CN108796106A - 牛贾第虫、隐孢子虫多重pcr检测试剂盒及其方法 - Google Patents

牛贾第虫、隐孢子虫多重pcr检测试剂盒及其方法 Download PDF

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cryptosporidum parvum
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract

本发明公开一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法，根据十二指肠贾第虫TPI基因、微小隐孢子虫18S rRNA基因与安氏隐孢子虫18S rRNA基因的部分保守序列设计引物，建立三重PCR检测方法，通过优化PCR反应的退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。本发明扩增的三种目的片段在琼脂糖凝胶电泳中大小差异显著，易于区分，且敏感性可达到1×103/g粪便，高于三种寄生虫已报导的镜检法与常规PCR检测方法，适合于临床实践中样本的检测。本发明检测方法可以同时快速检测牛的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。同时为实验用实牛的质量标准提供技术支持。

Description

牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明提供一种同时检测牛十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis, G.duodenalis)、微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏微小隐孢子虫(C.andersoni)三重PCR检测方法，本发明还提供了该试剂盒的制备方法和用法，属于寄生虫检测技术领域。
背景技术
贾第虫（Giardia）与隐孢子虫(Cryptosporidium)属于重要的人兽共患病原虫，隐孢子虫包括微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏隐孢子虫(C.andersoni)等，主要引起幼龄动物的消化道和呼吸道疾病，导致其生产性能下降或死亡。贾第虫又分为6种，包括敏捷贾第虫(Giardia agi-lis)、苍鹭贾第虫(Giardia ardeae)、鹦鹉贾第虫(Giardiapsittaci)、微小贾第虫(Giardia microti)、鼠贾第虫(Giardia muris)和十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis,G.duodenalis)，有些文献也称为蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)或肠贾第虫(Giardia in-testinalis)，其中十二指肠贾第虫是唯一可感染人类的贾第虫,同时可以感染包括宠物和家畜在内的其他哺乳动物。贾第虫（Giardia）与隐孢子虫(Cryptosporidium)感染宿主广，感染后临床症状以腹泻为主，并对畜牧业与养殖业造成巨大的经济损失。
牛作为重要的实验用动物，利用于大量的基础性实验当中，其身体健康状态直接影响实验数据以及实验人员的人身安全。牛是中国传统养殖业的典型动物，随着牛场养殖规模的不断扩大，对于牛群寄生虫快速检测的需要日趋增加。
目前对安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫的检测方法主要为三种，分别为病原学检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法，而在此之中被使用最多的是病原学检测方法，通过显微镜下检测粪便中的卵囊，来对安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫和十二指肠贾第虫进行确诊，但该方法具有费时费力，敏感性，特异性均不高，且不能辨别虫种和基因型的缺点。制备三重PCR检测试剂盒，可以在同一体系中快速检测牛十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis, G.duodenalis)、微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏微小隐孢子虫(C.andersoni)，比普通的显微镜下检测粪便中的卵囊以及单项PCR等方法都要更加简便快速、特异、敏感。这大大提高了检测这三种寄生虫的效率与准确性。
发明内容
本发明提供一种能同时检测实验用牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫三重PCR检测试剂盒，可用于牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫的快速检测。
本发明进一步提供了上述试剂盒的制备方法。
本发明牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫三重PCR检测试剂盒的组成材料：
（1）PCR反应液：2.5mM dNTPs、终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物、10×PCRbuffer，rTaq DNA聚合酶、DNA模板和ddH2O；
（2）三重PCR引物(均 15pM)：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较三重PCR产物以及监测三重PCR操作过程是否正确；
（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。
本发明的试剂盒还含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭，(E.B)10μg/μl及PCR 反应管。
本发明所述的牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)三重PCR引物(均 15pM)：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
2)粪便基因组DNA的提取：
使用生物公司出售的粪便基因组DNA提取试剂盒，提取牛粪便中的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA。
3）PCR 扩增：
（1）准备待检样品的PCR反应管并分别标记，管内加入PCR反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和rTaq Polymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件。
（2）PCR反应条件为：94℃预变性3min、94℃变性 30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共32个循环，后72℃延伸10min。
4）PCR产物观察：
配制1.0%琼脂糖凝胶(加入浓度0.5μg/mL 的E.B)，加样后120V-145V 电压下电泳18-25min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，若样品在 447bp(十二指肠贾第虫)、700bp（微小隐孢子虫）或223bp（安氏隐孢子虫）大小处存在条带就证明该样品为阳性。
本发明的积极效果在于：
根据十二指肠贾第虫TPI基因、微小隐孢子虫18S rRNA基因与安氏隐孢子虫18S rRNA基因的部分保守序列设计引物，建立三重PCR检测方法，并且通过优化PCR反应的退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。不同目的片段的区分是多重PCR检测方法建立的关键之一，本试剂盒扩增的三种目的片段在琼脂糖凝胶电泳中大小差异显著，易于区分，且敏感性可达到1×103/g粪便，高于三种寄生虫已报导的镜检法与常规PCR检测方法，适合于临床实践中样本的检测。本发明检测方法可以同时快速检测牛的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。同时为实验用实牛的质量标准提供技术支持。
附图说明
图 1：三重PCR退火温度的优化图；
图 2：三重PCR特异性试验图；
图 3：三重PCR灵敏度试验图；
图 4：三重PCR实际应用图。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例 1
十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫特异基因选择
十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫虫种特异诊断序列：选择具有高度保守性的TPI基因与18S rRNA基因序列，NCBI中比对其为贾第虫与隐孢子虫所特有，符合种特异检测研究标准。
三重PCR检测试剂盒的引物设计
用生物软件设计特异性诊断引物如下：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
在447bp(十二指肠贾第虫)、700bp（微小隐孢子虫）或223bp（安氏隐孢子虫）增出诊断基因片断，目的条带明亮，无非特异性杂带。能够实现灵敏、特异地检测出牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫的目的。
三重PCR检测试剂盒的组成
（1）PCR反应液：2.5mM dNTPs，终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游
引物，10×PCR buffer，rTaq DNA聚合酶，DNA模板和ddH2O。除DNA模板外，其他试剂可配制为Mix液冻存于-20℃长期存放。
（2）引物：十二指肠贾第虫上游引物(F1)和十二指肠贾第虫下游引物(R1)、微小隐孢子虫上游引物（F2）和微小隐孢子虫下游引物(R 2)、安氏隐孢子虫上游引物（F3）和安氏隐孢子虫下游引物（R3）(均15pM)。
（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；
（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。
此外，本发明的试剂盒还含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭(E.B)10μg/μl及 PCR 反应管。
三重PCR反应条件优化
退火温度的优化：设置退火温度梯度分别为57.0℃、58.0℃、59.0℃、60.0℃，结果显示最佳退火温度为58.0℃(见附图1：M：DL2000 marker；1~4：退火温度依次是57、58、59、60)。
三重PCR灵敏度试验
将十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫提取其虫体基因组DNA，用灭菌ddH2O依次倍比稀释样品为1×106、1×105 、1×104、1×103、1×102、1×10 、1个/g 粪便十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫。应用上述含不同虫体数量的基因组DNA作为模板（每个反应1μl）进行三重PCR扩增，混合液按照上游引物各1μl、下游引物各1μl、dNTPMixture 4μl、10╳PCR Buffer5μl、DNA混合模板1μl、r Taq Polymerase 0.5μl，最后用灭菌ddH2O补至50μl体系，并且用优化好的反应条件进行三重PCR扩增，以此来确定三重PCR的灵敏度(见附图3；M：DL2000 marker；1~7：1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1个/g粪便)。
三重PCR特异性测试
为了确定三重PCR特异性，本实验可选取牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫作为阳性对照，灭菌的ddH2O作为阴性对照，然后选取吉林大学动物医学学院寄生虫科研实验室保存的寄生虫基因组，分别是新孢子虫、弓形虫、旋毛虫DNA模板以及大肠杆菌O157DNA模板，同时按照上述的体系操作和优化好的反应条件进行三重PCR扩增，来确定所建立的三重PCR检测方法是否特异，结果只有阳性对照（十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫）出现特异条带，证明所建立的三重PCR方法特异性良好(见附图2：M: DL2000marker；1：微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫和十二指肠贾第虫；2：十二指肠贾第虫；3：微小隐孢子虫；4：安氏隐孢子虫；5：弓形虫；6：新孢子虫；7：旋毛虫；8：大肠杆菌O157)。
三重PCR检测试剂盒的稳定性和重复性试验
阳性模板、三重PCR反应液、引物和 r Taq Polymerase(5U/μl)在-20℃条件下贮存，溴酚蓝等其它物品常温保存即可。当贮存时间为1个月、2个月、3个月、5个月和6个月时取出试剂盒，用已知的阳性样品鉴定试剂盒稳定性。取 10 份阳性样品用该试剂盒重复检测3次，同时做阴性对照，结果表明在447bp或700bp或223bp大小处有特异的目的带，而阴性对照均无任何扩增带，故此试剂盒稳定性和重复性良好。
三重PCR检测试剂盒的保质期试验
将在-20℃贮存1个月、3个月和 6个月的试剂盒取出并对已知阳性样品进行检测。按照该试剂盒的说明进行操作，结果表明在-20℃条件下保存达6月之久的试剂盒依然能扩增出清晰的目的条带，无杂带。
试验例1
利用实施例1制备的试剂盒对实际样品检测进行测试，采集长春地区156份牛的粪便样品进行检测，提取其粪便基因组DNA156份，按照上述的体系操作和优化好的反应条件进行三重PCR扩增，操作重复3次，经三重PCR检测出十二指肠贾第虫阳性粪便样为121份(77.6%)，微小隐孢子虫阳性粪便样为5份(3.2%)，安氏隐孢子虫阳性粪便样为99份(63.5%)。(见附图4；M：DL2000 marker ；+：阳性对照 -：阴性对照1~156：检测样品)。
结论：通过上述检测例1证明本发明的试剂盒具有准确性和稳定性。可以进行牛十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis,G.duodenalis)、微小隐孢子虫（C.parvum）与安氏微小隐孢子虫(C.andersoni)三重PCR的快速检测，为今后牛贾第虫病与隐孢子虫病的流行性病学调查奠定基础。同时为实验用实牛的质量标准提供技术支持。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1583
<212> DNA
<213> 十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)
<400> 1
ggcgcattcc atggatggag gttcctgtcc cgggggttaa gcgatttctt gaggaggcta 60
tcgaggtcct tcattctcac atagtagatg ataacacatt agtgcgagtc tcgggccttt 120
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aggcagagga ggtccatgtg gggctccgaa agtggtttgc ggagaaggtt tgtgccgagg 1140
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tcaagtatat attcctgttt cgaaggaaat gggtaatctt ttgaatatgc atcgtgatgg 1500
ggatagatca ttgcaattat tgatcttgaa cgaggaattc ctagtaagcg caagtcatca 1560
gcttgcgctg attacgtccc tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctcct accgattgaa 1620
tgatccggtg aattattcgg accatacttt gtagcaatac atgtaaggaa agtttcgtaa 1680
accttatcat ttagaggaag gagaagtcgt aacaaggttt ccgtaggtga acctgcagaa 1740
ggatca 1746
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 微小隐孢子虫(Giardia duodenalis)
<400> 5
ccttactcct tcagcacctt atg 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 微小隐孢子虫(Giardia duodenalis)
<400> 6
tgttacgact tctccttcct ctaa 24
<210> 7
<211> 761
<212> DNA
<213> 安氏隐孢子虫(Giardia duodenalis)
<400> 7
tgattcataa taactttacg gatcgcatct ctgatgcgac atatcattca agtttctgac 60
ctatcagctt tagacggtag ggtattggcc taccgtggct atgacgggta acggggaatt 120
agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatctaagg aaggcagcag 180
gcgcgcaaat tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aagaaataac aatacagggc 240
ctaacggtct tgtaattgga atgagtgaag tataaacccc tttacgagta tcaattggag 300
ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt 360
tgcagttaaa aagctcgtag ttggatttct gttgtataat ttataatatt accaaggtaa 420
ttattatatt atcaacatcc ttcctattat attctaaata tataggaaat tttactttga 480
gaaaattaga gtgcttaaag caggcaactg ccttgaatac tccagcatgg aataataagt 540
aaggactttt gtctttctta ttggttctag gacaaaagta atggttaata gggacagttg 600
ggggcattcg tatttaacag ccagaggtga aattcttaga tttgttaaag acgaactact 660
gcgaaagcat ttgccaagga tgttttcatt aatcaagaac gaaagttagg ggatcgaaga 720
cgatcagata ccgtcgtagt cttaaccata aactatgccg a 761
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 安氏隐孢子虫(Giardia duodenalis)
<400> 8
taccgtggct atgacgggta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 安氏隐孢子虫(Giardia duodenalis)
<400> 9
caccagactt gccctccaat 20

Claims (3)

1.用于扩增牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
所述的牛十二指肠贾第虫特异基因序列如SEQ No.1所示；
所述的微小隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.4所示；
所述的安氏隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.7所示。
2.一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒，其特征在于：
（1）配制牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的PCR反应液：2.5mM dNTPs、终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物、10×PCR buffer，rTaq DNA聚合酶、DNA模板和ddH2O；
（2）如权利要求1所说牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的三重PCR引物：
（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较三重PCR产物以及监测三重PCR操作过程是否正确；
（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O；
（5）琼脂糖、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭10μg/μl，PCR 反应管。
3.如权利要求2所述的一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1) 牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫三重PCR引物设计：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
2)基因组DNA的提取：
提取牛粪便中的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA；
3）在同一体系中对十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫进行PCR 扩增：
（1）准备待检样品的PCR反应管并分别标记，管内加入PCR反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和rTaq Polymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件；
（2）PCR反应条件为：94℃预变性3min、94℃变性 30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共32个循环，后72℃延伸10min。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118189A (zh) * 2020-01-07 2020-05-08 西北农林科技大学 牛微小隐孢子虫特异性引物及其pcr检测方法和应用
CN114752594A (zh) * 2022-05-20 2022-07-15 华中农业大学 用于检测沙门氏菌和隐孢子虫的多重实时荧光定量pcr引物和探针组合
CN114908085A (zh) * 2022-05-05 2022-08-16 领航基因科技（杭州）有限公司 根霉菌pcr检测的引物、探针及其试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726566A (zh) * 2015-03-02 2015-06-24 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 多重pcr检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726566A (zh) * 2015-03-02 2015-06-24 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 多重pcr检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118189A (zh) * 2020-01-07 2020-05-08 西北农林科技大学 牛微小隐孢子虫特异性引物及其pcr检测方法和应用
CN114908085A (zh) * 2022-05-05 2022-08-16 领航基因科技（杭州）有限公司 根霉菌pcr检测的引物、探针及其试剂盒
CN114752594A (zh) * 2022-05-20 2022-07-15 华中农业大学 用于检测沙门氏菌和隐孢子虫的多重实时荧光定量pcr引物和探针组合
CN114752594B (zh) * 2022-05-20 2024-03-15 华中农业大学 用于检测沙门氏菌和隐孢子虫的多重实时荧光定量pcr引物和探针组合

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