号21） （５’）ｄ−ＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣ−（３’） ・・・・（ｖ；配列番号22） （５’）ｄ−ＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧＣＣ−（３’） ・・・・（ｗ；配列番号23） （５’）ｄ−ＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧ−（３’） ・・・・（ｘ；配列番号24） （５’）ｄ−ＡＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣ−（３’） ・・・・（ｙ; 配列番号25） （５’）ｄ−ＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＴ−（３’） ・・・・（ｚ；配列番号26） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）の産生するエンテロトキシンＥの
遺伝子（以下、ent E 遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧ−（３’） ・・・・（イ；配列番号27） （５’）ｄ−ＧＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡ−（３’） ・・・・（ロ；配列番号28） （５’）ｄ−ＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴ−（３’） ・・・・（ハ；配列番号29） （５’）ｄ−ＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡ−（３’） ・・・・（ニ；配列番号30） （５’）ｄ−ＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧ−（３’） ・・・・（ホ；配列番号31） （５’）ｄ−ＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＣＧＴＧ−（３’） ・・・・（ヘ；配列番号32） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 請求項１〜５項に記載された各オリゴヌ
クレオチドの配列のうち、少なくとも１つを有するオリ
ゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能さ
せ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることを
特徴とする方法であって、 （a ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 （b ）得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる同
時の鎖長反応の鋳型として機能し、 （c ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
とにより、特定のヌクレオチド配列が増幅され、増幅さ
れたヌクレオチド断片を検出し、 （d ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することで黄色ブドウ球菌の検
出を行うことを特徴とする黄色ブドウ球菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4184893A JPH07102159B2 (ja) | 1992-03-24 | 1992-07-13 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-66082 | 1992-03-24 | ||
| JP6608292 | 1992-03-24 | ||
| JP4184893A JPH07102159B2 (ja) | 1992-03-24 | 1992-07-13 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317098A true JPH05317098A (ja) | 1993-12-03 |
| JPH07102159B2 JPH07102159B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=13305579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4184893A Expired - Fee Related JPH07102159B2 (ja) | 1992-03-24 | 1992-07-13 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07102159B2 (ja) |
-
1992
- 1992-07-13 JP JP4184893A patent/JPH07102159B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07102159B2 (ja) | 1995-11-08 |
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