JP2005034121A - 食中毒起因細菌の一括検出方法及びその試薬 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
【課題】複数種類の病原細菌を対象として、プライマー設計および特異性証明に必要な時間、労力および経費を節減すると共に精度管理に有効なマルチプレックスPCR法を利用した簡便、迅速かつ安価な一括検出方法および試薬を提供する。
【解決手段】多数の既成PCR用プライマー対から、一定温度条件下で増幅可能な有効プライマー対群を選抜し濃度調整をする工程と、具体的な試薬作製の工程を備える。
【解決手段】多数の既成PCR用プライマー対から、一定温度条件下で増幅可能な有効プライマー対群を選抜し濃度調整をする工程と、具体的な試薬作製の工程を備える。
Description
本発明は、食品衛生、食品工場、環境衛生、家畜衛生に係わる食中毒起因細菌を一括してスクリーニングする検査技術に関するものである。
食品衛生、食品工場、環境衛生、家畜衛生に係わる環境の中で、HACCPを中心とした微生物制御体制が計られている今日、対象となる細菌の種類は非常に多い。加えて、1999年(平成11年)12月、食品衛生法施行規則の一部を改正する省令(厚生省令第105号)により、我が国においては、従来から一般的な食中毒の原因物質とされてきた腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、サルモネラ属菌、腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、ウェルシュ菌、カンピロバクタージェジュニ、カンピロバクターコリ、リステリアモノサイトゲネス、エルシニアエンテロコリティカ、エルシニアシュードチュベクローシス、セレウス菌、黄色ブドウ球菌及びボツリヌス菌等に加えて、2類感染症であるコレラ菌、赤痢菌及びチフス菌等が食品媒介性の原因物質として追加されている。これらの細菌の検査には一般的に培養検査が行われてきたが、検査方法が細菌種ごとに異なるため、事件毎に全ての検査を網羅することは不可能に近く、一括して検査ができる新検査技法の開発が望まれてきた。
最近では、これらの細菌に対する簡便で迅速な同定方法の一つとして、細菌の保持している遺伝子を人工的に増幅することにより同定するポリメラーゼ連鎖反応(以下「PCR」と略す。)が開発され、様々なプライマー対が設計され、市販されている。しかしながら、市販品の中では細菌の種類が制限されていることや、細菌を分離した後の性状試験を目的として商品化されているため高価であるといった問題点がある。このために、細菌が分離される前にスクリーニング的に応用することや一度のPCRで複数の遺伝子を同定するマルチプレックスPCR(以下「M−PCR」と略す。)へ応用することは非常に困難であった。これを解決する手段としては、自分でプライマー対をデザインし合成するか文献から選抜し合成する方法がある。しかし、前者ではまず基準菌株を用いてプライマー対の特異性を証明する必要があり、後者では膨大な数のプライマー対の中から適切なものを選抜しなければならない。
現在まで、報告されてきたPCRを用いた研究は、細菌属レベルあるいは細菌種レベルでの応用である事が多い。複数種類の微生物を検査対象としたものには「微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット」(特開2002−223766)がある。この発明は、広範に微生物種を同定する有効な方法であるが、食中毒起因細菌を対象にしておらず、M−PCRでの実施例がなく具体的な手段を提供していない。他に、13種類の食中毒起因細菌に対する一括検出方法の報告があるが(R−F.WANG et al、Journal of Applied Microbiology、1997、83、727−736)、文献からのプライマー対の選抜方法について明記されておらず、実施例も少なく技術的に安定した成績がでることを証明していない。また、1種類の細菌に対し1種類のみの対象遺伝子をターゲットにしているため、判定がわかりにくい。
M−PCRを実施する場合、対象とする細菌種数が多いことからプライマー対群の調整方法が煩雑になり、検査者毎の成績のバラツキやDNA汚染が生じやすくなる傾向にある。M−PCRに限らずPCR反応液の調製方法の不均一性は擬陽性や擬陰性の原因となっており、PCRを実施する上での適切な精度管理を困難にしている理由の一つとなっている。
このような状況の中で、本発明者等は、多数の既成PCR用プライマー対からの有効な選抜方法を確立すること、選抜プライマー対を用途に応じてグループ化し、それらの最適濃度条件を決定して調製方法を確立すること、ならびにプライマー対群調製済みのディスポーサブルチューブを作製することにより、食中毒起因細菌に対する迅速、簡便かつわかりやすい一括検出方法を確立するとともにPCRに対する最適な精度管理を提供することを目的とする。
上記課題を解決するための本発明は以下の技術的手段から構成される。
(1)多種類のプライマー対の選抜方法について、グラジエント式サーマルサイクラー(i−Cycler,BIO−RAD)を用いて、プライマー対と標的DNAを挿入した反応液をアニーリング温度条件を変えて反応させ、至適アニーリング温度が55℃付近に存在するプライマー対を選び出すことで、M−PCRにおける最適および均一なアニーリング条件を提供することを特徴とする細菌の一括検出方法。
(2)前(1)項でプライマー対群を検査用途にしたがってグループ化し、それぞれの競合作用を調べ、競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には濃度比を変えた反応液列を用いて最適濃度比を決定することで、グループ化後のプライマー対群の最適濃度条件を決定することを特徴とする細菌の一括検出方法。
(3)第(1)項および前(2)項で選抜、調整したグループ化後プライマー対群溶液を、無菌およびDNAaseフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させ、使用時にホットスタート用TaqDNAポリメラーゼを挿入し反応させることを特徴とする細菌の一括検出方法。
(1)多種類のプライマー対の選抜方法について、グラジエント式サーマルサイクラー(i−Cycler,BIO−RAD)を用いて、プライマー対と標的DNAを挿入した反応液をアニーリング温度条件を変えて反応させ、至適アニーリング温度が55℃付近に存在するプライマー対を選び出すことで、M−PCRにおける最適および均一なアニーリング条件を提供することを特徴とする細菌の一括検出方法。
(2)前(1)項でプライマー対群を検査用途にしたがってグループ化し、それぞれの競合作用を調べ、競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には濃度比を変えた反応液列を用いて最適濃度比を決定することで、グループ化後のプライマー対群の最適濃度条件を決定することを特徴とする細菌の一括検出方法。
(3)第(1)項および前(2)項で選抜、調整したグループ化後プライマー対群溶液を、無菌およびDNAaseフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させ、使用時にホットスタート用TaqDNAポリメラーゼを挿入し反応させることを特徴とする細菌の一括検出方法。
本発明について更に詳細に説明する。
一般的に、腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、チフス菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、ウェルシュ菌、カンピロバクタージェジュニ、カンピロバクターコリ、リステリアモノサイトゲネス、エルシニアエンテロコリティカ、エルシニアシュードチュベクローシス、セレウス菌、黄色ブドウ球菌及びボツリヌス菌のような細菌を検出し同定するためには、選択分離培地による培養や有機物の分解性を観察する性状試験、染色法による形態観察および薬物感受性試験等により細菌固有の性状を証明することが行われてきた。これらの検査方法は、細菌種ごとに異なっており、食中毒事件毎に全ての細菌種を網羅することは不可能に近く、事件の発生状況や検査者の判断で菌種の絞り込みを行い検査に供してきた。もちろん全ての事件に対して全ての検査を実施することは現実的ではなく必要性も乏しいが、一方で検査に供しても目的の細菌が検出されず、原因不明となることも少なくない。従って、多数の細菌種を一括して検査ができる新検査技法の開発が望まれてきた。
一般的に、腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、チフス菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、ウェルシュ菌、カンピロバクタージェジュニ、カンピロバクターコリ、リステリアモノサイトゲネス、エルシニアエンテロコリティカ、エルシニアシュードチュベクローシス、セレウス菌、黄色ブドウ球菌及びボツリヌス菌のような細菌を検出し同定するためには、選択分離培地による培養や有機物の分解性を観察する性状試験、染色法による形態観察および薬物感受性試験等により細菌固有の性状を証明することが行われてきた。これらの検査方法は、細菌種ごとに異なっており、食中毒事件毎に全ての細菌種を網羅することは不可能に近く、事件の発生状況や検査者の判断で菌種の絞り込みを行い検査に供してきた。もちろん全ての事件に対して全ての検査を実施することは現実的ではなく必要性も乏しいが、一方で検査に供しても目的の細菌が検出されず、原因不明となることも少なくない。従って、多数の細菌種を一括して検査ができる新検査技法の開発が望まれてきた。
PCRが食品衛生検査に応用されるようになって久しいが、前述の食中毒起因細菌に対して、様々な研究者により様々なプライマー対が設計され、それぞれの特異性が証明されてきた。この中で細菌株間や数種類の細菌種間ではM−PCRが応用され、方法論も確立してきたが、前述の細菌種を全般にわたって調査した報告は少ない。唯一、13種類の食中毒起因細菌に対する一括検出方法(R−F.WANG et al、Journal of Applied Microbiology、1997、83、727−736)が報告されているが、実用性の面から未だ未完成である。
報告されてきた様々なプライマー対は、標的細菌種に対する特異性については充分に証明されており、この面では全く新規性はない。しかしながら、これらのデータは各研究者の至適条件下で評価されたものであり、相対的な評価は全くなされていない。また、本来PCRの良否を問うべきプライマーの設計はPCR法のコアをなすべき部分であるが、標的遺伝子を保持した細菌株や類属細菌の基準株の入手はもちろん、プライマーの設計と実験の繰り返しとが必要であるため、その証明は非常に困難であるとともに、標的細菌種数が多くなればなるほど莫大な時間、手間および費用を費やさなければならない。
既成のプライマー対は、かなりの数が報告されてきており、中には非常に有効なものが存在する。本発明のようにM−PCRを目的とする場合には有効なプライマー対を効率よく選抜し、組み合わせることで全く別の用途が生じる。例えば、鶏や豚の食肉工場では、サルモネラ属菌、リステリア属菌およびカンピロバクター属菌が重要な病原菌であるが、水産漁場ではビブリオ属菌、赤痢菌や大腸菌が主要な標的である。一方、乳製品工場では基本的に汚染の是非が最重要点であり、加えて大腸菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌およびカンピロバクターといった病原細菌のスクリーニングが必要である等、製品の種類によって重要管理点となる細菌の種類が異なっている。このように、製品の種類に応じて様々な細菌種の組み合わせが要求されるために、プライマー対の効率的な選抜方法を確立することは非常に有効なことである。
本発明者等は、既報の様々な文献や特許から抽出した多数のプライマー対の中から有効なプライマー対を簡便且つ効率的に抽出する方法を提案する。PCRのコアの試薬であるプライマー対は20〜25対程度のオリゴヌクレオチドからなり、PCRの成否がこれにより左右されると言っても過言ではなく、その特性は塩基配列から計算されるGC含量とTm値による。ここで、Tm値は、簡便的にAとTとを2℃、GとCとを4℃として塩基配列から簡易的に算出できることが知られている。一般的にPCRで用いられるアニーリング温度はプライマー対のTm値から5℃程度下げた温度が用いられる。これらのことから、設計されたプライマーの塩基配列から至適アニーリング温度を便宜的に推測することは可能である。しかしながら、プライマー対と標的塩基配列との相性は周辺塩基配列の状況や繰り返し配列の存在あるいは反応液の組成等により千変万化であるため、実際には温度条件を変えて反応させることが簡便な最良の検証手段である。現在はグラジエント温度列によるPCRが可能なグラジエント式温度サイクラーを用いることにより至適アニーリング温度範囲を簡単に決定することができる。以上のことから、最初に各プライマー対の至適アニーリング温度範囲を決定することにより有効なプライマー対を選抜する。
図1により、文献や特許等から抽出した様々なプライマー対を調整した。即ち、これらのプライマー対は、カラム精製グレードで合成されたものを用い(依頼合成、インビトロジェン)、合成された乾燥状態のオリゴヌクレオチドを滅菌蒸留水で200μMに調製し、−30℃で凍結保存した。単プライマー対の場合はセンス及びアンチセンスを終濃度10μMになるように調製し、マルチプレックスプライマー対の場合は最適濃度比となるように調製して使用溶液とし、−30℃で凍結保存した。
試験に供した細菌株の一覧表を表1に示した。一部の菌株を除き全て野生株を用いた。図1に示した処理方法により、これらの菌株からDNAを抽出した。即ち、0.5mL用マイクロチューブに200μLの滅菌蒸留水を分注し、予めTSA寒天培地に純培養した細菌集落の1/3白菌耳を懸濁した。100℃、10分間煮沸するかヒートブロックで加熱したのち、12,000rpm×3分間遠心分離した上清2.5μLを粗DNA溶液として試験に供した。
各プライマー対の至適アニーリング温度範囲を測定した。PCR反応液は、至適pHを維持するためのPCR緩衝液、耐熱性ポリメラーゼ、プライマー対、4種のヌクレオチドおよび標的粗DNA溶液から構成される。最終的にM−PCRを目的とするため、本発明におけるポリメラーゼは、硫酸アンモニウムと塩化カリウムとをPCR緩衝液に使用することで高度な特異性が期待できるホットスタータックマスターミックスキット(キアゲン)を用いた。メーカー手順書に沿ってマスターミックスを調製し(終濃度塩化マグネシウム:1.5mM,dNTP:200μM,その他の試薬組成未公表)、プライマー対濃度を最終0.4μMに統一して挿入し、最後に標的DNA溶液2.5μLを入れて最終反応液量25μLで反応させた。PCR装置は、グラジエント式サーマルサイクラー(i−Cycler,BIO−RAD)を用いて、95℃×15minの前熱変性(ホットスタート用ポリメラーゼの活性化に必要)の後、95℃×30secの熱変性と45.0−70.0のグラジエントなアニーリング温度での反応(45sec)を35回繰り返し、72.0℃×7minの後伸長反応を行った。グラジエント温度の詳細は45.0、46.8、49.8、54.1、60.6、65.2、68.2、70.0℃である。
増幅産物は、終濃度0.5μg/mLとなるように臭化エチジウムを添加した2%アガロースゲル(アガロースL03,宝酒造)を用いて、1×TAE溶液により100V、35min電気泳動した。この成績において、明確なバンドを形成する温度範囲を各プライマー対の至適アニーリング温度範囲とした(図2)。
測定したプライマー対は、用途とプライマー対数を考慮に入れて、大腸菌用、サルモネラ赤痢菌用、ビブリオ属菌用、キャンピロバクター・ウェルシュ菌用および黄色ブドウ球菌用にグループ化し、それぞれのマスターミックスの作製を試みた。各プライマー対は100μMの保存溶液を適宜希釈混合して各々10μMの試作混合液を調製し、最終濃度0.4μMで試験に供した。
大腸菌用マスターミックス(以下「ECMX」。)は、malB遺伝子検出用プライマー対Eco−1&Eco−2(以下「pEco」。)、志賀毒素様毒素SLT遺伝子検出用プライマー対mMK2−1&mMK2−2(以下「pmMK」。)、毒素原性大腸菌易熱性毒素LT遺伝子検出用プライマー対LT−11&LT−2(以下「pLT」。)、毒素原性大腸菌耐熱性毒素ST遺伝子検出用プライマー対ST1a−s&ST1a−as&ST1b−s&ST1b−as(以下「pST」。)、およびinvE遺伝子検出用プライマー対I−1&I−51(以下「pI」。)が含まれる(表2)。
サルモネラ赤痢菌用マスターミックス(以下「SSMX」。)は、dH flagellin遺伝子検出用プライマー対ST3&ST4(以下「pST」。)、invA遺伝子検出用プライマー対salm3&salm4(以下「psalm」。)、hilA遺伝子検出用プライマー対HILA2−F&HILA2−R(以下「pHILA」。)、ipaH遺伝子検出用プライマー対Shi−1&Shi−2(以下「pShi」。)、およびinvE遺伝子検出用プライマー対I−1&I−51(以下「pI」。)、virA遺伝子検出用プライマー対virA−f&virA−r(以下「pvirA」。)が含まれる(表2)。
ビブリオ属菌用マスターミックス(以下「VIBMX」。)は、ctx遺伝子検出用プライマー対CT1&CT2(以下「pCT」。)、ctx遺伝子検出用プライマー対VC−1&VC−2(以下「pVC」。)、耐熱性溶血毒素TDH遺伝子検出用プライマー対TDH−1&TDH−2(以下「pTDH」。)、ToxR遺伝子検出用プライマー対ToxR339−1&ToxR339−2(以下「pToxR」。)、およびcytotoxin−hemolysin遺伝子検出用プライマー対VVp1&VVp2(以下「pVVp」。)が含まれる(表2)。
キャンピロバクター・ウェルシュ菌用マスターミックス(以下「CCWMX」。)は、16SrRNA検出用プライマー対C−c&j−F&C−c&j−R(以下「pC−c&j」。)、hippuricase遺伝子検出用プライマー対CJ−HIP−F&CJ−HIP−R(以下「pHIP」。)、C.Coli(NCTC11366T株)オープンリーディングフレームORF検出用プライマー対CC18−F&CC18−R(以下「pCC」。)、phospholipaseC遺伝子検出用プライマー対PL3&PL7(以下「pPL」。)、およびenterotoxin遺伝子検出用プライマー対P145&P146(以下「pP」。)が含まれる(表2)。
リステリア・エルシニア・セレウス菌用マスターミックス(以下「LYBMX」。)は、iap遺伝子検出用プライマー対MONOA&LIS1B(以下「pLm1」。)、listeriolysin O遺伝子検出用プライマー対LL5&LL4(以下「pLm2」。)、ail遺伝子検出用プライマー対Ye1&Ye2(以下「pYe」。)、inv遺伝子検出用プライマー対YP−3&YP−4(以下「pYp」。)、hemolysinBL遺伝子検出用プライマー対HEL−F&HEL−R(以下「pHEL」。)、cereolysin AB遺伝子検出用プライマー対CEL−F&CEL−R(以下「pCEL」。)、およびhemolysin遺伝子検出用プライマー対BC−1&BC−2(以下「pBc」。)が含まれる(表3)。
黄色ブドウ球菌用マスターミックス(以下「SAMX」。)は、enterotoxinA遺伝子検出用プライマー対GSEAR−1&GSEAR−2(以下「pGSEAR」。)、enterotoxinB遺伝子検出用プライマー対GSEBR−1&GSEBR−2(以下「pGSEBR」。)、enterotoxinC遺伝子検出用プライマー対GSECR−1&GSECR−2(以下「pGSECR」。)、enterotoxinD遺伝子検出用プライマー対GSEDR−1&GSEDRF−2(以下「pGSEDR」。)、及びenterotoxinE遺伝子検出用プライマー対GSEER−1&GSEER−2(以下「pGSEER」。)が含まれる(表3)。
ポツリヌス菌用マスターミックス(以下「CBMX」。)は、BonTA遺伝子検出用プライマー対CBMLA1&CBMLA2(以下「pCBMLA」。)、BonTB遺伝子検出用プライマー対CBMLB1&CBMLB2(以下「pCBMLB」。)、BonTE遺伝子検出用プライマー対CBMLE1&CBMLE2(以下「pCBMLE」。)、BonTF遺伝子検出用プライマー対CBMLF1&CBMLF2(以下「pCBMLF」。)、BonTA遺伝子検出用プライマー対AS11&AS−22(以下「pAS」。)、BonTB遺伝子検出用プライマー対BS−11&BS−22(以下「pBS」。)、BonTC遺伝子検出用プライマー対CS−11&CS−22(以下「pCS」。)、BonTD遺伝子検出用プライマー対DS−11&DS−22(以下「pDS」。)、BonTE遺伝子検出用プライマー対ES−11&ES−22(以下「pES」。)、およびBonTF遺伝子検出用プライマー対FS−11&FS−22(以下「pFS」。)が含まれる(表3)。
以上のマスターミックス群を用いて、表1の菌株について、PCRを実施した。この成績により、プライマー対同士の競合作用が認められる場合は、増幅されるべきバンドが消失したり、薄く反応して増幅効率に影響が認められ、そうでない場合は明瞭なバンドが形成される。ここで、図3に示したフローに沿って最適濃度比を決定するために競合PCRを次により実施した。競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には影響される側のプライマー濃度を1とし、影響する側のプライマー対を2倍段階希釈したプライマー溶液を6列作製して、コンペティティブに反応させる。その成績により、両者プライマー対の最適濃度比を決定し、最終的にミックスプライマーの濃度比を決定した。
ECMXにおいてpEcoは他の4種全てと競合作用を示した。成績(図4)により決定した各プライマー対の濃度比はpmMK:pLT:pST:pI:pEco=2:1:2:1:4(プライマー対最終濃度は各々0.2μM:0.1μM:0.2μM:0.1μM:0.4μM)であった(表2)。
SSMXでは、pSALとpHILAがそれぞれ競合作用を示した。成績(図4)により決定した各プライマー対の濃度比はpST:pSAL:pHILA:pShi:pI:pvirA=2:1:2:2:2:1(プライマー対最終濃度は各々0.4μM:0.2μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.2μM)であった(表2)。
VIBMXでは、pToxRとpTDHおよびpVVpが競合作用を示した。成績(図4)により決定した各プライマー対の濃度比はpCT:pVC:pToxR:pTDH:pVVp=4:2:4:1:1(プライマー対最終濃度は各々0.4μM:0.2μM:0.4μM.0.1μM:0.1μM)であった(表2)。
CCWMXでは、pC−c&jとpHIPおよびpCCが、それぞれ競合作用を示した(図4)。成績により決定した各プライマー対の濃度比は、pPL:pP:pC−c&j:pHIP:pCC=4:4:4:4:1(プライマー対最終濃度は各々0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.1μM)であった(表2)。
LYBMXでは、pHELとpCELおよびpBCに競合作用が認められた。成績(図4)により決定した各プライマー対の最終濃度比は、pLm1:pLm2:pYe:pYp:pHEL:pCEL:pBc=4:4:4:4:4:2:1(プライマー対最終濃度は各々0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.2μM:0.1μM)であった(表3)。
SAMXは、既製のM−PCR用プライマーであり、文献から引用した濃度比により目的のバンドが良好に増幅された。決定した各プライマー対の濃度比は、pGSEAR:pGSEBR:pGSECR:pGSEDR:pGSEER=1:1:1:1:1(プライマー対最終濃度は各々0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM)であった(表3)。
CBMXは、既製のM−PCR用プライマーであり、pCBMLAを除き、文献から引用した濃度比により目的のバンドが良好に増幅された。pCBMLAでは782bpのバンドが増幅されるはずであったがpCBMLBと同じ205bp程度のバンドが検出された。したがって、同様にボツリヌス神経毒を対象としている別のM−PCRでデザインされたプライマーと組み合わせて使用することにした。決定した各プライマー対の最終濃度比は、pCBMLA:pCBMLB:pCBMLE:pCBMLF:pAS:pBS:pCS:pDS:pES:pFS=1:1:1:1:1:1:1:1:1(プライマー最終濃度は各々0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM:0.4μM)であった(表2)。
以上の方法で調製したプライマー対溶液を、無菌およびDNAaseフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させることを試みた。合成プライマーは全て保存溶液が200μMとなるように調製した。これらの保存溶液を用いて、各種マスターミックスを、前述の濃度比で0.5mLマイクロチューブに100μL調製した。即ち、ECMXはpmMK原液、pLT原液、pST原液、pI原液、およびpEco原液の各々2.5μL、0.625μL、2.5μL、0.625μLおよび5μLずつを0.5mLマイクロチューブに入れ滅菌蒸留水で100μLとした。同様にSSMX、VIBMX、CCWMX、およびSAMXを調製した。これらのマスターミックスを滅菌済み8連チューブ用分割リザーバー(B−0817−1,ビーエ厶機器)にその順番で注入し、第8番目の分割容器にはDWを100μL注入した。これらをよく混釈した後、8連マイクロピペットを用いて、各々の分割容器から1μLをキャップ付き8連チューブに分注し、濃縮乾燥機(マイクロ遠心エバポレーター、旭テクノグラス)を用いて、60℃で3時間程度処理して完全に乾燥させた。これを食中毒起因細菌一括検出試薬とした。
食中毒起因細菌一括検出試薬を使用して特異性を確認した。耐熱性ポリメラーゼは、高度な特異性が期待でき、簡便な操作で準備できるホットスタータックマスターミックスキット(キアゲン)を用いた。メーカー手順書に沿ってマスターミックスを調製し(終濃度塩化マグネシウム:1.5mM,dNTP:200μM,その他の試薬組成未公表)、無菌的に、食中毒起因細菌一括検出試薬にチューブ当たり22.5μLずつ分注した。最後に表1で準備した標的DNA溶液2.5μLを株番号の順番で各々のマスターミックスに対応するように入れて反応させた。サーマルサイクラーの温度条件は、95℃×15minの前熱変性(ホットスタート用ポリメラーゼの活性化に必要)の後、95℃×30secの熱変性、55.0℃×30secのアニーリング、72℃×30secの伸長反応を35回繰り返し、72.0℃×7minの後伸長反応を行った。増幅産物は、マスターミックス毎に株番号の順番で泳動した。電気泳動は終濃度0.5μg/mLとなるように臭化エチジウムを添加した2%アガロースゲル(アガロースL03,宝酒造株式会社)を用いて、1×TAE溶液により100V、25min行った。
成績を図5〜10に示した。
ECOMXにより非病原性大腸菌(株番号EC1−7)、腸管毒素原性大腸菌(株番号EC3&4)、腸管侵入性大腸菌(株番号EC5&6)および腸管出血性大腸菌(株番号EC7&8)を明確に分別することが可能となった。SSMXによりチフス菌(株番号SS1&2)、赤痢菌(株番号SS3,4,5&6)、サルモネラ属菌(株番号SS7&8)を明確に分別することが可能となった。VIBMXによりコレラ菌(株番号VIB1&2)、耐熱性毒素産生性腸炎ビブリオ(株番号VIB3&4)、耐熱性毒素非産生性腸炎ビブリオ(株番号VIB5&6)およびビブリオバルニフィカス(株番号VIB7&8)を明確に分別することが可能となった。CCWMXにより毒素産生性ウェルシュ菌(株番号CCW1&2)、毒素非産生性ウェルシュ菌(株番号CCW3&4)、キャンピロバクタージェジュニ(株番号CCW5&6)およびキャンピロバクターコリ(株番号CCW7&8)を明確に分別することが可能となった。LYBMXによりリステリアモノサイトゲネス(株番号LYB1&2)、エルシニアエンテロコリティカ(株番号LYB3,4&5)、エルシニアシュードチュベクローシス(株番号LYB6)およびセレウス菌(株番号LYB7&8)を明確に分別することが可能となった。SAMXによりエンテロトキシンA陽性株(株番号SA1)、エンテロトキシンA&B陽性株(株番号SA2)、エンテロトキシンB陽性株(株番号SA3&7)、エンテロトキシンC陽性株(株番号SA5,6&8)およびエンテロトキシンD陽性株(株番号SA4)を明確に分別することが可能となった。CBMXによりニューロトキシンA陽性株(株番号CB1&4)、ニューロトキシンB陽性株(株番号CB2)およびエンテロトキシンE陽性株(株番号CB3)を明確に分別することが可能となった。
ECOMXにより非病原性大腸菌(株番号EC1−7)、腸管毒素原性大腸菌(株番号EC3&4)、腸管侵入性大腸菌(株番号EC5&6)および腸管出血性大腸菌(株番号EC7&8)を明確に分別することが可能となった。SSMXによりチフス菌(株番号SS1&2)、赤痢菌(株番号SS3,4,5&6)、サルモネラ属菌(株番号SS7&8)を明確に分別することが可能となった。VIBMXによりコレラ菌(株番号VIB1&2)、耐熱性毒素産生性腸炎ビブリオ(株番号VIB3&4)、耐熱性毒素非産生性腸炎ビブリオ(株番号VIB5&6)およびビブリオバルニフィカス(株番号VIB7&8)を明確に分別することが可能となった。CCWMXにより毒素産生性ウェルシュ菌(株番号CCW1&2)、毒素非産生性ウェルシュ菌(株番号CCW3&4)、キャンピロバクタージェジュニ(株番号CCW5&6)およびキャンピロバクターコリ(株番号CCW7&8)を明確に分別することが可能となった。LYBMXによりリステリアモノサイトゲネス(株番号LYB1&2)、エルシニアエンテロコリティカ(株番号LYB3,4&5)、エルシニアシュードチュベクローシス(株番号LYB6)およびセレウス菌(株番号LYB7&8)を明確に分別することが可能となった。SAMXによりエンテロトキシンA陽性株(株番号SA1)、エンテロトキシンA&B陽性株(株番号SA2)、エンテロトキシンB陽性株(株番号SA3&7)、エンテロトキシンC陽性株(株番号SA5,6&8)およびエンテロトキシンD陽性株(株番号SA4)を明確に分別することが可能となった。CBMXによりニューロトキシンA陽性株(株番号CB1&4)、ニューロトキシンB陽性株(株番号CB2)およびエンテロトキシンE陽性株(株番号CB3)を明確に分別することが可能となった。
以上の試験は模擬的に実施したものであるが、実際は1セットの食中毒起因細菌検出試薬により1検体をスクリーニングするのに用いられるため、以上の株の内どれかのバンド形態をもって検出されることになる。このことにより、1セットの食中毒起因細菌検出試薬を用いた18細菌種の一括検出が可能となる。
本発明により次の効果が得られた。
▲1▼以上のように、請求項1記載の発明によれば、複数種類の病原細菌を対象として、プライマー対設計並びに特異性証明に必要な時間、労力および経費を節減することができる。
▲2▼請求項2,請求項3および請求項4記載の発明によれば、精度管理に有効なマルチプレックスPCR法を利用した簡便、迅速かつ安価な一括検出方法および試薬を提供することができる。
▲1▼以上のように、請求項1記載の発明によれば、複数種類の病原細菌を対象として、プライマー対設計並びに特異性証明に必要な時間、労力および経費を節減することができる。
▲2▼請求項2,請求項3および請求項4記載の発明によれば、精度管理に有効なマルチプレックスPCR法を利用した簡便、迅速かつ安価な一括検出方法および試薬を提供することができる。
Claims (4)
- 菌種特異性または菌属特異性が証明されたプライマー対群を検査用途にしたがって選抜した後グループ化し、それぞれのプライマー対の競合作用を調べ、競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には濃度比を変えた反応液列を用いて最適濃度比を決定することで、グループ化後のプライマー対群の最適濃度条件を決定することを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出方法。
- 請求項1で選抜、調整したグループ化後プライマー対群溶液を、無菌およびDNAaseフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させ、使用時にホットスタート用TaqDNAポリメラーゼを挿入し反応させることを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出方法。
- 請求項2の組み合わせによるプライマー対群を8連0.2mLマイクロチューブに分注し、乾燥させたことを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出試薬。
- 市販の塩化アンモニウムおよび塩化カリウ厶を含有するPCRバッファーを含むホットスタート用PCR試薬を請求項3に挿入したことを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出試薬。
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Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005064016A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Prima Meat Packers, Ltd. | 微生物の多重検出方法 |
JP2011521665A (ja) * | 2008-06-03 | 2011-07-28 | ヘルス プロテクション エージェンシー | サルモネラ検出アッセイ |
WO2011142119A1 (ja) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | 東洋製罐株式会社 | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法 |
JP2012050362A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Toyo Seikan Kaisha Ltd | マルチプレックスpcr用プライマーセット及びそれを用いた微生物の検出方法 |
JP2013208068A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Seiko Epson Corp | 熱サイクル装置 |
JP2013208067A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Seiko Epson Corp | 熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法 |
US9278356B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-03-08 | Seiko Epson Corporation | Thermal cycler and control method of thermal cycler |
JP2016136973A (ja) * | 2016-05-11 | 2016-08-04 | セイコーエプソン株式会社 | 熱サイクル装置 |
US9427738B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-08-30 | Seiko Epson Corporation | Thermal cycler and control method of thermal cycler |
US9789459B2 (en) | 2014-02-20 | 2017-10-17 | Seiko Epson Corporation | Nucleic acid amplification reaction vessel and nucleic acid amplification reaction apparatus |
CN108004338A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-08 | 杭州医学院 | 检测spf小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测spf小鼠病原菌方法 |
WO2022191663A1 (en) * | 2021-03-11 | 2022-09-15 | Sanigen Co.,Ltd. | Primer set for detecting food poisoning bacteria by using next-generation sequencing method and method for detecting food poisoning bacteria by using the primer set |
-
2003
- 2003-07-15 JP JP2003296882A patent/JP2005034121A/ja not_active Withdrawn
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8298758B2 (en) | 2003-12-26 | 2012-10-30 | Prima Meat Packers, Ltd. | Method of multiplex microorganism detection |
WO2005064016A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Prima Meat Packers, Ltd. | 微生物の多重検出方法 |
JP2011521665A (ja) * | 2008-06-03 | 2011-07-28 | ヘルス プロテクション エージェンシー | サルモネラ検出アッセイ |
JP5851395B2 (ja) * | 2010-05-12 | 2016-02-03 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法 |
US9150931B2 (en) | 2010-05-12 | 2015-10-06 | Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. | Food-poisoning bacteria detection carrier, and method for detecting food-poisoning bacteria |
WO2011142119A1 (ja) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | 東洋製罐株式会社 | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法 |
JP2012050362A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Toyo Seikan Kaisha Ltd | マルチプレックスpcr用プライマーセット及びそれを用いた微生物の検出方法 |
JP2013208068A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Seiko Epson Corp | 熱サイクル装置 |
JP2013208067A (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-10 | Seiko Epson Corp | 熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法 |
US9278356B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-03-08 | Seiko Epson Corporation | Thermal cycler and control method of thermal cycler |
US9427738B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-08-30 | Seiko Epson Corporation | Thermal cycler and control method of thermal cycler |
US9789459B2 (en) | 2014-02-20 | 2017-10-17 | Seiko Epson Corporation | Nucleic acid amplification reaction vessel and nucleic acid amplification reaction apparatus |
JP2016136973A (ja) * | 2016-05-11 | 2016-08-04 | セイコーエプソン株式会社 | 熱サイクル装置 |
CN108004338A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-08 | 杭州医学院 | 检测spf小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测spf小鼠病原菌方法 |
CN108004338B (zh) * | 2017-12-22 | 2021-03-12 | 杭州医学院 | 检测spf小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测spf小鼠病原菌方法 |
WO2022191663A1 (en) * | 2021-03-11 | 2022-09-15 | Sanigen Co.,Ltd. | Primer set for detecting food poisoning bacteria by using next-generation sequencing method and method for detecting food poisoning bacteria by using the primer set |
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