JP2001095576A - 腸管出血性大腸菌の検出法 - Google Patents
腸管出血性大腸菌の検出法Info
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- JP2001095576A JP2001095576A JP27356099A JP27356099A JP2001095576A JP 2001095576 A JP2001095576 A JP 2001095576A JP 27356099 A JP27356099 A JP 27356099A JP 27356099 A JP27356099 A JP 27356099A JP 2001095576 A JP2001095576 A JP 2001095576A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、食中毒・下痢症にかかる検査におけ
る、簡便、迅速な大腸菌Ｏ１５７及び腸管出血性大腸菌
の検査法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、大腸菌Ｏ１５７及びベロ毒素１
型若しくは２型産生性大腸菌を選択的に検出するための
オリゴヌクレオチド、または、Ｏ１５７糖合成領域遺伝
子及びベロ毒素１型（ＶＴ１）若しくは２型（ＶＴ２）
遺伝子、若しくはベロ毒素２型の変異型（ＶＴ２ｖｈ
ａ、ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ1 、およびＶＴ２ｖｐ
２）の各遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチドの配列と相補的となるように化学
合成されたオリゴヌクレオチドの混合物を用いることに
より、各標的遺伝子毎に異なったサイズの増幅断片を同
一反応液内で生成させ、１型ベロ毒素及び２型毒素若し
くはその変異型毒素産生菌、さらにはＯ１５７抗原保有
菌をそれぞれ個別にかつ同時に検出することを特徴とし
ている。
る、簡便、迅速な大腸菌Ｏ１５７及び腸管出血性大腸菌
の検査法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、大腸菌Ｏ１５７及びベロ毒素１
型若しくは２型産生性大腸菌を選択的に検出するための
オリゴヌクレオチド、または、Ｏ１５７糖合成領域遺伝
子及びベロ毒素１型（ＶＴ１）若しくは２型（ＶＴ２）
遺伝子、若しくはベロ毒素２型の変異型（ＶＴ２ｖｈ
ａ、ＶＴ２ｖｈｂ、ＶＴ２ｖｐ1 、およびＶＴ２ｖｐ
２）の各遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチドの配列と相補的となるように化学
合成されたオリゴヌクレオチドの混合物を用いることに
より、各標的遺伝子毎に異なったサイズの増幅断片を同
一反応液内で生成させ、１型ベロ毒素及び２型毒素若し
くはその変異型毒素産生菌、さらにはＯ１５７抗原保有
菌をそれぞれ個別にかつ同時に検出することを特徴とし
ている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、食品の
品質検査、とりわけ食中毒に関する検査、もしくは下痢
症検査における大腸菌Ｏ157、ベロ毒素産生性大腸菌の
検出・同定に関するものである。
品質検査、とりわけ食中毒に関する検査、もしくは下痢
症検査における大腸菌Ｏ157、ベロ毒素産生性大腸菌の
検出・同定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】腸管出血性大腸菌症の起因菌であるベロ
（志賀）毒素産生性大腸菌（ＥＨＥＣ又はＶＴＥＣ）は
ベロ（又は志賀）毒素産生により出血性大腸炎や、重篤
な疾患である溶血性尿毒症症候群（hemolytic uremic s
yndrome ）を惹起させることが知られており、臨床検査
では、本菌の検出が重要視されつつある。さらに、Ｏ１
５７抗原を保有するいわゆる大腸菌Ｏ１５７は指定伝染
病原因菌として行政機関への届出が義務づけられてい
る。これら大腸菌の検出および同定には生化学的、免疫
化学的な手法が用いられているが、操作が煩雑で結果を
得るまでに２日ないし３日程度の時間を要する上、特異
性も十分なものではない。
（志賀）毒素産生性大腸菌（ＥＨＥＣ又はＶＴＥＣ）は
ベロ（又は志賀）毒素産生により出血性大腸炎や、重篤
な疾患である溶血性尿毒症症候群（hemolytic uremic s
yndrome ）を惹起させることが知られており、臨床検査
では、本菌の検出が重要視されつつある。さらに、Ｏ１
５７抗原を保有するいわゆる大腸菌Ｏ１５７は指定伝染
病原因菌として行政機関への届出が義務づけられてい
る。これら大腸菌の検出および同定には生化学的、免疫
化学的な手法が用いられているが、操作が煩雑で結果を
得るまでに２日ないし３日程度の時間を要する上、特異
性も十分なものではない。
【０００３】一方、近年ではオリゴヌクレオチドを核酸
合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術
が用いられ、ベロ毒素遺伝子または大腸菌Ｏ１５７に特
異的なＯ１５７糖合成領域遺伝子等を標的とした特異性
の高い検出が可能となっているが、一つの標的遺伝子ご
とに一つの反応液を調製して行っているため、腸管出血
性大腸菌の検出のように一つの菌を同定するために複数
の標的遺伝子を検出しなければならない場合には複数の
反応液を調製しなければならず操作が煩雑である。
合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術
が用いられ、ベロ毒素遺伝子または大腸菌Ｏ１５７に特
異的なＯ１５７糖合成領域遺伝子等を標的とした特異性
の高い検出が可能となっているが、一つの標的遺伝子ご
とに一つの反応液を調製して行っているため、腸管出血
性大腸菌の検出のように一つの菌を同定するために複数
の標的遺伝子を検出しなければならない場合には複数の
反応液を調製しなければならず操作が煩雑である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、ＥＨＥＣの病原因子遺伝子であ
るベロ（又は志賀）毒素１型遺伝子（VT-1）又はベロ
（又は志賀）毒素２型遺伝子（VT-2）若しくはその変異
型遺伝子（VT-2vha,VT-2vhb,VT-2vp1,VT-2vp2）又は大
腸菌Ｏ１５７の糖合成領域遺伝子のうち少なくとも一つ
の遺伝子を保有する大腸菌を一反応で個別に検出するも
のである。それにより、大腸菌Ｏ１５７を含む腸管出血
性大腸菌の簡便、迅速な検査法を提供することにある。
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、ＥＨＥＣの病原因子遺伝子であ
るベロ（又は志賀）毒素１型遺伝子（VT-1）又はベロ
（又は志賀）毒素２型遺伝子（VT-2）若しくはその変異
型遺伝子（VT-2vha,VT-2vhb,VT-2vp1,VT-2vp2）又は大
腸菌Ｏ１５７の糖合成領域遺伝子のうち少なくとも一つ
の遺伝子を保有する大腸菌を一反応で個別に検出するも
のである。それにより、大腸菌Ｏ１５７を含む腸管出血
性大腸菌の簡便、迅速な検査法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ベロ毒素１型
遺伝子（VT-1）検出用プライマー、およびベロ毒素２型
（VT-2）遺伝子、若しくはベロ毒素２型の変異型遺伝子
（VT-2vha,VT-2vhb,VT-2vp1,VT-2vp2）検出用プライマ
ーおよびＯ１５７糖合成領域遺伝子検出用プライマーの
混合溶液を用いて遺伝子増幅法により複数の標的遺伝子
を同時に検出するものである。すなわち、本発明は大腸
菌Ｏ１５７及び腸管出血性大腸菌の検査において確認し
なければならないベロ毒素産生性及び毒素型別、Ｏ１５
７であるか否かの血清型型別を一回の検査で行うことを
特徴としている。
遺伝子（VT-1）検出用プライマー、およびベロ毒素２型
（VT-2）遺伝子、若しくはベロ毒素２型の変異型遺伝子
（VT-2vha,VT-2vhb,VT-2vp1,VT-2vp2）検出用プライマ
ーおよびＯ１５７糖合成領域遺伝子検出用プライマーの
混合溶液を用いて遺伝子増幅法により複数の標的遺伝子
を同時に検出するものである。すなわち、本発明は大腸
菌Ｏ１５７及び腸管出血性大腸菌の検査において確認し
なければならないベロ毒素産生性及び毒素型別、Ｏ１５
７であるか否かの血清型型別を一回の検査で行うことを
特徴としている。
【０００６】ここでいうプライマーとは、次の配列番号
１〜６ 配列番号１； ( ５')ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−( ３' ）・・（ａ） 配列番号２； ( ５')ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−( ３')・・（ｂ） 配列番号３； ( ５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−( ３')・・（ｃ） 配列番号４； ( ５')ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−( ３')・・（ｄ） 配列番号５； ( ５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−( ３')・・（ｅ） 配列番号６； ( ５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−( ３')・・（ｆ） の各配列の一部あるいは全部を有するオリゴヌクレオチ
ドであり、プライマー混合溶液とは配列番号１から６の
配列の一部あるいは全部と有するオリゴヌクレオチドの
うち、少なくとも２種類以上のオリゴヌクレオチドを含
む溶液である。また、各配列の一部とは、少なくとも連
続した１０塩基以上の同一配列を含む場合をいう。
１〜６ 配列番号１； ( ５')ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−( ３' ）・・（ａ） 配列番号２； ( ５')ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−( ３')・・（ｂ） 配列番号３； ( ５')ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−( ３')・・（ｃ） 配列番号４； ( ５')ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−( ３')・・（ｄ） 配列番号５； ( ５')ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−( ３')・・（ｅ） 配列番号６； ( ５')ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−( ３')・・（ｆ） の各配列の一部あるいは全部を有するオリゴヌクレオチ
ドであり、プライマー混合溶液とは配列番号１から６の
配列の一部あるいは全部と有するオリゴヌクレオチドの
うち、少なくとも２種類以上のオリゴヌクレオチドを含
む溶液である。また、各配列の一部とは、少なくとも連
続した１０塩基以上の同一配列を含む場合をいう。
【０００７】なお、配列番号１及び２はＯ１５７糖合成
領域遺伝子の塩基配列（Shimizu, T., et.al. : Analys
is of the genes responsible for the O-antigen symt
hesis in enterohemorrhagic Escherichia coli O157,
Microb. Pathog., 26, 235-247 (1999)）を、配列番号
３及び４はベロ毒素１型遺伝子の塩基配列（Takao, T.,
et.al.: Identity of molecular structure of Shiga-
like toxin I (VT1) from Escherichia coli O157:H7
with that of Shiga toxin, Microb. Pathog.,5, 357-3
69 (1988)）を、配列番号５及び６はベロ毒素２型遺伝
子の塩基配列（Jacson, M.P., et.al.: Nucleotide seq
uence analysis and comparison of the structural ge
nes for Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II
encoded by bacteriophages from Escherichia coli 9
33, FEMS Microbio. Lett., 44, 109-114 (1987)： It
o, H., et.al. : Cloning and nucleotide sequencingo
f Vero toxin 2 variant genes from Escherichia col
i O91:H21 isolated from patient with the hemolyti
c uremic syndrome, Microb. Pathog., 8, 47-60 (199
0)： Weinstein, D.L., et.al. : Cloning and sequenc
ing of a Shiga-like toxin type II variant from an
Escherichia coli strain responsiblefor edema dise
ase of swine, J. Bacteriol.,170, 4223-4230 (198
8)）に相補的な配列となっている。
領域遺伝子の塩基配列（Shimizu, T., et.al. : Analys
is of the genes responsible for the O-antigen symt
hesis in enterohemorrhagic Escherichia coli O157,
Microb. Pathog., 26, 235-247 (1999)）を、配列番号
３及び４はベロ毒素１型遺伝子の塩基配列（Takao, T.,
et.al.: Identity of molecular structure of Shiga-
like toxin I (VT1) from Escherichia coli O157:H7
with that of Shiga toxin, Microb. Pathog.,5, 357-3
69 (1988)）を、配列番号５及び６はベロ毒素２型遺伝
子の塩基配列（Jacson, M.P., et.al.: Nucleotide seq
uence analysis and comparison of the structural ge
nes for Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II
encoded by bacteriophages from Escherichia coli 9
33, FEMS Microbio. Lett., 44, 109-114 (1987)： It
o, H., et.al. : Cloning and nucleotide sequencingo
f Vero toxin 2 variant genes from Escherichia col
i O91:H21 isolated from patient with the hemolyti
c uremic syndrome, Microb. Pathog., 8, 47-60 (199
0)： Weinstein, D.L., et.al. : Cloning and sequenc
ing of a Shiga-like toxin type II variant from an
Escherichia coli strain responsiblefor edema dise
ase of swine, J. Bacteriol.,170, 4223-4230 (198
8)）に相補的な配列となっている。
【０００８】なお、配列番号１及び２のプライマーセッ
トは４５７塩基対の当該遺伝子由来の増幅産物が生成す
るように設計した。また、配列番号３及び４のプライマ
ーセットは３４９塩基対の増幅産物が生成するように設
計した。さらに、配列番号５及び６のプライマーセット
は１１２塩基対の増幅産物が生成するように設計した。
トは４５７塩基対の当該遺伝子由来の増幅産物が生成す
るように設計した。また、配列番号３及び４のプライマ
ーセットは３４９塩基対の増幅産物が生成するように設
計した。さらに、配列番号５及び６のプライマーセット
は１１２塩基対の増幅産物が生成するように設計した。
【０００９】以上により、アガロースゲル電気泳動等で
は各プライマーセットによる増幅産物がそれぞれ分離し
たしたバンドとして検出されそれら増幅産物の分子量を
測定することで各標的遺伝子の同時検出が可能となる。
は各プライマーセットによる増幅産物がそれぞれ分離し
たしたバンドとして検出されそれら増幅産物の分子量を
測定することで各標的遺伝子の同時検出が可能となる。
【００１０】遺伝子増幅は、Saiki らが開発したPolyme
rase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略する；Sc
ience 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。この方
法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのベロ毒素１型又は２型遺
伝子若しくはその変異型遺伝子又はＯ１５７抗原合成遺
伝子）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱
変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、
生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な
反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すことで、
２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコ
ピー数が増大してくる。さらに、同一反応液内において
複数のプライマーセットを互いに干渉しない条件で混在
させることにより、複数の遺伝子領域を同時に増幅させ
ることも可能である。
rase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略する；Sc
ience 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。この方
法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのベロ毒素１型又は２型遺
伝子若しくはその変異型遺伝子又はＯ１５７抗原合成遺
伝子）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱
変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、
生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な
反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すことで、
２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコ
ピー数が増大してくる。さらに、同一反応液内において
複数のプライマーセットを互いに干渉しない条件で混在
させることにより、複数の遺伝子領域を同時に増幅させ
ることも可能である。
【００１１】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、有機溶媒、酸又はアルカリ等での化学処理、ま
たは90℃から100℃での熱処理を行うことでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
さらには標的菌が十分存在する場合は核酸抽出処理を省
略し、標的菌を含む検体を直接反応液に添加するだけで
検出できる場合もある。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、有機溶媒、酸又はアルカリ等での化学処理、ま
たは90℃から100℃での熱処理を行うことでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
さらには標的菌が十分存在する場合は核酸抽出処理を省
略し、標的菌を含む検体を直接反応液に添加するだけで
検出できる場合もある。
【００１２】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５゜ Ｃの温度で活性を保持してい
れば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜
９５゜ Ｃ、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリ
ング操作の温度は３７〜６５゜ Ｃ、重合反応は５０〜７
５゜ Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２５から４
０サイクル行って増幅させる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５゜ Ｃの温度で活性を保持してい
れば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜
９５゜ Ｃ、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリ
ング操作の温度は３７〜６５゜ Ｃ、重合反応は５０〜７
５゜ Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２５から４
０サイクル行って増幅させる。
【００１３】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル等を用いた電気泳動にかけることで、増幅
されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確認
できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべき
配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定
することができる。この判定は、そのままベロ毒素産生
性大腸菌または大腸菌Ｏ１５７の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効である。ま
た、上記増幅されたヌクレオチド断片に相補的なヌクレ
オチドをプローブとして機能させ、膜上、あるいはその
他支持体上において増幅されたヌクレオチド断片を選択
的に検出してもよい。
ガロースゲル等を用いた電気泳動にかけることで、増幅
されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確認
できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべき
配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定
することができる。この判定は、そのままベロ毒素産生
性大腸菌または大腸菌Ｏ１５７の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効である。ま
た、上記増幅されたヌクレオチド断片に相補的なヌクレ
オチドをプローブとして機能させ、膜上、あるいはその
他支持体上において増幅されたヌクレオチド断片を選択
的に検出してもよい。
【００１４】
【実施例】試験菌株 本発明の性能を評価するために以下の性状を持った腸管
出血性大腸菌６株及び陰性対照としての非病原性大腸菌
１株を用いた。 菌株番号１：Ｏ１５７,ベロ毒素１型産生，ベロ毒素２型産生 菌株番号２：Ｏ１５７,ベロ毒素１型産生、 菌株番号３：Ｏ１５７,ベロ毒素２型産生 菌株番号４：Ｏ１５７,ベロ毒素非産生 菌株番号５：Ｏ１１１,ベロ毒素１型産生、ベロ毒素２型産生 菌株番号６：Ｏ２６,ベロ毒素１型産生 菌株番号７：Ｏ１３９,ベロ毒素２型産生 菌株番号８：Ｏ１,ベロ毒素非産生 これら菌株の性状は抗血清による通常の免疫学的手法に
基づき決定されたものである。
出血性大腸菌６株及び陰性対照としての非病原性大腸菌
１株を用いた。 菌株番号１：Ｏ１５７,ベロ毒素１型産生，ベロ毒素２型産生 菌株番号２：Ｏ１５７,ベロ毒素１型産生、 菌株番号３：Ｏ１５７,ベロ毒素２型産生 菌株番号４：Ｏ１５７,ベロ毒素非産生 菌株番号５：Ｏ１１１,ベロ毒素１型産生、ベロ毒素２型産生 菌株番号６：Ｏ２６,ベロ毒素１型産生 菌株番号７：Ｏ１３９,ベロ毒素２型産生 菌株番号８：Ｏ１,ベロ毒素非産生 これら菌株の性状は抗血清による通常の免疫学的手法に
基づき決定されたものである。
【００１５】試料調整 各菌株をＴＳＢ培地で終夜培養した後、培養液を９５
℃、５分間の加熱処理し、菌抽出液を得た。
℃、５分間の加熱処理し、菌抽出液を得た。
【００１６】プライマー 配列番号１〜６に示した各配列を選び、それらと同じ配
列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、
β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行った。
合成したオリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ18逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。各プラ
イマーは配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドについ
ては０．８ｐｍｏＬ／μＬ、配列番号３、４、５、６の
オリゴヌクレオチドについては３．２ｐｍｏＬ／μＬの
濃度で混合し蒸留水に溶解させ、プライマー混合液 と
した。
列のオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、
β−シアノエチルフォスホアミダイト法により行った。
合成したオリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ18逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。各プラ
イマーは配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドについ
ては０．８ｐｍｏＬ／μＬ、配列番号３、４、５、６の
オリゴヌクレオチドについては３．２ｐｍｏＬ／μＬの
濃度で混合し蒸留水に溶解させ、プライマー混合液 と
した。
【００１７】陽性コントロール用鋳型ＤＮＡ 本実施例では試料溶液等からの反応阻害物質による反応
不良の結果、偽陰性となるのを防ぐため、陽性コントロ
ール用鋳型ＤＮＡを反応液に添加した。陽性コントロー
ル鋳型ＤＮＡはConpetitive DNA Construction Kit(宝
酒造製)を用い、配列番号１および２のプライマーによ
り６４１塩基の増幅産物が生成するように１μＬ当たり
５分子の濃度の水溶液として調製した。なお、陽性コン
トロール鋳型ＤＮＡは偽陰性の恐れがない場合は添加し
なくともよい。
不良の結果、偽陰性となるのを防ぐため、陽性コントロ
ール用鋳型ＤＮＡを反応液に添加した。陽性コントロー
ル鋳型ＤＮＡはConpetitive DNA Construction Kit(宝
酒造製)を用い、配列番号１および２のプライマーによ
り６４１塩基の増幅産物が生成するように１μＬ当たり
５分子の濃度の水溶液として調製した。なお、陽性コン
トロール鋳型ＤＮＡは偽陰性の恐れがない場合は添加し
なくともよい。
【００１８】ＰＣＲ 前記試料液５μＬを用い、それに滅菌蒸留水１０. ７５
μＬ、５ｘ反応用緩衝液（Ampdirect：島津製作所製）
１０μＬ，ｄＮＴＰ溶液４μＬ、プライマー混合液 １
０μＬ、陽性コントロール用鋳型ＤＮＡ１０μＬおよび
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. ２５μＬを加えて、全量
５０μＬの反応液を調製した。この反応液の入った容器
にミネラルオイル（SIGMA 社製）を２０μＬ加え、反応
液上に重層した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは宝酒造製
のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用した。反応条件は、
次のとおりである。 熱変性：９４゜ Ｃ、１分 アニーリング：５５゜ Ｃ、１分 重合反応：７２゜ Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクルとし、これを３５サイクル（総所要時間約３
時間）行った。これらの操作は、ＤＮＡサーマルサイク
ラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上記反応条件をプロ
グラムして行った。
μＬ、５ｘ反応用緩衝液（Ampdirect：島津製作所製）
１０μＬ，ｄＮＴＰ溶液４μＬ、プライマー混合液 １
０μＬ、陽性コントロール用鋳型ＤＮＡ１０μＬおよび
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. ２５μＬを加えて、全量
５０μＬの反応液を調製した。この反応液の入った容器
にミネラルオイル（SIGMA 社製）を２０μＬ加え、反応
液上に重層した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは宝酒造製
のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用した。反応条件は、
次のとおりである。 熱変性：９４゜ Ｃ、１分 アニーリング：５５゜ Ｃ、１分 重合反応：７２゜ Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクルとし、これを３５サイクル（総所要時間約３
時間）行った。これらの操作は、ＤＮＡサーマルサイク
ラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上記反応条件をプロ
グラムして行った。
【００１９】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度２．５％（W/V ）とし、臭化エ
チジウム（０．５μＬ/ｍＬ）を含むものを用いた。泳
動の条件は５Ｖ／ｃｍ、６０分で行った。操作方法なら
びに他の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第
２版（1989）に記載されている技法で行った。反応液の
他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の
比較によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度２．５％（W/V ）とし、臭化エ
チジウム（０．５μＬ/ｍＬ）を含むものを用いた。泳
動の条件は５Ｖ／ｃｍ、６０分で行った。操作方法なら
びに他の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第
２版（1989）に記載されている技法で行った。反応液の
他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の
比較によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００２０】結果 Ｏ１５７糖合成遺伝子は配列番号１及び配列番号２のプ
ライマーセットにより検出され、４５７塩基対の当該遺
伝子由来の増幅産物が生成すると予想される。また、ベ
ロ毒素１型遺伝子は、配列番号３および配列番号４のプ
ライマーセットにより同様に３４９塩基対の増幅産物が
生成すると予想される。さらに、ベロ毒素２型遺伝子及
びその変異型遺伝子は、配列番号５および配列番号６の
プライマーセットにより同様に１１２塩基対の増幅産物
が生成すると予想される。これらの予想された増幅産物
のヌクレオチド長と実際に増幅されたヌクレオチド長が
一致した場合、これらプライマーは、標的としている遺
伝子領域を正しく増幅していると判断した。
ライマーセットにより検出され、４５７塩基対の当該遺
伝子由来の増幅産物が生成すると予想される。また、ベ
ロ毒素１型遺伝子は、配列番号３および配列番号４のプ
ライマーセットにより同様に３４９塩基対の増幅産物が
生成すると予想される。さらに、ベロ毒素２型遺伝子及
びその変異型遺伝子は、配列番号５および配列番号６の
プライマーセットにより同様に１１２塩基対の増幅産物
が生成すると予想される。これらの予想された増幅産物
のヌクレオチド長と実際に増幅されたヌクレオチド長が
一致した場合、これらプライマーは、標的としている遺
伝子領域を正しく増幅していると判断した。
【００２１】検出結果をアガロースゲル電気泳動のゲル
写真図として図１に示す。図１中Ｍは分子量マーカーφ
X174/HincII、各レーンの番号は菌株番号に対応する。
図１より各菌株の性状に合わせて予想される分子量の増
幅産物が確認されていることがわかる。従って、本発明
は、試験菌株の性状に合わせて標的遺伝子を正しく検出
していることが示された。なお、陽性コントロール用鋳
型ＤＮＡ由来の６４１塩基の増幅産物は標的遺伝子が存
在する場合は検出されないか、又は検出されても当該産
物の量が少なくなる場合がある。ただし、標的遺伝子を
全く保有しない菌株番号８の菌株では陽性コントロール
用鋳型ＤＮＡ由来の６４１塩基の増幅産物のみが明確に
確認できた（図中、レーン８）。
写真図として図１に示す。図１中Ｍは分子量マーカーφ
X174/HincII、各レーンの番号は菌株番号に対応する。
図１より各菌株の性状に合わせて予想される分子量の増
幅産物が確認されていることがわかる。従って、本発明
は、試験菌株の性状に合わせて標的遺伝子を正しく検出
していることが示された。なお、陽性コントロール用鋳
型ＤＮＡ由来の６４１塩基の増幅産物は標的遺伝子が存
在する場合は検出されないか、又は検出されても当該産
物の量が少なくなる場合がある。ただし、標的遺伝子を
全く保有しない菌株番号８の菌株では陽性コントロール
用鋳型ＤＮＡ由来の６４１塩基の増幅産物のみが明確に
確認できた（図中、レーン８）。
【００２２】
【発明の効果】本発明では、Ｏ１５７糖合成領域遺伝
子、べロ毒素１型遺伝子、および同２型遺伝子を個別に
かつ同時に検出することにより腸管出血性大腸菌症の起
因菌を簡便かつ迅速に同定することができる。以上によ
り腸管出血性大腸菌症の治療及び感染予防に有効な手法
を提供することになる。
子、べロ毒素１型遺伝子、および同２型遺伝子を個別に
かつ同時に検出することにより腸管出血性大腸菌症の起
因菌を簡便かつ迅速に同定することができる。以上によ
り腸管出血性大腸菌症の治療及び感染予防に有効な手法
を提供することになる。
＜110＞shimadzu corp. ＜120＞Method for detecting enteric hemorrhagic E.
coli ＜130＞K0990761 ＜160＞６ ＜210＞１ ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞1 gtatttggagacatgggagc ＜210＞2 ＜211＞21 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞２ actaatgacacgattcgttcc ＜210＞3 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞3 caacactggatgatctcag ＜210＞4 ＜211＞18 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞4 ccccctcaactgtaata ＜210＞5 ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞5 atcagtcgtcactcactggt ＜210＞6 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞6 ctgctgtcacagtgacaaa
coli ＜130＞K0990761 ＜160＞６ ＜210＞１ ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞1 gtatttggagacatgggagc ＜210＞2 ＜211＞21 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞２ actaatgacacgattcgttcc ＜210＞3 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞3 caacactggatgatctcag ＜210＞4 ＜211＞18 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞4 ccccctcaactgtaata ＜210＞5 ＜211＞20 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞5 atcagtcgtcactcactggt ＜210＞6 ＜211＞19 ＜212＞DNA ＜213＞Escherichia coli ＜400＞6 ctgctgtcacagtgacaaa
【図１】代表的な腸管出血性大腸菌から試料調製し、本
発明のプライマーを用いてベロ毒素１型遺伝子、ベロ毒
素２型遺伝子及びＯ１５７抗原合成遺伝子を同時に増幅
させ、その増幅断片をアガロースゲル電気泳動により検
出した図。
発明のプライマーを用いてベロ毒素１型遺伝子、ベロ毒
素２型遺伝子及びＯ１５７抗原合成遺伝子を同時に増幅
させ、その増幅断片をアガロースゲル電気泳動により検
出した図。
Claims (3)
- 【請求項１】ベロ（志賀）毒素１型遺伝子を保有する大
腸菌又はベロ（志賀）毒素２型（その変異型を含む）遺
伝子を保有する大腸菌又はＯ１５７糖合成領域遺伝子を
保有する大腸菌を選択的に検出するためにそれら遺伝子
のヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成され
た配列番号１、２、３、４、５、６から成るオリゴヌク
レオチドの混合物。 - 【請求項２】請求項１記載のオリゴヌクレオチドの配列
のうち少なくとも連続した１０塩基以上の同一配列を含
むオリゴヌクレオチドの混合物。 - 【請求項３】請求項１または請求項２の配列を含むオリ
ゴヌクレオチドのうち、少なくとも２種をプライマーと
して機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅さ
せることを特徴とする方法であって、 （１）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 （２）得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖
に分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる
鎖長反応の鋳型として機能し、 （３）これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−
ションを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列
が増幅され、増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （４）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでベロ（志賀）毒素１
型遺伝子を保有する大腸菌又はベロ（志賀）毒素２型
（その変異型を含む）遺伝子を保有する大腸菌又はＯ15
7抗原遺伝子を保有する大腸菌を同時に検出することを
特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27356099A JP2001095576A (ja) | 1999-09-28 | 1999-09-28 | 腸管出血性大腸菌の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27356099A JP2001095576A (ja) | 1999-09-28 | 1999-09-28 | 腸管出血性大腸菌の検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001095576A true JP2001095576A (ja) | 2001-04-10 |
Family
ID=17529517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27356099A Pending JP2001095576A (ja) | 1999-09-28 | 1999-09-28 | 腸管出血性大腸菌の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001095576A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003057880A1 (fr) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Procede et kit de quantification d'acides nucleiques |
| CN1661112B (zh) * | 2004-02-03 | 2010-07-28 | 东曹株式会社 | 肠出血性大肠杆菌的志贺菌毒素家族基因的检测试剂 |
| US8298758B2 (en) | 2003-12-26 | 2012-10-30 | Prima Meat Packers, Ltd. | Method of multiplex microorganism detection |
| WO2015190106A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、食中毒菌検出用キット、食中毒菌の検出方法、及び食中毒菌用ｐｃｒ反応液 |
| WO2015190109A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体 |
| JP2016000016A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌の検出方法、及び食中毒菌用ｐｃｒ反応液 |
| JP2016000015A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌検出用キット |
-
1999
- 1999-09-28 JP JP27356099A patent/JP2001095576A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003057880A1 (fr) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Procede et kit de quantification d'acides nucleiques |
| US8298758B2 (en) | 2003-12-26 | 2012-10-30 | Prima Meat Packers, Ltd. | Method of multiplex microorganism detection |
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| WO2015190106A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、食中毒菌検出用キット、食中毒菌の検出方法、及び食中毒菌用ｐｃｒ反応液 |
| WO2015190109A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体 |
| JP2016000016A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌の検出方法、及び食中毒菌用ｐｃｒ反応液 |
| JP2016000015A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌検出用キット |
| JP2016000013A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体 |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051018 |