JPH0349697A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野]
本発明は臨床検査、殊に食中毒にががる検査、あるいは
、食品検査での腸炎ビブリオ菌( Vibrlopar
ahaemolyticus )の検出に関すものであ
る.〔従来の技術と問題点] 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取りN
料の場合、脳炎ビプリオ菌と同定するまでには、増菌培
養、分離培養を経て鑑別培養に至る操作を行わなければ
ならない.各培養段階に要する時間は,増菌培養で10
〜16時間、分離培養でl8〜24時間、鑑別培養で1
8〜24時間かかり、総所要時間にすると2〜4日間と
なり,長時間を要する.鑑別培養における試験では、N
aCt加寒天培地での発育試験,ダラム染色、オキシダ
ーゼ試験等を行う必要があり、操作的にも煩雑で、時間
や費用もがかる.=iた、腸炎ビブリオ菌が産生ずる耐
熱性溶血毒の検出法として、抗毒素血清より得た特異免
疫グロブリンを用いた逆受身赤血球凝集反応があるが、
結果を得るまでに20〜24時間を要する.一方、最近
では、オリゴヌクレオチドを用いたDNA1ローブ法あ
るいはハイブリダイゼーション法が試みられるようにな
ってきた.しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾した
プローブにより膜上、あるいは他の支持体上でパイプリ
ダイゼイションを行い、これを検出する場合、細菌検査
において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい. [発明の目的〕 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により腸炎ビブリ
オ菌由来のtdh遺伝子を検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供するこ
とにある. [問題点を解決するための手段および作用]本発明は、
腸炎ビブリオ菌のtdh3jl伝子と選択的にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、腸炎
ビブリオ菌を選択的に検出することを特徴としている.
遺伝子増幅は、S&ikiらが、開発したPoly++
erase Chain Reaction法(以下、
略してPCR法; Science.230.135
0(1985))をもとに行っている.この方法は、あ
る特定のヌクレオチド配列領域(本発明の場合は腸炎ビ
ブリオ菌のtdh遺伝子〉を検出する場合、その領域の
両端の一方は十鎖を他方は一鎖をそれぞれ認識してハイ
プリダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用
意し、それを熱変性により1本鎖状態にした試f4核酸
に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーと
して機能させ、生戒した2本M核酸を再び1本鎖に分離
し、再び、同様な反応を起こさせる.この一連の操作を
繰り返すことで2つのプライマーにはさまれた領域は検
出できるまでにコピー数が増大してくる.検体としては
、臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジ
ェネートなど、また、食品材料でもよい.これら材料を
PCHの試料として用いるには、材料中に存在する菌体
から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要とな
る.しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が
数分子から数史 十分子以上存在すればPCRは進ので、検査材料を溶菌
酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけで
PCRを進行させるに十分な核酸量を持った試利液が調
製できる.本発明でプライマーとして用いられるオリゴ
ヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から考
えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さを
持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然のど
ちらでもよい.また、プライマーは、特に検出用として
標識されていなくてもよい.プライマーが規定している
腸炎ビブリオ菌のtdh遺伝子のヌクレオチド配列にお
ける増I!領域は、50塩基から2,000塩基、望ま
しくは、100@基から1. 000塩基となればよ
い.鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DN
Aポリメラーゼを用いているが、この酵素の起源につい
ては90〜95℃の温度で活性を保持していれば、どの
生物種由来でもよい.pA変性温度は、9 0=9 5
℃、プライマーをパイプリダイズさせるアニーリング操
作の温度は37〜65℃、重合反応は50〜75℃で、
これを1サイクルとしたPCRを20から42サイクル
行って増幅させる.検出は酵素反応液をそのまま、アガ
ロースゲル電気泳動におけることで増幅されたヌクレオ
チド断片の存在、およびその長さが砿認できる.その結
果から、検体中に、プライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる.この判定は、そのまt腸炎ビブリオ菌の有無を
判定するものとなる.増幅されたヌクレオチド断片の検
出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効
である. 〔実施例〕 (実施例1) 炙坐△盟玉 腸炎ビブリオ菌は表1の縦の見出しに示した5株を用い
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気的
条件下で終夜培養を行い、その培地、 1.5mlから
遠心操作により菌体を回収した,10mM}リスー塩酸
#Il衝液( p H 7. 5 )で1回洗浄後、
同M衝液にリゾチームをlmg/m+となるように溶か
した液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で溶菌
させた.溶菌液に前記y1衝液で飽和させたフェノール
を同容量加え、よく攬はんした.遠心後、上層液を回収
し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ、
その沈澱物を前記′MI衝液、lmlに溶かして、これ
を検体と9した. − マー A 腸炎ビブリオ菌のtdhll伝子の塩基配列( Nis
i−buchi, M. and Kaper, J.
B. ;J. Bacteriol. 162, 5
58−564 (1985) )から、特許請求範囲第
2項に示した配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した.化学合成は島津DNA合
成機NS−1を用い、トリエステル法により行った.合
成したオリゴヌクレオチド断片の精製はC18逆相カラ
ムを用いて行った. L呈上 前記検体液を3μ1を用いそれに滅菌蒸留水16.05
μ!、10×反応用バッファ−3μ!、dNTP溶液4
.8μ1、プライマー(a).1. 5μl、プライ
マー(bH.5μ1そして耐熟性DNAポリメラーゼ0
. 15μ1を加え、30μ1の反応液を調製した.
この反応液の入った容器にミネラルオイル(SIGM
A社製)を50μ1加え反応液上に重層する.各添加さ
れた液の内容を下記に示す. 10X反応用バッフy−: 500mM KCI,
100mM Tris−HCI (pH8.3)1
5mM MgC I2, 0. 1%( w /
v )ゼラチdNTP溶液: dATP,dCTP
, dGTP,dTTPを混合させたもので各終濃度
が1.25mM. プライマー(a)および(b〉; 前述した化学合成1
lI製品の各水溶液(50Dυ/m1) 耐熱性DNAポリメラーゼ: Taq DNAポリ
メラーゼ( 5 unit/ ml; Perkin
Elmer Cetus社製). 反応条件は、次の通りである. 熱変性: 94℃ 1分 アニーリング= 37℃ 1分 重合反応; 60℃ 1分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を1
サイクル(所要時間5.7分〉とし、これを42サイク
ル(総所要時間約4時間)行った.これらの操作は、P
erkin Elmer Cetus社製 DN^Th
era+al Cyclerに上記反応条件をプログラ
ムすることにより行った. 権皿 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った. アガロースゲルはゲル濃度2%(w/v)とし,臭化エ
チジウム(0.5μg/m I )を含むものを用いた
.泳動の電気的条件は、定電圧1 0 0 V,時間は
30分行った.操作方法ならびに他の条件はMania
tls等、Molecular Clontng(19
82)に記載されている技法で行った.反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
より、ヌクレオチド断片の長さを算出した.U 前述したように、腸炎ビブリオ菌のtdh遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわち、プライマーがPCRにより、増幅さ
せてくるヌクレオチドの大きさは推定できる.それによ
ると、1ライマー(a)と(b)では、439塩基の長
さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである.表1に
示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌクレオチド
の長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対である.同
表からわかるように、各プライマーの組合せとも、推定
されたヌクレオチドの長さと一致しており、これらが、
tdh遺伝子の標的としている領域を正しく増幅してき
ていることを示している. 表 1 (実施M2) 実施例1で得られた結果が、腸炎ビブリオ菌に対し選択
的なものかどうか確かめるため、臨床検査において腸炎
ビブリオ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較
検討した. 方法は、実施例1に示したものと同じであるが、(13
), (14). (15)の株については嫌気的条件
下、37℃で一晩培養を行い、PCR法に適用しうる試
料を調製してきた.検体の調製において培養した菌は,
表2の縦の見出しに示した16m株である.また,ヒト
胎盤由来DNAは1μg / m lの濃度のものを調
製し、これも同様にPCRを行わせた.結果を表2に示
す.表1と同様、欄内の数値の単位はキロ塩基対である
.一部の菌種においてPCR反応の副次的産物とみられ
る、増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが,どれ
もtdh遺伝子の配列から推定される→ヌクレオチド断
片の長さとは異なっている.!炎ビブリオ菌と同じtd
h遺伝子をこれらの菌種が持っていれば実施例1の結果
と同じ長さのヌクレオチド断片が検出されるはずクレオ
チドは腸炎ビブリオ菌のtdh遺伝子を認識して生戒さ
れたものではないことが明らかであり、腸炎ビブリオ菌
を容易に区別し、検出できることがわかる.なお、本発
明の実施例に用いているアガロース電気泳動を前述の泳
動条件で行えば、100塩基対以下の範囲であれば5か
ら10塩基対、100から500塩基対の範囲であれば
10から20塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別
することができる.また、アクリルアミドなどをゲルに
用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を向上さ
せれば、選択的検出における信頼度はさらに高まるもの
と考えられる. (以下余白) 表 2 Vibrjo parahaeaolyticus (IFO1271
1)0.44 Vibrio angui!larus+(3) 0.35 [発明の効果 〕 本発明では、PCR法を用いたことで、腸炎ビブリオ菌
の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と
5 2つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性を得ることができる.また
、高い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の
前処理が簡便で済む.しかも、反応時間が短く、検出も
簡単な機材だけで行え、操作ら容易なため同定までの時
間を大幅に短縮できる.以下の実施例に示すが、反応時
間が4時間、検出にかかる操作が30分である.また、
検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる
核酸染色法をもちいることで、プライマー等に標識せず
に検出が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結
果の信頼性が高いものとなる. 腸炎ビブリオ菌は、一般に感染性食中毒の原因菌として
知られ、事実この菌による健康障害のほとんどは、下痢
、腹痛等を主徴とする胃腸炎である.この病原因子とし
て最も注目されているのは耐熱性溶血1 ( ther
IIostable direct hei+olyS
in;TDH )である.従って、プライマーが標的と
するヌクレオチド配列にtdh遺伝子をもちいることで
食中毒原因菌としての腸炎ビブリオ菌を選択的に検出す
ることができる.
、食品検査での腸炎ビブリオ菌( Vibrlopar
ahaemolyticus )の検出に関すものであ
る.〔従来の技術と問題点] 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取りN
料の場合、脳炎ビプリオ菌と同定するまでには、増菌培
養、分離培養を経て鑑別培養に至る操作を行わなければ
ならない.各培養段階に要する時間は,増菌培養で10
〜16時間、分離培養でl8〜24時間、鑑別培養で1
8〜24時間かかり、総所要時間にすると2〜4日間と
なり,長時間を要する.鑑別培養における試験では、N
aCt加寒天培地での発育試験,ダラム染色、オキシダ
ーゼ試験等を行う必要があり、操作的にも煩雑で、時間
や費用もがかる.=iた、腸炎ビブリオ菌が産生ずる耐
熱性溶血毒の検出法として、抗毒素血清より得た特異免
疫グロブリンを用いた逆受身赤血球凝集反応があるが、
結果を得るまでに20〜24時間を要する.一方、最近
では、オリゴヌクレオチドを用いたDNA1ローブ法あ
るいはハイブリダイゼーション法が試みられるようにな
ってきた.しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾した
プローブにより膜上、あるいは他の支持体上でパイプリ
ダイゼイションを行い、これを検出する場合、細菌検査
において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい. [発明の目的〕 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により腸炎ビブリ
オ菌由来のtdh遺伝子を検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供するこ
とにある. [問題点を解決するための手段および作用]本発明は、
腸炎ビブリオ菌のtdh3jl伝子と選択的にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、腸炎
ビブリオ菌を選択的に検出することを特徴としている.
遺伝子増幅は、S&ikiらが、開発したPoly++
erase Chain Reaction法(以下、
略してPCR法; Science.230.135
0(1985))をもとに行っている.この方法は、あ
る特定のヌクレオチド配列領域(本発明の場合は腸炎ビ
ブリオ菌のtdh遺伝子〉を検出する場合、その領域の
両端の一方は十鎖を他方は一鎖をそれぞれ認識してハイ
プリダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用
意し、それを熱変性により1本鎖状態にした試f4核酸
に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーと
して機能させ、生戒した2本M核酸を再び1本鎖に分離
し、再び、同様な反応を起こさせる.この一連の操作を
繰り返すことで2つのプライマーにはさまれた領域は検
出できるまでにコピー数が増大してくる.検体としては
、臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジ
ェネートなど、また、食品材料でもよい.これら材料を
PCHの試料として用いるには、材料中に存在する菌体
から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要とな
る.しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸が
数分子から数史 十分子以上存在すればPCRは進ので、検査材料を溶菌
酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけで
PCRを進行させるに十分な核酸量を持った試利液が調
製できる.本発明でプライマーとして用いられるオリゴ
ヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から考
えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さを
持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然のど
ちらでもよい.また、プライマーは、特に検出用として
標識されていなくてもよい.プライマーが規定している
腸炎ビブリオ菌のtdh遺伝子のヌクレオチド配列にお
ける増I!領域は、50塩基から2,000塩基、望ま
しくは、100@基から1. 000塩基となればよ
い.鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DN
Aポリメラーゼを用いているが、この酵素の起源につい
ては90〜95℃の温度で活性を保持していれば、どの
生物種由来でもよい.pA変性温度は、9 0=9 5
℃、プライマーをパイプリダイズさせるアニーリング操
作の温度は37〜65℃、重合反応は50〜75℃で、
これを1サイクルとしたPCRを20から42サイクル
行って増幅させる.検出は酵素反応液をそのまま、アガ
ロースゲル電気泳動におけることで増幅されたヌクレオ
チド断片の存在、およびその長さが砿認できる.その結
果から、検体中に、プライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる.この判定は、そのまt腸炎ビブリオ菌の有無を
判定するものとなる.増幅されたヌクレオチド断片の検
出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効
である. 〔実施例〕 (実施例1) 炙坐△盟玉 腸炎ビブリオ菌は表1の縦の見出しに示した5株を用い
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、37℃、好気的
条件下で終夜培養を行い、その培地、 1.5mlから
遠心操作により菌体を回収した,10mM}リスー塩酸
#Il衝液( p H 7. 5 )で1回洗浄後、
同M衝液にリゾチームをlmg/m+となるように溶か
した液、0.5mlで懸濁させ、37℃、10分で溶菌
させた.溶菌液に前記y1衝液で飽和させたフェノール
を同容量加え、よく攬はんした.遠心後、上層液を回収
し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ、
その沈澱物を前記′MI衝液、lmlに溶かして、これ
を検体と9した. − マー A 腸炎ビブリオ菌のtdhll伝子の塩基配列( Nis
i−buchi, M. and Kaper, J.
B. ;J. Bacteriol. 162, 5
58−564 (1985) )から、特許請求範囲第
2項に示した配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した.化学合成は島津DNA合
成機NS−1を用い、トリエステル法により行った.合
成したオリゴヌクレオチド断片の精製はC18逆相カラ
ムを用いて行った. L呈上 前記検体液を3μ1を用いそれに滅菌蒸留水16.05
μ!、10×反応用バッファ−3μ!、dNTP溶液4
.8μ1、プライマー(a).1. 5μl、プライ
マー(bH.5μ1そして耐熟性DNAポリメラーゼ0
. 15μ1を加え、30μ1の反応液を調製した.
この反応液の入った容器にミネラルオイル(SIGM
A社製)を50μ1加え反応液上に重層する.各添加さ
れた液の内容を下記に示す. 10X反応用バッフy−: 500mM KCI,
100mM Tris−HCI (pH8.3)1
5mM MgC I2, 0. 1%( w /
v )ゼラチdNTP溶液: dATP,dCTP
, dGTP,dTTPを混合させたもので各終濃度
が1.25mM. プライマー(a)および(b〉; 前述した化学合成1
lI製品の各水溶液(50Dυ/m1) 耐熱性DNAポリメラーゼ: Taq DNAポリ
メラーゼ( 5 unit/ ml; Perkin
Elmer Cetus社製). 反応条件は、次の通りである. 熱変性: 94℃ 1分 アニーリング= 37℃ 1分 重合反応; 60℃ 1分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を1
サイクル(所要時間5.7分〉とし、これを42サイク
ル(総所要時間約4時間)行った.これらの操作は、P
erkin Elmer Cetus社製 DN^Th
era+al Cyclerに上記反応条件をプログラ
ムすることにより行った. 権皿 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った. アガロースゲルはゲル濃度2%(w/v)とし,臭化エ
チジウム(0.5μg/m I )を含むものを用いた
.泳動の電気的条件は、定電圧1 0 0 V,時間は
30分行った.操作方法ならびに他の条件はMania
tls等、Molecular Clontng(19
82)に記載されている技法で行った.反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
より、ヌクレオチド断片の長さを算出した.U 前述したように、腸炎ビブリオ菌のtdh遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレ
オチド、すなわち、プライマーがPCRにより、増幅さ
せてくるヌクレオチドの大きさは推定できる.それによ
ると、1ライマー(a)と(b)では、439塩基の長
さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである.表1に
示した数値は、上記方法で増幅されてきたヌクレオチド
の長さを測定した結果で、単位はキロ塩基対である.同
表からわかるように、各プライマーの組合せとも、推定
されたヌクレオチドの長さと一致しており、これらが、
tdh遺伝子の標的としている領域を正しく増幅してき
ていることを示している. 表 1 (実施M2) 実施例1で得られた結果が、腸炎ビブリオ菌に対し選択
的なものかどうか確かめるため、臨床検査において腸炎
ビブリオ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較
検討した. 方法は、実施例1に示したものと同じであるが、(13
), (14). (15)の株については嫌気的条件
下、37℃で一晩培養を行い、PCR法に適用しうる試
料を調製してきた.検体の調製において培養した菌は,
表2の縦の見出しに示した16m株である.また,ヒト
胎盤由来DNAは1μg / m lの濃度のものを調
製し、これも同様にPCRを行わせた.結果を表2に示
す.表1と同様、欄内の数値の単位はキロ塩基対である
.一部の菌種においてPCR反応の副次的産物とみられ
る、増幅されたヌクレオチド断片が検出されたが,どれ
もtdh遺伝子の配列から推定される→ヌクレオチド断
片の長さとは異なっている.!炎ビブリオ菌と同じtd
h遺伝子をこれらの菌種が持っていれば実施例1の結果
と同じ長さのヌクレオチド断片が検出されるはずクレオ
チドは腸炎ビブリオ菌のtdh遺伝子を認識して生戒さ
れたものではないことが明らかであり、腸炎ビブリオ菌
を容易に区別し、検出できることがわかる.なお、本発
明の実施例に用いているアガロース電気泳動を前述の泳
動条件で行えば、100塩基対以下の範囲であれば5か
ら10塩基対、100から500塩基対の範囲であれば
10から20塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別
することができる.また、アクリルアミドなどをゲルに
用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を向上さ
せれば、選択的検出における信頼度はさらに高まるもの
と考えられる. (以下余白) 表 2 Vibrjo parahaeaolyticus (IFO1271
1)0.44 Vibrio angui!larus+(3) 0.35 [発明の効果 〕 本発明では、PCR法を用いたことで、腸炎ビブリオ菌
の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と
5 2つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性を得ることができる.また
、高い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の
前処理が簡便で済む.しかも、反応時間が短く、検出も
簡単な機材だけで行え、操作ら容易なため同定までの時
間を大幅に短縮できる.以下の実施例に示すが、反応時
間が4時間、検出にかかる操作が30分である.また、
検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる
核酸染色法をもちいることで、プライマー等に標識せず
に検出が行え、しかも、核酸の長さが確認できるので結
果の信頼性が高いものとなる. 腸炎ビブリオ菌は、一般に感染性食中毒の原因菌として
知られ、事実この菌による健康障害のほとんどは、下痢
、腹痛等を主徴とする胃腸炎である.この病原因子とし
て最も注目されているのは耐熱性溶血1 ( ther
IIostable direct hei+olyS
in;TDH )である.従って、プライマーが標的と
するヌクレオチド配列にtdh遺伝子をもちいることで
食中毒原因菌としての腸炎ビブリオ菌を選択的に検出す
ることができる.
Claims (7)
- (1)検体中に存在する腸炎ビブリオ菌(Vibrio
parahaemolyticus)を選択的に検出す
るためのオリゴヌクレオチド、または、腸炎ビブリオ菌
の耐熱性溶血毒遺伝子(tdh遺伝子)をコードするヌ
クレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相
補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
あつて、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 (5’)d−GGTAATGTGTATATCCAAC
(3’)…(a) (5’)d−CTACGTCAAAGTCGCACTA
G(3’)…(b) または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - (2)請求項第1項に記載された各オリゴヌクレオチド
の配列のうち、少なくとも連続した10塩基以上を含む
オリゴヌクレオチド。 - (3)請求項第1項に記載された配列のうち、少なくと
も1つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライ
マーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に
増幅させることを特徴とする方法であつて、 (a)検体中の1本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ4種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (b)得られた2本鎖標的ヌクレオチド配列を1本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
長反応の鋳型として機能し、 (c)これら2種のプライマーによる同時の鎖長反応、
プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
とにより特定のヌクレオチド配列が増幅され、電気泳動
、クロマトグラフィーで増幅されたヌクレオチド断片を
検出し、 (d)その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することで腸炎ビブリオ菌の検
出を行うことを含む方法。 - (4)請求項第3項記載の方法における反応物から電気
泳動、ないしクロマトグラフィーにより増幅されたヌク
レオチド配列を分離し、この分子量を決定することによ
り腸炎ビブリオ菌の検出を行うことを含む方法。 - (5)請求項第3項記載の方歩における反応物を用いア
ガロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色
を行うことによる検出方法。 - (6)請求項第1項記載の配列の1つを有するオリゴヌ
クレオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはそ
の他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出す
る方法。 - (7)請求項第1項記載の配列の1つを有するオリゴヌ
クレオチドが標識物で修飾されていることを特徴とする
請求項第6項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18568289A JPH0789957B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18568289A JPH0789957B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0349697A true JPH0349697A (ja) | 1991-03-04 |
JPH0789957B2 JPH0789957B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16175026
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18568289A Expired - Fee Related JPH0789957B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0789957B2 (ja) |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP18568289A patent/JPH0789957B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0789957B2 (ja) | 1995-10-04 |
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