CN104789657A - TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法，通过选取Be特异的一段基因序列，并基于该特异基因序列设计得到特异性的引物(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)与TaqMan探针(SEQ ID No.4)。本发明建立的TaqMan实时荧光探针定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出伊丽莎白巴尔通体，为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。

Description

TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法。
背景技术
伊丽莎白巴尔通体(Bartonella elizabethae，Be)是一种能引起巴尔通体心内膜炎疾病的革兰阴性杆菌。1993年，Daly等人从美国马州伊丽莎白医院一心内膜炎患者血液中分离出来，是巴尔通体属中新发现的人兽共患病病原菌。
伊丽莎白巴尔通体具有巴尔通体属细菌的共同特征，对培养条件要求较高、培养时间长。目前，国内外对此菌的检测方法主要是分离培养和常规PCR检测核酸分子。分离培养方法虽然能够获得直接的感染证据，但是由于Be难于培养、生长缓慢，又由于样品取材限制，培养成功率较低，不适用于快速诊断、筛查和流行病学调查。在血清学检测方法中，国际上通常应用IFA法检测巴尔通体抗体，有些种如汉赛巴尔通体(B.henselae，Bh)和五日热巴尔通体(B.quintana，Bq)有市售的检测试剂盒，对于Be仅有国外个别实验室能够进行，而且应用全菌作为检测抗原存在交叉反应，另外IFA法判读有一定的主观性，不易于推广使用和结果比较。常规PCR虽然避免了上述两类方法的缺陷，但是方法的敏感性和可能存在污染是不得不考虑的问题。荧光定量PCR方法由于其灵敏度高、自动化程度高等优点，能够很好地解决上述问题，在传染病病原检测上日渐普及，因此有必要建立荧光定量PCR方法检测伊丽莎白巴尔通体。
目前，国内外尚未见应用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测伊丽莎白巴尔通体的报道。本研究选取伊丽莎白巴尔通体特有的一段核酸序列设计特异引物和探针，利用探针技术建立检测此菌的荧光定量PCR方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法。
为了实现本发明目的，本发明选取伊丽莎白巴尔通体特有的基因序列为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。
其中，特有的基因序列为序列特异性扩增区标记(Sequencecharacterized amplified region，SCAR)，是通过应用随机引物3S(S15:5'-GGAGGGTGTT-3'，S18:5'-CCACAGCAGT-3'，S103:5'-AGACGTCCAC-3')对Be ATCC 49927、Bh ATCC 49882、BqATCCVR-358、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae，Bc)ATCC51734、克勒巴尔通体(B.koehlerae，Bk)ATCC700693、杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis，Bb)ATCC35685、文森巴尔通体博格霍夫亚种(B.vinsonii subsp.berkhoffii，Bvb)ATCC51672、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B.vinsonii subsp.arupensis，Bva)ATCC 700727、格拉汉姆巴尔通体(B.grahamii，Bg)ATCC 700132、道志巴尔通体(B.doshiae，Bd)ATCC 700133及特利波契巴尔通体(B.tribocorum，Bt)CIP105476共11种巴尔通体进行RAPD-PCR，依据RAPD图谱中巴尔通体各个种之间的差异扩增带，筛选得到Be的SCAR。
本发明将所述SCAR标记作为目标序列，提供技术方案如下：
本发明首先提供一种用于检测伊丽莎白巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物，所述引物包括：
上游引物BeF：5′-ACACCTGCACAAATAAAACCAAGAT-3′；
下游引物BeR：5′-TTTGCTGTTGTTGGTGTTTGC-3′。
本发明还提供了与前述引物配合使用的探针，所述探针为：
探针BeT：5′-FAM-AGCCATCAAGCCATACAAGACCACCCA-BHQ-3′；
其中，FAM为荧光报告基团，BHQ为荧光淬灭基团。
本发明还提供了含有前述引物及前述探针的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法，其是利用上游引物BeF和下游引物BeR及探针BeT，或所述试剂盒对伊丽莎白巴尔通体进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。
进一步地，前述方法包括以下步骤：
1)提取样品组织中的总DNA；
2)以步骤1)中的总DNA为模板，BeF和BeR为引物，BeT为探针，进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
其中，PCR反应体系以20μl计为：
进一步地，所述PCR反应条件为：95℃2分钟，单个循环；95℃3秒，60℃30秒，共40个循环。
本发明的有益效果在于：
本发明选取Be特异的一段基因序列，基于该特异基因序列，设计引物与TaqMan探针。本发明设计的TaqMan探针具有种水平特异性；最低检出限为每个PCR反应23个拷贝；组内和组间的变异系数(CV)值分别为0.10％－0.14％和0.09％－0.17％，在允许范围内，表明该方法稳定，规范操作可实现数据的良好重复性，数据可靠；标准曲线线性关系良好(R2＝1)，扩增效率高(E＝97％)，说明PCR反应条件得到了最佳优化、实验操作准确，结果可信。因而，本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出伊丽莎白巴尔通体，为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。
附图说明
图1为本发明实施例中应用3S引物(S15,10-mer；S18,10-mer；S103,10-mer)扩增伊丽莎白巴尔通体的RAPD图谱，图中M为DNA分子量标准，Be为伊丽莎白巴尔通体。
图2为本发明实施例中不同退火温度的扩增曲线。
图3为本发明实施例中不同探针浓度(A)和不同引物浓度(B)的扩增曲线。
图4为本发明实施例中伊丽莎白巴尔通体TaqMan-MGB探针荧光定量PCR特异性结果。
图5为本发明实施例中不同稀释度标准质粒的扩增曲线。
图6为本发明实施例中质粒标准品荧光定量PCR标准曲线(A)和扩增曲线图(B)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法
1材料与方法
1.1菌株和生物样本DNA
巴尔通体基因组DNA包括Be ATCC 49927、Bh ATCC 49882、Bq ATCCVR-358、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae，Bc)ATCC51734、克勒巴尔通体(B.koehlerae，Bk)ATCC700693、杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis，Bb)ATCC35685、文森巴尔通体博格霍夫亚种(B.vinsoniisubsp.berkhoffii，Bvb)ATCC51672、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B.vinsonii subsp.arupensis，Bva)ATCC 700727、文森巴尔通体文森亚种(B.vinsonii subsp.vinsonii，Bvv)ATCC VR-152、格拉汉姆巴尔通体(B.grahamii，Bg)ATCC 700132、道志巴尔通体(B.doshiae，Bd)ATCC700133、特利波契巴尔通体(B.tribocorum，Bt)CIP 105476；根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；人、猫、鼠及蜱基因组DNA均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室保存。布鲁氏菌(Brucella species)为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所相关科室提供。
1.2主要仪器设备与试剂
伯乐(BioRad)CFX96荧光定量PCR仪、台式高速离心机Eppendorf centrifuge 5804R、核酸浓度测定仪NanoDrop-1000。
QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)，pEASY-T1Cloning Kit、qPCR Master Mix购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司。
1.3靶基因筛选、引物与TaqMan探针的设计与合成
应用随机引物3S(S15:5'-GGAGGGTGTT-3'，S18:5'-CCACAGCAGT-3'，S103:5'-AGACGTCCAC-3')对Be、Bh、Bq、Bc、Bk、Bva、Bvb、Bg、Bt、Bd、Bb进行RAPD-PCR，依据RAPD图谱中巴尔通体各个种之间的差异扩增带，筛选Be的SCAR标记，选择此标记为目标序列，采用ABI Primer Express2.0软件设计探针BeT(FAM-AGCCATCAAGCCATACAAGACCACCCA-BHQ)、上游引物为BeF(5′-ACACCTGCACAAATAAAACCAAGAT-3′)和下游引物为BeR(5′-TTTGCTGTTGTTGGTGTTTGC-3′)。
1.4引物和探针的特异性、敏感性及实验重复性分析
为确认引物和探针对Be的适用性和特异性，应用PCR模拟工具http://insilico.ehu.es/PCR/，输入上下游引物以巴尔通体(B.alsatica、B.bacilliformis、B.birtlesii、B.doshiae、Be、B.melophagi、B.queenslandensis、B.rattaustraliani、B.tamiae、B.taylorii、B.vinsoniisubsp.arupensis、B.washoensis)和布鲁氏菌(B.abortus、B.canis、B.ceti、B.melitensis、B.pinnipedialis和B.suis)基因组为模板在线模拟PCR扩增。并应用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)检查引物特异性，搜索数据库选择Genome database(Chromosomes from all organisms)，其余参数选择默认选项。
将Be、上述其他种巴尔通体、布鲁菌和根癌土壤杆菌等非巴尔通体菌及人、猫、鼠和蜱基因组DNA的浓度调整至大约10ng/μL左右，取模板1uL进行定量PCR检测。
将Be标准质粒(2.32×109拷贝/μL)作10×倍比稀释，分别取1μL稀释后的标准质粒(2.32×100－2.32×108拷贝/μL)为模板进行定量PCR，分析能够检出的最小标准质粒拷贝数，即方法的敏感性。在同一次定量PCR反应中，每个稀释度标准质粒做3个重复孔，以分析组内差异；以上述相同条件分别进行3次独立重复实验，分析组间差异，计算Ct值变异系数CV值以验证该方法的稳定性。
1.5标准品的制备
以BeF和BeR为引物，Be标准菌株ATCC 927709的DNA为模板，扩增目的基因159bp；PCR产物切胶回收纯化后连接到pEASY-T载体上；将连接后载体导入DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，用PCR、测序方法验证后提取质粒，测定浓度，作为绘制定量PCR标准曲线的标准品。质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于-20℃和-70℃。
1.6质粒拷贝数浓度换算
测定质粒浓度为10.3ng/μL，pEASY-T载体的碱基数为3928bp，每个碱基的平均分子量为660dalton/bp，质粒分子量即为(3928+119)×660＝2.67×106，根据公式拷贝数浓度(拷贝/μL)＝(质量/分子量)×6.02×1023计算得出拷贝数浓度为2.32×109拷贝/μL。
1.7标准曲线的制备
将质粒原液按10×倍比稀释，使浓度达到2.30×102－2.30×108拷贝/μL进行定量PCR，同时做3个平行样品。
1.8反应条件优化
1.8.1退火温度：以阳性对照DNA为模板，51℃－62℃进行梯度定量PCR，筛选最优退火温度。
1.8.2探针及引物浓度:分别固定引物和探针浓度，探针和引物反应浓度分别为100、200、300、400、500nmol/L和100、200、300、400、500nmol/L，根据Ct值和扩增曲线的荧光信号强度选择最优探针和引物浓度，设3孔平行样进行检测。
1.9反应体系及反应参数
GoTaq qPCR Master Mix为10μL，上游引物BeF(10mol/L)为0.8μL，下游引物BeR(10mol/L)为0.8μL，TaqMan探针BeT(10mol/L)为0.6μL，DNA模板1μL，去离子水6.8μL，反应体系为20μL。扩增程序：第一步，95℃2min；第二步，95℃3sec，60℃30sec，40个循环。
2结果
2.1SCAR标记筛选及探针、引物设计
3S引物扩增发现Be的E带在其他巴尔通体Bh、Bq、Bc、Bk、Bva、Bvb、Bg、Bt、Bd、Bb的对应位置上无扩增带(图1)，测序后在NCBI数据库中Blast比对发现与其相似性最大的是Bg的未知外膜蛋白基因Bgr_17470(79％)，和Bt的未知外膜蛋白基因BM1374166_01912(73％)。以E带核酸序列作为SCAR标记，设计用于特异性扩增Be的探针及引物。
2.2最优反应条件
2.2.1最优退火温度:退火温度为51.0、51.7、53.2、55.3、58.0、60.2、61.4和62.0℃时，Ct值分别为19.41、19.48、19.23、19.79、19.37、19.35、19.17、19.44℃，Ct值没有明显差异，为方便操作退火温度定为60℃(图2)。
2.2.2最优探针和引物反应浓度:当探针浓度为300nmol/L时，与100nmol/L、200nmol/L进行统计学分析，P<0.05，差异有统计学意义；与400nmol/L、500nmol/L进行比较时，P>0.05，差异无统计学意义。Ct值较小、荧光信号强，重复实验结果稳定，综合考虑故选择300nmol/L为探针浓度(图3A)。当引物反应浓度为400nmol/L时，与100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L进行统计学分析，P<0.05，差异有统计学意义；与500nmol/L进行比较时，P>0.05，差异无统计学意义。Ct值较小、荧光信号强，重复实验结果稳定，故选择400nmol/L为引物反应浓度(图3B)。
2.3引物及探针的特异性检测
In silico PCR模拟扩增除外Be能够扩增出159bp目的片段，其他种巴尔通体和布鲁氏菌各种均未扩增出任何片段。Primer-BLAST特异性搜索未出现非特异扩增带。
Be标准菌株及实验室分离的Be菌株扩增均为阳性，汉赛巴尔通体等其它种巴尔通体和布鲁菌、根癌土壤杆菌及大肠杆菌等非巴尔通体属细菌的核酸样品检测均未见荧光信号，扩增结果均为阴性，空白对照NTC为阴性(图4)。
2.4引物和探针的敏感性试验
以10×倍比稀释的标准质粒(2.32×100－2.32×106拷贝/μL)为模板检测方法的敏感性，实验重复3次。结果显示，最低检出浓度为2.32×101拷贝/μL(Ct值为38.6)，即每个反应需23个拷贝，检测线以上各浓度质粒均出现良好的扩增信号，空白对照(NTC)没有扩增信号(图5)，本研究应用的定量PCR方法敏感。
2.4标准曲线
根据Ct值与标准质粒的浓度对数值绘制标准曲线，其相关系数R2为1.000，扩增效率E＝97％，Ct值和浓度之间呈现良好的线性关系(图6A、B)。
2.5重复性分析
在同一次定量PCR反应中，每个稀释度标准质粒做3个重复孔，以分析组内差异；以上述相同条件分别进行3次独立重复实验，分析组间差异，计算Ct值变异系数CV值以验证该方法的稳定性。
表1 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体重复性评估
Be是近些年发现的重要鼠传致病性巴尔通体，能够引起人心内膜炎等严重疾病，主要宿主为啮齿类动物，在鼠群中巴尔通体菌血症的流行率相当高，可高达62.2％。伊丽莎白巴尔通体已经被报道是一种人类疾病的病原体，在亚洲这种细菌菌株在共生的哺乳动物中能够被普遍分离。伊丽莎白巴尔通体作为潜在的犬的致病菌，从四只狗中获得的EDTA抗凝血样本中提取到的伊丽莎白巴尔通体已经得到扩增和测序。结果显示伊丽莎白巴尔通体可以作为犬传染性的病原体。在以色列共生动物鼠中一种巴尔通体菌株的分离与鉴定紧密地与伊丽莎白巴尔通体相关，中国尚未有此菌的检出，概因受限于缺乏方便、快捷的检测方法。为了便于开展对鼠中Be的检测和监测调查，本研究在SCAR标记基础上，开发建立了以Taqman探针荧光定量PCR方法，用以方便、快捷、灵敏、特异地检出此菌。本研究应用RAPD-PCR方法筛选出Be的SCAR标记，依据这段特异基因序列，设计引物与TaqMan探针。应用目标基因克隆质粒作为标准品，检测敏感性、扩增效率等指标，应用多种巴尔通体和其它种属的细菌作为阴性对照进一步验证方法的特异性，建立了Be的荧光定量PCR检测方法。除目标菌外，包括其他11种巴尔通体、近源细菌布鲁氏菌和根癌土壤杆菌及人、猫、鼠和蜱蚤的基因组DNA均无扩增信号，表明该方法具有很好的特异性，不会出现假阳性反应。最低检测限可达到每个PCR反应检出23个拷贝的目的基因，因此所设计的探针具有高灵敏性。倍比稀释的标准品3次平行重复实验的组内和组间变异值均较低，具有很好的重复性，表明该方法稳定、规范操作可实现数据的良好重复性，数据可靠。标准曲线的绘制反应出Ct值与质粒浓度良好的线性关系和高扩增效率，说明PCR反应条件得到了最佳优化、实验操作准确，结果可信，能够满足一般临床样品要求。因而，本研究建立的荧光定量PCR方法可为Be引起的一系列鼠传疾病的早期临床诊断、疾病监测和筛查以及流行病学调查提供一种高效的实验室检测手段。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.用于检测伊丽莎白巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物BeF：5′-ACACCTGCACAAATAAAACCAAGAT-3′；
下游引物BeR：5′-TTTGCTGTTGTTGGTGTTTGC-3′。
2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述探针为：
探针BeT：5′-FAM-AGCCATCAAGCCATACAAGACCACCCA-BHQ-3′；
其中，FAM为荧光报告基团，BHQ为荧光淬灭基团。
3.含有权利要求1所述引物及权利要求2所述探针的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法，其是利用权利要求1所述引物及权利要求2所述探针，或权利要求3-5任一项所述试剂盒对伊丽莎白巴尔通体进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样品组织中的总DNA；
2)以步骤1)中的总DNA为模板，BeF和BeR为引物，BeT为探针，进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃2分钟，单个循环；95℃3秒，60℃30秒，共40个循环。
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