KR101414349B1 - 장출혈성 대장균 ｏ157:ｈ7 검출방법 - Google Patents

장출혈성 대장균 ｏ157:ｈ7 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)의 검출방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계; (b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계. 본 발명의 프라이머쌍 및 이를 이용한 방법은 인체에 유해한 대장균 O157:H7 균주만을 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통해 대장균 O157:H7-유발 질환의 진단에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 DNA 수준에서 대장균 O157:H7 균주의 감염 진위 여부를 판별할 수 있어 오염된 식품 및 감염 여부의 예찰 및 방제에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

장출혈성 대장균 Ｏ157:Ｈ7 검출방법{Methods for Detecting Enterohemorrhagic Escherichia coli Ｏ157:Ｈ7}
본 발명은 장출혈성 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 및 이를 이용한 장출혈성 대장균 O157:H7 검출방법에 관한 것이다.
산업의 발전과 수입 자유화에 따른 식품 교역량 증가와 더불어 웰빙문화에 따른 식품 안전성에 대한 국민의 관심은 더욱 높아졌다. 그러나, 최근에 일어난 중국산 기생충 김치, 납 꽃게, 돼지고기에서 다이옥신 검출, 살모넬라, 장출혈성 대장균 O157:H7, 수입 소시지에서 검출된 리스테리아균 등은 모두 수입식품으로 인한 파동 및 집단 식중독을 거치면서 먹거리에 대한 불신은 극에 달했다. 이러한 식품 안정성 논란이 있을 때마다 소비자들은 식품에 대한 검역조치를 강화할 것을 요구하고 있다. 미국, 유럽, 일본 등의 여러 선진국 경우도 지난 20년간 비슷한 경험을 하면서 농장에서 식탁까지 오염될 수 있는 식품 유해물질의 퇴치를 위해 부단히 노력해 왔다. 하지만, 지구 온난화 및 환경적인 변화로 식중독 발생은 매년 증가하고 있어 이에 맞는 식품 안정성 확보를 위한 대책이 절실히 요구되고 있다. 또한, 재래식 방법을 통한 식품 유해물질 검사는 아직도 높은 비용과 오랜 시간을 요구하는 노동 집약적인 방법이 사용되는 경우가 많아서 신속 정확한 검사 방법이 시급한 상황이다.
유아와 성인에게 발생하는 병원성 대장균 식중독은 각종 외래성 대장균이 오염 및 증식된 식품을 섭취함으로써 일어난다. 이러한 병원성 대장균(pathogenic E.coli)은 비병원성대장균(non-pathogenic E.coli)의 형태와 생화학적 성상이 유사하다. 이들 병원성 대장균은 장내세균과에 속하는 0.4-0.7 × 1-30 ㎛ 크기로 비포자이고 그람 음성의 간균이며 주모성 편모가 있어서 운동성이 있으나, 편모가 없고 비운동성인 것도 있다. 또한, 보통배지에서 쉽게 배양이 가능하며 적정 온도는 37℃로 중온균으로 구분된다. 이들 대장균이 가진 항원은 somatic(O) 항원 180종, capsular(K) 항원 100종, flagella(H) 항원 56여종 등 3종류로 분류되어 있으며, 또한 serotype, biotype, phase type, enterotoxin 생성에 따라 세분화되어 장출혈성 대장균 O157:H7의 특이적인 검출에는 어려움이 있었다.
우리나라의 식중독 발생현황을 살펴보면, 원인식품으로는 육류 및 식육가공품이 약 50% 이상을 차지하고 있다. 정확한 원인균의 동정을 위해서 오염된 가검물이나 식품을 배양하여 생화학적 테스트를 수행하는 것을 원칙으로 하는데, 이는 최소 3일에서 수 주일이 소요된다. 이와 같은 배지법이나 생화학적 테스트는 공인검사법으로 널리 사용되고 있기는 하지만 원인병원체를 파악하고 역학조사를 완료하기 전에 이미 식중독이 집단적으로 확산될 가능성이 매우 높다. 따라서, 추가적으로 유전자 스크리닝 검사법을 확보함으로써, 식중독 원인 병원체에 대한 조기진단을 가능하게 할 수 있다. 유전자검사법으로 처음 등장한 PCR법은 각 균에 대한 특이적 독소유전자(toxin gene)를 증폭시킴으로써 병원체의 유전자를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 PCR법이 임상진단에 널리 보급되고 있으나, 독소유전자만을 증폭시킴으로써 비독소 유전자(non-toxin gene)를 가진 병원균에서 발생하는 식중독은 검출하지 못하는 한계가 있다.
상술한 바와 같이, PCR법과 같은 다양한 기술을 이용하여 신속하고 정확하며, 식중독 원인균의 배양과정이 생략된 식중독 원인균의 검출 및 이로부터 식품의 오염 정도를 검출할 수 있는 검출 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7 균주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7을 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하고 이를 이용한 증폭을 통해 장출혈성 대장균 O157:H7을 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 장출혈성 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)의 검출방법을 제공한다:
(a) 시료를 준비하는 단계;
(b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머로 이루어진 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7 균주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7을 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하고 이를 이용한 증폭을 통해 장출혈성 대장균 O157:H7을 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
대장균 혈청형 O157:H7는 막대형 그람-음성 박테리아로, “O”는 세포벽(체세포의) O 항원의 수를 나타내고 “H”는 편모 항원을 의미한다. 대부분의 대장균은 무해하여 포유동물의 장에서 일반적으로 발견되지만, 대장균 O157:H7는 시가-유사 독소(shiga-like toxins)을 생산하여 심각한 질병을 야기하는 병원성 대장균[장출혈성 대장균(enterohemorrhagic Escherichia coli)으로 알려짐]의 한 클래스로, 때때로 베로사이토톡신-생산 대장균(verocytotoxin-producing E. coli, VTEC) 또는 시가-유사 독소-생산 대장균(shiga-like Toxin-producing E. coli, STEC)으로도 불린다.
병원성 대장균은 독성형질, 일상 역학, 임상 형질 및 병리생리학적 작용기전에 따라 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli: EHEC), 장독소 대장균 (Enterotoxigenic E. coli: ETEC), 장병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli: EPEC) 및 장침입성 대장균(Enteroin vasive E. coli: EIEC)의 4 그룹으로 분류된다. 특히, 장출혈성 대장균은 출혈성대장염(hemorrhagic colitis: HC)의 원인균으로서 장관에 장착 후 베로독소를 생산하여 장관 상피세포에 손상을 준다(Morrison DM, Am. J. Clin. Pathol 86, 108-112 (1985)). 장출혈성 대장균 O157:H7은 특히 어린이와 노인에게 있어서 용혈성 요독 증후군(HUS : hemolytic Uremic Syndrom)을 일으킬 수 있는 대장균으로, 모든 연령에서의 감염이 보고되어 있다.
이에, 본 발명자들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 프로그램을 이용하여 장출혈성 대장균 O157:H7을 특이적으로 검출할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 정보를 탐색한 결과, 장출혈성 대장균 O157:H7을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하였으며, 이는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 예시되어 있다(참고: 표 2).
본 발명에 따르면, 본 발명은 시료에서 매우 효과적이고 간편하게 장출혈성 대장균 O157:H7을 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 타겟 유전자를 적합한 방법으로 분석하여 장출혈성 대장균 O157:H7을 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 장출혈성 대장균 O157:H7을 검출할 수 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상의 시료(예컨대, 식품)에서 대장균 O157:H7(바람직하게는, 장출혈성 대장균 O157:H7)을 검출하는 것이다. 즉, 본 발명의 방법은 시료 내 장출혈성 대장균 O157:H7의 게놈 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용한 유전자 증폭 반응을 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식품 검체로부터 DNA를 추출한 후, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하고 이의 결과물을 확인한다. 그 결과, 예상 크기의 PCR 증폭산물이 검출되면 상기 식품 검체에 장출혈성 대장균 O157:H7이 포함된 것으로 판단(/진단)할 수 있다.
본 명세서의 용어 “식품 검체”는 장출혈성 대장균 O157:H7의 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 DNA를 추출하는 미지의 물질을 의미하며, 예를 들어 장출혈성 대장균 O157:H7에 오염된 식품, 천연물(예컨대, 물) 및 생물학적 시료(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
식품 검체로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 쌍(E157F 및 E157R)을 이용한 증폭산물은 장출혈성 대장균 O157:H7을 포함하는 시료에서 179 bp의 증폭산물을 생산한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
인간에서 식중독을 유발하는 주요 균들은 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 쉬겔라 종(Shigella spp.), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)를 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 쌍은 장출혈성 대장균 O157:H7을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 시료(예컨대, 식품 검체) 내 대장균 O157:H7(바람직하게는, 장출혈성 대장균 O157:H7)을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 즉, 본 발명의 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물은 장출혈성 대장균 O157:H7의 존재에 대한 지표가 될 수 있으며, 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환의 진단에 이용될 수 있다.
본 명세서의 용어 “장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환”은 대장균 O157:H7에 의해 유발되는 질환을 의미하며, 특히 장출혈성 대장균 O157:H7에 오염된 식품이나 천연물(예컨대, 소고기, 물)을 섭취하거나 장출혈성 대장균 O157:H7에 감염된 대상(예컨대, 인간)과 접촉함으로써 유발되는 질환으로 설사, 탈수, 구토, 발열, 구역질, 두통 및 심한 복통의 증상을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환은 식중독, 출혈성대장염(hemorrhagic colitis: HC), 용혈성 요독 증후군(HUS : hemolytic Uremic Syndrom), 비염증 또는 염증을 동반한 분비성 설사 및 박테리아-유발 위장관염(gastroenteritis)을 포함하며, 가장 바람직하게는 식중독이다.
본 발명에서 용어 “대장균(Escherichia coli)”은 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli(EHEC)), 장독소원성 대장균(enterotoxigenic E. coli(ETEC)), 장관병원성 대장균(enteropathogenic E. coli(EPEC)), 장관침입성 대장균(enteroinvasive E. coli(EIEC)), 장관집합성 대장균(enteroaggregative E. coli(EAggEC)) 및 요로병원성 대장균(uropathogenic E.coli(UPEC))을 포함하며, 보다 바람직하게는 장출혈성 대장균이고, 보다 더 바람직하게는 장출혈성 대장균 O26, O103, O104, O146 및 O157이며, 가장 바람직하게는 장출혈성 대장균 O157:H7이다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 또는 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 증폭반응(예컨대, PCR)에 의한 장출혈성 대장균 O157:H7의 검출을 위해 필요한 최소 DNA 양은 1 fg-100 ng이고, 보다 바람직하게는 2 fg-50 ng이며, 보다 더 바람직하게는 5 fg-25 ng이고, 가장 바람직하게는 5 fg-5 ng이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 검출될 수 있는 장출혈성 대장균 O157:H7의 시료 내 양은 101-107 세포/g이고, 가장 바람직하게는 102-106 세포/g이다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 장출혈성 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍, 이를 이용한 장출혈성 대장균 O157:H7 검출방법, 그리고 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단 키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법은 인체에 유해한 장출혈성 대장균 O157:H7만을 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통해 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환의 진단에 이용될 수 있다.
(c) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 DNA 수준에서 장출혈성 대장균 O157:H7의 감염 진위 여부를 판별할 수 있어 오염된 식품 및 감염 여부의 예찰 및 방제에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 약어: M, DNA 사이즈 마커; 1 내지 23, 표 1에 기재된 번호의 균주; 및 24, 음성 대조군.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 실험균주
본 발명에서 사용된 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)을 포함한 기타 미생물은 표 1에 정리하였다.
본 발명에서 이용된 균주들.
번호 균주명
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23		 Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O1:K1:H7T
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli O157:H42
Shigella sonnei T
Shigella flexneri T
Shigella boydii T
Shigella dysenteriae T
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar TyphimuriumT
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi A
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi B
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhi
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Kentucky
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Virginia
Salmonella enterica subsp. houtenae T
Salmonella enterica subsp. arizonae
Salmonella enterica subsp. diarizonae
Salmonella enterica subsp. indica
Salmonella bongori
T; 스트레인형.
사용된 균주들은 영양배지[Nutrient agar; 염화 나트륨 5 g, 펩톤(Difco) 5 g, 이스트 익스트렉트(Difco) 2 g, 미트 익스트렉트(Difco) 1 g, 아가 15 g : 1L]에서 배양하였다.
실시예 2: 프라이머 쌍 제작
실시예 2-1: DNA 추출
실시예 1에서 배양된 균주들의 게놈(genomic) DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 게놈 DNA 추출 키트(Genomic-tips)를 이용하여 추출하였다.
실시예 2-2: 특이 염기서열 정보 탐색
대장균 O157:H7을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제작을 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 대장균 O157:H7의 유전체 정보를 blastn 프로그램을 이용한 분석을 통해 제작하였으며, 그 결과 상기 염기서열이 대장균 O157:H7-특이적이라는 것을 확인하였다.
실시예 2-3: 프라이머 쌍 제작
대장균 O157:H7의 179 bp 크기의 단편을 증폭하는 E157F 프라이머와 E157R 프라이머 쌍을 제작하였다. 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
본 발명에서 이용된 프라이머 서열.
번호 명칭 염기서열(5’-> 3’)
1
2		 E157F
E157R		 GCCGTACATGCTGCTGAGAGT
AGCGCGACCTGACCATAAGAG
상기 프라이머는 GenBank 등록된 각각의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인한 후 제작하였다.
실시예 3: 프라이머 쌍의 특이성 확인
실시예 3-1: 일반 PCR 증폭 반응
E157F 및 E157R로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 표 1에 기재된 균주들을 대상으로 PCR 증폭 반응을 실시하였다.
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% 젤라틴, dNTP(각각 0.2 mM), 10 pM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 1 unit의 Taq 중합효소(Taq polymerase; Promega, Madison, Wis.)를 함유하는 PCR 혼합액으로 총 50 ㎕의 양으로 실시하였다. PCR 혼합액에 첨가한 균주들의 게놈 DNA 양은 약 50 ng이었다.
대장균 O157:H7의 PCR 반응 조건은 다음과 같다: (a) 전변성 단계, 94℃에서 5분; (b) PCR 증폭단계(40 사이클), 1 사이클 당 95℃에서 60초, 53℃에서 30초 및 72℃에서 60초; 및 (c) 최종 연장단계, 72℃에서 10분. 증폭반응 후 10 ㎕의 PCR 증폭산물을 1.5% 농도의 아가로오스 젤에 전기영동한 후 EtBr(Ethidium bromide)로 염색하여 자외선 조사기(UV transilluminator)로 밴드 패턴을 확인하였다(도 1).
도 1을 통해 알 수 있듯이, PCR 증폭 산물은 대장균 O157:H7인 1 내지 4번에서만 확인되었는 바, 본 발명의 프라이머 쌍이 대장균 O157:H7 균주를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SmartBioLab. INC. <120> Methods for Detecting Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 <130> PN110275 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E157F primer <400> 1 gccgtacatg ctgctgagag t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E157R primer <400> 2 agcgcgacct gaccataaga g 21

Claims (7)

  1. 다음의 단계를 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)의 검출방법:
    (a) 식품 검체로부터 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
    (b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 검출은 유전자 증폭을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단용 키트로, 상기 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환은 식중독인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 삭제
  7. 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머로 이루어진 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 검출용 프라이머 쌍.
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