JP2775663B2 - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
- Publication number
- JP2775663B2 JP2775663B2 JP5143181A JP14318193A JP2775663B2 JP 2775663 B2 JP2775663 B2 JP 2775663B2 JP 5143181 A JP5143181 A JP 5143181A JP 14318193 A JP14318193 A JP 14318193A JP 2775663 B2 JP2775663 B2 JP 2775663B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- nucleotide sequence
- seq
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒検査もしくは下痢症検査におけるＥＨＥＣまたはＶ
ＴＥＣ、およびＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子の検出に関
するものである。
中毒検査もしくは下痢症検査におけるＥＨＥＣまたはＶ
ＴＥＣ、およびＶＴ１遺伝子、ＶＴ２遺伝子の検出に関
するものである。
【０００２】
【従来技術】ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣは、出血性大腸炎
に代表される食中毒症状のみでなく、小児の溶血性尿毒
症症候群（hemolytic uremic syndrome ）の原因菌とも
なることが認められ、近年、臨床検査では、本菌の検出
が重要視されつつある。
に代表される食中毒症状のみでなく、小児の溶血性尿毒
症症候群（hemolytic uremic syndrome ）の原因菌とも
なることが認められ、近年、臨床検査では、本菌の検出
が重要視されつつある。
【０００３】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）にかかる検査では、
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体からＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行う必要がある。
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体からＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行う必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの培
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると３〜４日となり、非常に長時間
である。ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の血清型としては、現
在、Ｏ１５７：Ｈ７が代表的であるが、この血清型同定
に必要な診断用抗血清はまだ市販されておらず、自家調
製しなければならない。さらにＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に
おいては、血清型と起病性とは必ずしも一致するもので
はないので、血清型による同定だけでは起因菌としての
判定に困難が生じる場合が多い。したがって、現在のＥ
ＨＥＣ（ＶＴＥＣ）検査法では、迅速性および簡便性に
欠け、実効的でない。
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると３〜４日となり、非常に長時間
である。ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の血清型としては、現
在、Ｏ１５７：Ｈ７が代表的であるが、この血清型同定
に必要な診断用抗血清はまだ市販されておらず、自家調
製しなければならない。さらにＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に
おいては、血清型と起病性とは必ずしも一致するもので
はないので、血清型による同定だけでは起因菌としての
判定に困難が生じる場合が多い。したがって、現在のＥ
ＨＥＣ（ＶＴＥＣ）検査法では、迅速性および簡便性に
欠け、実効的でない。
【０００５】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺
伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ食中毒・下
痢症にかかる検査における、簡便、迅速、かつ高感度な
ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査法を提供することを目的と
する。
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺
伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ食中毒・下
痢症にかかる検査における、簡便、迅速、かつ高感度な
ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査法を提供することを目的と
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＥＨＥＣ（Ｖ
ＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺伝子と選択的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌク
レオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用いて、本菌
の病原因子の一つであるＶＴ１、ＶＴ２を産生する菌の
みを選択的に検出することを特徴としている。
ＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺伝子と選択的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌク
レオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用いて、本菌
の病原因子の一つであるＶＴ１、ＶＴ２を産生する菌の
みを選択的に検出することを特徴としている。
【０００７】ここで用いるプライマーは、ＶＴ１遺伝子
を検出するときは、以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・（ｂ：配列番号２） または対応する相補的配列からなるものを使用し、ＶＴ
２遺伝子およびその変異型遺伝子（ＶＴ２ｖｈａ，ＶＴ
２ｖｈｂ，およびＶＴ２ｖｐ１）を検出するときは、以
下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−（３’） ・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−（３’） ・・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなるものを使用し、ＶＴ
１遺伝子およびＶＴ２遺伝子、ＶＴ２ｖｈａ，ＶＴ２ｖ
ｈｂ，ＶＴ２ｖｐ１を検出するときは以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＧＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＣ−（３’） ・・・（ｅ：配列番号５） （５’）ｄ−ＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＣ−（３’） ・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−（３’） ・・・（ｇ：配列番号７） または対応する相補的配列からなるものを使用する。
を検出するときは、以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・（ｂ：配列番号２） または対応する相補的配列からなるものを使用し、ＶＴ
２遺伝子およびその変異型遺伝子（ＶＴ２ｖｈａ，ＶＴ
２ｖｈｂ，およびＶＴ２ｖｐ１）を検出するときは、以
下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−（３’） ・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−（３’） ・・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなるものを使用し、ＶＴ
１遺伝子およびＶＴ２遺伝子、ＶＴ２ｖｈａ，ＶＴ２ｖ
ｈｂ，ＶＴ２ｖｐ１を検出するときは以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＧＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＣ−（３’） ・・・（ｅ：配列番号５） （５’）ｄ−ＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＣ−（３’） ・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−（３’） ・・・（ｇ：配列番号７） または対応する相補的配列からなるものを使用する。
【０００８】遺伝子増幅は、Saiki らが開発したPolyme
rase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略する；Sc
ience 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。この方
法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのＶＴ１、ＶＴ２遺伝子）
を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方
は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションする
ようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性によ
り１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレ
オチド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した
２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起
こさせる。この一連の操作を繰り返すことで、２つのプ
ライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が
増大してくる。
rase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略する；Sc
ience 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。この方
法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのＶＴ１、ＶＴ２遺伝子）
を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方
は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションする
ようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性によ
り１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレ
オチド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した
２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起
こさせる。この一連の操作を繰り返すことで、２つのプ
ライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が
増大してくる。
【０００９】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。 しかし、プライマー
がハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上
存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製でき
る。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。 しかし、プライマー
がハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上
存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製でき
る。
【００１０】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺伝子のヌク
レオチド配列における増幅領域は、５０塩基から２, ０
００塩基、望ましくは、１００塩基から１, ０００塩基
となればよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺伝子のヌク
レオチド配列における増幅領域は、５０塩基から２, ０
００塩基、望ましくは、１００塩基から１, ０００塩基
となればよい。
【００１１】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。検出はＰＣＲを終えた反応液を
そのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅
されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確認
できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべき
配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定
することができる。この判定は、そのままＶＴ１遺伝子
またはＶＴ２をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）菌の有無を判
定するものとなる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。検出はＰＣＲを終えた反応液を
そのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅
されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確認
できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべき
配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定
することができる。この判定は、そのままＶＴ１遺伝子
またはＶＴ２をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）菌の有無を判
定するものとなる。
【００１２】増幅されたヌクレオチド断片の検出には、
その他の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効であ
る。また、上記の配列の１つを有するオリゴヌクレオチ
ドをプローブとして機能させ、膜上、あるいはその他支
持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出する方法
でも良い。
その他の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効であ
る。また、上記の配列の１つを有するオリゴヌクレオチ
ドをプローブとして機能させ、膜上、あるいはその他支
持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出する方法
でも良い。
【００１３】
【作用】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１、ＶＴ２遺伝子
と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作
製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝
子増幅に用いて、本菌の病原因子の一つであるＶＴ１、
ＶＴ２を産生する菌のみを選択的に検出する
と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作
製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝
子増幅に用いて、本菌の病原因子の一つであるＶＴ１、
ＶＴ２を産生する菌のみを選択的に検出する
【００１４】
［実施例１：ＶＴ１遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調製 使用したＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）は、患者等から由来した
もので、総計３２０株を用いた。各菌株をＬＢ培地（１
％トリプトン、０. ５％イーストエクストラクト、およ
び１％塩化ナトリウム）に接種し、３７℃、好気的条件
下で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で
１０倍に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った
後、これらを遠心し、その上清を検体とした。
もので、総計３２０株を用いた。各菌株をＬＢ培地（１
％トリプトン、０. ５％イーストエクストラクト、およ
び１％塩化ナトリウム）に接種し、３７℃、好気的条件
下で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で
１０倍に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った
後、これらを遠心し、その上清を検体とした。
【００１５】プライマーの合成 ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子の塩基配列（Taka
o, T et al.,Microb.Pathog.,5:357-369(1988) ）か
ら、請求項１に示した各配列を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、
サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオ
リサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミ
ダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの
精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで行った。
o, T et al.,Microb.Pathog.,5:357-369(1988) ）か
ら、請求項１に示した各配列を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、
サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオ
リサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミ
ダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの
精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで行った。
【００１６】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７．０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．０μｌ、プライマー(2) １．
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．０μｌ、プライマー(2) １．
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１７】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml）。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml）。
【００１８】プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製
品を下表のとおりに組合せて使用した。
品を下表のとおりに組合せて使用した。
【００１９】 プライマー(1) プライマー(2) (a) (b) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus 社製） 反応条件
は、次のとおりである。 熱変性：９４℃、１分。
（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus 社製） 反応条件
は、次のとおりである。 熱変性：９４℃、１分。
【００２０】アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００２１】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２２】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
し、臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
【００２３】コロニーハイブリダイゼーション試験 ＶＴ１遺伝子、またはＶＴ２遺伝子にそれぞれ特異的な
オリゴクレオチドプローブを用いて、Grunstein の方法
（Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961 (1975) ）にしたがって行った。
オリゴクレオチドプローブを用いて、Grunstein の方法
（Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961 (1975) ）にしたがって行った。
【００２４】結果 前述したようにＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(a) と(b) の組合せでは、３４９
塩基（または３４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(a) と(b) の組合せでは、３４９
塩基（または３４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
【００２５】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、Ｖ
Ｔ１遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株はＶＴ１遺伝子を有していると判断
した。被験菌株３２０株で調べた結果を表１に示す。各
プライマーの組合せは、コロニーハイブリダイゼーショ
ン試験で、ＶＴ１遺伝子陽性と判断された菌株ＤＮＡの
みを増幅し、ＶＴ１遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反
応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子を正しく増幅
し、ＶＴ１遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を正確に
検出していることを示している。
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、Ｖ
Ｔ１遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株はＶＴ１遺伝子を有していると判断
した。被験菌株３２０株で調べた結果を表１に示す。各
プライマーの組合せは、コロニーハイブリダイゼーショ
ン試験で、ＶＴ１遺伝子陽性と判断された菌株ＤＮＡの
みを増幅し、ＶＴ１遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反
応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子を正しく増幅
し、ＶＴ１遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を正確に
検出していることを示している。
【００２６】
【表１】 （実験例２）実験例１で得られた結果がＶＴ１遺伝子を
もつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対して、選択的なものかど
うかを確かめるため、臨床検査において検査対象とな
る、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）以外の下痢症菌等の遺伝子に
ついて本発明のプライマーが反応するかどうかを調べ
た。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示したも
のと同じである。
もつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対して、選択的なものかど
うかを確かめるため、臨床検査において検査対象とな
る、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）以外の下痢症菌等の遺伝子に
ついて本発明のプライマーが反応するかどうかを調べ
た。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示したも
のと同じである。
【００２７】検体の調製 表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。
【００２８】この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。
【００２９】結果 表２に一部のプライマーの組合せにおける試験結果を示
す。表中のプライマーの全ての組合せは、一部の赤痢菌
（Shigella dysenteriae type I ）のＤＮＡを除いて、
下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、
それらのＤＮＡを増幅することはなかった。
す。表中のプライマーの全ての組合せは、一部の赤痢菌
（Shigella dysenteriae type I ）のＤＮＡを除いて、
下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、
それらのＤＮＡを増幅することはなかった。
【００３０】また、Shigella dysenteriae type I がＶ
Ｔ１遺伝子を有しており、ＶＴ１遺伝子の有無のみで
は、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）とShigella dysenteriae typ
e I との鑑別が不可能なことは、学界で周知である。し
たがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプラ
イマーは、ＶＴ１遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反
応するものと断言できる。
Ｔ１遺伝子を有しており、ＶＴ１遺伝子の有無のみで
は、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）とShigella dysenteriae typ
e I との鑑別が不可能なことは、学界で周知である。し
たがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプラ
イマーは、ＶＴ１遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反
応するものと断言できる。
【００３１】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル
材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向
上させることができ、ＶＴ１遺伝子の選択的検出におけ
る信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル
材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向
上させることができ、ＶＴ１遺伝子の選択的検出におけ
る信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
【００３２】
【表２】 ［実施例２：ＶＴ２遺伝子の検出］ （実験例１）検体の調整 実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００３３】プライマーの合成 ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ２遺伝子の塩基配列（Jack
son, M. P. et al., FEMS Microbio. Lett., 44:109-11
4(1987) ）から、請求項第２項に示した各配列を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
た。合成の手法は、実施例１の実験例１と同様の手法で
行った。
son, M. P. et al., FEMS Microbio. Lett., 44:109-11
4(1987) ）から、請求項第２項に示した各配列を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
た。合成の手法は、実施例１の実験例１と同様の手法で
行った。
【００３４】ＰＣＲ プライマーの組み合わせとして、下記のものを用いた以
外実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
外実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００３５】 プライマー(1) プライマー(2) (c) (d) 検出およびコロニーハイブリダイゼーション試験 実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００３６】結果 前述したようにＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ２遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(c) と(d) の組合せでは、４０４
塩基（または４０４塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(c) と(d) の組合せでは、４０４
塩基（または４０４塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
【００３７】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、Ｖ
Ｔ２遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株はＶＴ２遺伝子を有していると判断
した。被検菌株３２０株で調べた結果を表３に示す。各
プライマーの組合せは、コロニーハイブリダイゼーショ
ン試験で、ＶＴ２遺伝子陽性と判断された菌株ＤＮＡの
みを増幅し、ＶＴ２遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反
応しなかった。すなわち、ＶＴ２遺伝子を正しく増幅
し、ＶＴ２遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を正確に
検出していることを示している。
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、Ｖ
Ｔ２遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株はＶＴ２遺伝子を有していると判断
した。被検菌株３２０株で調べた結果を表３に示す。各
プライマーの組合せは、コロニーハイブリダイゼーショ
ン試験で、ＶＴ２遺伝子陽性と判断された菌株ＤＮＡの
みを増幅し、ＶＴ２遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反
応しなかった。すなわち、ＶＴ２遺伝子を正しく増幅
し、ＶＴ２遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を正確に
検出していることを示している。
【００３８】
【表３】 （実験例２）実験例１で得られた結果がＶＴ２遺伝子を
もつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対して、選択的なものかど
うかを実施例１の実験例２の方法で確かめた。
もつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対して、選択的なものかど
うかを実施例１の実験例２の方法で確かめた。
【００３９】表２に一部のプライマーの組合せにおける
試験結果を示す。表中のプライマーの全ての組合せは、
下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、
それらのＤＮＡを増幅することはなかった。したがっ
て、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマー
は、ＶＴ２遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。
試験結果を示す。表中のプライマーの全ての組合せは、
下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、
それらのＤＮＡを増幅することはなかった。したがっ
て、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマー
は、ＶＴ２遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。
【００４０】［実施例３：ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺
伝子の検出］ （実験例１）検体の調整 実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
伝子の検出］ （実験例１）検体の調整 実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００４１】プライマーの合成 前述した公知のＶＴ１，ＶＴ２遺伝子の塩基配列から、
請求項第３項に示した各配列を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。合成の手法
は、実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
請求項第３項に示した各配列を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。合成の手法
は、実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００４２】ＰＣＲ プライマーの組み合わせとして、下記のものを用いた以
外実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
外実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００４３】 プライマー(1) プライマー(2) (e) (g) (f) (g) 検出およびコロニーハイブリダイゼーション試験 実施例１の実験例１と同様の手法で行った。
【００４４】結果 ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝子は、すでに塩基配列が
決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオチド
の大きさは容易に推定できる。それによるとプライマー
(e) と(g) の組合せでは、４９５塩基（または４９５塩
基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオチド
の大きさは容易に推定できる。それによるとプライマー
(e) と(g) の組合せでは、４９５塩基（または４９５塩
基対）の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずであ
る。
【００４５】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、Ｖ
Ｔ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子中の標的としている領域
を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はＶＴ１遺伝子
またはＶＴ２遺伝子、もしくはその両方の遺伝子を有し
ていると判断した。被験菌株３２０株で調べた結果を表
４に示す。各プライマーの組合せは、コロニーハイブリ
ダイゼーション試験で、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝
子陽性と判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ＶＴ１遺
伝子陰性およびＶＴ２遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く
反応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２
遺伝子を正しく増幅し、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝
子、もしくはその両方の遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）を正確に検出していることを示している。
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、Ｖ
Ｔ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子中の標的としている領域
を正しく増幅しており、かつ、当該菌株はＶＴ１遺伝子
またはＶＴ２遺伝子、もしくはその両方の遺伝子を有し
ていると判断した。被験菌株３２０株で調べた結果を表
４に示す。各プライマーの組合せは、コロニーハイブリ
ダイゼーション試験で、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝
子陽性と判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ＶＴ１遺
伝子陰性およびＶＴ２遺伝子陰性の菌株ＤＮＡとは全く
反応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２
遺伝子を正しく増幅し、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝
子、もしくはその両方の遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）を正確に検出していることを示している。
【００４６】
【表４】 （実験例２）実験例１で得られた結果がＶＴ１遺伝子ま
たはＶＴ２遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対し
て、選択的なものかどうかを実施例１の実験例２の方法
で確かめた。
たはＶＴ２遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対し
て、選択的なものかどうかを実施例１の実験例２の方法
で確かめた。
【００４７】表２に一部のプライマーの組合せにおける
試験結果を示す。表中のプライマーの全ての組合せは、
一部の赤痢菌（Shigella dysenteriae type I ）のＤＮ
Ａを除いて下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡ
について、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。
Shigella dysenteriae type I がＶＴ１遺伝子を有して
おり、ＶＴ１遺伝子の有無のみでは、ＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）とShigella dysen teriae type I との鑑別が不可能
なことは、学界で周知である。したがって、本発明のオ
リゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、ＶＴ１遺伝
子またはＶＴ２遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応
するものと断言できる。
試験結果を示す。表中のプライマーの全ての組合せは、
一部の赤痢菌（Shigella dysenteriae type I ）のＤＮ
Ａを除いて下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡ
について、それらのＤＮＡを増幅することはなかった。
Shigella dysenteriae type I がＶＴ１遺伝子を有して
おり、ＶＴ１遺伝子の有無のみでは、ＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）とShigella dysen teriae type I との鑑別が不可能
なことは、学界で周知である。したがって、本発明のオ
リゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、ＶＴ１遺伝
子またはＶＴ２遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応
するものと断言できる。
【００４８】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の病原因子の一つであるＶＴ
１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を標的とするプライマーを
用いたことにより、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を
有する菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検
出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプライマー
で反応が規定されることによる高い選択性とが得られ
る。
よびＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の病原因子の一つであるＶＴ
１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を標的とするプライマーを
用いたことにより、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を
有する菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検
出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプライマー
で反応が規定されることによる高い選択性とが得られ
る。
【００４９】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
【００５０】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査には、発見患
者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞の
ない正確な結果が要求される。また、本発明は、ＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）の１病原因子であるＶＴ１遺伝子または
ＶＴ２遺伝子を選択的に検出するものである。したがっ
て、本発明により、起因菌としてのＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）の検出を正確に行うことが可能となる。
者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞の
ない正確な結果が要求される。また、本発明は、ＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）の１病原因子であるＶＴ１遺伝子または
ＶＴ２遺伝子を選択的に検出するものである。したがっ
て、本発明により、起因菌としてのＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）の検出を正確に行うことが可能となる。
【００５１】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡ
Ｇ
Ｇ
【００５２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ
【００５３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧ
ＧＴ
ＧＴ
【００５４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴ
ＣＴＧ
ＣＴＧ
【００５５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴ
ＣＧＡＣ
ＣＧＡＣ
【００５６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＣＣ
ＡＣ
ＡＣ
【００５７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡ
Ａ
Ａ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−297489（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−297488（ＪＰ，Ａ) 加藤勝久編 「バイオテクノロジー実 験操作入門」 （1991−４−10） 講談 社 Ｐ．84 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/09 C12Q 1/68 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 検体中に存在する腸管出血性大腸菌（ｅ
ｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ、以下、ＥＨＥＣ）またはベロ毒素産
生性大腸菌（Ｖｅｒｏｃｙｔｏｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕ
ｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下、
ＶＴＥＣ）の産生するベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の
遺伝子（以下、ＶＴ１遺伝子）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・・（ｂ：配列番号２） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣの産生するベロ
毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以下、ＶＴ２遺伝
子）、およびその変異型遺伝子（ＶＴ２ｖｈａ，ＶＴ２
ｖｈｂ，およびＶＴ２ｖｐ１）をコードするヌクレオチ
ド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、
合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−（３’） ・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−（３’） ・・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣの産生するベロ
毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子（以下、ＶＴ１遺伝
子）およびベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以
下、ＶＴ２遺伝子）とその変異型遺伝子（ＶＴ２ｖｈ
ａ，ＶＴ２ｖｈｂ，およびＶＴ２ｖｐ１）をコードする
ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＡＧＴＴＴＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＣ−（３’） ・・・（ｅ：配列番号５） （５’）ｄ−ＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡＣ−（３’） ・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−（３’） ・・・（ｇ：配列番号７） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項４】請求項１〜３項に記載された配列のうち、
少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応
のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を
選択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖
に分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる
鎖長反応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによるハイブリダイゼー
ションを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列
が増幅され、増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでＥＨＥＣまたはＶＴ
ＥＣの検出を行うことを含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5143181A JP2775663B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5143181A JP2775663B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078280A JPH078280A (ja) | 1995-01-13 |
| JP2775663B2 true JP2775663B2 (ja) | 1998-07-16 |
Family
ID=15332775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5143181A Expired - Lifetime JP2775663B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2775663B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399B1 (en) * | 1994-02-28 | 2003-10-01 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| FR2760749B1 (fr) * | 1997-03-14 | 1999-04-30 | Veterinaires Et Alimentaires C | Oligonucleotides derives des genes vts de bacteries e. coli productrices de verotoxines, et leurs utilisations |
| JPH11332599A (ja) * | 1998-05-29 | 1999-12-07 | Shimadzu Corp | 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| JP2001314187A (ja) * | 2000-03-02 | 2001-11-13 | Hitachi Chem Co Ltd | ベロ毒素遺伝子の検出方法 |
| JP4501443B2 (ja) * | 2004-02-03 | 2010-07-14 | 東ソー株式会社 | 腸管出血性大腸菌の志賀毒素群遺伝子の検出試薬 |
| JP6446907B2 (ja) * | 2014-08-20 | 2019-01-09 | 東洋紡株式会社 | 食中毒原因菌を分離検出する方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04197489A (ja) * | 1990-11-29 | 1992-07-17 | Fuji Photo Film Co Ltd | 被酸化性物質含有廃液の処理方法 |
-
1993
- 1993-06-15 JP JP5143181A patent/JP2775663B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 加藤勝久編 「バイオテクノロジー実験操作入門」 （１９９１−４−１０） 講談社 Ｐ．８４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH078280A (ja) | 1995-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1036846A2 (en) | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process | |
| EP0556504B1 (en) | Oligonucleotides for detecting Vibrio parahaemolyticus | |
| JP2792462B2 (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2775663B2 (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| US6165724A (en) | Oligonucleotides for detecting enteric hemorrhagic E.coli and detection method using the same | |
| JP3414261B2 (ja) | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2001095576A (ja) | 腸管出血性大腸菌の検出法 | |
| JP3134907B2 (ja) | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3141976B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3331977B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2885081B2 (ja) | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH119281A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3419299B2 (ja) | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH04293486A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2993314B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH03112498A (ja) | カンピロバクター検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 | |
| JPH11332598A (ja) | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07114720B2 (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05317098A (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05227999A (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07236500A (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0349697A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0789958B2 (ja) | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH03112497A (ja) | 病原大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0789960B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080501 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090501 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100501 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100501 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110501 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110501 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120501 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130501 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130501 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140501 Year of fee payment: 16 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |