CN108004338A

CN108004338A - 检测spf小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测spf小鼠病原菌方法

Info

Publication number: CN108004338A
Application number: CN201711416698.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋锦琴; 范兴丽; 花扣珍; 杜蓬; 张磊; 徐小寅; 戴方伟
Original assignee: Hangzhou Medical College
Current assignee: Hangzhou Medical College
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108004338B

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，提供了一种检测SPF小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测SPF小鼠病原菌方法。本发明提供的检测SPF小鼠病原菌的引物组合物可以同时检测支原体、鼠棒状杆菌、泰泽病原体和嗜肺巴斯德杆菌，特异性好没有交叉反应；本发明提供的用于检测SPF小鼠病原菌的试剂检测快速，灵敏度高，特异性强；本发明提供的用于检测SPF小鼠病原菌的试剂盒可以一次检测四种病原菌，检测操作方便，保证了检测结果准确，同时降低了检测成本，可以直接应用于社会生产实践。本发明提供的SPF小鼠病原菌的检测方法操作简单，结果准确，为SPF动物病原菌携带的检测研究提供了快速多重检测方法。

Description

检测SPF小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测SPF小鼠病原菌方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种检测SPF小鼠病原菌的引物组合物及应用和应用其的产品以及检测SPF小鼠病原菌方法。

背景技术

实验动物是生命科学研究的基础和支撑条件，是医学教学和生物医学研究不可缺少的实验材料，也是药物生产检测和新药研究的基础。随着社会经济的长足发展和生命科学研究的突飞猛进，实验动物科技事业和职业健康与安全已越来越被人们所重视。实验动物的质量直接影响实验效果和研究课题的成败，决定研究成果的可重复性、可行性和科学性。特别是人兽共患疾病，甚至直接威胁饲养和实验工作者的健康和生命安全。定期对实验动物进行微生物学质量监测是对饲养动物环境设施及管理最终结果的检验，是保证实验动物质量的有效措施。

根据国家标准，按微生物和寄生虫的控制程度，将实验动物的微生物标准划分为普通级动物、清洁级动物、无特定病原体动物(SPF)和无菌动物四个等级。SPF动物，是国际上公认的标准级别的实验动物，而实验动物是否达到SPF级别，其重要的评价手段就是实验动物微生物、寄生虫质量控制。定期对实验动物进行微生物学质量监测是对饲养动物环境设施及管理最终结果的检验，是保证实验动物质量的有效措施。

根据中华人民共和国国家标准GB 14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》，SPF小鼠病原菌检测项目共15项，病原菌检测项目中必须检测项目并要求阴性的8项，其中包括支原体、鼠棒状杆菌、泰泽病原体和嗜肺巴斯德杆菌。小鼠是现代医学研究和生命科学研究最常用的模式动物之一，ICR、KM、C57BL、BALB/c和BALB/c-nu是我国目前需求量最大的几种小鼠品系，SPF小鼠是国际上公认的标准级别的实验小鼠，对SPF小鼠病原菌核酸检测具有很大的必要性。

目前用PCR或荧光定量PCR细菌快速检测方法，研究的多数是单个或两个细菌的检测，以纯科研目的为主。这些方法如应用实验动物的多种病原菌检测，因项目多，各自成一个检测体系，参数、条件各不相同，直接应用于社会生产实践，可操作性差，且多次操作成本很高。寻找一种快速、准确、高灵敏、高通量的现代检测技术，运用于实验动物传染病的监控工作，对保证实验动物的质量及等级标准具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测SPF小鼠病原菌的引物组合物，本发明的第二目的在于提供上述引物组合物在检测SPF小鼠病原菌中的应用，本发明的第三目的在于提供上述引物组合物在制备用于检测SPF小鼠病原菌的产品中的应用，本发明的第四目的在于提供一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂，本发明的第五目的在于提供一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂盒，本发明的第六目的在于提供一种SPF小鼠病原菌的检测方法，以缓解现有技术中想要检测样本中是否携带支原体、鼠棒状杆菌、泰泽病原体和嗜肺巴斯德杆菌时需要逐个按照不同实验步骤、体系和条件一一检测的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种检测SPF小鼠病原菌的引物组合物，所述引物组合物包括用于检测泰泽病原体的引物对，用于检测嗜肺巴斯德杆菌的引物对，用于检测鼠棒状杆菌的引物对和用于检测支原体的引物对。

进一步地，所述用于检测泰泽病原体的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TACACTGGGATAACATCGAGAAATC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物-RP：5’-ACCAACTAGCTAATCAGACGCGGGC-3’(SEQ ID NO.2)；

所述用于检测嗜肺巴斯德杆菌的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TATGGAGGGGGATAACTGCGGGAAA-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物-RP：5’-AGACCAGCTAGAGATCGACGGCTTG-3’(SEQ ID NO.4)；

所述用于检测鼠棒状杆菌的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TAGTGTGTGTGGTGGAAAGTTTTTT-3’(SEQ ID NO.5)；

下游引物-RP：5’-GGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGC-3’(SEQ ID NO.6)；

所述用于检测支原体的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TGTGGTAGGGAGTTTTGGAATTTCA-3’(SEQ ID NO.7)；

下游引物-RP：5’-AGTATCTATCGTTTACGGTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.8)。

本发明还提供了上述引物组合物在检测SPF小鼠病原菌中的应用。

本发明还提供了上述的引物组合物在制备用于检测SPF小鼠病原菌的产品中的应用。

进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂，包括上述的引物组合物。

本发明还提供了一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂盒，包括上述的引物组合物或试剂。

本发明还提供了一种SPF小鼠病原菌的检测方法，应用上述的引物组合物或试剂或试剂盒。

进一步地，所述方法包括：以所述引物组合物为引物，以待测样本的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应进行鉴定。

进一步地，所述引物组合物中每种引物在反应体系中的使用浓度为0.2pmol/μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的检测SPF小鼠病原菌的引物组合物可以同时检测支原体、鼠棒状杆菌、泰泽病原体和嗜肺巴斯德杆菌，特异性好没有交叉反应；本发明提供的用于检测SPF小鼠病原菌的试剂包括本发明提供的引物组合物，检测快速，灵敏度高，特异性强；本发明提供的用于检测SPF小鼠病原菌的试剂盒可以一次同时检测样本中是否有泰泽病原体，嗜肺巴斯德杆菌，鼠棒状杆菌和支原体，该试剂盒检测操作方便，检测特异性好，灵敏度高，保证了检测结果准确，同时降低了检测成本，可以直接应用于社会生产实践。本发明提供的SPF小鼠病原菌的检测方法操作简单，检测速度成倍提高，检测特异性好，结果准确，同时降低了时间成本和人工成本，节省资源，在SPF小鼠病原菌必检八项目中，可以同时检测四项结果，为SPF动物病原菌携带的检测研究提供了快速多重检测方法。

附图说明

图1为本发明实施例3提供的反应体系对嗜肺巴斯德杆菌DNA不同稀释倍数的扩增结果图；

图2为本发明实施例3提供的反应体系对鼠棒状杆菌DNA不同稀释倍数的扩增结果图；

图3为本发明实施例3提供的反应体系对泰泽病原体DNA不同稀释倍数的扩增结果图；

图4为本发明实施例3提供的反应体系对支原体DNA不同稀释倍数的扩增结果图；

图5A为本发明实施例3提供的反应体系对四种病原菌荧光定量PCR联合检测特异性分析结果示意图；

图5B为本发明实施例3提供的反应体系对四种病原菌荧光定量PCR联合快速检测特异性熔解曲线示意图；

图6A为本发明实施例5的SPF小鼠病原菌携带模型样本检测的特异性分析结果示意图；

图6B为本发明实施例5的SPF小鼠病原菌携带模型样本检测的特异性溶解曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

进一步地，所述引物对为：

本发明还提供了上述的引物组合物在制备用于检测SPF小鼠病原菌的产品中的应用。进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂，包括上述的引物组合物。检测快速，灵敏度高，特异性强。

上述检测SPF小鼠病原菌的试剂盒还包括荧光定量PCR预混体系和ddH₂O。荧光定量PCR预混体系即UItraSYBR Mixture，其中包括：脱氧核糖核苷三磷酸、MgCl₂、DNA聚合酶以及含有SYBR Green I和ROX染料的PCR缓冲液。该荧光定量PCR预混体系可直接外购获得。ddH₂O为双蒸水，是重蒸水的一种。

本发明提供的检测SPF小鼠病原菌的试剂盒可以一次同时检测样本中是否有泰泽病原体，嗜肺巴斯德杆菌，鼠棒状杆菌和支原体，该试剂盒检测操作方便，检测特异性好，灵敏度高，保证了检测结果准确，同时降低了检测成本，可以直接应用于社会生产实践。

其中反应体系为：

荧光定量PCR反应程序为：95℃变性10min；95℃退火15s；60℃延伸1min，进行40个循环。

本发明提供的SPF小鼠病原菌的检测方法操作简单，检测速度成倍提高，检测特异性好，结果准确，同时降低了时间成本和人工成本，节省资源，在SPF小鼠病原菌必检八项目中，可以同时检测四项结果，为SPF动物病原菌携带的检测研究提供了快速多重检测方法。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1引物设计

从美国的NCBI基因数据库下载支原体、鼠棒状杆菌、泰泽病原体和嗜肺巴斯德杆菌的基因组序列。通过对各病原菌的待检目的基因片段进行序列分析和同源性比对后设计特异性引物，经过对比筛选得到特异性最好的四对引物，具体信息如下(序列表中的第1，2，3，4，5，6，7，8序列)：

本发明使用的引物委托上海英骏生物科技有限公司合成。

实施例2反应体系和条件优化

荧光定量PCR预混体系(即2×UItraSYBR Mixture(With ROX))由北京康为世纪公司提供。

不同病原菌检测荧光定量反应体系都为50μl，其中2×UltraSYBR Mixture(WithROX)25μl，上游与下游引物各1μl，模板DNA 5μl，ddH₂O水补足至50μl。

结果判断：选择荧光检测模式SYBR，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线并呈良好的对数增长为阳性，无典型的扩增曲线，判断为阴性。

经优化，荧光定量PCR反应条件如下：95℃10min变性；95℃15s退火；60℃1min延伸，然后进行荧光检测；变性、退火和延伸共进行40个循环。熔解曲线分析条件为：95℃15s，60℃1min，95℃15s后进行荧光检测，60℃15s。

在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，采用不同引物浓度进行检测，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物浓度为0.2pmol/μl。

实施例3灵敏度和特异性检测

(a)待测菌株样品DNA：支原体、鼠棒状杆菌、嗜肺巴斯德杆菌菌株的DNA为杭州医学院保存菌株提取物，泰泽病原体的DNA由浙江医学科学研究院实验动物中心戴方伟老师惠赠。将上述DNA提取物稀释成50ng/ul，作为模板母液，在此基础上，进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9梯度稀释，得到不同病原菌不同浓度的DNA作为后续PCR扩增的模板；

(b)以各梯度DNA为模板，与四对特异性引物混合分别配制成四个反应体系进行联合PCR检测：四对特异性引物、PCR制剂、ddH₂O；

(c)反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；选择荧光检测模式为SYBR荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；PCR反应荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，体现检测体系特异性良好。

所述步骤(b)中PCR反应体系中各成分的终浓度如下：

所述步骤(b)中PCR反应条件如下：95℃10min变性；95℃15s退火；60℃1min延伸，然后进行荧光检测；变性、退火和延伸共进行40个循环。

实验结果如图1为反应体系对嗜肺巴斯德杆菌DNA不同稀释倍数的扩增结果；图2为反应体系对鼠棒状杆菌DNA不同稀释倍数的扩增结果；图3为反应体系对泰泽病原体DNA不同稀释倍数的扩增结果；图4为反应体系对支原体DNA不同稀释倍数的扩增结果。

嗜肺巴斯德杆菌、鼠棒状杆菌、泰泽病原体、支原体不同稀释度DNA荧光定量PCR试验Ct值如下表所示。

特异性试验：

以泰泽病原体，嗜肺巴斯德杆菌，鼠棒状杆菌和支原体的基因组DNA为模板，采用荧光定量PCR联合快速检测方法在优化PCR扩增条件下检测上述四种病原菌验证方法的特异性，结果如图5A和图5B所示，可以看出本发明建立的荧光定量PCR联合快速检测试剂盒及检测方法对泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆都具有较好的特异性，对四种病原的基因组DNA进行检测也显示阳性反应。而且病原菌之间检测无交叉反应。

图5A中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中校正荧光强度的对数值等于0.100横线为阈值线，曲线1-4表示反应体系对泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌核酸检测扩增结果，曲线5表示阴性对照的核酸扩增检测结果。Ct值为达到阈值线所需要的循环数(即曲线1-4分别在横线Y相交点的读数)；

图5B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线6-9表示泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌扩增产物的熔解曲线分析结果。曲线10表示阴性对照的核酸溶解曲线分析结果。

敏感性试验：

由上表的荧光定量PCR检测结果可知，设计构建的反应体系实验效果符合预期，能特异、灵敏、联合检测实验动物必检感染病原体泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆的DNA。以嗜肺巴斯德杆菌荧光定量PCR结果数据为例推算，项目组构建设计的检测体系，对嗜肺巴斯德杆菌的检测拷贝数在10个左右，即10个左右的含菌浓度即可被灵敏、特异扩增。具体计算方法如下：

经DNA浓度和Q-PCR结果推测细菌检测灵敏度拷贝数的方法：嗜肺巴斯德杆菌2.43Mb的DNA大小。一个基因组的碱基数N就是2×2.43×10^⁶。分子量就是324.5×2×2.43×10^⁶＝1.58×10^⁹；加入反应体系1μl的模板相当于有333.5ngDNA，即3.335×10^^-7g。这样，基因组摩尔数，即细菌摩尔数就是3.335×10^^-7，除以1.58×10^9＝2.12×10^-16mol(样品DNA的摩尔数)。再乘以阿伏伽德罗常数2.12×10^^-16×6.02×10^²³＝1.3×10^⁸拷贝。约等于10^⁸拷贝。qPCR的Ct值一般控制在15-35比较好，本实验中，嗜肺巴斯德杆菌DNA稀释倍数在10^-6时，仍然可以获得较好Ct值，推断体系检测灵敏度在细菌拷贝数10左右。

进一步用实验验证理论计算值：对鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌做了验证实验。鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌均做稀释梯度：10⁵、10⁴、10³、10²、10¹/ml每个反应管，并通过采用宝生物工程有限公司的细菌DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书所述方法提取不同病原菌的基因组DNA。通过以不同稀释梯度病原菌的DNA提取物作为联合荧光定量PCR检测的模板。经荧光定量PCR方法进行检测，结果显示联合荧光定量PCR检测方法的病原菌检测敏感性达到10¹/ml。

由于泰泽病原体不能在无活细胞人工培养基上生长，且极度厌氧，纯培养菌株获取困难，所以泰泽病原体敏感性检测用提取物DNA梯度稀释进行上述灵敏度检测，经DNA浓度和Q-PCR结果推测细菌检测灵敏度拷贝数在10左右。

实施例4重复性试验

采用本发明所建立的联合荧光定量PCR检测方法对不同病原菌的不同浓度DNA模版进行检测，反应体系如实施例2所述，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.05～0.15之间，具有较好的重复性。

实施例5SPF小鼠病原菌携带模型样本的病原菌检测应用

对鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌做了活菌感染小鼠实验，泰泽病原体检测用提取物DNA。通过建立SPF小鼠病原菌携带模型，以不同病原菌感染小鼠模型。采集SPF感染小鼠的体液和组织样本直接提取细菌DNA，之后采用本研究发明的联合荧光PCR检测方法对泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆DNA提取物分别进行检测和应用模拟实验，实验结果均显示本发明的检测方法可以对目的病原菌DNA提取物进行有效检测(图6A和图6B)。结果显示本方法对四种病原菌的基因组DNA进行检测显示特异阳性反应，并且病原菌之间没有交叉反应。

图6A中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数；图中校正荧光强度的对数值等于0.100横线为阈值线，曲线1-4表示反应体系对泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌核酸检测扩增结果，曲线5表示阴性对照的核酸扩增检测结果。Ct值为达到阈值线所需要的循环数(即曲线1-4分别在横线Y相交点的读数)；

图6B图中：纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示温度；曲线6-9表示泰泽病原体、鼠棒状杆菌、支原体和嗜肺巴斯德杆菌扩增产物的熔解曲线分析结果。曲线10表示阴性对照的核酸溶解曲线分析结果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州医学院

<120> 检测SPF小鼠病原菌的引物组合物及其应用和应用其的产品以及检测SPF小鼠

病原菌的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tacactggga taacatcgag aaatc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accaactagc taatcagacg cgggc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatggagggg gataactgcg ggaaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaccagcta gagatcgacg gcttg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagtgtgtgt ggtggaaagt ttttt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggccgtatct cagtcccaat gtggc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtggtaggg agttttggaa tttca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtatctatc gtttacggtg tggac 25

Claims

1.一种检测SPF小鼠病原菌的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括用于检测泰泽病原体的引物对，用于检测嗜肺巴斯德杆菌的引物对，用于检测鼠棒状杆菌的引物对和用于检测支原体的引物对。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，

所述用于检测泰泽病原体的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TACACTGGGATAACATCGAGAAATC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物-RP：5’-ACCAACTAGCTAATCAGACGCGGGC-3’(SEQ ID NO.2)；

所述用于检测嗜肺巴斯德杆菌的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TATGGAGGGGGATAACTGCGGGAAA-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物-RP：5’-AGACCAGCTAGAGATCGACGGCTTG-3’(SEQ ID NO.4)；

所述用于检测鼠棒状杆菌的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TAGTGTGTGTGGTGGAAAGTTTTTT-3’(SEQ ID NO.5)；

下游引物-RP：5’-GGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGC-3’(SEQ ID NO.6)；

所述用于检测支原体的引物对的引物序列为：

上游引物-FP：5’-TGTGGTAGGGAGTTTTGGAATTTCA-3’(SEQ ID NO.7)；

下游引物-RP：5’-AGTATCTATCGTTTACGGTGTGGAC-3’(SEQ ID NO.8)。

3.如权利要求1或2所述的引物组合物在检测SPF小鼠病原菌中的应用。

4.如权利要求1或2所述的引物组合物在制备用于检测SPF小鼠病原菌的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。

6.一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合物。

7.一种用于检测SPF小鼠病原菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合物或权利要求6所述的试剂。

8.一种SPF小鼠病原菌的检测方法，其特征在于，应用权利要求1或2所述的引物组合物或权利要求6所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括：以所述引物组合物为引物，以待测样本的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应进行鉴定。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述引物组合物中每种引物在反应体系中的使用浓度为0.2pmol/μl。